CN106370844A - 人骨代谢标志物检测双胶体金试纸条及应用其的检测装置 - Google Patents

人骨代谢标志物检测双胶体金试纸条及应用其的检测装置 Download PDF

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Abstract

本发明属于临床医学检验领域，具体涉及一种定量检测人骨代谢标志物的胶体金试纸条及应用其的检测装置，本发明提供的试纸条，其为在底板上依次相互交错地粘贴的样品垫、涂覆有金标链霉亲和素的玻璃纤维垫、涂覆有金标抗体的玻璃纤维垫、硝酸纤维素膜及吸收垫。硝酸纤维素膜上设有一条预先包被羊抗鼠IgG抗体的质控线，硝酸纤维素膜上还设有与上述质控线平行的检测线，检测线上包被有能与待测抗原人骨代谢标志物特异性结合的抗体；所述的金标抗体为能与待测抗原人骨代谢标志物特异性结合的抗体。本发明能定量检测人骨代谢标志物，对仪器的要求低，缩短临床检测人骨代谢标志物的时间，降低检测的繁琐程度和成本。

Description

人骨代谢标志物检测双胶体金试纸条及应用其的检测装置
技术领域
本发明属于临床医学检验领域，具体涉及一种基于双胶体金探针定量检测人骨代谢标志物的胶体金试纸条及应用其的检测装置。
技术背景
世界卫生组织给骨质疏松(osteoporosis,OP)的定义是骨矿物含量较低，骨骼微结构改变，极易被破坏，骨骼韧性降低，容易发生骨折。全世界骨质疏松症以及与其相关的并发症和后遗症患者达到2亿人以上。骨质疏松的发病率增长速度逐年加快。根据最近的统计，其全球发病率排在所有慢性疾病的第七位。
临床上诊断骨质疏松最常用手段是骨密度(BMD)检测，最常用方法是双能X射线吸收仪(DEXA)检测。不过，BMD的具体标准仍然存在较大争议，人种、地域、性别对BMD的标准都存在一定的影响。此外，BMD检测一般都是人体局部检测，难以提供人体全面的骨强度信息。BMD检测的另一个缺陷是对骨质疏松治疗效果的评价功能不佳。相邻两次BMD检测的间隔最少需要3个月，因此无法及时反应骨质疏松治疗的效果。
多种生化物质会在骨吸收和骨重构过程中产生，并进入到血液、尿液或其他体液。这些物质被称为骨代谢标志物。随着对骨质疏松研究的不断深入和许多新的骨质疏松诊断和治疗手段的出现，人们对骨代谢标志物的关注程度越来越高。目前认为，骨代谢标志物可以评估患者骨转换情况、预测绝经后妇女骨质疏松症患者骨折的风险性和评估骨病患者药物治疗后的疗效，是一个与骨矿物密度有一定相关性，但又独立于骨矿物密度的骨强度相关标志。
骨代谢标志物可以分为两大类，骨形成标志物，包括血清骨钙素(s-OC)、血清骨碱性磷酸酶(s-BALP)；血清T型原胶原N端前肽(s-PINP)；血清I型原胶原C端前肽(s-PICP)；骨吸收标志物，包括尿吡啶啉(u-PTD)；尿I型胶原交联N末端肽(u-NTX)；尿I型胶原交联C末端肽(u-CTX)；血清I型胶原交联N-末端肽(s-NTX)；尿脱氧吡啶啉(u-DPD)；血清抗酒石酸酸性磷酸酶5b(s-TRACP-5b)；血清I型胶原交联C末端肽(s-CTX)。
临床上一般使用电化学免疫法和ELISA法检测骨代谢标志物，这两种方法的检测时间过长，电化学免疫法的检测时间一般在45分钟以上，ELISA法的检测时间一般在1小时30分钟以上。并且，以上两种方法的操作较为复杂，需要专业的检验人员才能操作。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，基于胶体金标记技术和链霉亲和素-生物素放大***，提供了一种定量、快速、简便、高灵敏度的检测人骨代谢标志物的双胶体金试纸条及应用其的检测装置，可以解决现有检测技术耗时长、操作复杂、仪器设备要求高的问题。该试纸条可以在10分钟内完成人血清样品中的骨代谢标志物定量检测，敏感快捷、成本低、小型化仪器、所用样品量少，在临床医学检验领域有广阔的应用前景。
本发明的目的可通过采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种人骨代谢标志物检测用双胶体金试纸条，包括试纸条底衬、样品垫、第一结合垫、第二结合垫、硝酸纤维素膜及吸收垫，其特征在于，所述试纸条底衬上顺次相互搭接粘贴的样品垫、第一结合垫、第二结合垫、硝酸纤维素膜及吸收垫，所述的硝酸纤维素膜上设有一条预先包被羊抗鼠IgG抗体的质控线，硝酸纤维素膜上还设有与上述质控线平行的检测线，检测线上包被有能与待测人骨代谢标志物抗原特异性结合的抗体，所述的第一结合垫涂覆有金标链霉亲和素，所述的金标链霉亲和素可以与金标生物素化抗体特异结合，所述的第二结合垫涂覆有金标生物素化抗体，所述的金标生物素化抗体是能与待测人骨代谢标志物抗原特异结合的抗体。
进一步的，所述能与待测人骨代谢标志物抗原特异性结合的抗体为能与待测人骨代谢标志物抗原特异性结合的单克隆抗体。
进一步的，所述的检测线为包被抗人骨代谢标志物单克隆抗体。
进一步的，所述的金标生物素化抗体为胶体金标记的生物素化单克隆抗体。
进一步的，所述的金标链霉亲和素制备方法为：取胶体金溶液，使用碳酸钾溶液调节pH值；加入链霉亲和素；室温下孵育15min后加入PEG-20000；混匀后离心、重悬，4℃保持备用。
进一步的，所述的金标生物素化抗体制备方法为：取胶体金溶液，使用碳酸钾溶液调节pH值；加入抗人骨代谢标志物单克隆抗体；缓慢搅拌；4℃孵育；加入3’端生物素化单链核苷酸；4℃孵育；加入PEG-20000；混匀后离心、重悬，4℃保持备用。
本发明还提供了一种定量检测人骨代谢标志物的胶体金检测装置，所述检测装置包括上述的人骨代谢标志物检测用双胶体金试纸条以及包裹所述试纸条的卡塞，所述卡塞进一步包括面板和底板，所述面板上设置有观察槽和加样口，所述加样口开口于所述样品垫上部，并露出部分或全部所述样品垫，所述观察槽开口于所述硝酸纤维素膜上侧，并露出全部所述的检测线和控制线。
进一步地，所述卡塞的面板和底板采用高密度聚乙烯材料制成。
本试纸条可以用来检测人骨代谢标志物液体样品，操作时，将全血、血浆或血清按一定的量滴加在本试纸条的样品垫上，将试纸条放入与其配套的金标定量阅读仪中，反应10分钟后，通过金标定量阅读仪得出检测结果。
本发明相比现有技术的有益效果是：
本发明采用了现代POCT检测中最流行的胶体金技术，通过金标链霉亲和素和金标生物素化抗体放大胶体金产生的信号，从而达到提高检测灵敏度的目的。本试纸条的检测结果准确，快速，操作简便，可以广泛用于骨质疏松诊断和药物治疗效果的评价。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1本发明的双胶体金试纸条的横断面结构示意图；
图2为本发明的双胶体金试纸条检测装置的卡塞的结构示意图；
其中：1、底衬；2、样品垫；3、第一结合垫；4、第二结合垫；5、硝酸纤维素膜；6、吸水垫；7、包被抗人骨代谢标志物抗体的检测线；8、包被羊抗鼠IgG抗体的质控线；201、卡塞；202、面板；203、底板；204、观察槽；205、加样口。
具体实施方式
以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
以人骨代谢标志物中的一种标志物人血清骨钙素(OC)为例。具体阐述本发明。
预先制备针对人血清骨钙素不同位点的单克隆抗体Anti-Osteocalcin抗体1(anti-OC mAb 1)，Anti-Osteocalcin抗体2(anti-OC mAb 2)。41nm胶体金制备：将100mL质量分数0.01％氯金酸溶液加热至95℃，迅速加入1mL质量分数1％柠檬酸三钠溶液，并充分搅拌。混合溶液变成红色后，继续加热15min。停止加热后冷却至室温，0.22μm过滤，使用双蒸水补足纳米金溶液到100mL，加入700μL 0.1mol/L碳酸钾溶液。
13nm胶体金制备：将100mL质量分数0.01％氯金酸溶液加热至95℃，迅速加入3.5mL质量分数1％柠檬酸三钠溶液，并充分搅拌。混合溶液变成红色后，继续加热15min。停止加热后冷却至室温，0.22μm过滤，使用双蒸水补足纳米金溶液到100mL，加入500μL0.1mol/L碳酸钾溶液。
所述的金标生物素化抗体制备方法为：使用PBS缓冲液(pH＝8.0,10mmol/L)稀释抗骨钙素单克隆抗体至浓度为0.036mg/mL。取0.036mg/mL抗骨钙素单克隆抗体Ab13418(anti-OC mAb 1)100μL,加至1mL AuNP溶液(13nm)，使用磁力搅拌器缓慢搅拌15min。4℃孵育1h。然后加入3’端生物素化单链核苷酸溶液10μL，质量分数为3.3mg/mL。4℃孵育12h。最后，加入100μL 1％PEG-20000，室温下搅拌15min。混合液4℃离心，10000g×50min，弃上清，加入1mL金标抗体储存液，混匀。重复3次。最后一次离心，弃上清后，加入0.2mL金标抗体储存液，4℃保存备用。
所述的金标链霉亲和素制备方法为：使用PBS缓冲液(pH＝8.5,10mmol/L)稀释链霉亲和素质量分数为0.15mg/mL。取0.15mg/mL链霉亲和素溶液100μL,加至1mL AuNP溶液(粒径为41nm)，使用磁力搅拌器缓慢搅拌。室温下孵育15min后加入100μL 1％PEG-20000。继续搅拌15min。混合液4℃离心,6000g×30min，弃上清，加入1mL金标链霉亲和素储存液，混匀。重复3次。最后一次离心，去上清后，加入0.2mL金标链霉亲和素储存液，4℃保存备用。
如图1及图2所示，人骨代谢标志物(以OC为例)检测用双胶体金试纸条，包括试纸条底衬1，以及试纸条底衬上顺次相互搭接粘贴的样品垫2、涂覆有金标链霉亲和素的第一结合垫3、涂覆有金标生物素化抗体的第二结合垫4、硝酸纤维素膜5及吸收垫6。硝酸纤维素膜5上设有一条预先包被羊抗鼠IgG抗体的质控线8，硝酸纤维素膜5上还设有与上述质控线平行的包被与待测抗原OC特异性结合的抗体(anti-OC mAb 2)检测线7。
涂覆金标链霉亲和素的第一结合垫3中有胶体金颗粒标记的链霉亲和素。
涂覆金标生物素化抗体的第二结合垫4中有胶体金颗粒标记的生物素化抗OC单克隆抗体。
定量检测人骨钙素的胶体金检测装置，所述检测装置包括人骨钙素检测用双胶体金试纸条以及包裹所述试纸条的卡塞201，所述卡塞201进一步包括面板202和底板203，所述面板上设置有观察槽204和加样口205；所述加样口205开口于所述样品垫2上部，并露出部分或全部所述样品垫2，所述观察槽204开口于所述硝酸纤维素膜上侧，以露出全部所述的检测线7和质控线8。
进一步的,所述卡塞201的面板202和底板203采用高密度聚乙烯材料制成。
本实施例提供试纸条的检测方法。
向人骨代谢标志物(以OC为例)双胶体金试纸条的样品垫2上滴加120μL血清样品。把试纸条放入金标定量阅读仪中，反应10分钟后，阅读仪自动检测试纸条上检测线7和质控线8的颜色强度，并显示检测结果。
本实施例提供试纸条的各项性能，以检测人血清骨钙素为例。
分析灵敏度定义为：对20次空白标准品测定，取其2倍的平均偏差，在其标准曲线上所对应的浓度即为分析灵敏度。
分析灵敏度为：0.50ng/mL
精密度：批内变异系数≤10％，批间变异系数≤12％
线性系数：r≥0.9900
线性范围：0.50～180ng/mL。
特异性：测定1000μg/L的骨钙素酶解碎片，干扰度≤1％。
本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。

Claims (8)

1.人骨代谢标志物检测用双胶体金试纸条，包括试纸条底衬(1)、样品垫(2)、第一结合垫(3)、第二结合垫(4)、硝酸纤维素膜(5)及吸收垫(6)，其特征在于，所述试纸条底衬(1)上顺次相互搭接粘贴的样品垫(2)、第一结合垫(3)、第二结合垫(4)、硝酸纤维素膜(5)及吸收垫(6)，所述的硝酸纤维素膜(5)上设有一条预先包被羊抗鼠IgG抗体的质控线(8)，硝酸纤维素膜(5)上还设有与上述质控线(8)平行的检测线(7)，检测线(7)上包被有能与待测人骨代谢标志物抗原特异性结合的抗体，所述的第一结合垫(3)涂覆有金标链霉亲和素，所述的金标链霉亲和素可以与金标生物素化抗体特异结合，所述的第二结合垫(4)涂覆有金标生物素化抗体，所述的金标生物素化抗体是能与待测人骨代谢标志物抗原特异结合的抗体。
2.根据权利要求1所述的人骨代谢标志物检测用双胶体金试纸条，其特征在于，所述能与待测人骨代谢标志物抗原特异性结合的抗体为能与待测人骨代谢标志物抗原特异性结合的单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的人骨代谢标志物检测用双胶体金试纸条，其特征在于，所述的检测线(7)为包被抗人骨代谢标志物单克隆抗体。
4.根据权利要求2所述的人骨代谢标志物检测用双胶体金试纸条，其特征在于，所述的金标生物素化抗体为胶体金标记的生物素化单克隆抗体。
5.根据权利要求1所述的人骨代谢标志物检测用双胶体金试纸条，其特征在于，所述金标链霉亲和素制备方法为：取胶体金溶液，使用碳酸钾溶液调节pH值；加入链霉亲和素；室温下孵育15min后加入PEG-20000；混匀后离心、重悬，4℃保持备用。
6.根据权利要求1所述的人骨代谢标志物检测用双胶体金试纸条，其特征在于，所述的金标生物素化抗体制备方法为：取胶体金溶液，使用碳酸钾溶液调节pH值；加入抗人骨代谢标志物单克隆抗体；缓慢搅拌；4℃孵育；加入3’端生物素化单链核苷酸；4℃孵育；加入PEG-20000；混匀后离心、重悬，4℃保持备用。
7.一种应用权利要求1-6任一项所述的人骨代谢标志物检测用双胶体金试纸条的检测装置，其特征在于，所述检测装置包括人骨代谢标志物检测用双胶体金试纸条以及包裹所述试纸条的卡塞(201)，所述卡塞(201)进一步包括面板(202)和底板(203)，所述面板(202)上设置有观察槽(204)和加样口(205)，所述加样口(205)开口于所述样品垫(2)上部，并露出部分或全部所述样品垫(2)，所述观察槽(204)开口于所述硝酸纤维素膜上侧，并露出全部所述的检测线(7)和质控线(8)。
8.根据权利要求7所述的检测装置，其特征在于，所述卡塞(201)的面板(202)和底板(203)采用高密度聚乙烯材料制成。
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