CN105424923A - 彩色-荧光双功能免疫层析试纸条及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种彩色-荧光双功能免疫层析试纸条及其制备方法，包括底板(1)，底板(1)的一面上顺序设有添加待测样品的加样垫(2)、标记物结合垫(3)、设有检测线T线(41)和质控线C线(42)的检测垫(4)和提供毛细管虹吸动力的吸水垫(5)，相邻各垫依次搭接，标记物结合垫(3)上涂覆有彩色-荧光双功能微球标记物探针。本发明的彩色-荧光双功能免疫层析试纸条及其制备方法，其检测结果既可通过肉眼进行阴阳性初步定性判断，又可通过仪器分析，获得准确的检测数据。

Description

彩色-荧光双功能免疫层析试纸条及其制备方法
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种彩色-荧光双功能免疫层析试纸条及其制备方法。
背景技术
在免疫层析检测领域，目前有两种主流的检测方式：一种是通过肉眼判读的定性检测免疫层析试纸条，包括胶体金标记试纸条、彩色乳胶标记试纸条等，其优点是无需配置任何检测设备即可对样品中待测物的含量做出定性的判断，缺点是无法定量，不能提供准确的浓度数据，且其检测灵敏度偏低，一般只能检出浓度在ng/ml级别以上的待测物；另一种是通过仪器判读的荧光免疫层析试纸条，其优点是通过仪器判读数据，可提供准确的浓度数据，且检测灵敏度比胶体金或彩色乳胶标记的试纸条要高2-3个数量级，但其缺点是在没有读数仪的情况下完全无法获得待测物的含量浓度情况。
发明内容
本发明主要提供了一种彩色-荧光双功能免疫层析试纸条及其制备方法，其检测结果既可通过肉眼进行阴阳性初步定性判断，又可通过仪器分析，获得准确的检测数据。
一种彩色-荧光双功能免疫层析试纸条，包括底板，底板的一面上顺序设有添加待测样品的加样垫、标记物结合垫、设有检测线T线和质控线C线的检测垫和提供毛细管虹吸动力的吸水垫，相邻各垫依次搭接，标记物结合垫上涂覆有彩色-荧光双功能微球标记物探针。
优选的，所述彩色-荧光双功能微球标记物探针含有待测物抗体彩色-荧光双功能微球标记物和兔、鼠或其他与待测物抗原抗体无交叉反应的抗原抗体彩色-荧光双功能微球标记物，待测物抗体彩色-荧光微球标记物由与待测物相关的抗原抗体或配体受体和彩色-荧光双功能微球结合制备而成，兔、鼠或其他与待测物抗原抗体无交叉反应的抗原抗体彩色-荧光双功能微球标记物由兔、鼠或其他与待测物抗原抗体无交叉反应的抗原抗体和彩色-荧光双功能微球结合制备而成。
优选的，所述检测线T线包被有与待测物相关的抗原抗体或配体受体，质控线C线包被有与待测物无关的抗原抗体或配体受体。
优选的，所述彩色-荧光双功能微球的粒径为50-1000nm，彩色-荧光双功能微球的材质为聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚乙烯吡啶微球、聚乙基丙烯酸甲酯微球、脂质微球和二氧化硅微球中的一种，所述彩色-荧光双功能微球表面带有羧基、氨基、醛基、溴乙酰基、碘乙酰基、硫醇基和环氧基中的一种或多种或不带基团。
优选的，所述彩色-荧光双功能微球的颜色为红色、蓝色、绿色、紫色和黑色中的一种肉眼可见的深色；荧光是稀土螯合物荧光、量子点荧光和普通荧光中的一种；颜色发射的波长和荧光物质发射的波长差大于等于30nm。
优选的，所述加样垫为具有过滤作用的材质，加样垫的材质为玻璃纤维、聚酯膜、海绵、滤纸或经过添加有表面活性剂、糖类、蛋白类、高分子多聚物、盐类中的一种或多种的磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液浸泡预处理后的玻璃纤维、聚酯膜、海绵、滤纸；
优选的，所述标记物结合垫的材质为玻璃纤维、聚酯膜或经过添加有表面活性剂、糖类、蛋白类、高分子多聚物、盐类中的一种或多种的磷酸缓冲液或三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl缓冲液)浸泡预处理后的玻璃纤维或聚酯膜；
优选的，所述检测垫为具有强疏水特性的多孔材料，检测垫的材质为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜，T线和C线至少为一条。
一种彩色-荧光双功能免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
(Ⅰ)加样垫的制备
用含有乙二胺四乙酸(EDTA)、吐温20(tween-20)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和牛血清白蛋白(BSA)的磷酸缓冲液(PBS缓冲液)浸泡玻璃纤维、聚酯膜、海绵或滤纸，然后置于烘箱中烘干，密封干燥保存备用；
(Ⅱ)标记物结合垫的制备
用含有海藻糖、牛血清白蛋白、tween-20和PVP的PBS缓冲液浸泡玻璃纤维或聚酯膜，然后置于烘箱中烘干，再将彩色-荧光双功能微球标记物探针喷涂于处理烘干后的玻璃纤维或聚酯膜上，再次置于烘箱中烘干，密封干燥保存备用；
(Ⅲ)检测垫的制备
检测线T线的包被：将与待测物相关的抗原抗体或配体受体与用含有海藻糖和十二烷基硫酸钠(SDS)的PBS缓冲液溶解，制得喷涂液一，将喷涂液一喷涂在距检测垫左端12mm处形成检测线T线；
质控线C线的包被：将与待测物无关的抗原抗体或配体受体用含有海藻糖和SDS的磷酸缓冲液溶解，制得喷涂液二，将喷涂液二喷涂在距检测垫左端18mm处形成检测线T线；
将喷涂好的检测垫干燥保存备用；
(Ⅳ)试纸条的组装
在聚氯乙烯(PVC)底板上依次搭接处理过的加样垫、喷有彩色-荧光双功能微球标记物探针的标记物结合垫、喷涂有检测线T线和质控线C线的检测垫以及吸水垫，组装完毕后剪切成4mm宽的试纸条即可。
优选的，步骤(Ⅱ)中所述彩色-荧光双功能微球标记物探针具体制备方法如下：
(b)彩色-荧光双功能微球的制备：在去离子水中加入二氯甲烷或四氢呋喃和步骤(a)制备完成的微球，得微球溶液，将溶于二氯甲烷或四氢呋喃的荧光标记物和脂溶性彩色颜料逐滴加入微球溶液中并密封搅拌均匀，然后解除密封并去除二氯甲烷或四氢呋喃，最后离心处理，得到彩色-荧光双功能微球，备用；
(c)待测物抗体彩色-荧光双功能微球标记物的制备：用缓冲液稀释步骤(b)制备完成的彩色-荧光双功能微球，加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，于摇床上活化后，离心处理，去除上清液，加入缓冲液对沉淀复溶，然后加入与待测物相关的抗原抗体或配体受体，于摇床上偶联，然后加入乙醇胺和牛血清白蛋白，密封过夜，最后离心处理，去除上清液，再用缓冲液对沉淀复溶，超声处理，制得待测物抗体彩色-荧光微球标记物；
(d)兔、鼠或其他与待测物抗原抗体无交叉反应的抗原抗体彩色-荧光微球标记物的制备：用缓冲液稀释彩色-荧光双功能微球，加入碳二亚胺和兔、鼠或其他与待测物抗原抗体无交叉反应的抗原抗体，于摇床上偶联，然后加入乙醇胺和牛血清白蛋白，密封过夜，最后离心处理，去除上清液，再用缓冲液复溶，超声处理，制得兔、鼠或其他与待测物抗原抗体无交叉反应的抗原抗体彩色-荧光微球标记物；
(e)彩色-荧光双功能微球标记物探针的制备：待测物抗体彩色-荧光微球标记物与兔、鼠或其他与待测物抗原抗体无交叉反应的抗原抗体彩色-荧光微球标记物按一定比例混合，喷于结合垫上制得彩色-荧光双功能微球标记物探针。
采用上述彩色-荧光双功能免疫层析试纸条，本发明具有以下优点：
本发明制备的彩色-荧光双功能免疫层析试纸条既可以通过肉眼对检测结果进行阴阳性初步定性判断，在不需要专业检测仪器时，对样品中待测物的含量作出定性判断，检测灵敏度高，可以定性检测ng/ml级别以下的待测物；又可通过仪器对结果进行定量分析，获得准确的浓度数据，且检测灵敏度比现有的胶体金或彩色乳胶标记的试纸条要高2-3个数量级，检测精度高，满足了不同检测项目、环境、目的、灵敏度要求情况下多样的检测需求。
附图说明
图1为本发明的彩色-荧光双功能免疫层析试纸条的结构示意图。
其中：1、底板，2、加样垫，3、标记物结合垫，4、检测垫，41、检测线T线，42、质控线C线，5、吸水垫。
具体实施方式
一种彩色-荧光双功能免疫层析试纸条，包括底板1，底板1的一面上顺序设有添加待测样品的加样垫2、标记物结合垫3、设有检测线T线41和质控线C线42的检测垫4和提供毛细管虹吸动力的吸水垫5，相邻各垫依次搭接，标记物结合垫3上涂覆有彩色-荧光双功能微球标记物探针。
彩色-荧光双功能微球标记物探针含有待测物抗体彩色-荧光双功能微球标记物和兔、鼠或其他与待测物抗原抗体无交叉反应的抗原抗体彩色-荧光双功能微球标记物，待测物抗体彩色-荧光双功能微球标记物由与待测物相关的抗原抗体或配体受体和彩色-荧光双功能微球结合制备而成，兔、鼠或其他与待测物抗原抗体无交叉反应抗原抗体彩色-荧光双功能微球标记物由兔、鼠或其他与待测物抗原抗体无交叉反应的抗原抗体和彩色-荧光双功能微球结合制备而成。
检测线T线41包被有与待测物相关的抗原抗体或配体受体，质控线C线42包被有与待测物无关的抗原抗体或配体受体。
待检测物可以是生物毒素及其代谢物、小分子化学物质及大分子蛋白、核酸等，均可使用本发明的试纸条检测。以下具体实施例中以黄曲霉毒素M1和氯霉素为例，示意性说明本发明的试纸条具有彩色-荧光双功能。检测其他物质时，与实施例中操作类似，做简单替换即可。
所述生物毒素为黄曲霉毒素M1时，彩色-荧光双功能微球标记物探针含有黄曲霉毒素M1抗体彩色-荧光双功能微球标记物和兔IgG彩色-荧光微球标记物。检测线T线41包被有黄曲霉毒素M1-牛血清白蛋白偶联物，质控线C线42包被有羊抗兔多克隆抗体。
所述小分子化学物质为氯霉素时，彩色-荧光双功能微球标记物探针含有氯霉素抗体彩色-荧光双功能微球标记物和鸡IgG彩色-荧光微球标记物。检测线T线41包被有氯霉素-牛血清白蛋白偶联物，质控线C线42包被有羊抗鸡多克隆抗体。
所述彩色-荧光双功能微球的粒径为50-1000nm，彩色-荧光双功能微球的材质为聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚乙烯吡啶微球、聚乙基丙烯酸甲酯微球、脂质微球和二氧化硅微球中的一种，所述彩色-荧光双功能微球表面带有羧基、氨基、醛基、溴乙酰基、碘乙酰基、硫醇基和环氧基中的一种或多种或不带基团。
所述彩色-荧光双功能微球的颜色为红色、蓝色、绿色、紫色和黑色中的一种肉眼可见的深色；荧光是稀土螯合物荧光、量子点荧光和普通荧光中的一种；颜色发射的波长和荧光物质发射的波长差大于等于30nm。
加样垫2为具有过滤作用的材质，加样垫2的材质为玻璃纤维、聚酯膜、海绵、滤纸或经过添加有表面活性剂、糖类、蛋白类、高分子多聚物、盐类中的一种或多种的磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液浸泡预处理后的玻璃纤维、聚酯膜、海绵、滤纸；
标记物结合垫3的材质为玻璃纤维、聚酯膜或经过添加有表面活性剂、糖类、蛋白类、高分子多聚物、盐类中的一种或多种的磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液浸泡预处理后的玻璃纤维或聚酯膜；
检测垫4为具有强疏水特性的多孔材料，检测垫4的材质为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜，T线和C线至少为一条。
一种彩色-荧光双功能免疫层析试纸条的制备方法包括以下步骤：
(Ⅰ)加样垫2的制备
用含有EDTA、tween-20、PVP和BSA的PBS缓冲液浸泡玻璃纤维、聚酯膜、海绵或滤纸，然后置于烘箱中烘干，密封干燥保存备用；
(Ⅱ)标记物结合垫3的制备
用含有海藻糖、牛血清白蛋白、tween-20和PVP的PBS缓冲液浸泡玻璃纤维或聚酯膜，然后置于烘箱中烘干，再将彩色-荧光双功能微球标记物探针喷涂于处理烘干后的玻璃纤维或聚酯膜上，再次置于烘箱中烘干，密封干燥保存备用。
上述彩色-荧光双功能微球标记物探针具体制备方法如下：
(a)微球的制备：取聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯吡啶、聚乙基丙烯酸甲酯、脂质和二氧化硅中的一种溶于十二烷基磺酸钠的去离子水中搅拌均匀，对其进行去除空气密封并加热，解除密封后加入过硫酸钾搅拌，然后对搅拌液过滤，对收集的滤液离心纯化，得到微球，备用；
(b)彩色-荧光双功能微球的制备：在去离子水中加入二氯甲烷或四氢呋喃和步骤(a)制备完成的微球，得微球溶液，将溶于二氯甲烷或四氢呋喃的荧光标记物和脂溶性彩色颜料逐滴加入微球溶液中并密封搅拌均匀，然后解除密封并去除二氯甲烷或四氢呋喃，最后离心处理，得到彩色-荧光双功能微球，备用；
(c)待测物抗体彩色-荧光双功能微球标记物的制备：用缓冲液稀释步骤(b)制备完成的彩色-荧光双功能微球，加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，于摇床上活化后，离心处理，去除上清液，加入缓冲液对沉淀复溶，然后加入与待测物相关的抗原抗体或配体受体，于摇床上偶联，然后加入乙醇胺和牛血清白蛋白，密封过夜，最后离心处理，去除上清液，再用缓冲液对沉淀复溶，超声处理，制得待测物抗体彩色-荧光双功能微球标记物；
(d)兔、鼠或其他与待测物抗原抗体无交叉反应的抗原抗体彩色-荧光双功能微球标记物的制备：用缓冲液稀释彩色-荧光双功能微球，加入碳二亚胺和兔、鼠或其他与待测物抗原抗体无交叉反应的抗原抗体，于摇床上偶联，然后加入乙醇胺和牛血清白蛋白，密封过夜，最后离心处理，去除上清液，再用缓冲液复溶，超声处理，制得兔、鼠或其他与待测物抗原抗体无交叉反应的抗原抗体彩色-荧光双功能微球标记物彩色-荧光微球标记物；
(e)彩色-荧光双功能微球标记物探针的制备：待测物抗体彩色-荧光双功能微球标记物与兔、鼠或其他与待测物抗原抗体无交叉反应的抗原抗体彩色-荧光微球标记物混合并喷于结合垫上，制得彩色-荧光双功能微球标记物探针。
(Ⅲ)检测垫4的制备
检测线T线41的包被：将与待测物相关的抗原抗体或配体受体用含有海藻糖和SDS的PBS缓冲液溶解，制得喷涂液一，将喷涂液一喷涂在距检测垫4左端12mm处形成检测线T线41；
质控线C线42的包被：将与待测物无关的抗原的抗体或配体受体用含有海藻糖和SDS的磷酸缓冲液溶解，制得喷涂液二，将喷涂液二喷涂在距检测垫4左端18mm处形成质控线C线42；
将喷涂好的检测垫4干燥保存备用；
(Ⅳ)试纸条的组装
在PVC底板1上依次搭接处理过的加样垫2、喷有彩色-荧光双功能微球标记物探针的标记物结合垫3、喷涂有检测线T线41和质控线C线42的检测垫4以及吸水垫5，组装完毕后剪切成4mm宽的试纸条即可。
具体实施例
实施例1
黄曲霉毒素M1蓝色-时间分辨荧光双功能免疫层析试纸条
一、试纸条的制备方法
(a)微球的制备
取8mmol的苯乙烯单体和0.8mmol的丙烯酸单体溶解于10ml含0.3mmol的十二烷基磺酸钠的去离子水中，将混合液加入圆底烧瓶中，用磁力搅拌子搅拌均匀。然后用高纯氮气将圆底烧瓶中空气除尽，密封加热至70℃，加入0.3ml0.2mmol的过硫酸钾，密封隔氧搅拌反应8h后，降至室温。然后将反应液用孔径为8μm的滤纸过滤，收集滤液离心纯化，离心条件为50000g10℃恒温离心15min，去除上清液，用5ml去离子水复溶沉淀，反复洗涤三遍，最后加入浓度为0.05％的十二烷基磺酸钠和浓度为0.05％的叠氮化钠于4℃保存。通过调节加入丙烯酸的单体的量即可得到微球表面不同的羧基密度；通过调节十二烷基磺酸钠和过硫酸钾的量，即可制备不同粒径的微球。
(b)蓝色-时间分辨荧光双功能微球的制备
取1ml固含量为10％的上述制备完成的微球，加入9ml去离子水中，再加入3ml二氯甲烷，置于37℃恒温环境中，磁力搅拌30min，得预处理微球溶液。取10mg铕螯合物(Eu:β-NTA:TOPO＝1：3：3)和5mg分散蓝2BLN，溶解于1ml二氯甲烷中，然后将上述溶液逐滴加入预处理微球溶液中，密封，37℃恒温磁力搅拌5h。然后打开密封盖子，使溶液体系中的二氯甲烷在37℃条件下挥发干净。将溶液转入离心管中，离心洗涤三次，离心条件为：50000g10℃恒温离心15min。去上清，前两次离心得的沉淀用50％的乙醇复溶，最后一次离心得的沉淀用10mlpH8.0的0.05M硼酸缓冲液复溶，再加入浓度为0.05％的十二烷基磺酸钠和浓度为0.05％的叠氮化钠4℃保存。
(c)黄曲霉毒素M1抗体蓝色-时间分辨荧光微球标记物的制备
取固含量为1％的上述蓝色-时间分辨荧光双功能微球100μL稀释于浓度为0.05mol/L、pH8.0的400μL硼酸缓冲液中，加入30μL浓度为10mg/mL的碳二亚胺(EDC)(购自上海晶纯生化科技股份有限公司)和60μL浓度为10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(购自上海晶纯生化科技股份有限公司)，将上述混合液室温条件下置于旋转摇床上在50转/分钟条件下活化15min，然后40000g离心10min，去除上清液，用0.05mol/L、pH8.0的硼酸缓冲液复溶沉淀，然后80W超声处理30S，加入25μg黄曲霉毒素M1鼠单抗(购自上海飞测生物科技有限公司)，室温置于旋转摇床上50转/分钟偶联2小时，加入50mmol/L的乙醇胺(购自上海晶纯生化科技股份有限公司)、10％的BSA(购自上海西宝生物科技有限公司)溶液50μL封闭过夜。最后40000g离心10min，用0.05mol/L、pH8.0的硼酸缓冲液复溶沉淀，反复洗涤2～3次，然后80W超声处理30S，置于4～8℃冰箱中保存备用。
(d)兔IgG蓝色-时间分辨荧光微球标记物的制备
取固含量为1％的上述蓝色-时间分辨荧光双功能微球100μL稀释于0.05mol/L、pH8.0的400μL硼酸缓冲液中，加入30μL10mg/mL的碳二亚胺(EDC)(购自上海晶纯生化科技股份有限公司)，再加入100μg兔IgG(购自长沙博优生物科技有限公司)，将上述混合液室温条件下置于旋转摇床上50转/分钟偶联2小时，加入50mmol/L的乙醇胺(购自上海晶纯生化科技股份有限公司)、10％的BSA(购自上海西宝生物科技有限公司)溶液50μL封闭过夜。最后40000g离心10分钟，用0.05mol/LpH8.0的硼酸缓冲液复溶沉淀，反复洗涤2～3次，然后80W超声处理30S，置于4～8℃冰箱中保存备用。
(e)试纸条的制备
(Ⅰ)加样垫2的制备
用含有10mmol/L的EDTA、1％(v/v)的tween-20、0.5％(m/v)的PVP、0.5％(m/v)的BSA的PBS缓冲液(0.2mol/L，pH8.0)浸泡玻璃纤维素膜加样垫，然后置于37℃烘箱中烘烤2小时至完全干燥，置于密封干燥包装袋中保存备用。
(Ⅱ)标记物结合垫3的制备
首先用含有2.5％(m/v)的海藻糖、1％(m/v)的牛血清白蛋白、1％(v/v)的tween-20、0.5％(m/v)的PVP的0.1mol/LpH7.4的磷酸缓冲液浸泡结合垫Fusion5(购自GE公司)，然后置于37℃烘箱中烘干2小时。再将上述制备完成的黄曲霉毒素M1抗体蓝色-时间分辨荧光微球标记物和兔IgG蓝色-时间分辨荧光微球标记物用0.1mol/L、pH7.4的磷酸缓冲液分别稀释500倍和1200倍后混合制成黄曲霉毒素M1抗体蓝色-荧光双功能微球标记物探针，将上述探针用喷金仪喷于处理烘干后的Fusion5上，置于37℃烘箱中烘干2小时后，置于密封干燥包装袋中保存备用。
(Ⅲ)检测垫4的制备
检测线T线41的包被
将黄曲霉毒素M1与牛血清白蛋白偶联物(购自上海飞测生物科技有限公司)用含有1.5％(m/v)的海藻糖和0.05％(v/v)的SDS的浓度为0.01mol/L、pH7.4的磷酸缓冲液溶解至终浓度为0.025mg/mL，将上述混合液用喷膜机喷涂在距硝酸纤维素膜左端12mm处形成检测线T线41。
质控线C线42的包被
将羊抗兔IgG单克隆抗体用含有1.5％(m/v)的海藻糖和0.05％(v/v)的SDS的浓度为0.01mol/L、pH7.4的磷酸缓冲液溶解至终浓度1.0mg/mL，将上述混合液用喷膜机喷涂在距硝酸纤维素膜左端18mm处形成质控线C线42。将喷涂好的硝酸纤维素膜在37℃条件下烘干2小时，置于室温干燥环境中保存备用。
(Ⅳ)试纸条的组装
如图1所示，所述彩色-荧光双功能免疫层析试纸条包括底板1，底板1的一面上顺序设有添加待测样品的加样垫2、标记物结合垫3、设有检测线T线41和质控线C线42的检测垫4和提供毛细管虹吸动力的吸水垫5，相邻各垫在PVC背衬上依次搭接并粘贴。
将本实施例处理过的加样垫2、喷有黄曲霉毒素M1抗体蓝色-荧光双功能微球标记物探针的标记物结合垫3、喷涂有检测线T线41和质控线C线42的检测垫4以及吸水垫5组装完毕后剪切成4mm宽的试纸条，装入塑料卡壳中，然后装入内置有干燥剂的铝箔袋中，室温干燥保存即可，保质期可达两年以上。
若将上述试纸条固定于具有加样孔和检测窗口的塑料卡壳中，则制成检测卡。
二、荧光定量标准曲线的确定
将黄曲霉毒素M1标准品用生乳稀释到0ng/mL、0.025ng/mL、0.075ng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、2.7ng/mL、8.1ng/mL，按照标准操作流程每种毒素每个浓度检测10次，然后将所测得的数值输入Microdetection食品安全管理软件(南京微测生物科技有限公司)中，即可获得标准曲线的各个参数，然后将标准曲线的参数、产品批号等信息录入IC卡中即可。
三、待测样品检测
1.检测方法
将制备完成的黄曲霉毒素M1蓝色-荧光双功能免疫层析试纸条平放于桌面上，取100μL待测奶样(20-30℃)，滴加至试纸条的加样垫2处，计时5分钟，观察检测结果。
2.结果判定
①肉眼判读
当检测试纸条的T线肉眼不可见，C线肉眼可见时，说明奶样中黄曲霉毒素M1的浓度高于0.3ng/ml；当检测试纸条的T线肉眼可见，C线肉眼可见时，说明奶样中黄曲霉毒素M1的浓度低于0.3ng/ml；当C先肉眼不可见，不管T线是否肉眼可见，均判为无效，需重新检测。
②荧光读数仪判读
将检测试纸条***荧光读数仪中，按读数键即可进行读数和自动计算，黄曲霉毒素M1的浓度可通过液晶屏显示，也可通过读数仪自带的热敏打印机现场打印，还可通过仪器上GPRS和WIFI无线通信模块将检测数据实时发送到云端数据管理平台，实现对检测结果的实时监控。
3.试纸条检测结果准确性判定
向经高效液相色谱质谱联用仪检测黄曲霉毒素M1含量为0的鲜牛奶中添加黄曲霉毒素M1标准品溶液，使其浓度分别达到0ng/mL、0.025ng/mL、0.075ng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、2.7ng/mL，8.1ng/mL，分别检测本实施例制备完成的试纸条的准确性。重复以上检测实验10次，取仪器判读结果的平均值。
检测实验结果如下表1所示。
表1检测试验结果1
测试结果表明：本实施例制备完成的蓝色-荧光微球双功能检测试纸条在使用时，既可肉眼判断奶样中黄曲霉毒素M1的量是否超过0.3ng/ml，进行初步定性判读，得知奶样是否为合格牛奶；也可通过荧光读数仪获得准确的定量检测结果，很好的满足了多样的检测需求。
实施例2
氯霉素红色-罗丹明荧光双功能免疫层析试纸条
一、试纸条的制备方法
(a)微球的合成
取8mmol的苯乙烯单体0.8mmol的丙烯酸单体溶解于10ml含0.3mmol的十二烷基磺酸钠的去离子水中，将混合液加入圆底烧瓶中，用磁力搅拌子搅拌均匀。然后用高纯氮气将圆底烧瓶中空气除尽，密封加热至70℃，加入0.3ml0.2mmol的过硫酸钾，密封隔氧搅拌反应8h后，降至室温。然后将反应液用孔径为8μm的滤纸过滤，收集滤液离心纯化，离心条件为50000g10℃恒温离心15min，去除上清液，用5ml去离子水复溶沉淀，反复洗涤三遍，最后加入浓度为0.05％的十二烷基磺酸钠和浓度为0.05％的叠氮化钠于4℃保存。通过调节加入丙烯酸的单体的量即可得到微球表面不同的羧基密度；通过调节十二烷基磺酸钠和过硫酸钾的量，即可制备不同粒径的微球。
(b)红色-罗丹明荧光双功能微球的制备
取1ml固含量为10％的上述制备完成的微球，加入9ml去离子水中，再加入3.5ml四氢呋喃，置于室温环境中，磁力搅拌30min，得预处理微球溶液。取3mg罗丹明B和5mg分散红SER，溶于2ml四氢呋喃中，然后将上述溶液逐滴加入预处理微球溶液中，磁力搅拌条件下室温保持5h。然后打开密封盖子，旋转真空条件下使溶液体系中的四氢呋喃挥发干净。将溶液转入离心管中，离心洗涤三次，离心条件为：50000g10℃恒温离心15min。去上清，前两次离心得的沉淀用50％的乙醇复溶，最后一次离心得的沉淀用10mlpH8.0的0.05M硼酸缓冲液复溶，再加入浓度为0.05％的十二烷基磺酸钠和浓度为0.05％的叠氮化钠4℃保存。
(c)氯霉素抗体红色-罗丹明荧光微球标记物的制备
取固含量为1％的上述红色-罗丹明荧光双功能微球100μL稀释于浓度为0.05mol/L、pH8.0的400μL硼酸缓冲液中，加入30μL浓度为10mg/mL的碳二亚胺(EDC)(购自上海晶纯生化科技股份有限公司)和60μL浓度为10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(购自上海晶纯生化科技股份有限公司)，将上述混合液室温条件下置于旋转摇床上在50转/分钟条件下活化15min，然后40000g离心10min，去除上清液，用0.05mol/L、pH8.0的硼酸缓冲液复溶沉淀，然后80W超声处理30S，加入20μg氯霉素鼠单抗(购自上海飞测生物科技有限公司)，室温置于旋转摇床上50转/分钟偶联2小时，加入50mmol/L的乙醇胺(购自上海晶纯生化科技股份有限公司)、10％的BSA(购自上海西宝生物科技有限公司)溶液50μL封闭过夜。最后40000g离心10min，用0.05mol/L、pH8.0的硼酸缓冲液复溶沉淀，反复洗涤2～3次，然后80W超声处理30S，置于4～8℃冰箱中保存备用。
(d)兔IgG红色-罗丹明荧光微球标记物的制备
取固含量为1％的上述红色-罗丹明荧光双功能微球100μL稀释于0.05mol/L、pH8.0的400μL硼酸缓冲液中，加入30μL10mg/mL的碳二亚胺(EDC)(购自上海晶纯生化科技股份有限公司)，再加入100μg兔IgG(购自长沙博优生物科技有限公司)，将上述混合液室温条件下置于旋转摇床上50转/分钟偶联2小时，加入50mmol/L的乙醇胺(购自上海晶纯生化科技股份有限公司)、10％的BSA(购自上海西宝生物科技有限公司)溶液50μL封闭过夜。最后40000g离心10分钟，用0.05mol/LpH8.0的硼酸缓冲液复溶沉淀，反复洗涤2～3次，然后80W超声处理30S，置于4～8℃冰箱中保存备用。
(e)试纸条的制备
(Ⅰ)加样垫2的制备
用含有10mmol/L的EDTA、1％(v/v)的tween-20、0.5％(m/v)的PVP、0.5％(m/v)的BSA的PBS缓冲液(0.2mol/L，pH8.0)浸泡玻璃纤维素膜加样垫，然后置于37℃烘箱中烘烤2小时至完全干燥，置于密封干燥包装袋中保存备用。
(Ⅱ)标记物结合垫3的制备
首先用含有2.5％(m/v)的海藻糖、1％(m/v)的牛血清白蛋白、1％(v/v)的tween-20、0.5％(m/v)的PVP的0.1mol/LpH7.4的磷酸缓冲液浸泡结合垫Fusion5(购自GE公司)，然后置于37℃烘箱中烘干2小时。再将上述制备完成的氯霉素抗体红色-罗丹明荧光微球标记物和兔IgG红色-罗丹明荧光微球标记物用0.1mol/L、pH7.4的磷酸缓冲液分别稀释400倍和1000倍后混合成氯霉素抗体红色-罗丹明荧光双功能微球标记物探针，将上述探针用喷金仪喷于处理烘干后的Fusion5上，置于37℃烘箱中烘干2小时后，置于密封干燥包装袋中保存备用。
(Ⅲ)检测垫4的制备
检测线T线41的包被
将氯霉素与牛血清白蛋白偶联物(购自上海飞测生物科技有限公司)用含有1.5％(m/v)的海藻糖和0.05％(v/v)SDS的浓度为0.01mol/L、pH7.4的磷酸缓冲液溶解至终浓度为0.025mg/mL，将上述混合液用喷膜机喷涂在距硝酸纤维素膜左端12mm处形成检测线T线41。
质控线C线42的包被
将羊抗兔IgG单克隆抗体用含有1.5％(m/v)的海藻糖和0.05％(v/v)的SDS的浓度为0.01mol/L、pH7.4的磷酸缓冲液溶解至终浓度1.0mg/mL，将上述混合液用喷膜机喷涂在距硝酸纤维素膜左端18mm处形成质控线C线42。将喷涂好的硝酸纤维素膜在37℃条件下烘干2小时，置于室温干燥环境中保存备用。
(Ⅳ)试纸条的组装
如图1所示，所述彩色-荧光双功能免疫层析试纸条包括底板1，底板1的一面上顺序设有添加待测样品的加样垫2、标记物结合垫3、设有检测线T线41和质控线C线42的检测垫4和提供毛细管虹吸动力的吸水垫5，相邻各垫在PVC背衬上依次搭接并粘贴。
将本实施例处理过的加样垫2、喷有氯霉素抗体红色-罗丹明荧光双功能微球标记物探针的标记物结合垫3、喷涂有检测线T线41和质控线C线42的检测垫4以及吸水垫5组装完毕后剪切成4mm宽的试纸条，装入塑料卡壳中，然后装入内置有干燥剂的铝箔袋中，室温干燥保存即可，保质期可达两年以上。
若将上述试纸条固定于具有加样孔和检测窗口的塑料卡壳中，则制成检测卡。
二、荧光定量标准曲线的确定
将氯霉素标准品用生乳稀释到0ng/mL、0.025ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.3ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL，按照标准操作流程每种毒素每个浓度检测10次，然后将所测得的数值输入Microdetection食品安全管理软件(南京微测生物科技有限公司)中，即可获得标准曲线的各个参数，然后将标准曲线的参数、产品批号等信息录入IC卡中即可。
三、待测样品检测
1.检测方法
将制备完成的氯霉素红色-罗丹明荧光双功能免疫层析试纸条平放于桌面上，取100μL待测奶样(20-30℃)，滴加至试纸条的加样垫2处，计时5分钟，观察检测结果。
2.结果判定
①肉眼判读
当检测试纸条的T线肉眼不可见，C线肉眼可见时，说明奶样中氯霉素的浓度高于0.1ng/ml；当检测试纸条的T线肉眼可见，C线肉眼可见时，说明奶样中氯霉素的浓度低于0.1ng/ml；当C先肉眼不可见，不管T线是否肉眼可见，均判为无效，需重新检测。
②荧光读数仪判读
将检测试纸条***荧光读数仪中，按读数键即可进行读数和自动计算，氯霉素的浓度可通过液晶屏显示，也可通过读数仪自带的热敏打印机现场打印，还可通过仪器上GPRS和WIFI无线通信模块将检测数据实时发送到云端数据管理平台，实现对检测结果的实时监控。
3.试纸条检测结果准确性判定
向经高效液相色谱质谱联用仪检测氯霉素含量为0的鲜牛奶中添加氯霉素标准品溶液，使其浓度分别达到0ng/mL、0.025ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.3ng/mL、0.5ng/mL，1.0ng/mL，分别检测本实施例制备完成的试纸条的准确性，重复以上检测实验10次，取仪器判读结果的平均值。
检测实验结果如下表2所示。
表2检测试验结果2
本实施例制备完成的红色-罗丹明荧光微球双功能检测试纸条在使用时，既可肉眼判断奶样中氯霉素的量是否超过0.1ng/ml，进行初步定性判断，得知奶样是否为合格牛奶；也可通过荧光读数仪获得准确的定量检测结果，很好的满足了多样的检测需求。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种彩色-荧光双功能免疫层析试纸条，其特征在于：包括底板(1)，底板(1)的一面上顺序设有添加待测样品的加样垫(2)、标记物结合垫(3)、设有检测线T线(41)和质控线C线(42)的检测垫(4)和提供毛细管虹吸动力的吸水垫(5)，相邻各垫依次搭接，标记物结合垫(3)上涂覆有彩色-荧光双功能微球标记物探针。
2.根据权利要求1所述的彩色-荧光双功能免疫层析试纸条，其特征在于：彩色-荧光双功能微球标记物探针含有待测物抗体彩色-荧光双功能微球标记物和兔、鼠或其他与待测物抗原抗体无交叉反应的IgG彩色-荧光双功能微球标记物，待测物抗体彩色-荧光微球标记物由与待测物相关的抗原抗体或配体受体和彩色-荧光双功能微球结合制备而成，兔、鼠或其他与待测物抗原抗体无交叉反应的IgG彩色-荧光微球标记物由兔、鼠或其他与待测物抗原抗体无交叉反应的IgG和彩色-荧光双功能微球结合制备而成。
3.根据权利要求2所述的彩色-荧光双功能免疫层析试纸条，其特征在于：检测线T线(41)包被有与待测物相关的抗原的抗体或配体受体，质控线C线(42)包被有与待测物相关的抗原的抗体或配体受体或包被有与待测物无关的抗原的抗体或配体受体。
4.根据权利要求2所述的彩色-荧光双功能免疫层析试纸条，其特征在于：所述彩色-荧光双功能微球的粒径为50-1000nm，彩色-荧光双功能微球的材质为聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚乙烯吡啶微球、聚乙基丙烯酸甲酯微球、脂质微球和二氧化硅微球中的一种，所述彩色-荧光双功能微球表面带有羧基、氨基、醛基、溴乙酰基、碘乙酰基、硫醇基和环氧基中的一种或多种或不带基团。
5.根据权利要求2-4任一项所述的彩色-荧光双功能免疫层析试纸条，其特征在于：所述彩色-荧光双功能微球的颜色为红色、蓝色、绿色、紫色和黑色中的一种肉眼可见的深色；荧光是稀土螯合物荧光、量子点荧光和普通荧光中的一种；颜色发射的波长和荧光物质发射的波长差大于等于30nm。
6.根据权利要求5所述的彩色-荧光双功能免疫层析试纸条，其特征在于：加样垫(2)为具有过滤作用的材质，加样垫(2)的材质为玻璃纤维、聚酯膜、海绵、滤纸或经过添加有表面活性剂、糖类、蛋白类、高分子多聚物、盐类中的一种或多种的磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液浸泡预处理后的玻璃纤维、聚酯膜、海绵、滤纸；
标记物结合垫(3)的材质为玻璃纤维、聚酯膜或经过添加有表面活性剂、糖类、蛋白类、高分子多聚物、盐类中的一种或多种的磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液浸泡预处理后的玻璃纤维或聚酯膜；
检测垫(4)为具有强疏水特性的多孔材料，检测垫(4)的材质为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜，检测线T线(41)和质控线C线(42)至少为一条。
7.一种权利要求6的彩色-荧光双功能免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(Ⅰ)加样垫(2)的制备
用含有EDTA、tween-20、PVP和BSA的PBS缓冲液浸泡玻璃纤维、聚酯膜、海绵或滤纸，然后置于烘箱中烘干，密封干燥保存备用；
(Ⅱ)标记物结合垫(3)的制备
用含有海藻糖、牛血清白蛋白、tween-20和PVP的PBS缓冲液浸泡玻璃纤维或聚酯膜，然后置于烘箱中烘干，再将彩色-荧光双功能微球标记物探针喷涂于处理烘干后的玻璃纤维或聚酯膜上，再次置于烘箱中烘干，密封干燥保存备用；
(Ⅲ)检测垫(4)的制备
检测线T线(41)的包被：将与待测物相关的抗原抗体或配体受体用含有海藻糖和SDS的PBS缓冲液溶解，制得喷涂液一，将喷涂液一喷涂在距检测垫(4)左端12mm处形成检测线T线(41)；
质控线C线(42)的包被：将与待测物无关的抗原抗体或配体受体用含有海藻糖和SDS的磷酸缓冲液溶解，制得喷涂液二，将喷涂液二喷涂在距检测垫(4)左端18mm处形成质控线C线(42)；
将喷涂好的检测垫(4)干燥保存备用；
(Ⅳ)试纸条的组装
在PVC底板(1)上依次搭接处理过的加样垫(2)、喷有彩色-荧光双功能微球标记物探针的标记物结合垫(3)、喷涂有检测线T线(41)和质控线C线(42)的检测垫(4)以及吸水垫(5)，组装完毕后剪切成4mm宽的试纸条即可。
8.根据权利要求7所述的彩色-荧光双功能免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：步骤(Ⅱ)中所述彩色-荧光双功能微球标记物探针具体制备方法如下：
(a)微球的制备：采用微乳聚合法制备粒径为50-1000nm的聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚乙烯吡啶微球、聚乙基丙烯酸甲酯微球、脂质微球和二氧化硅微球中的一种，所述微球表面带有羧基、氨基、醛基、溴乙酰基、碘乙酰基、硫醇基和环氧基中的一种或多种或不带基团；
(b)彩色-荧光双功能微球的制备：在去离子水中加入二氯甲烷或四氢呋喃和步骤(a)制备完成的微球，得微球溶液，将溶于二氯甲烷或四氢呋喃的荧光标记物和脂溶性彩色颜料逐滴加入微球溶液中并密封搅拌均匀，然后解除密封并去除二氯甲烷或四氢呋喃，最后离心处理，得到彩色-荧光双功能微球，备用；
(c)待测物抗体彩色-荧光双功能微球标记物的制备：用缓冲液稀释步骤(b)制备完成的彩色-荧光双功能微球，加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，于摇床上活化后，离心处理，去除上清液，加入缓冲液对沉淀复溶，然后加入与待测物相关的抗原抗体或配体受体，于摇床上偶联，然后加入乙醇胺和牛血清白蛋白，密封过夜，最后离心处理，去除上清液，再用缓冲液对沉淀复溶，超声处理，制得待测物抗体彩色-荧光微球标记物；
(d)兔、鼠或其他与待测物抗原抗体无交叉反应的抗原抗体彩色-荧光微球标记物的制备：用缓冲液稀释彩色-荧光双功能微球，加入碳二亚胺和兔、鼠或其他与待测物抗原抗体无交叉反应的抗原抗体，于摇床上偶联，然后加入乙醇胺和牛血清白蛋白，密封过夜，最后离心处理，去除上清液，再用缓冲液复溶，超声处理，制得兔、鼠或其他与待测物抗原抗体无交叉反应的抗原抗体彩色-荧光微球标记物；
(e)彩色-荧光双功能微球标记物探针的制备：待测物抗体彩色-荧光微球标记物与兔、鼠或其他与待测物抗原抗体无交叉反应的抗原抗体彩色-荧光微球标记物按一定比例混合，喷于结合垫上制得彩色-荧光双功能微球标记物探针。
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