CN109022311B

CN109022311B - 一株粪产碱菌bc13及其在防治作物细菌性病害中的应用

Info

Publication number: CN109022311B
Application number: CN201810846976.9A
Authority: CN
Inventors: 周佳暖; 陈霞; 李洁玲; 胡明; 薛洋; 张炼辉
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2018-07-27
Filing date: 2018-07-27
Publication date: 2020-12-11
Anticipated expiration: 2038-07-27
Also published as: CN109022311A

Abstract

本发明公开了一株粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）BC13及其在防治作物细菌性病害中的应用。所述粪产碱菌BC13菌株于2018年7月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No:60412。本发明所述菌株BC13对作物细菌性软腐病菌、青枯病菌、水稻白叶枯病菌和泛菌具有很好的抑制作用，可明显减轻作物细菌性软腐病的发生，并且在盆栽试验中效果较好，说明BC13菌株可用于开发针对作物细菌性病害的生物农药。同时该菌株对部分植物致病真菌也有有较好的抑菌作用，如水稻纹枯病菌、荔枝霜疫霉菌。

Description

一株粪产碱菌BC13及其在防治作物细菌性病害中的应用

技术领域

本发明涉及生物防治技术领域，具体地，涉及一株粪产碱菌BC13及其在防治作物细菌性病害中的应用。

背景技术

细菌性病害是由病原细菌侵染所致的植物病害，如软腐病、青枯病等，可引起严重的经济损失。

例如玉米狄克氏菌（Dickeya zeae），除侵染单子叶植物外，还可同时侵染双子叶植物，其寄主范围包括水稻、玉米、甘蔗、香蕉、臂形草、鸢尾、射干、萱草、狼尾草、菠萝、马铃薯、烟草、大白菜、胡萝卜、花生、凤仙花、菊花等植物。已报道的由玉米狄克氏菌引起的严重植物病害包括水稻细菌性基腐病和香蕉细菌性软腐病，其引起的病害有潜伏侵染的现象，造成作物的大量严重减产损失。

目前的防治方法主要有：（1）种植抗病品种：这是防治水稻、香蕉细菌性软腐病最经济有效的方法。有研究表明，大蕉、巴西蕉、皇帝蕉对香蕉细菌性软腐病有一定的抗性。然而，随着抗病品种种植时间的延长，病原菌可能会产生新的生理小种，从而使抗病品种变成感病品种。（2）使用化学药剂：目前防治细菌病害包括软腐病的药剂品种较少，主要有铜制剂、抗生素类杀菌剂等。然而，化学药剂对人畜有一定的毒性，还会引起病菌抗药性、水资源污染等问题。

因此，寻找合适的生物防治方法是防治细菌性病害的发展方向和有效途径。

发明内容

本发明针对现有作物细菌性病害防治技术的不足，提供了一株粪产碱菌BC13，该菌株对多种作物病原细菌具有较好的抑制作用，为使用微生物代替化学合成杀菌剂提供了新的途径，可作为生物农药进行开发利用。

本发明另一目的在于提供所述粪产碱菌BC13在防治作物细菌性病害和/或真菌性病害中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种防治作物细菌性病害的生物制剂。

本发明的另一目的在于提供一种防治作物细菌性病害的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的：

一株粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）BC13，所述菌株于2018年7月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏编号为GDMCC No:60412，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

菌株BC13为革兰氏阴性菌；BC13在LB培养基上菌落圆形，乳白色，边缘光滑整齐，中凹台状，不透明，产生过氧化氢酶，不产生淀粉酶，不水解明胶，不能利用半乳糖、甘露醇、果糖、海藻糖、葡萄糖和蔗糖，可利用不同的有机酸和氨基酸为碳源。

经研究发现，所述菌株BC13在含水稻细菌性基腐病菌EC1、香蕉细菌性软腐病菌MS2和MS3菌液的平板上能形成明显抑菌圈，并且在温室盆栽试验中没有影响水稻和粉蕉苗的生长，并且能有效抑制MS2对粉蕉苗的侵染。除此之外，发现BC13对青枯病菌、水稻白叶枯病菌、泛菌具有很好的抑菌效果，因此BC13菌株可被用于开发针对作物细菌性病害的生物农药。该菌株的发现，有利于减轻化学药剂滥用的问题，也为利用生物防治方法防治植物细菌性病害提供了资源。同时该菌对部分植物致病真菌也有较好的抑菌作用，如水稻纹枯病菌、荔枝霜疫霉菌。

因此，所述粪产碱菌BC13在防治作物细菌性病害和/或真菌性病害中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

优选地，所述作物细菌性病害包括由D.zeae、青枯病菌、水稻白叶枯病菌或泛菌引起的细菌性病害；所述真菌性病害包括由水稻纹枯病菌或荔枝霜疫霉菌引起的真菌性病害。

更优选地，所述的细菌性病害包括但不限于水稻细菌性基腐病、香蕉细菌性软腐病、君子兰细菌性软腐病、茄科作物青枯病、水稻白叶枯病、水稻软腐病或桃子腐烂病；所述真菌性病害包括但不限于水稻纹枯病、荔枝霜疫霉病。

本发明还请求保护一种防治作物细菌性病害的生物制剂，包含所述粪产碱菌BC13。

优选地，所述粪产碱菌BC13浓度为OD₆₀₀=1.0~1.5。

更优选地，所述粪产碱菌BC13浓度为OD₆₀₀ =1.3。

优选地，所述生物制剂由粪产碱菌BC13的菌液和/或发酵液制成。

本发明还请求保护一种防治作物细菌性病害的方法，采用所述粪产碱菌BC13或所述生物制剂处理土壤或植物材料即可。

优选地，所述处理为接种处理。

更优选地，所述接种处理为注射接种或刺伤接种。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一株粪产碱菌BC13，该菌株对多种病原细菌具有显著的抑制作用，尤其是对作物细菌性软腐病菌、青枯病菌、水稻白叶枯病菌和泛菌具有很好的抑制作用，可明显减轻作物细菌性软腐病的发生，并且在盆栽试验中防治效果较好。而且，菌株BC13本身无致病力，可用于开发针对作物细菌性病害的生物农药，用于生物防治作物细菌性病害。同时该菌对部分植物致病真菌也有较好的抑菌作用，如水稻纹枯病菌、荔枝霜疫霉菌。

附图说明

图1为菌株BC13 基于16S rDNA基因序列的聚类图。

图2为生防菌BC13对作物病原细菌的抑菌谱测定。

图3为生防菌BC13对作物病原真菌的抑菌谱测定。

图4为菌株BC13显著减轻大白菜、马铃薯和胡萝卜上细菌性软腐病症状的发生。

图5为菌株BC13显著减轻香蕉细菌性软腐病症状的发生。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1 假单胞菌BC13的分离和筛选

1、样本采集：在广西合浦曲樟乡亚山村委大岭下村白菜根围土壤，挖取土表5 cm以下土样装袋保存，带回实验室进行菌株分离。

2、菌株分离：土壤样本采用稀释涂布平板法进行菌株的分离。具体地，采得的土壤样品用手充分混匀后，称取4.0 g，用20 mL无菌水浸泡摇匀后于28℃、180 rpm摇床震荡培养20 min，进行梯度稀释。取稀释倍数为10⁵～10⁹的稀释液100 µL涂布于LB平板上，室温吹干后封口，倒置在28℃培养箱培养24 h。挑取LB平板上生长的单菌落，标号，置于含500µL液体LB的2 mL离心管中，于28℃、180 rpm摇床过夜震荡培养，待用。

3、菌株筛选：在LB平板上活化香蕉细菌性软腐病菌MS2，挑取单菌落于含15 mL LB培养液的50 mL离心管里，28℃、180 rpm摇床过夜震荡培养，待用。取已融化的15 mL固体LB培养基在10×10 cm的方形培养皿里倒板，吹干后，将15 mL浓度为1%的琼脂糖（先冷却到50～60℃后分别加入150 µL MS2菌液）倒在铺有LB的方形培养皿上，吹干。用直径为5 mm的打孔器打孔，灭菌牙签挑去培养基后，向孔内注入20 µL过夜培养的待测菌液，吹干，封口。把板正放在28℃培养箱里，培养16～18 h，观察是否有透明的抑菌圈。从而筛选获得一株生防菌株BC13。

实施例2 生防菌BC13的鉴定

1、形态和生理生化鉴定

菌株BC13为革兰氏阴性菌；BC13在LB培养基上菌落圆形，乳白色，边缘光滑整齐，中凹台状，不透明，产生过氧化氢酶，不产生淀粉酶，不水解明胶，不能利用半乳糖、甘露醇、果糖、海藻糖、葡萄糖和蔗糖作为碳源产酸，可利用不同的有机酸和氨基酸为碳源。

2、分子鉴定

为了明确实施例1获得的菌株BC13的分类地位，采用16S rDNA序列进行***发育树分析（Phylogenetic analysis）结合生理生化测定的方法鉴定BC13菌株。

16S rDNA序列分析是细菌鉴定的分子生物学鉴定手段，本发明通过分析16S rDNA序列，运用MEGA 6.0软件采用Neighbor-joining方法构建***发育树，分析了BC13的进化关系，结果表明：BC13的16S rDNA序列与Alcaligenes faecalis BDB4、P156、ZD02的同源性均达99.47%，与A. faecalis qz-13、DSM 30030、SeY03的同源性分别达99.40%、99.13%、98.93%，与A. aquatilis C_11、C_6、C_15的同源性分别达99.13%、99.07%、98.93%，与43个近缘菌株的16S rDNA序列进行***发育关系分析，发现BC13与A. faecalis的关系最近（图1）。

综合以上结果，鉴定菌株BC13属于粪产碱菌Alcaligenes faecalis。

实施例3 生防菌BC13抑菌谱的测定

1、为了能够更好地研究实施例1获得菌株BC13的生防潜力，对该菌的抑菌谱进行了测定。具体操作如下：

（1）探究BC13是否有抑制其他致病细菌生长的能力。使用与实施例1菌株筛选相同的方法，把致病菌MS2换成培养条件和方法相同的等量的水稻基腐病菌EC1、香蕉细菌性软腐病MS3、青枯病菌EP1（第一层15 mL的LB换成15 mL的TTC）、水稻白叶枯病菌Xoo、水稻软腐病菌Pantoea ananatis SC7、桃子腐烂病菌P. ananatis PP1，其余步骤不变。

（2）探究BC13是否有抑制致病真菌生长的能力。供测试的真菌包括辣椒炭疽菌、胶胞炭疽菌、香蕉枯萎病菌、水稻纹枯病菌、荔枝霜疫霉菌和甘蔗鞭黑粉菌。其中黑粉病菌使用平板对峙法。取20 mL的PDA于13×13的方形培养皿上倒板，待平板吹干后切成宽0.5 cm，长6 cm的长方形条，每块隔0.5 cm。取1 µL过夜培养的BC13菌液点于PDA条带的一端，3个一组，中间分别均匀点上黑粉菌“+”担孢子，“-”担孢子和两种担孢子等量混合的混合液。待菌液吹干后置于28℃培养箱倒置培养1～2天，观察黑粉菌的生长情况，待对照平板上形成白色绒毛状菌丝，记录试验结果。

其余真菌复苏后用0.5 cm打孔器打孔，把菌饼倒放在PDA板中央，在离菌饼相同距离的地方滴2 µL过夜培养的BC13，大肠杆菌DH5α菌液，待菌液吹干后，封口，正放在28℃培养箱里培养3～4天，观察菌丝的生长情况并记录实验结果。

2、实验结果发现，菌株BC13对水稻基腐病菌EC1、香蕉细菌性软腐病菌MS2和MS3、茄科青枯菌EP1、水稻白叶枯病菌Xoo、水稻软腐病菌SC7、桃腐烂病菌 PP1、水稻纹枯病菌、荔枝霜疫霉菌具有很强的抑菌作用（如图2、3），对辣椒炭疽菌、胶胞炭疽菌、香蕉枯萎病菌和黑粉病菌的抑菌效果都较弱（图3），说明BC13可用于开发专门针对作物细菌性病害的生防试剂。

实施例4 生防菌BC13对细菌性软腐病的防效测定

1、在LB固体平板上活化香蕉细菌性软腐病菌MS2、生防菌BC13菌株，挑单菌落于含有10 mL LB的50 mL离心管中，放在28℃、180 rpm摇床过夜培养，取1 mL OD₆₀₀约为1.3的BC13菌液与等量的MS2菌液混合。MS2菌液加入1 mL LB菌液混合作为正对照，LB培养基作为负对照。不同处理分别接种马铃薯、大白菜和粉蕉苗。每处理3个重复。挑选12株长势相似的粉蕉苗，用1 mL注射器分别取200 µL的LB、MS2+LB、BC13+LB、BC13+MS2混合液注射到粉蕉的假茎，每种处理做3个重复，每天观察粉蕉苗的生长状况，做好记录。

2、实验结果表明，菌株BC13可显著降低大白菜、马铃薯、胡萝卜（如图4）、粉蕉（如图5）上细菌性软腐病的发病率。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一株粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)BC13，其特征在于所述菌株于2018年7月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏编号为GDMCC No:60412。

2.权利要求1所述的粪产碱菌BC13在防治作物细菌性病害和/或真菌性病害中的应用；

所述细菌性病害包括由D.zeae、青枯病菌、水稻白叶枯病菌或泛菌引起的细菌性病害；所述真菌性病害包括由水稻纹枯病菌、荔枝霜疫霉菌引起的真菌性病害；

所述细菌性病害包括水稻细菌性基腐病、香蕉细菌性软腐病、君子兰细菌性软腐病、茄科作物青枯病、水稻白叶枯病、水稻软腐病或桃子腐烂病；所述真菌性病害包括水稻纹枯病、荔枝霜疫霉病。

3.一种防治作物细菌性病害的生物制剂，其特征在于，包含权利要求1所述粪产碱菌BC13。

4.根据权利要求3所述生物制剂，其特征在于，所述粪产碱菌BC13的浓度为OD600＝1.0～1.5。

5.根据权利要求3所述生物制剂，其特征在于，所述生物制剂由粪产碱菌BC13的菌液和/或发酵液制成。

6.一种防治作物细菌性病害的方法，其特征在于，采用权利要求1所述粪产碱菌BC13或权利要求3～5任一项所述生物制剂处理土壤或植物材料。

7.根据权利要求6所述的防治方法，其特征在于，所述处理为接种处理。

8.根据权利要求7所述的防治方法，其特征在于，所述接种处理为注射接种或刺伤接种。