CN1310230A - 苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种菌株发酵工艺及杀虫用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及高效、广谱苏云金芽孢杆菌菌株、生产发酵工艺及其在生物杀虫领域的应用。其特征是,分离到一种同时对鳞翅目、膜翅目昆虫有高毒力的苏云金芽孢杆菌,其血清为H₇,含有cry1Aa,cry1Ac,cry1Icry2Ab,cry11等多种类型的杀虫蛋白基因;拥有130－140Kda、90Kda、70Kda、60Kda四种大小的晶体蛋白组分;采用液体发酵工艺生产的生物杀虫剂,对赤松毛虫、柏毛虫、杏幕毛虫、日本弓背蚁、家蚁、玉米螟、稻卷叶虫、刺蛾、小菜蛾、菜青虫、小车蝗等杀虫效果显著,对棉铃虫等也有较好的杀虫效果。

Description

苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种菌株 发酵工艺及杀虫用途

本发明涉及一种分离筛选得到的可用作生物杀虫剂的苏云金芽孢杆菌，特别是苏云金芽孢杆菌CGMCC NO.0453(一种苏云金芽孢杆菌，已于2000年5月25日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCCNO.0453)的选育、生产工艺以及在生物杀虫剂领域的应用。

标准H₇血清型的苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种菌株存在毒力低，难以实际应用的缺点；市场上用于杀虫剂的苏云金芽孢杆菌大多为H3血清型，只有一条130-140Kda杀虫蛋白带，仅对鳞翅目昆虫具有高毒力，而对膜翅目昆虫——蚂蚁类、直翅目昆虫——蝗虫类无毒力，对抗性小菜蛾及甜菜夜蛾毒力差，杀虫谱较窄。且存在发酵周期较长等缺点，其发酵周期一般为33-34小时左右。

本发明的目的在于克服已有技术的不足，选育一种杀虫谱广、发酵时间短的杀虫苏云金芽孢杆菌，设计它的发酵工艺和制备生物杀虫剂。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明的特征包括苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种CGMCC NO.0453株本身、发酵工艺以及在生物杀虫剂领域的应用。

本发明涉及的菌株于1992年5月自我国江苏省云台山赤松树皮中采集到自然死亡的膜翅目昆虫—日本弓背蚁(Camponotusjaponicus Mayr)幼虫尸体中分离而得，并于2000年5月在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCCNO.0453。

一、该菌株具有以下性质

1、形态特征

菌株革兰氏反应呈阳性，营养细胞为杆状，两端钝圆，单生(极少)，双联体，或以双联体为单位连成短链状，菌体大小(0.8-1.2)μm×(2.4-3.6)μm，周生鞭毛(附图1-2)。菌株培养18小时左右即开始形成芽孢和伴孢晶体。芽孢呈椭圆形，不使孢囊膨大，偏端生。伴孢晶体菱形、球形、不规则形和晶体镶嵌，且具显著晶格(附图3-5)。37℃下培养18小时即可见晶体释放。在完全肉汤培养基上生长，最高温度45℃，最低温度10℃，最适合温度32-37℃。菌株在pH值为5.0和10.0的培养基上不生长，适宜pH值为6.7-8。菌苔薄，表面光滑有光泽，乳白色，边缘呈根状分枝。

2、遗传学特性

该菌株拥有130-140Kda、90Kda、70Kda、60Kda四种大小的晶体蛋白组分(附图6)。含有crylAa,crylAc,crylI,cry2Ab,cryll等多种类型的杀虫蛋白基因。该菌株属血清型H₇与苏云金杆菌鲇泽亚种(Bacillus thuringiensis subsp.Aizawai)相同。

3、生理生化特征

a、卵磷脂酶(+)

b、尿酶(+)

c、水杨苷：反应不稳定

d、蔗糖：反应不稳定

e、甘露糖(+)

f、纤维糖(-)

g、蛋白质水解(++)

h、七叶灵(++)

i、淀粉水解(+)

j、色素(-)

k、菌膜(-)

l、精氨酸脱羧酶(+)

m、VP(+)

n、MR(+)

上述试验的结果表明，该菌株属苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种，但又与标准苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种有明显区别，其水杨苷、蔗糖反应不够明显，甘露糖结果相反。

二、苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种CGMCC NO.0453株发酵工艺

本发明所述的苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种CGMCC NO.0453株可以通过以下发酵工艺进行发酵生产。

1、原始菌种

从自然死亡的日本弓背蚁幼虫体内分离筛选的高毒力菌株苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种CGMCC NO.0453株作为原始菌种。

2、斜面培养

斜面培养基配方：玉米粉2.4％，黄豆饼粉4.8％，鱼粉1.2％，蛋白胨0.24％，酵母粉0.12％,CaCO₃ 0.25％,MgSO₄·7H₂O 0.085％,KH₂PO₄ 0.12％；按每个茄子瓶(200ml)装量60ml分装茄子瓶，制成斜面，斜面置37℃培养一天后，如无菌生长，方可使用。

斜面菌种的培养：将烧红的接种环冷却，按无菌操作从保藏菌的沙土管中挑出数环沙土，均匀涂布于茄子瓶斜面培养基上，置30℃培养3-4天，肉眼观察菌苔丰满，表面乳白色，无噬菌斑，显微镜检查无杂菌，90％以上芽孢脱落方可用于生产。将原始菌种接种于均匀涂布于茄子瓶斜面培养基上，置30℃培养3-4天，即为生产用斜面菌种；

3、发酵罐培养

在已培养好的茄子瓶斜面菌种中加入无菌水100毫升，制成菌悬液，然后转入500毫升血清瓶中，塞上经灭菌的针头或接种管，置80℃水浴锅内处理20分钟，用压差法将芽孢悬液接入发酵罐；按发酵罐容积的60％投入培养基。发酵罐培养基配方：豆饼粉4％，淀粉2.4％，玉米浆2％，酵母粉0.45％，蛋白胨0.42％,MgSO₄ 0.06％,KH₂PO₄ 0.12％,CaCO₃ 0.2％，消泡剂0.01％,pH消前8.5、消后7.0。通入高压蒸汽118-126℃，压力为0.6-1.0kg/cm²，维持30分钟高压蒸汽灭菌，冷却至35℃后，用盐酸调节pH值为7.0-7.5；在28-35℃，罐压0.5kg/cm²，通气量1∶0.8-1.2(v/v)，搅拌180rpm的条件下培养28-29小时，用显微镜检查有70％--90％的芽胞囊破裂、释放晶体，可停止发酵，放罐。

三、生物杀虫剂的制备及应用

当确定发酵液无杂菌污染时，放罐后迅速用HCl将发酵液pH调至4.5-5.5，以防止伴胞晶体的降解。加入防腐剂NaCl 5％和苯甲酸钠0.3％制成悬浮剂，即可包装成品。

该成品生物杀虫剂在使用时采用稀释喷洒方法，一般稀释至原液的100-200倍，也可根据不同的使用目的而适量增减，使用量以完全湿润被保护植物的叶片为量。

本发明从自然死亡的膜翅目昆虫—幼虫体内分离获得的苏云金芽孢杆菌CGMCC NO.0453株，能产生菱形、不规则形、球形及镶嵌形等多种形态的伴孢晶体，拥有四种大小的晶体蛋白组分(130-140Kda、90Kda、70Kda、60Kda)，该菌还含有多种类型的杀虫蛋白基因(crylAa,crylAc,crylI,cry2Aa,cryll等)。同时对鳞翅目、膜翅目昆虫有高毒力。且发酵周期只有28小时左右，克服了现已用于生产杀虫剂的Bt菌株发酵周期较长，杀虫谱较窄等缺点。具有杀虫谱广(同时对鳞翅目、膜翅目、直翅目昆虫有毒力)、杀虫毒力高、生产发酵周期短等特点。

图1为本发明菌株的菌体形态(杆状)图。

图2为本发明菌株的菌体形态(周生鞭毛)图。

图3为本发明菌株的多种形态晶体图。

图4为本发明菌株的菱形晶体及晶体镶嵌图。

图5为本发明菌株的镶嵌形晶体及其晶格图。

图6为标准蛋白与本发明菌株的晶体蛋白SDS-PAGE对照图谱。

以下实施例详细说明了本发明的技术方案。

实施例1

1、斜面菌种培养

斜面培养基配方：玉米粉2.4％，黄豆饼粉4.8％，鱼粉1.2％，蛋白胨0.24％，酵母粉0.12％,CaCO₃ 0.25％,MgSO₄·7H₂O 0.085％,KH₂PO₄ 0.12％；按每个茄子瓶(200ml)装量60ml分装茄子瓶，制成斜面，斜面置37℃培养一天后，如无菌生长，方可使用。

斜面菌种的培养：将烧红的接种环冷却，按无菌操作从保藏菌的沙土管中挑出数环沙土，均匀涂布于茄子瓶斜面培养基上，置30℃培养3-4天，肉眼观察菌苔丰满，表面乳白色，无噬菌斑，显微镜检查无杂菌，90％以上芽孢脱落方可用于生产。将原始菌种接种(均匀涂布)于茄子瓶斜面培养基上，置30℃培养3-4天，即为生产用斜面菌种；

2、发酵罐培养

按发酵罐容积的60％投入培养基。发酵罐培养基配方：豆饼粉4％，淀粉2.4％，玉米浆2％，酵母粉0.45％，蛋白胨0.42％，MgSO₄0.06％,KH₂PO₄ 0.12％,CaCO₃ 0.2％，消泡剂0.01％,pH消前8.5、消后7.0。通入118-126℃高压蒸汽，压力控制在0.6-1.0kg/cm²，维持30分钟高压蒸汽灭菌，冷却至35℃后，用盐酸调节pH值为7.0-7.5；在已培养好的茄子瓶斜面菌种中加入无菌水100毫升，制成菌悬液，然后转入500毫升血清瓶中，塞上经灭菌的针头或接种管，置70℃水浴锅内处理15分钟，用压差法将芽孢悬液接入发酵罐；在31℃，罐压0.3kg/cm²，通气量1∶0.6(v/v)，搅拌180转/分的条件下培养32小时，用显微镜检查有75％的芽胞囊破裂、释放晶体，停止发酵，放罐。

3、生物杀虫剂制备

放罐后迅速用HCl将发酵液pH调至4.5-5.5，以防止伴胞晶体的降解。加入防腐剂NaCl 5％和苯甲酸钠0.3％制成悬浮剂，即可包装成品。

实施例2

1、斜面菌种培养

斜面培养基配方：玉米粉2.4％，黄豆饼粉4.8％，鱼粉1.2％，蛋白胨0.24％，酵母粉0.12％，CaCO₃ 0.25％，MgSO₄ 7H₂O 0.085％,KH₂PO₄ 0.12％；按每个茄子瓶(200ml)装量60ml分装茄子瓶，制成斜面，斜面置37℃培养一天后，如无菌生长，方可使用。

斜面菌种的培养：将烧红的接种环冷却，按无菌操作从保藏菌的沙土管中挑出数环沙土，均匀涂布于茄子瓶斜面培养基上，置30℃培养3-4天，肉眼观察菌苔丰满，表面乳白色，无噬菌斑，显微镜检查无杂菌，90％以上芽孢脱落方可用于生产。将原始菌种接种于均匀涂布于茄子瓶斜面培养基上，置34℃培养3-4天，即为生产用斜面菌种；

2、发酵罐培养

按发酵罐容积的60％投入培养基，发酵罐培养基配方：豆饼粉4％，淀粉2.4％，玉米浆2％，酵母粉0.45％，蛋白胨0.42％,MgSO₄0.06％,KH₂PO₄ 0.12％,CaCO₃ 0.2％，消泡剂0.01％,pH消前8.5、消后7.0。通入高压蒸汽118-126℃，压力为0.6-1.0kg/cm²，维持30分钟高压蒸汽灭菌，冷却至40℃后，用盐酸调节pH值为7.0-7.5；在已培养好的茄子瓶斜面菌种中加入无菌水100毫升，制成菌悬液，然后转入500毫升血清瓶中，塞上经灭菌的针头或接种管，置85℃水浴锅内处理20分钟，用压差法将芽孢悬液接入发酵罐；在33℃，罐压0.5kg/cm²，通气量1∶0.9(v/v)，搅拌260转/分的条件下培养28小时，用显微镜检查有95％的芽胞囊破裂、释放晶体，停止发酵，放罐。

 3、生物杀虫剂制备

放罐后迅速用HCl将发酵液pH调至4.5-5.5，以防止伴胞晶体的降解。加入防腐剂NaCl 5％和苯甲酸钠0.3％制成悬浮剂，即可包装成品。

实施例3

1、斜面菌种培养

斜面培养基配方：玉米粉2.4％，黄豆饼粉4.8％，鱼粉1.2％，蛋白胨0.24％，酵母粉0.12％,CaCO₃ 0.25％,MgSO₄ 7H₂O 0.085％，KH₂PO₄ 0.12％；按每个茄子瓶(200ml)装量60ml分装茄子瓶，制成斜面，斜面置37℃培养一天后，如无菌生长，方可使用。

斜面菌种的培养：将烧红的接种环冷却，按无菌操作从保藏菌的沙土管中挑出数环沙土，均匀涂布于茄子瓶斜面培养基上，置32℃培养3-4天，肉眼观察菌苔丰满，表面乳白色，无噬菌斑，显微镜检查无杂菌，90％以上芽孢脱落方可用于生产。将原始菌种接种于均匀涂布于茄子瓶斜面培养基上，置34℃培养3-4天，即为生产用斜面菌种；

2、发酵罐培养

按发酵罐容积的60％投入培养基，发酵罐培养基配方：豆饼粉4％，淀粉2.4％，玉米浆2％，酵母粉0.45％，蛋白胨0.42％,MgSO₄0.06％,KH₂PO₄ 0.12％,CaCO₃ 0.2％，消泡剂0.01％,pH消前8.5、消后7.0。通入高压蒸汽，使罐温达到118-126℃，压力为0.6-1.0kg/cm²，维持30分钟高压蒸汽灭菌，冷却至35℃后，用盐酸调节pH值为7.0-7.5；在已培养好的茄子瓶斜面菌种中加入无菌水100毫升，制成菌悬液，然后转入500毫升血清瓶中，塞上经灭菌的针头或接种管，置85℃水浴锅内处理20分钟，用压差法将芽孢悬液接入发酵罐；在35℃，罐压0.8kg/cm²，通气量1∶1.5(v/v)，搅拌260转/分的条件下培养26小时，用显微镜检查有95％的芽胞囊破裂、释放晶体，停止发酵，放罐。

3、生物杀虫剂制备

放罐后迅速用HCl将发酵液pH调至4.5-5.5，以防止伴胞晶体的降解。加入防腐剂NaCl 5％和苯甲酸钠0.3％制成悬浮剂，即可包装成品。

实施例4：

苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种CGMCC NO.0453株制剂以1∶100倍稀释，喷洒到被保护植物表面，以完全湿润为量，观察该杀虫剂毒杀赤松毛虫、柏毛虫、玉米螟、菜青虫、小菜蛾、日本弓背蚁的使用效果，观察使用48小时后的害虫死亡率，对照标准苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种标准菌株杀虫剂，结果见表一

表一(48小时，死亡率％)

	苏云金芽孢杆菌CGMCC NO.0453株				苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种标准菌株
									浓度	原液	10-1	10-2	CK	原液	10-1	10-2	CK
赤松毛虫	96.5	86	51	2	34.5	24	6	1
									柏毛虫	86	68	55	1	74.5	62	48.5	2
玉米螟	89	84.5	61	1	30.5	18.5	4	2
									菜青虫	100	93	73	0	86.5	73	45	0
小菜蛾	87	83.5	68	0	47.5	31.5	10	1
									日本弓背蚁	95.2	87.5	73	1	68.5	56	12	1

实施例5

苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种CGMCC NO.0453株制剂以1∶100、1∶200倍稀释，喷洒到被保护植物表面，以完全湿润为量，观察该杀虫剂毒杀小菜蛾的使用效果，观察使用2天、4天、6天后的害虫死亡率，对照5％氯氰菊酯杀虫剂，结果见表二：

表二：苏云金芽孢杆菌CGMCC NO.0453株乳剂防治小菜蛾的药效试验结果

药剂	稀释倍数	平均防治效果(死亡率％)
					2天	4天	6天
		苏云金芽孢杆菌CGMCC NO.0453株发酵产品	100	71.66				81.76	84.32

苏云金芽孢杆菌CGMCC NO.0453株发酵产品	200	63.71	70.93	74.25
					5％氯氰菊酯	1000	43.36	59.93	63.68

实施例6

苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种CGMCC NO.0453株制剂以1∶200、1∶400倍稀释，喷洒到被保护植物表面，以完全湿润为量，观察该杀虫剂毒杀赤松毛虫的使用效果，观察使用2天、3天、4天后的害虫死亡率，结果见表三：表三：苏云金芽孢杆菌CGMCC NO.0453株乳剂防治赤松毛虫试验结果

药剂	平均防治效果(死亡率％)
				2天	3天	4天
	稀释200倍	37	85.6				88.3
稀释400倍				32.5	77.8	79.6
	对照0.1％洗衣液	0	1.8				1.8

实施例7

苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种CGMCC NO.0453株制剂以1∶100倍与蜂蜜配比稀释，放30只家蚁与一对扣的培养皿中，观察该杀虫剂毒杀家蚁的使用效果，以Bt菌C005株为阳性对照，清水为阴性对照，观察使用3天后的死亡率，结果见表四。表四：苏云金芽孢杆菌CGMCC NO.0453株乳剂毒杀家蚁试验结果

菌株

死亡率％

CGMCC NO.0453株	88.5
		Bt菌C005株	10
CK	3

实施例8

剪取1cm²大小的鲜玉米叶，分别吸取15微升苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种CGMCC NO.0453株制剂于每个叶片上，自然晾干后，放于小指管中，每个指管中投放一头小车蝗2-3龄幼虫，待幼虫吃光叶片后，移放入直径为10cm、高度为40cm的养虫筒中，每个筒投放幼虫30只，以Bt菌C005株、假单孢菌为阳性对照，清水为阴性对照，7天后观察死亡率，结果见表五。表五：苏云金芽孢杆菌CGMCC NO.0453株乳剂毒杀小车蝗试验结果

菌株	死亡率％
		CGMCC NO.0453株	94.5
Bt菌C005株	14
		假单孢菌	32
CK	9.4

Claims (4)

1、一种苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种(Bacillus thuringiensissubsp.aizawai serotype H₇)CGMCC NO.0453。

2、根据权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种CGMCC NO.0453，该菌株具有以下特征：(1)该菌株属血清型H₇，依国际微生物命名委员会规定的14组生化反应与其他H₇血清型菌株相比，仅水杨酸、蔗糖反应不稳定，甘露醇结果相反，另外11组反应结果完全相同；(2)该菌株拥有130-140Kda、90Kda、70Kda、60Kda四种大小的晶体蛋白组分；(3)该菌含有crylAa,crylAc,crylI,cry2Ab,cryll等多种类型的杀虫蛋白基因；(4)拥有菱形、不规则形、球形及镶嵌形等多种形态的伴孢晶体。

3、权利要求1所述苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种CGMCC NO.0453株的发酵工艺，其特征主要包括以下几个步骤：(1)将原始菌种均匀涂布于茄子瓶斜面培养基上，置30-34℃培养3-4天，即为生产用斜面菌种；(2)在已培养好的茄子瓶斜面菌种中加入无菌水100毫升，制成菌悬液，然后转入500毫升血清瓶中，塞上经灭菌的针头或接种管，置70-85℃水浴锅内处理15-20分钟，用压差法将芽孢悬液接入发酵罐；(3)按发酵罐容积的60％投入培养基，通入高压蒸汽使罐温达到118-126℃，压力为0.6-1.0kg/cm²，维持30分钟高压蒸汽灭菌，冷却至33-40℃后，用盐酸调节pH值为7.0-7.5；(4)在31-35℃，罐压0.3-0.8kg/cm²，通气量1∶0.6-1.5(v/v)，搅拌180-260转/分条件下培养26-32小时，用显微镜检查有70％-90％的芽胞囊破裂、释放晶体，可停止发酵，放罐；(5)茄子瓶斜面培养基组成为玉米粉2.4％，黄豆饼粉4.8％，鱼粉1.2％，蛋白胨0.24％，酵母粉0.12％,CaCO₃ 0.25％,MgSO₄·7H₂O 0.085％,KH₂PO₄ 0.12％；(6)发酵罐培养基配方：豆饼粉4％，淀粉2.4％，玉米浆2％，酵母粉0.45％，蛋白胨0.42％，MgSO₄ 0.06％,KH₂PO₄ 0.12％,CaCO₃ 0.2％,消泡剂0.01％，消泡前pH为8.5、消泡后pH为7.0。

4、权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种CGMCCNO.0453作为生物农药主要杀菌成分在毒杀鳞翅目、膜翅目、直翅目昆虫上的应用。

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