CN114480227B - 一株绿针假单胞菌及其在防治植物细菌性软腐病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株绿针假单胞菌及其在防治植物细菌性软腐病中的应用。本发明的绿针假单胞菌L5，其保藏编号为GDMCCNO.62059，该菌株对Dickeya属的软腐菌产生的VFM群体感应信号具有很好的淬灭作用，能显著减轻多种作物细菌性软腐病的发生，并且在盆栽试验中防治效果优良；而且，绿针假单胞菌L5本身无致病力，可用于开发针对作物细菌性软腐病的生防制剂，为利用生物防治作物细菌性软腐病提供了新思路、新材料。

Description

一株绿针假单胞菌及其在防治植物细菌性软腐病中的应用

技术领域

本发明属于植物病害生防技术领域，具体涉及一株绿针假单胞菌及其在防治植物细菌性软腐病中的应用。

背景技术

群体感应(Quorum sensing，QS)是一种细胞间的通讯过程，使细菌能够集体改变行为，以响应周围微生物群落的细胞密度和环境变化。近十年来细菌与细菌间的群体感应***成为微生物领域的研究热点，不仅揭示影响微生物重要生命过程的调控网络，同时为微生物传染性疾病的研究及治疗带来新的希望。群体淬灭(Quorum quenching，QQ)是指在不产生耐药性且不影响微生物生长的情况下，通过干扰或破坏群体感应***来阻断细菌间的信号交流，从而达到有效抑制毒力基因表达的目的，是一种新型环境友好型的病原菌防治策略，具有良好的发展前景。

软腐肠杆菌科(Soft-rot Enterobacteriaceae,SRE)主要由Pectobacterium属和Dickeya属组成，是一类在世界范围内引起多种粮食、蔬菜和观赏植物发生毁灭性病害的革兰氏阴性病原菌。目前Dickeya已知12个种均可产生AHL(Acyl homoserine lactone)和VFM(Virulence Factor Modulating)两类群体感应(Quorum sensing，QS)信号调控病原菌的不同生物学表型。前期研究表明，AHL信号主要调控病原菌的运动性和生物膜形成，对病原菌的致病性影响不大；而VFM是一种新型QS信号，主要调控病原菌毒力因子的产生，显著调控病原菌的致病性。因此，通过靶向VFM信号筛选QQ生防菌株将对细菌性软腐病的安全、高效生物防控具有重大意义。目前，由于VFM群体感应信号化学结构未知，成为Dickeya软腐菌QQ技术发展的壁垒之一。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有作物细菌性软腐病防治技术的缺陷和不足，提供一株对Dickeya属作物软腐细菌的VFM群体感应信号具有优良淬灭作用的生防菌——绿针假单胞菌L5，为使用微生物代替化学合成杀菌剂提供新的开发资源，可作为生物农药进行开发利用。

本发明利用前期构建的VFM群体感应信号报告***VR2(已公开于专利申请CN202110772560.9中)，从环境中筛选到一株绿针假单胞菌Pseudomonas chlororaphisL5，在不影响报告***VR2生长的前提下，能通过淬灭VFM群体感应信号，显著降低多种作物软腐菌的致病力，高效防控作物细菌性软腐病。

本发明发现绿针假单胞菌L5菌株能高效淬灭Dickeya属的VFM群体感应信号，在温室盆栽试验中没有影响香蕉、水稻、芋头和马铃薯的生长，并且能有效抑制香蕉细菌性软腐病菌D.zeae MS2对香蕉、水稻细菌性基腐病菌D.oryzae EC1对水稻、马铃薯软腐病菌D.dadantii 3937对马铃薯、芋头软腐病菌D.fangzhongdai CL3对芋头的侵染。说明本发明的绿针假单胞菌L5可被用于开发针对作物细菌性软腐病的生物农药。该菌株的发现，有利于减轻化学药剂滥用的问题，也为利用群体淬灭技术防治作物细菌性软腐病害提供了资源。

因此，本发明的第一个目的是提供一株绿针假单胞菌L5，其保藏编号为GDMCC NO.62059。

本发明还提供绿针假单胞菌L5在防治植物细菌性软腐病中的应用。

优选，所述的植物细菌性软腐病是由Dickeya属细菌引起的、依赖VFM群体感应信号分子介导致病的细菌性病害。

更优选的，所述的植物细菌性软腐病为香蕉细菌性软腐病、水稻细菌性基腐病、马铃薯软腐病和芋头软腐病。

优选，所述的应用，包括将绿针假单胞菌L5和/或包含绿针假单胞菌L5的培养物接种至植物体的步骤。

优选，所述的接种采用伤根灌菌接种法。

优选，所述的接种采用注射接种法。

优选，所述的接种采用刺伤接种法。

本发明还提供一种植物细菌性软腐病的生防制剂，其含有绿针假单胞菌L5和/或包含绿针假单胞菌L5的培养物作为有效成分。

优选，所述的生防制剂为绿针假单胞菌L5的菌悬液，浓度为OD₆₀₀1.0～1.5。

本发明具有以下有益效果：

本发明结果表明，绿针假单胞菌L5能高效地淬灭Dickeya属细菌产生的VFM群体感应信号；在接种试验中发现绿针假单胞菌L5对香蕉、水稻、马铃薯和芋头均无致病力，但能很好的抑制病原菌D.zeae MS2对香蕉、D.oryzae EC1对水稻、D.dadantii 3937对马铃薯、D. fangzhongdai CL3对芋头的侵染，降低其细菌性软腐病的发病率。而且，绿针假单胞菌L5本身无致病力，可用于开发针对作物细菌性病的生物农药，为利用生物防治作物细菌性软腐病提供了新思路、新的菌株资源。

本发明提供了一株绿针假单胞菌L5并证实其对作物细菌性软腐病菌的VFM群体感应信号具有很好的淬灭作用，显著减轻多种作物细菌性软腐病的发生，并且在盆栽试验中防治效果优良。而且，绿针假单胞菌L5本身无致病力，可用于开发针对作物细菌性软腐病的生防制剂，为生物防治作物细菌性软腐病提供了新思路、新材料。

保藏说明：

本发明的Pseudomonas chlororaphis L5(绿针假单胞菌L5)于2021年11月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号：GDMCC No.62059，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所。

附图说明

图1为菌株L5对香蕉细菌性软腐病菌Dickeya zeae MS2的拮抗效果图。

图2为流式细胞仪测定菌株L5对VR2报告***中VFM信号的淬灭效果图。

图3为菌株L5基于16S rDNA基因序列的聚类图。

图4为菌株L5基于rpoB和rpoD基因序列的联合***发育聚类图。

图5为菌株L5显著减轻香蕉和水稻上细菌性软腐病症状的发生。

图6为菌株L5显著减轻马铃薯和芋头上细菌性软腐病症状的发生。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：菌株L5的分离和筛选

1、菌株分离

样本采集：在湖北孝感水稻田采集田间土壤样本，装袋保存，带回实验室进行菌株分离。

菌株分离：土壤样本采用稀释涂布平板法进行菌株的分离。具体地，将采集到的田间土壤样本充分混匀后，称取5.0g置于装有15mL新鲜LB液体培养基的灭菌离心管内，于28℃、 200rpm摇床震荡培养15min，静置至土壤颗粒沉于离心管底部，取上清液以无菌水梯度稀释，吸取100μL 10^-5、10^-6、10^-7稀释液涂布于LB平板，倒置于28℃恒温培养箱内培养24h后将所得单菌落划线纯化。挑取纯化后平板上的单菌落，标号，置于含1mL液体LB的2mL 离心管中，于28℃、200rpm摇床过夜震荡培养，作为待筛菌液，备用。

2、菌株筛选：利用酶标仪高通量筛选。具体地，将VR2报告菌株(已公开于专利申请CN202110772560.9中，是通过基因工程手段改造香蕉细菌性软腐病菌Dickeya zeae MS2得到的VFM群体感应信号报告菌株)用LB+Kan固体培养基划线活化，挑取单菌落置于LB+Kan液体培养基中，于28℃、200rpm摇床震荡培养至菌液OD₆₀₀＝1.0，按1:100的比例(接种量)加入到LB液体培养基中，混合均匀后以每孔200μL加入到96孔培养板，以0.1％的接种量接入预先准备好的待筛菌液，每个样品处理重复三次，以无菌LB液体培养基做空白对照，以接入0.1％接种量的大肠杆菌DH5α做负对照。接种完成后贴上封膜，并盖上板盖，放入酶标仪内连续测24h，每隔三个小时测定一次OD₆₀₀和OD₄₈₅/OD₅₂₈。初步筛选对病原菌VFM 群体感应信号具有淬灭作用的菌株。

3、菌株抑菌作用测定：抑菌圈实验。具体地，将利用酶标仪初步筛选得到的菌株挑取单菌落于含15mL LB培养液的50mL离心管里，于28℃、200rpm摇床震荡培养，待用。取已融化的15mL固体LB培养基在10×10cm的方形培养皿里倒板，吹干后，将15mL 1％琼脂糖(先冷却到50℃-60℃后加入150μL香蕉细菌性软腐病菌Dickeya zeae MS2菌液)倒在铺有LB的方形培养皿上，吹干。用直径为5mm的打孔器打孔，灭菌牙签挑去培养基后，向孔内注入20μL过夜培养的待测菌液，吹干，封口。把板正放在28℃培养箱里，培养16-18h，观察是否有透明的抑菌圈。获得一株对病原菌VFM群体感应信号具有淬灭作用但无抑菌效果的生防菌株，命名为菌株L5(图1)。

实施例2：流式细胞仪验证菌株L5对VFM的淬灭效果

将VR2报告菌株用LB+Kan固体培养基划线活化，挑取单菌落置LB+Kan液体培养基中，于28℃、200rpm摇床震荡培养至菌液OD₆₀₀＝1.0，将报告菌株VR2和菌株L5(淬灭菌)等量接种混合培养，以只接入报告菌株VR2为对照，每隔四小时测定一次样品荧光强度MFI。从图2可知，在菌株培养4-8小时时，菌株L5可以显著淬灭VR2产生的VFM信号，而当菌株培养到12小时时，VR2自身的淬灭基因就可以降解***中的VFM信号，这时候加和不加菌株L5，报告***响应到的VFM信号值都与原来相比急剧降低。

实施例3：菌株L5的鉴定

1、形态鉴定

菌株L5为革兰氏阴性；在LB营养培养基上菌落呈现橙黄色，圆形，凸起，表面光滑，较粘稠，易挑起，边缘整齐。

2、分子鉴定

为了明确实施例1获得的菌株L5的分类地位，我们采用多位点序列分析(Multilocus sequences analysis，MLSA)结合***发育树分析(Phylogenetic analysis)的方法鉴定菌株L5。

16S rDNA序列分析是细菌鉴定的分子生物学鉴定手段，通过分析16S rDNA序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，结合保守看家基因rpoB(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示) 和rpoD序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，运用MEGA 6.0软件采用Neighbor-joining 方法构建***发育树，综合分析了菌株L5的进化关系，研究表明，菌株L5的16SrDNA序列与绿针假单胞菌Pseudomonas chlororaphis LMG 21630和Lzh-T5菌株的同源性达到最高的 99.93％，进化系数与P.chlororaphis LMG 21630最为相近(图3)，通过分析rpoB和rpoD基因序列发现，菌株L5与P.chlororaphis ATCC 13985和PCLRTO2最为接近(图4)。

综上，结合多个看家基因的***发育分析，将该生防菌鉴定为假单胞菌属的Pseudomonas chlororaphis，命名为绿针假单胞菌Pseudomonas chlororaphis L5；并将该菌株于2021年11 月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号：GDMCCNO.62059。

实施例4：菌株L5对细菌性软腐病的防效测定

在LB固体培养基上活化病原菌香蕉细菌性软腐病菌D.zeae MS2、水稻细菌性基腐病菌 D.oryzae EC1、马铃薯软腐病菌D.dadantii 3937、芋头软腐病菌D.fangzhongdaiCL3(以下分别简述为菌株MS2、EC1、3937、CL3)和(生防菌)菌株L5，倒置于28℃培养箱过夜培养待用。

1、用PBS溶液分别将菌株MS2平板和菌株L5平板上的菌体冲洗下来，并将MS2菌悬液和L5菌悬液OD₆₀₀调至0.5；取1mL MS2菌悬液和等量PBS溶液混合(MS2)作为正对照；取1mLL5菌悬液与等量的MS2菌悬液混合(L5+MS2)；取1mL L5菌悬液和等量PBS 溶液混合(L5)作为负对照；取2mL PBS溶液(PBS)作为空白对照。

采用注射接种法接种香蕉。挑选12株长势相似的香蕉苗，用1mL注射器分别取200μL 的MS2、L5+MS2、L5、PBS注射到香蕉的假茎，每处理3个重复，每天观察香蕉苗的生长状况，做好记录。

实验结果表明，接种7天后，菌株L5对香蕉细菌性软腐病的防控率达到100％(图5A)。

2、用PBS溶液分别将菌株EC1平板和菌株L5平板上的菌体冲洗下来，并将EC1菌悬液和L5菌悬液OD₆₀₀调至0.5；取10mL EC1菌悬液和等量PBS溶液混合(EC1)作为正对照；取10mL L5菌悬液与等量的EC1菌悬液混合(L5+EC1)；取10mL L5菌悬液和等量PBS 溶液混合(L5)作为负对照；取20mL PBS溶液(PBS)作为空白对照。将所有菌液用PBS 定容至100mL后，采用伤根灌菌法(刺伤处理水稻根部)接种到水稻盆栽土壤中，每盆12 棵长势均等的水稻苗，每个处理3个重复，每天观察接种植物的生长状况，做好记录。

实验结果表明，接种两天后，菌株L5对水稻细菌性基腐病的防控率达到100％(图5B)。

3、分别挑取菌株3937、CL3和菌株L5单菌落于含有10mL LB的50mL离心管中，放在28℃、200rpm摇床过夜培养。取1mL OD₆₀₀约为1.0的3937或CL3菌液加入等量LB液体培养基混合分别作为正对照；取1mL OD₆₀₀约为1.0的3937或CL3菌液加入等量L5菌液混合；取1mLOD₆₀₀约为1.0的L5菌液加入等量LB液体培养基混合作为负对照，LB液体培养基作为空白对照。

采用刺伤接种法分别接种马铃薯和芋头，每个处理3个重复。将马铃薯和芋头切片处理后，分别取2μL的3937菌液与LB混合液(3937)、3937菌液与L5菌液混合液(L5+3937)、L5菌液与LB混合液(L5)、LB液体培养基(LB)接种到已做刺伤处理的马铃薯切片上；分别取2μL的CL3菌液与LB混合液(CL3)、CL3菌液与L5菌液混合液(L5+CL3)、L5菌液与LB混合液(L5)、LB液体培养基(LB)接种到已做刺伤处理的芋头切片上，观察接种切片的发病状况，做好记录。

实验结果表明，接种24小时后，菌株L5可显著减轻马铃薯和芋头上细菌性软腐病的发病症状(图6)。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一株绿针假单胞菌及其在防治植物细菌性软腐病中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1495

<212> DNA

<213> 绿针假单胞菌L5(Pseudomonas chlororaphis L5)

<400> 1

taccttgtta cgacttcacc ccagtcatga atcacaccgt ggtaaccgtc ctcccgaagg 60

ttagactagc tacttctggt gcaacccact cccatggtgt gacgggcggt gtgtacaagg 120

cccgggaacg tattcaccgc gacattctga ttcgcgatta ctagcgattc cgacttcacg 180

cagtcgagtt gcagactgcg atccggacta cgatcggttt tatgggatta gctccacctc 240

gcggcttggc aaccctctgt accgaccatt gtagcacgtg tgtagcccag gccgtaaggg 300

ccatgatgac ttgacgtcat ccccaccttc ctccggtttg tcaccggcag tctccttaga 360

gtgcccacca taacgtgctg gtaactaagg acaagggttg cgctcgttac gggacttaac 420

ccaacatctc acgacacgag ctgacgacag ccatgcagca cctgtctcaa tgttcccgaa 480

ggcaccaatc catctctgga aagttcattg gatgtcaagg cctggtaagg ttcttcgcgt 540

tgcttcgaat taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc ccccgtcaat tcatttgagt 600

tttaaccttg cggccgtact ccccaggcgg tcaacttaat gcgttagctg cgccactaag 660

agctcaaggc tcccaacggc tagttgacat cgtttacggc gtggactacc agggtatcta 720

atcctgtttg ctccccacgc tttcgcacct cagtgtcagt atcagtccag gtggtcgcct 780

tcgccactgg tgttccttcc tatatctacg catttcaccg ctacacagga aattccacca 840

ccctctacca tactctagct cgccagtttt ggatgcagtt cccaggttga gcccggggat 900

ttcacatcca acttaacgaa ccacctacgc gcgctttacg cccagtaatt ccgattaacg 960

cttgcaccct ctgtattacc gcggctgctg gcacagagtt agccggtgct tattctgtcg 1020

gtaacgtcaa aatactcacg tattaggtaa gtacccttcc tcccaactta aagtgcttta 1080

caatccgaag accttcttca cacacgcggc atggctggat caggctttcg cccattgtcc 1140

aatattcccc actgctgcct cccgtaggag tctggaccgt gtctcagttc cagtgtgact 1200

gatcatcctc tcagaccagt tacggatcgt cgccttggtg agccattacc tcaccaacta 1260

gctaatccga cctaggctca tctgatagcg caaggcccga aggtcccctg ctttctcccg 1320

taggacgtat gcggtattag cgtccgtttc cgaacgttat cccccactac caggcagatt 1380

cctaggcatt actcacccgt ccgccgctct caagagaagc aagcttctct ctaccgctcg 1440

acttgcatgt gttaggcctg ccgccagcgt tcaatctgag ccatgatcaa actct 1495

<210> 2

<211> 1230

<212> DNA

<213> 绿针假单胞菌L5(Pseudomonas chlororaphis L5)

<400> 2

tggccgagaa ccagttccgc gttggcctgg tgcgtgtaga gcgcgcggtc aaagagcgtc 60

tgtcgatggc tgaaagcgaa ggcctgatgc cgcaagacct gatcaacgcc aagccagtgg 120

cggcggcggt gaaggagttc ttcggttcca gccagctgtc ccagttcatg gaccagaaca 180

acccgctgtc cgagatcacc cacaagcgcc gtgtctctgc actcggccca ggcggcctga 240

ctcgtgagcg tgcaggcttc gaagttcgtg acgtacaccc gactcactac ggtcgtgtat 300

gcccgatcga gacgccggaa ggtccgaaca tcggtctgat caactccctg gccgcctatg 360

ctcgcaccaa ccagtacggc ttcctcgaga gcccgtaccg tgtggtgaaa gaaggtctgg 420

tgaccgacga aatcgtgttc ctgtccgcta tcgaagaggc cgatcacgtg atcgcccagg 480

cttcggcgac catgaacgac aaaggtcaac tgatcgacga gctggtagct gttcgtcacc 540

tgaacgaatt caccgtcaag gcgccagaag acgtcacctt gatggacgtt tcgccgaagc 600

aggtagtttc ggttgcggcg tcgctgattc cgttcctcga gcacgacgac gccaaccgtg 660

cgttgatggg ttcgaacatg cagcgtcagg ctgtaccaac cctgcgtgcc gacaagccgc 720

tggtaggtac cggcatggag cgtaacgttg cccgtgactc cggcgtctgc gtcgtggctc 780

gtcgtggcgg cgtgatcgac tcggttgatg ccagccgtat cgtggttcgt gttgcagatg 840

acgaagttga gccaggcgaa gccggtgtcg acatctacaa cctgaccaaa tacacccgct 900

ccaaccagaa cacctgcatc aaccagcgtc cgctggtgag caagggtgat cgggttcagc 960

gcagcgacat catggccgac ggtccgtcca ccgacatggg tgaactggct ctgggtcaga 1020

acatgcgcat cgcgttcatg gcatggaacg gcttcaactt cgaagactcc atctgcctgt 1080

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<210> 3

<211> 740

<212> DNA

<213> 绿针假单胞菌L5(Pseudomonas chlororaphis L5)

<400> 3

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ttctgctggc aacggatgat gtccggctgc aggcggccga tggcttcggc gtacttggcc 120

ttgcctttgg ccagcgcgtc ggaccagctt tcgtccactt cattgccagg gaactggcgc 180

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ggaaccagtt tgatcggcat gaacagttca gccagggcca gcatttcggc cagggcttgc 360

ttgtgttcgc gaccgtgctt cttcagcgcc ttgcgggtga tttccatctg gtcggcaacg 420

gcgccaaagc gctgggctgc gatgaccgga tccggaccgc tttcggcttc ttcttcgtcg 480

tcactggctt cggcgtcatc gtcgtcggtg tcgtcgtccg cttttgcagc cttggcatcg 540

acaggcggtg gtacttcggc ggcaggcggc gcaatgccgt cgtccgggtc gatgtaaccg 600

ctcaggacgt cggacaggcg gccaccttcg gtggtgacgc gagtgtattc ggagaggatg 660

tgctcaaccg tgccagggaa gtgcgcgatc gcgcccatca cttcacggat gccctcttcg 720

atacgcttgg cgatttcgat 740

Claims (8)

1.一株绿针假单胞菌L5，其特征在于，其保藏编号为GDMCCNO.62059。

2.权利要求1所述的绿针假单胞菌L5在防治植物细菌性软腐病中的应用，所述的植物细菌性软腐病是由Dickeya属细菌引起的、依赖VFM群体感应信号分子介导致病的香蕉细菌性软腐病、水稻细菌性基腐病、马铃薯软腐病和芋头软腐病。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括将绿针假单胞菌L5和/或包含绿针假单胞菌L5的菌液接种至植物体的步骤。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的接种采用伤根灌菌接种法。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的接种采用注射接种法。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的接种采用刺伤接种法。

7.一种植物细菌性软腐病的生防制剂，其特征在于，含有权利要求1所述的绿针假单胞菌L5和/或包含权利要求1所述的绿针假单胞菌L5的菌液作为有效成分。

8.根据权利要求7所述的生防制剂，其特征在于，所述的生防制剂为绿针假单胞菌L5的菌悬液，浓度为OD₆₀₀1.0～1.5。

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