CN108624526B - 一株荧光假单胞菌sc3及其在防治作物细菌性软腐病中的应用 - Google Patents

一株荧光假单胞菌sc3及其在防治作物细菌性软腐病中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）SC3及其在防治作物细菌性软腐病中的应用。所述株荧光假单胞菌SC3已于2018年4月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO. 60367。该菌株SC3对多种细菌性病害菌具有显著的抑制作用，尤其是对作物细菌性软腐病菌、青枯病菌和黄单胞杆菌具有很好的抑制作用，减轻作物细菌性软腐病的发生，并且在盆栽试验中防治效果较好。而且，菌株SC3本身无致病力，可用于开发针对作物细菌性病害的生物农药，为利用生物防治作物细菌性软腐病提供了新思路、新想法。

Description

一株荧光假单胞菌SC3及其在防治作物细菌性软腐病中的 应用
技术领域
本发明属于植物病害生防技术领域。更具体地，涉及一株荧光假单胞菌SC3及其在防治作物细菌性软腐病中的应用。
背景技术
细菌性病害是由细菌病菌侵染所致的植物病害，如软腐病、青枯病等，引起严重的经济损失。细菌性病害症状表现为萎蔫、腐烂、枯萎等，发病后期遇潮湿天气，在病害部位溢出细菌粘液，有明显恶臭味，是细菌病害的特征。
例如玉米狄克氏菌（Dickeya zeae），该菌寄主范围广泛，除侵染单子叶植物外，还可同时侵染双子叶植物，其寄主范围包括除水稻、玉米、甘蔗、香蕉、臂形草、鸢尾、射干、萱草、狼尾草、菠萝、马铃薯、烟草、大白菜、胡萝卜、花生、凤仙花、菊花等。已报道的由D. zeae引起的严重植物病害包括水稻细菌性基腐病和香蕉细菌性软腐病，其引起的病害有潜伏侵染的现象，造成作物的大量严重减产损失。
由于病原菌繁殖速度快，传播途径多样，病菌还能够在土壤中长时间存活，且菌系分化明显，变异速度快，致病机理复杂，故防治比较困难。目前的防治方法主要有：（1）种植抗病品种：这是防治水稻、香蕉细菌性软腐病最经济有效的方法。有研究表明，大蕉、巴西蕉、皇帝蕉对香蕉细菌性软腐病有一定的抗性。然而，随着抗病品种种植时间的延长，病原菌可能会产生新的生理小种，从而使抗病品种变成感病品种。（2）使用化学药剂：目前防治细菌病害包括软腐病的药剂品种较少，主要有铜制剂、抗生素类杀菌剂等。陈远凤等的研究结果表明，用高于5 mg/L的二氧化氯（ClO2）进行水体消毒可有效预防细菌性软腐病通过水源传播， 用1500 mg/L以上的ClO2对发病蕉穴土壤消毒可以达到清除病原的目的。另外，有研究指出，水合霉素和菌毒清对香蕉细菌性软腐性病害起到防治作用，但未进行田间试验。然而，化学药剂对人畜有一定的毒性，还会引起病菌抗药性、水资源污染等问题。
因此，寻找合适的生物防治方法是防治细菌性病害的发展方向和有效途径。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有细菌性病害防治技术的缺陷和不足，提供一种对多种作物细菌性病害菌具有较好的抑制作用的生防菌，为使用微生物代替化学合成杀菌剂提供新的开发资源，可作为生物农药进行开发利用。
本发明的目的是提供一株荧光假单胞菌SC3。
本发明另一目的是提供所述荧光假单胞菌SC3在防治作物细菌性病害方面的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明筛选鉴定得到一株荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）SC3，并于2018年4月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO. 60367，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
经研究发现，所述菌株SC3在含水稻细菌性基腐病菌EC1、香蕉细菌性软腐病菌MS2和MS3菌液的平板上能形成明显抑菌圈，并且在温室盆栽试验中没有影响水稻和粉蕉苗的生长，并且能有效抑制EC1对水稻、MS2对粉蕉苗的侵染。除此之外，发现SC3对许多植物病原细菌包括茄科青枯病菌EP1、野油菜黄单胞感觉Xcc、水稻白叶枯病菌Xoo具有较强的抑菌作用。但是对许多植物致病真菌包括辣椒炭疽菌、胶胞炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、水稻纹枯病菌、稻瘟病菌和甘蔗鞭黑粉病菌的生长抑制作用并不明显。说明本发明的菌株SC3可被用于开发针对作物细菌性病害的生物农药。该菌株的发现，有利于减轻化学药剂滥用的问题，也为利用生物防治方法防治植物细菌性病害提供了资源。
因此，所述荧光假单胞菌SC3在防治作物细菌性病害方面的应用，也应在本发明的保护范围之内。
优选地，所述作物细菌性病害包括但不限于由Dickeya zeae或Erwinia引起的细菌性病害。
优选地，所述细菌性病害包括水稻细菌性基腐病、细菌性软腐病、茄科青枯病、十字花科黑腐病或水稻白叶枯病等。
其中，细菌性软腐病包括香蕉、粉蕉、君子兰、萝卜、胡萝卜、大白菜、马铃薯等上的细菌性软腐病。
所述茄科青枯病是由Ralstonia solanacearum引起的。所述十字花科黑腐病是由Xanthomonas campetris pv. campetris引起的。所述水稻白叶枯病是由Xanthomonas oryzae pv. oryzae引起的。
另外，包含所述荧光假单胞菌SC3的作物细菌性病害的生防制剂，也应在本发明的保护范围之内。
优选地，所述生防制剂中荧光假单胞菌SC3的浓度为OD600 1.0～1.5。
作为一种可选择的实施方式，本发明还提供了一种防治作物细菌性病害的方法，将上述生防制剂接种于植物材料即可。
优选地，所述接种可采用注射接种法。
优选地，所述接种可采用刺伤接种法。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一株荧光假单胞菌SC3，对多种细菌性病害菌具有显著的抑制作用，尤其是对作物细菌性软腐病菌、青枯病菌和黄单胞杆菌具有很好的抑制作用，减轻作物细菌性软腐病的发生，并且在盆栽试验中防治效果较好。
本发明研究表明，菌株SC3在含EC1、MS2、MS3、EP1、Xcc和Xoo菌液的平板上能形成抑菌圈；在接种试验中发现SC3对萝卜、胡萝卜、大白菜、马铃薯、水稻、粉蕉均无致病力，但能很好的抑制病原菌对萝卜、胡萝卜、大白菜、马铃薯、水稻苗和粉蕉苗的侵染，降低其细菌性软腐病的发病率。
而且，菌株SC3本身无致病力，可用于开发针对作物细菌性病害的生物农药，为利用生物防治作物细菌性软腐病提供了新思路、新想法。
附图说明
图1为菌株SC3 基于16S rDNA基因序列的聚类图。
图2为菌株SC3 基于gyrB基因序列的聚类图。
图3为菌株SC3 基于rpoB基因序列的聚类图。
图4为菌株SC3 基于rpoD基因序列的聚类图。
图5为生防菌SC3对重要作物病原细菌的抑菌谱测定。
图6为生防菌SC3对重要作物病原真菌的抑菌谱测定。
图7为菌株SC3显著减轻双子叶寄主植物细菌性软腐病症状的发生。
图8为菌株SC3显著减轻香蕉细菌性软腐病症状的发生。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 假单胞菌SC3的分离和筛选
1、菌株分离
样本采集：在四川农业大学水稻田中，拔取水稻苗出现基部腐烂的植株，连同水稻根部的土样，装袋保存，带回实验室进行菌株分离。
菌株分离：土壤样本采用稀释涂布平板法进行菌株的分离。具体地，采得的土壤样品用手充分混匀后，称取4.0 g，用20 mL无菌水浸泡摇匀后于28℃，180 rpm摇床震荡培养20 min，进行梯度稀释。取稀释倍数为105-109的稀释液100 µL涂布于LB平板上，室温吹干后封口，倒置在28℃培养箱培养24 h。挑取LB平板上生长的单菌落，标号，置于含500 µL液体LB的2 mL离心管中，于28℃，180 rpm摇床过夜震荡培养，待用。
2、菌株筛选：在LB平板上活化香蕉细菌性软腐病菌MS2，挑取单菌落于含15 mL LB培养液的50 mL离心管里，28℃、180 rpm摇床过夜震荡培养，待用。取已融化的15 mL固体LB培养基在10×10 cm的方形培养皿里倒板，吹干后，将15 mL浓度为1%的琼脂糖（先冷却到50-60℃后分别加入150 µL MS2菌液）倒在铺有LB的方形培养皿上，吹干。用直径为5 mm的打孔器打孔，灭菌牙签挑去培养基后，向孔内注入20 µL过夜培养的待测菌液，吹干，封口。把板正放在28℃培养箱里，培养16-18 h，观察是否有透明的抑菌圈。获得一株抑菌效果最佳的生防菌株，命名为SC3。
实施例2 假单胞菌SC3的鉴定
1、形态鉴定
菌株SC3为革兰氏阴性；在LB营养培养基上菌落呈现淡黄色，圆形，中间稍凸，表面光滑，边缘整齐；液体培养基中呈扩散性混浊，明胶液化，产酸、产气、产氧化酶、产过氧化氢酶，不产生淀粉酶。
2、分子鉴定
为了明确实施例1获得的菌株SC3的分类地位，我们采用多位点序列分析（Multilocus sequences analysis，MLSA）结合***发育树分析（Phylogenetic analysis）的方法鉴定SC3菌株。
16S rDNA序列分析是细菌鉴定的分子生物学鉴定手段，本发明通过分析16S rDNA序列，结合保守看家基因gyrB、rpoB和rpoD序列，运用MEGA 5.0软件采用Neighbor-joining方法构建***发育树，综合分析了SC3的进化关系，研究表明，SC3的16S rDNA序列与假单胞菌Pseudomonas fluorescens 48D1、和Pfo-1菌株的同源性达到最高的99%，进化系数与P. fluorescens 48D1最为相近（如图1），通过分析gyrB、rpoB和rpoD基因序列发现，SC3与P. fluorescens 48D1和LMG14673最为接近（如图2-4）。
综上，结合多个看家基因的***发育分析，将该生防菌鉴定为假单胞菌属的Pseudomonas fluorescens，命名为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）SC3。并将所述菌株于2018年4月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO.60367，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例3 假单胞菌SC3抑菌谱的测定
1、为了能够更好地研究本发明菌株SC3的生防潜力，我们对该菌的抑菌谱进行了研究。具体操作如下：
（1）探究SC3是否有抑制其他致病细菌生长的能力。使用与实施例1菌株筛选相同的方法，把致病菌MS2换成培养条件和方法相同的等量的水稻基腐病菌EC1、香蕉细菌性软腐病菌MS2和MS3、青枯病菌EP1（第一层15 mL的LB换成15 mL的TTC）、十字花科黑腐病菌Xcc、水稻白叶枯病菌Xoo、桃腐烂病菌Pantoea ananatis PP1、黄皮腐烂病菌Pantoea anthophila CL1，其余步骤不变。
（2）探究SC3是否有抑制致病真菌生长的能力。供测试的真菌包括辣椒炭疽菌、胶胞炭疽菌、香蕉枯萎病病菌、水稻纹枯病菌、稻瘟病菌、黑粉病菌。其中黑粉病菌使用平板对峙法。取20 mL的PDA于13×13的方形培养皿上倒板，待平板吹干后切成宽0.5 cm，长6 cm的长方形条，每块隔0.5 cm。取1 µL过夜培养的SC3菌液点于PDA条带的一端，3个一组，中间分别均匀点上黑粉菌“+”担孢子，“-”担孢子和两种担孢子等量混合的混合液。待菌液吹干后置于28℃培养箱倒置培养1-2天，观察黑粉菌的生长情况，待对照平板上形成白色绒毛状菌丝，记录试验结果。
其余真菌复苏后用0.5 cm打孔器打孔，把菌饼倒放在PDA板中央，在离菌饼相同距离的地方滴2 µL过夜培养的SC3，大肠杆菌DH5α菌液，待菌液吹干后，封口，正放在28℃培养箱里培养3-4天，观察菌丝的生长情况并记录实验结果。
2、实验结果发现，菌株SC3对水稻基腐病菌EC1、香蕉细菌性软腐病菌MS2和MS3、茄科青枯菌EP1、十字花科黑腐病菌Xcc、水稻白叶枯病菌Xoo具有很强的抑菌作用，对桃腐烂病菌Pantoea ananatis PP1、黄皮腐烂病菌Pantoea anthophila CL1抑菌作用不理想（如图5），对辣椒炭疽菌、胶胞炭疽菌、香蕉枯萎病菌、水稻纹枯病菌、稻瘟病病菌、黑粉病菌的抑菌效果较弱（图6），说明SC3可用于开发专门针对作物细菌性病害的生防试剂。
实施例4 假单胞菌SC3对细菌性软腐病的防效测定
1、在LB固体平板上活化香蕉细菌性软腐病菌MS2、生防菌SC3菌株，挑单菌落于含有10 mL LB的50 mL离心管中，放在28℃，180 rpm摇床过夜培养，取1 mL OD600约为1.3的SC3菌液与等量的MS2菌液混合。MS2菌液加入1 mL LB菌液混合作为正对照，LB培养基作为负对照。
不同处理分别接种萝卜、胡萝卜、大白菜、马铃薯和粉蕉苗。每处理3个重复。挑选12株长势相似的粉蕉苗，用1 mL注射器分别取200 µL的LB、MS2+LB、SC3+LB、SC3+MS2混合液注射到粉蕉的假茎，每种处理做3个重复，每天观察粉蕉苗的生长状况，做好记录。
2、实验结果表明，菌株SC3可显著降低萝卜、胡萝卜、大白菜、马铃薯（如图7）、粉蕉（如图8）上细菌性软腐病的发病率。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一株荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)SC3，其特征在于，于2018年4月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO.60367。
2.权利要求1所述荧光假单胞菌SC3在防治作物细菌性病害方面的应用，其特征在于，所述作物细菌性病害包括由Dickeya zeae或Erwinia引起的细菌性病害。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述细菌性病害包括细菌性软腐病、水稻细菌性基腐病、茄科青枯病、十字花科黑腐病或水稻白叶枯病。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述细菌性软腐病包括香蕉、粉蕉、君子兰、萝卜、胡萝卜、大白菜或马铃薯上的细菌性软腐病。
5.一种防治作物细菌性病害的生物制剂，其特征在于，包含权利要求1所述荧光假单胞菌SC3。
6.根据权利要求5所述生物制剂，其特征在于，荧光假单胞菌SC3的浓度为OD600 1.0～1.5。
7.一种防治作物细菌性病害的方法，其特征在于，将权利要求6所述生物制剂接种于植物材料即可。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述接种可采用注射接种法。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述接种可采用刺伤接种法。
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