CN109908216A - 一种复方物的提取方法及其在治疗焦虑性抑郁症的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复方物的提取方法及其在治疗焦虑性抑郁症的应用，涉及药物提取与应用技术领域，采用合欢花、柴胡、贯叶金丝桃、酸枣仁、川芎、人参、茯苓、钩藤和黄连九味中药为原料，并针对药材有效成分性质的不同，进行不同的提取步骤，最后采用超临界流体纯化，一方面提高药物的纯度，另一方面超临界流体提取率高，减少药效的损失，且绿色环保，能耗低，采用多种焦虑和抑郁的行为学评价方法对提出的复方物进行试验，表明复方物能改善大鼠HPA轴结构功能紊乱，可应用于调节焦虑，抑郁情绪。

Description

一种复方物的提取方法及其在治疗焦虑性抑郁症的应用

技术领域

本发明涉及药物提取与应用技术领域，特别是指一种复方物的提取方法及其在治疗焦虑性抑郁症的应用。

背景技术

随着社会竞争和生活工作上压力的日益增加，人们承受着各种远远大于自身承受力的压力，随着压力慢慢的挤压，人们的思维和做事风格逐渐被扭曲病变，同时产生严重的焦虑和抑郁情绪，临床称之为焦虑性抑郁症。焦虑性抑郁症是心理和精神上双重障碍性疾病，与单纯的抑郁症相比，其具有症状重、病程慢性化、社会功能损害重、***率高和预后差等特征，是全球死亡率的一个重要因素，WHO数据预测，到2020年，焦虑性抑郁症在残疾中的排名将上升到第二位。

焦虑性抑郁症的病理机制复杂，目前还没有形成统一的观点，但中医界的普遍观点是焦虑性抑郁症的发病是体质禀赋和情绪刺激相互作用的结果，以气滞结在先，脏腑虚损为本。目前调理该抑郁症的中药材也是多种多样，其中复方中药由于具有多成分、多靶点、多方面***地调节机体，有副作用小等优点，是最常用的调理药物，申请人在研究中药对焦虑性抑郁症的过程中发现：目前用于调整焦虑性抑郁症的复方中药，多是采用传统的直接煎服，不仅药效损失高，而且药味刺鼻反胃，不易下服。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种复方物的提取方法及其在治疗焦虑性抑郁症的应用，以解决现有技术中全部或者部分不足。

基于上述目的本发明提供的一种复方物的提取方法，将合欢花、贯叶金丝桃、川穹、钩藤和黄连，置于乙醇中浸泡1～5h，然后研磨成浆料，并超声处理1～3.5h，真空抽滤，得提取液和药渣，将药渣冷冻干燥，并加入酸枣仁、人参、茯苓和水，进行超微粉碎成糊粉，然后将糊粉与提取液混合均匀后，回流提取2～5次，将回流液合并，树脂吸附脱色、除味，将回流液进行超临界流体纯化后，得复方物。

在一些可选实施例中，所述复方物包括如下重量成分：合欢花14％、柴胡14％、贯叶金丝桃4.7％、酸枣仁15.6％、川芎14％、人参9.4％、茯苓15.6％、钩藤9.4％和黄连3.3％。

在一些可选实施例中，所述浆料中的乙醇为无水乙醇，料液比为1:18～30。

在一些可选实施例中，所述超声处理的功率130～200w，频率为0.1～0.5KHz。

在一些可选实施例中，所述冷冻干燥采用变温方式，第一阶段降温速率为0.5～1.5℃/min，降温至零下10～18℃后，保温冷冻1.5～4h，第二阶段降温速率为2.5～4℃/min，降温至零下25～28℃后，保温冷冻10～18h，第三阶段升温速率为0.8～1.7℃/min，升温至零下17～22℃后，保温冷冻10～20h。

在一些可选实施例中，所述树脂吸附为D101，流速10～20m/min，时间15～25min。

在一些可选实施例中，所述超临界流体纯化的流动相为CO₂和改善剂溶液，流速为15～20mL/min。

在一些可选实施例中，所述改善剂溶液为乙醇、甲醇、***中的任一种，且与CO₂的体积比为0.13～0.25。

在一些可选实施例中，所述超临界流体纯化的条件为：温度38～43℃，压力18～30Mpa，进样量为0.05～0.09mL。

一种复方物，采用所述的复方物的提取方法制备而成，且可应用于治疗和/或调节焦虑，抑郁情绪。

从上面所述可以看出，本发明提供的一种复方物的提取方法，首先将形态不同的中药分别进行处理，合欢花、贯叶金丝桃、川穹、钩藤和黄连形态相近，且有效药用活性物质溶解度相近，进行浸泡软化，然后再进行研磨，一方面在研磨挤压过程的中对药材内部纤维结构进行剪切作用，另一方面，挤压出药材浸泡时吸入的乙醇溶液，此过程为物理挤压提取，然后在超声的作用下，对药材的细胞进行二次的机械剪切和超声空化处理，有利于有效药物的析出；然后再将酸枣仁、人参、茯苓进行加水超微粉碎，水的作用是防止粉末的飞溅，防止原料的流失，再将提取液和糊粉混合进行回流提取，并采用树脂吸附脱色、除味，降低中药刺鼻气味，提高药物的下服性，最后再进行超临界流体纯化，一方面提高药物的纯度，另一方面超临界流体提取率高，减少药效的损失，且绿色环保，能耗低。

提取的复方物，经在大鼠身上试验，表明复方物能改善大鼠HPA轴结构功能紊乱，可应用于治疗和/或调节焦虑，抑郁情绪。

附图说明

图1为本发明实施例大鼠下丘脑组织形态学变化图；

图2为本发明实施例大鼠垂体组织形态学变化图；

图3为本发明实施例大鼠肾上腺组织形态学变化。

A-空白对照组，B-焦虑性抑郁症模型组，C-阳性药物组，D-复方物高剂量组，E-复方物中剂量组，F-复方物低剂量组。

具体实施方式

为下面通过对实施例的描述，本发明的具体实施方式如所涉及的制造工艺及操作使用方法等，作进一步详细的说明，以帮助本领域技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。

为了解决现有技术中全部或者部分不足，本发明提供的一种复方物的提取方法，将合欢花、贯叶金丝桃、川穹、钩藤和黄连，置于乙醇中浸泡1～5h，然后研磨成浆料，并超声处理1～3.5h，真空抽滤，得提取液和药渣，将药渣冷冻干燥，并加入酸枣仁、人参、茯苓和水，进行超微粉碎成糊粉，然后将糊粉与提取液混合均匀后，回流提取2～5次，将回流液合并，树脂吸附脱色、除味，将回流液进行超临界流体纯化后，得复方物。

首先将合欢花、贯叶金丝桃、川穹、钩藤和黄连形态相近，且有效药用活性物质溶解度相近，进行浸泡软化，然后再进行研磨，一方面在研磨挤压过程的中对药材内部纤维结构进行剪切作用，另一方面，挤压出药材浸泡时吸入的乙醇溶液，此过程为物理挤压提取，然后在超声的作用下，对药材的细胞进行二次的机械剪切和超声空化处理，有利于有效药物的析出；然后再将酸枣仁、人参、茯苓进行加水超微粉碎，水的作用是防止粉末的飞溅，防止原料的流失，再将提取液和糊粉混合进行回流提取，并采用树脂吸附脱色、除味，降低中药刺鼻气味，提高药物的下服性，最后再进行超临界流体纯化，一方面提高药物的纯度，另一方面超临界流体提取率高，减少药效的损失，且绿色环保，能耗低。

提取的复方物，经在大鼠身上试验，表明复方物能改善大鼠HPA轴结构功能紊乱，可应用于调节焦虑，抑郁情绪。

在一些可选实施例中，本发明实施例1提供的一种复方物的提取方法，其中，复方物包括如下重量成分：合欢花14％、柴胡14％、贯叶金丝桃4.7％、酸枣仁15.6％、川芎14％、人参9.4％、茯苓15.6％、钩藤9.4％和黄连3.3％。

按上述配方称取各成分，首先将14g合欢花、4.7g贯叶金丝桃、14g川穹、9.4g钩藤和3.3g黄连，置于无水乙醇罐中，保持料液比为1:25，然后密封罐口，常温下浸泡1～5h，然后解开罐盖，将料液一并倒入研磨机中，进行研磨成浆料，然后将浆料置于超声仪下，并在功率130～200w，频率为0.1～0.5KHz下超声处理1～3.5h，然后将浆料进行真空抽滤，得提取液和药渣，将药渣冷冻干燥，冷冻干燥采用变温方式，第一阶段降温速率为0.9℃/min，降温至零下15℃后，保温冷冻3h，第二阶段降温速率为3℃/min，降温至零下26.5℃后，保温冷冻16h，第三阶段升温速率为0.95℃/min，升温至零下20℃后，保温冷冻18h。

然后向干燥后的药渣中加入15.6g酸枣仁、9.4g人参、15.6g茯苓和水，水是为了防止药末的飞溅，采用喷洒的方式添加，水的添加量为药材0.03～0.1％将药材加入到超微粉碎机中，进行超微粉碎成糊粉，然后将糊粉与提取液混合均匀后，进行回流提取2～5次，将回流液合并，然后将合并液经过D101树脂，在控制流速10～20m/min，树脂吸附脱色、除味15～25min，除去中药的刺鼻气味和各种药中的杂质色，增加药物的色泽和下服口感与气味，最后将回流液进行超临界流体纯化，超临界流体纯化的流动相为(V/V)0.18％乙醇-SC-CO₂，流速为17.8mL/min，温度39.5℃，压力25Mpa，进样量为0.065mL，馏分收集器根据电脑输出的信号会自动收集馏分，得复方物。

本发明提供的实施例2中，冷冻干燥，第一阶段降温速率为0.5℃/min，降温至零下10℃后，保温冷冻1.5h，第二阶段降温速率为2.5℃/min，降温至零下25℃后，保温冷冻10h，第三阶段升温速率为0.8℃/min，升温至零下17℃后，保温冷冻10h；

超临界流体纯化的流动相为(V/V)0.13％乙醇-SC-CO₂，流速为15mL/min，温度38℃，压力18Mpa，进样量为0.05mL。

本发明提供的实施例3中，冷冻干燥，第一阶段降温速率为1.5℃/min，降温至零下18℃后，保温冷冻4h，第二阶段降温速率为4℃/min，降温至零下28℃后，保温冷冻18h，第三阶段升温速率为1.7℃/min，升温至零下22℃后，保温冷冻20h；

超临界流体纯化的流动相为(V/V)0.25％乙醇-SC-CO₂，流速为20mL/min，温度43℃，压力30Mpa，进样量为0.09mL。

将上述各个实施例中的超临界流体纯化的流动相变换成***-SC-CO₂，分别得到实施例4～6。

将实施例2中的超临界流体纯化的条件变换成超临界流体纯化的流动相为(V/V)0.25％乙醇-SC-CO₂，流速为20mL/min，温度43℃，压力30Mpa，进样量为0.09mL，得到实施例7。

将实施例3中的超临界流体纯化的条件变换成超临界流体纯化的流动相为(V/V)0.13％乙醇-SC-CO₂，流速为15mL/min，温度38℃，压力18Mpa，进样量为0.05mL，得实施例8。

本发明实施例制备的样品在大鼠身上做了如下测试。

1、材料与方法

动物：SPF级健康雄性SD大鼠，雄性，体质量(180±20)g，购于斯贝福(北京)实验动物科技有限公司，实验开始前，于SPF级动物房适应性饲养5d，保持饲养温度(23±1)℃，环境湿度为40～70％。

药物与试剂：实施例1制备的复方物，葡萄糖，市售普通款，盐酸文拉法辛缓释胶囊，北京万生药业有限责任公司生产。PV6001-试剂盒，DAB-显色试剂盒，苏木素，伊红(HE)染色试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司；皮质酮，北京索莱宝生物科技有限公司。

测试仪器：大鼠游泳装置，高架十字迷宫，敞箱，斯金纳箱，成都泰盟科技公司，全自动石蜡切片机，美国Thermo Fisher Scientific公司；光学显微镜，德国ZEISS公司；CMIAS-多功能真彩色病理图像分析***，北京麦克奥迪图像技术有限公司。

2、建立模型与给药

筛选出72只大鼠，按随机数字表法分成6组：A组-空白对照组(普通喂养)，B组-焦虑性抑郁症模型组(普通喂养)，C组-阳性药物组(盐酸文拉法辛0.008g/kg)，D组-复方物高剂量组(15g/kg)，E组-复方物中剂量组(8g/kg)，G组-复方物低剂量组(2g/kg)。采用慢性束缚应激(6h)联合皮质酮注射(30mg/kg)的方法建立焦虑性抑郁症大鼠模型，造模同时灌胃给药，连续21d，末次给药1h后进行实验测试。

数据处理：实验结果数据釆用Graphpad prism5.0软件进行统计分析，计数资料数据。其余计量资料数据以表示。

3.各组大鼠体重变化

空白对照组大鼠体重值随着实验时间的延长而明显增加；焦虑性抑郁症模型组大鼠体重值前期保持不变，随后有下降趋势，与对照组比较，从第2周开始具有统计学差异(P<0.05)；与模型组比较，在第2周开始复方物高剂量和阳性物组可明显改善大鼠体重减少情况(P<0.05)。上述结果表明，焦虑性抑郁症大鼠在长期应激模式会出现食欲不振等情况导致体重值下降，复方物高剂量可以改善模型大鼠食欲和增加其体重值。见表1。

表1各组大鼠体重变化(n＝12,g)

^*P﹤0.05，^**P﹤0.01vsA组,；^#P﹤0.05，^##P<0.01vsB组，下同。

4、大鼠焦虑-抑郁样行为学变化

4.1大鼠焦虑样行为检测

(1)高架十字迷宫实验

与空白对照组比较，焦虑性抑郁症模型组大鼠穿臂总次数(OE+OT)、进入开臂次数百分比(OE％)、进入开臂时间百分比(OT％)下降(P＜0.05，P＜0.01)，与模型组比较，复方物高剂量组大鼠OE+CE、OE％和OT％值均明显上升(P＜0.05)。见表2。

表2各组大鼠OE+CE、OE％、OT％值比较(n＝12)

(2)场景恐惧实验

与空白对照组比较，焦虑性抑郁症模型组大鼠僵住反应(Freezing)时间百分比值显著增加，(P＜0.01)；与模型组比较，复方物高、中剂量组大鼠Freezing百分比明显减少(P﹤0.05，P＜0.01)见表3。

表3各组大鼠Freezing时间百分比(n＝12,％)

分组	Freezing时间百分比
		A组	20.71±5.31
B组	81.20±9.57**
		C组	36.78±7.05<sup>##</sup>
D组	39.84±7.91<sup>##</sup>
		E组	54.91±6.78<sup>#</sup>
F组	76.76±10.31

上述结果表明，焦虑性抑郁症模型大鼠存在内心冲突、恐惧等焦虑样行为，而复方物高、中剂量能较好地改善该情绪行为。

4.2大鼠抑郁样行为检测

(1)旷场实验

与空白对照组比较，焦虑性抑郁症模型组大鼠自主活动次数明显减少(P＜0.01)；与模型组比较，复方物高、中剂量组大鼠自主活动次数均显著增加(P﹤0.05，P＜0.01)。见表4。

表4各组大鼠自主活动次数(n＝12)

分组	自主活动次数
		A组	50.71±10.24
B组	19.53±4.29**
		C组	44.91±6.92<sup>##</sup>
D组	47.97±7.65<sup>##</sup>
		E组	38.07±5.07<sup>#</sup>
F组	21.47±3.97

(2)强迫游泳实验

与空白对照组比较，焦虑性抑郁症模型组大鼠强迫游泳不动时间显著增加(P＜0.01)；与模型组比较，复方物高、中剂量组均能显著降低不动时间(P＜0.01)。见表5。

表5各组大鼠强迫游泳不动时间(n＝12,s)

分组	不动时间
		A组	8.27±1.54
B组	59.75±10.08**
		C组	20.91±4.42<sup>##</sup>
D组	22.07±3.99<sup>##</sup>
		E组	31.78±5.41<sup>##</sup>
F组	45.11±6.98

上述结果表明，焦虑性抑郁症模型大鼠存在不爱运动、行为绝望等抑郁样行为，经复方物治疗后其抑郁样行为明显缓解，疗效与阳性药物相当。

5、HPA轴结构功能变化

(1)下丘脑形态结构变化

正常大鼠下丘脑神经元细胞分布均匀，形态正常；模型大鼠下丘脑神经元数量明显减少，部分胞体破裂、萎缩，胞核深染，胶质细胞增生；阳性药物组和复方物高、中剂量组大鼠下丘脑神经元排列较为规则，胞体肿胀、萎缩等病变情况有所缓解。见图1。

(2)垂体形态结构变化

正常大鼠垂体嗜酸、嗜碱性细胞均匀分布，形态规则；模型大鼠嗜碱性细胞增多，部分胞体肿胀，排列无序；阳性药物组和复方物高剂量组大鼠垂体嗜酸、嗜碱性细胞分布基本均匀，无明显病变现象。见图2。

(3)肾上腺形态结构变化

正常大鼠肾上腺皮质束状带和网状带细胞界限清晰，呈行状排列；模型大鼠肾上腺皮质细胞胞核增大，胞浆空泡样或空网状增多，处于功能亢进状态；阳性药物模型组和复方物高剂量组大鼠肾上腺皮质细胞形态、排列均趋于正常。见图3。

(4)HPA轴功能指标检测

与空白对照组比较，焦虑性抑郁症模型组大鼠血浆CRH、ACTH、CORT含量均显著升高(P＜0.01)；与模型组比较，复方物高剂量组大鼠CRH、ACTH、CORT含量均下降(P＜0.05，P＜0.01)。结果表明，焦虑性抑郁症大鼠HPA轴功能亢进明显，而复方物能有效降低其高亢状态，恢复HPA功能。见表6。

表6各组大鼠血浆CORT、ACTH、CRH含量比较(n＝12,ng/L)

分组	CRH	ACTH	CORT
				A组	4.87±0.95	1.86±0.96	7.95±1.18
B组	12.76±0.73**	7.27±1.30**	14.47±1.29**
				C组	8.71±1.55	3.92±1.07<sup>#</sup>	10.25±0.96<sup>#</sup>
D组	7.83±1.37<sup>#</sup>	4.20±0.72<sup>#</sup>	10.65±0.78<sup>#</sup>
				E组	10.24±1.57	6.58±0.79	12.22±1.54
F组	11.13±0.93	7.18±0.93	13.27±1.86

本实验综合采用多种焦虑和抑郁的行为学评价方法，为焦虑性抑郁症动物模型评价及治疗药物筛选提供了最基础最直接的判断依据。在高架十字迷宫和场景恐惧测试中，焦虑性抑郁症模型大鼠穿臂总次数、进入开臂次数和时间百分比均明显减少，Freezing时间比增加，模拟了临床焦虑症患者内心冲突、情景恐惧等焦虑情绪；在旷场实验和强迫游泳测试中，模型大鼠自主探究活动次数明显减少，强迫游泳不动时间显著增加，模拟了临床抑郁症患者不爱运动、行为绝望等抑郁特征。在给予复方物治疗后，上述结果皆出现明显逆转，模型大鼠的焦虑和抑郁样行为均得以改善，与临床治疗焦虑性抑郁症的一线用药文拉法辛效果一致。

在精神疾病的发病过程中，由应激引发的神经内分泌***的改变甚是瞩目，HPA轴结构损伤与功能亢进是其最重要的生理病理改变之一。HPA轴作为人体应激反应重要的反馈调节***，是神经内分泌网络的枢纽，通过调节体内各级的内分泌腺和激素水平维持机体内环境平衡。当外界应激性刺激作用于机体时，下丘脑室旁核部位大量合成并释放促肾上腺皮质激素(CRH)，CRH特异性作用于垂体前叶膜受体CRHR1并激活G-蛋白偶联受体，使垂体释放出促肾上腺皮质激素(ACTH)，随体循环作用于肾上腺皮质细胞，合成并释放GCs。GCs分为皮质醇和皮质酮两种，在啮齿动物中主要以皮质酮(CORT)形式存在。GCs浓度升高后能通过负反馈***抑制CRH和ACTH的释放。研究表明，持续的焦虑情绪会激活HPA轴，而焦虑性抑郁症患者较单一的抑郁症患者具有更强的HPA轴活性。HPA轴过分亢进所产生的GCs可透过血脑屏障损伤脑内富含其受体的海马组织，而海马是机体学习记忆功能与情绪行为的调节中心，其损伤后会进一步导致情绪失调，加重焦虑抑郁情绪。本研究发现，焦虑性抑郁症模型大鼠HPA轴结构损伤，功能亢进，在给予高剂量的复方物治疗后，模型大鼠HPA轴损伤情况明显缓解。

综上，本发明实施例制备的复方物可能通过保护焦虑性抑郁症模型大鼠HPA轴结构功能紊乱从而改善其焦虑抑郁样症状，可应用于调节焦虑，抑郁情绪。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。

本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种复方物的提取方法，其特征在于，将合欢花、贯叶金丝桃、川穹、钩藤和黄连，置于乙醇中浸泡1～5h，然后研磨成浆料，并超声处理1～3.5h，真空抽滤，得提取液和药渣，将药渣冷冻干燥，并加入酸枣仁、人参、茯苓和水，进行超微粉碎成糊粉，然后将糊粉与提取液混合均匀后，回流提取2～5次，将回流液合并，树脂吸附脱色、除味，将回流液进行超临界流体纯化后，得复方物。

2.根据权利要求1所述的复方物的提取方法，其特征在于，所述复方物包括如下重量成分：合欢花14％、柴胡14％、贯叶金丝桃4.7％、酸枣仁15.6％、川芎14％、人参9.4％、茯苓15.6％、钩藤9.4％和黄连3.3％。

3.根据权利要求1所述的复方物的提取方法，其特征在于，所述浆料中的乙醇为无水乙醇，料液比为1:18～30。

4.根据权利要求1所述的复方物的提取方法，其特征在于，所述超声处理的功率130～200w，频率为0.1～0.5KHz。

5.根据权利要求1所述的复方物的提取方法，其特征在于，所述冷冻干燥采用变温方式，第一阶段降温速率为0.5～1.5℃/min，降温至零下10～18℃后，保温冷冻1.5～4h，第二阶段降温速率为2.5～4℃/min，降温至零下25～28℃后，保温冷冻10～18h，第三阶段升温速率为0.8～1.7℃/min，升温至零下17～22℃后，保温冷冻10～20h。

6.根据权利要求1所述的复方物的提取方法，其特征在于，所述树脂吸附为D101，流速10～20m/min，时间15～25min。

7.根据权利要求1所述的复方物的提取方法，其特征在于，所述超临界流体纯化的流动相为CO₂和改善剂溶液，流速为15～20mL/min。

8.根据权利要求7所述的复方物的提取方法，其特征在于，所述改善剂溶液为乙醇、甲醇、***中的任一种，且与CO₂的体积比为0.13～0.25。

9.根据权利要求1所述的复方物的提取方法，其特征在于，所述超临界流体纯化的条件为：温度38～43℃，压力18～30Mpa，进样量为0.05～0.09mL。

10.一种复方物，其特征在于，采用权利要求1～9任一所述的复方物的提取方法制备而成，且可应用于治疗和/或调节焦虑，抑郁情绪。