CN108998530B - 肺癌上调长链非编码rna标志物及其应用 - Google Patents
肺癌上调长链非编码rna标志物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种肺癌上调长链非编码RNA标志物及其应用,该标志物为AC089998.4、AC103925.1、AC113189.2、AC130324.2、AC239868.1、AL031985.3、AL079303.1、AL121902.1、AP000873.3、PCAT6和PVT1的组合。这类标志物可以单独或两种或两种以上组合来进行肺癌的早期诊断。本发明提供的肺癌标志物共11种,具有准确性高,灵敏度高的特点,这11种标志物预测线下面积AUC都大于0.9,提示这11种标志物具有确性高,敏感度高的特点。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体地说,涉及一种肺癌上调长链非编码RNA标志物及其应用。
背景技术
肺癌是中国以及全球发病率最高的恶性肿瘤,也是导致男性癌症死亡的首要原因。在女性人群中肺癌的发生率仅次于乳腺癌。全球疾病负担(Global Burden ofDisease,GBD)数据显示,2016年全球患有气管、支气管或肺癌的人数超过280万,其中中国患病人数高达100万。2016年全球患有上述癌症的死亡人数为170万,占总死亡人数的3.12%。中国2016年死亡患者数为59万,占总死亡人数的6.11%。统计结果显示,从1990年到2016年全球气管、支气管和肺癌患病率和死亡率持续增长,中国患病率和死亡率也持续增长且增长趋势和全球增长趋势相对一致。
中国云南是癌症高发区之一,特别是女性肺癌发病率是世界上最高的地区之一。云南省肺癌平均发病率为44人/10万人,是全国平均发病率的两倍。其中,云南省宣威地区肺癌发病率位居全国第一。宣威肺癌的发病机制尚不清楚。从近几年统计来看,宣威、富源等以采矿业较为集中的地区发病率较高,因此临床上不排除环境污染与肺癌的关系。目前针对肺癌尚无有效的治疗手段。早期肺癌患者可通过手术治疗达到较好的预后,因此肺癌的早发现早预防早治疗,防止疾病进展,避免临床失代偿性并发症的出现是肺癌治疗的基本原则。由于肺具有较强的代偿性,早期肺癌往往并不表现出明显的临床症状,而到了症状较明显时,往往已到了肺癌晚期。因此发现肺癌的诊断标志物具有良好的临床意义及应用价值。
临床上用于确诊肺癌的手段主要依靠超声影像并由肺穿刺进行确诊。超声诊断的灵敏度较低,而肺穿刺对患者的肺部有损伤,存在风险,不易推广,导致很多患者直到肺癌失代偿期才被确诊。最近有研究发现血清的代谢标志物可以作为肺癌诊断,但是其敏感度与特异性有待提高,目前尚未被临床采用作为肺癌诊断的指标。
发明内容
有鉴于此,本发明针对提供了一种肺癌上调长链非编码RNA标志物及其应用,长链非编码RNA(lncRNA)具有结构稳定,容易检测等特点。可以作为肺癌诊断的候选标志物。
为了解决上述技术问题,本发明公开了一种肺癌上调长链非编码RNA标志物,该标志物为AC089998.4、AC103925.1、AC113189.2、AC130324.2、AC239868.1、AL031985.3、AL079303.1、AL121902.1、AP000873.3、PCAT6和PVT1的组合。
可选地,AC089998.4、AC103925.1、AC113189.2、AC130324.2、AC239868.1、AL031985.3、AL079303.1、AL121902.1、AP000873.3、PCAT6和PVT1的核苷酸探针序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.11所示。
本发明还公开了一种上述的肺癌上调长链非编码RNA标志物在制备肺癌早期诊断产品中的应用,所述诊断产品包含检测所述一种或多种标志物的试剂,所述试剂通过检测受试者标本中所述一种或多种标志物的浓度来判断受试者是否患有肺癌。
可选地,所述标本是肺组织或血液。
可选地,所述试剂是基于基因芯片检测或实时荧光定量PCR检测所述一种或多种标志物浓度时所需的试剂。
可选地,所述标志物AC089998.4和/或AC103925.1和/或AC113189.2和/或AC130324.2和/或AC239868.1和/或AL031985.3和/或AL079303.1和/或AL121902.1和/或AP000873.3和/或PCAT6和/或PVT1在肺癌患者肺组织或血液中的浓度与正常对照浓度相比显著增加。
可选地,所述诊断产品是试剂盒、芯片或检测平台。
本发明还公开了一种肺癌早期诊断试剂盒,该试剂盒用于检测肺组织或血液中AC089998.4和/或AC103925.1和/或AC113189.2和/或AC130324.2和/或AC239868.1和/或AL031985.3和/或AL079303.1和/或AL121902.1和/或AP000873.3和/或PCAT6和/或PVT1。
与现有技术相比,本发明可以获得包括以下技术效果:
本发明提供的肺癌标志物具有准确性高,灵敏度高的特点。本发明中的11种标志物,其AUC均超过了0.9。提示其准确性与敏感度均达到90%以上,可以直接用作肺癌的指标。
当然,实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解,构成本发明的一部分,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1是本发明AC010776.2肺癌标志物在正常以及肿瘤组织表达值变化以及对应的ROC曲线;其中,A:AC010776.2在正常以及肿瘤组织表达值变化。B:AC010776.2对应的ROC曲线;
图2是本发明AC027277.2肺癌标志物在正常以及肿瘤组织表达值变化以及对应的ROC曲线;其中,A:AC027277.2在正常以及肿瘤组织表达值变化。B:AC027277.2对应的ROC曲线;
图3是本发明AC091588.3肺癌标志物在正常以及肿瘤组织表达值变化以及对应的ROC曲线;其中,A:AC091588.3在正常以及肿瘤组织表达值变化。B:AC091588.3对应的ROC曲线;
图4是本发明本发明AC093110.1肺癌标志物在正常以及肿瘤组织表达值变化以及对应的ROC曲线;其中,A:AC093110.1在正常以及肿瘤组织表达值变化。B:AC093110.1对应的ROC曲线;
图5是本发明AC135178.1肺癌标志物在正常以及肿瘤组织表达值变化以及对应的ROC曲线;其中,A:AC135178.1在正常以及肿瘤组织表达值变化。B:AC135178.1对应的ROC曲线;
图6是本发明AL024497.2肺癌标志物在正常以及肿瘤组织表达值变化以及对应的ROC曲线;其中,A:AL024497.2在正常以及肿瘤组织表达值变化。B:AL024497.2对应的ROC曲线;
图7是本发明AL109741.1肺癌标志物在正常以及肿瘤组织表达值变化以及对应的ROC曲线;其中,A:AL109741.1在正常以及肿瘤组织表达值变化。B:AL109741.1对应的ROC曲线;
图8是本发明AL136369.1肺癌标志物在正常以及肿瘤组织表达值变化以及对应的ROC曲线;其中,A:AL136369.1在正常以及肿瘤组织表达值变化。B:AL136369.1对应的ROC曲线;
图9是本发明AL355499.1肺癌标志物在正常以及肿瘤组织表达值变化以及对应的ROC曲线;其中,A:AL355499.1在正常以及肿瘤组织表达值变化。B:AL355499.1对应的ROC曲线;
图10是本发明AL359378.1肺癌标志物在正常以及肿瘤组织表达值变化以及对应的ROC曲线;其中,A:AL359378.1在正常以及肿瘤组织表达值变化。B:AL359378.1对应的ROC曲线;
图11是本发明AL589935.1肺癌标志物在正常以及肿瘤组织表达值变化以及对应的ROC曲线;其中,A:AL589935.1在正常以及肿瘤组织表达值变化。B:AL589935.1对应的ROC曲线。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式,藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例1肺癌诊断标志物:
本发明提供的肺癌标志物共11种,包括:AC089998.4,AC103925.1,AC113189.2,AC130324.2,AC239868.1,AL031985.3,AL079303.1,AL121902.1,AP000873.3,PCAT6,PVT1;这11种标志物的核苷酸探针序列如表1所示:
表1. 11种标志物的核苷酸探针序列
标志物 | 核苷酸探针序列 |
AC089998.4 | AAGACAGTGGAATACTGTTTGTCTCCATACTGTCAATGCCCAGCGTAATCTCTGACAAAT |
AC103925.1 | ACAATCCTCTTTTCAATAATAACGGGGAGCTGGGCATGTCCCATTCTGAACGTGAACCAT |
AC113189.2 | TTACGGATGAGTTCTGGAAAAGACCCAGCTATGATTCATAAAAACACTTCTGGATGAATC |
AC130324.2 | AGGTGTCGTACAGTCTTTGTTGCTGTCAACAGGTACTGATTCAGGTGACTTTATCTTGCA |
AC239868.1 | CGCCGCAGTATGCTTAACATGTATTTTCTAAGTTTGTATTATGCCTTTATCTTGGTACTT |
AL031985.3 | CTATGGTCTTAGATTTCCCAAGAATTTGAATTTCTCCAATTGCTTATTTCCCTGAAAGAC |
AL079303.1 | TGTGTGGTATGGTGTCTGAGCCAATGGTCGGCATTCGTCTTCCCCAAGTGCGGAAAAGAG |
AL121902.1 | CAAGCTGGGCAATGAGAAAATCTAACTCTTCATGTGTTATTCCCAATAAATCAGTTATGA |
AP000873.3 | AGATTCCTCCATTCAGATTCAGACATCAAATGGGTTTTACGGACCAGCTTGGCTATGTCC |
PCAT6 | GCTGAGGATGGAGCTTTGGGCTGGACAAAGAAGAATCTGGTTGACCACATGAAGCAGGAA |
PVT1 | CCCAAAATACAGTCTTTGTGTTGCCATCTGGGAACTGGATTTGGAATTGTTCTTCCATGA |
实施例2:肺癌诊断标志物的筛查及鉴定
本发明中采用基因芯片或实时荧光定量PCR方法来筛查并鉴定标志物,但鉴定的方面并不一定限于以上方法,其它方法如化学分析方法也同样适用于标志物的筛查于鉴定。在本发明中以肺组织为例对标志物的筛查于鉴定进行说明:
1、获取受试者样品,并进行前处理:
手术提取23例肺癌患者的肺肿瘤组织和正常肺部组织,采用Trizol(Invitrogen公司,美国)提取组织块或细胞中的总RNA。并进一步采用 RNA clean-up试剂盒(Macherey Nagel公司,德国)对总RNA进行过柱纯化。然后用分光光度计方法进行定量,用琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。
2、将前处理过肿瘤和正常组织样品进行芯片检测(参照晶芯lncRNA+mRNA表达谱芯片实验);
2.1反转录合成第一链cDNA:以Total RNA起始,含有T7启动子序列的T7 Oligo(dT)Primer和T7-特异引物,既可以结合带poly(A)的mRNA,也可以结合除rRNA以外其它不带poly(A)的RNA,使用第一链Enzyme Mix(市购)合成第一链cDNA。
2.2合成第二链DNA:用第二链Enzyme Mix(市购)将DNA-RNA杂合体中的RNA链转化为第二链cDNA,合成双链DNA。
2.3体外转录合成cRNA:以第二链cDNA为模板,用T7 Enzyme Mix(市购)合成cRNA。
2.4cRNA纯化:使用RNA纯化柱纯化cRNA,除去反应中的盐、酶等试剂,并对cRNA进行定量、质控。
2.5反转录:以cRNA为模板,Random Primer为引物,CbcScriptⅡ酶进行反转录。纯化回收反转录得到的cDNA并定量。
2.6标记:以反转录的cDNA产物为模板,Random Primer为引物,用KlenowFragment酶合成cDNA互补链并掺入带有荧光基团的dNTP(单通道为Cy3-dCTP,双通道为Cy3-dCTP和Cy5-dCTP),纯化并定量标记产物用于芯片杂交。
2.7杂交结束后,取出芯片在博奥Slide Washer8芯片洗干仪进行清洗。清洗程序完成后,离心甩干。使用Agilent芯片扫描仪(G2565CA)对清洗后的芯片进行扫描,得到杂交图片。使用Agilent Feature Extraction(v10.7)软件对杂交图片进行分析并提取原始数据。
3、lncRNA标志物筛选:
首先通过Ensembl数据库(http://asia.ensembl.org/index.html)对所有的lncRNA进行注释,选取数据库中有明确记录的lncRNA。进一步,采用配对样本t检验计算肿瘤与正常组之间的显著差异的lncRNA,显著差异筛选标准为倍数变化的绝对值大于1.5且P值小于0.05,筛选在肿瘤组织中显著上调的lncRNA。然后使用R语言(v3.4.0版本,https://www.r-project.org/)中的pROC程序包(https://web.expasy.org/pROC/)对每个显著上调的lncRNA进行ROC分析并计算AUC,选取AUC大于0.9的显著上调的lncRNA作为肺癌预测指标。
4、在受试者的组织样本中测定本发明中所述一种或两种标志物的水平:将受试者样品中的一种或两种标志物与对照样品中11个标志物物中的一种或多种标志物的水平相比较,受试者样品中的一种或多种标志物的水平的差异指示所述受试者具有肺癌病变。
其中:所述对照样品可以是正常肺组织的样品;所述差异是指受试者标志物的水平与正常组相比具有显著性(P<0.05)。
通过对23个肺癌病人正常以及肿瘤组织的前瞻性研究,各标志物在肺癌病人中的变化及对应的预测线下面积ROC如表1。
表1:各标志物在肺癌病人中的变化及对应的预测线下面积
用于本发明的组合物和方法的标志物的准确性可通过作受试者工作特征曲线(ROC)来表征。ROC是对于诊断标志物的不同可能的割点的真阳性率相假阳性率的曲线。ROC曲线显示灵敏性和特异性之间的关系。即是说,灵敏性的增加将伴随特异性的降低。曲线越靠近ROC空间的左轴,然后顶缘,标志物越准确。相反地,曲线越靠近ROC图的45度对角线,标志物越不准确。ROC下的面积是标志物准确性的度量。标志物的准确性取决于标志物如何适当地将待测试的组分成具有所述疾病的组和不具有所述疾病的组。曲线下面积(AUC)为1表示完美的标志物,而面积为0.5表示有用性较差的标志物。
从表1可见,所有的11个标志物预测线下面积AUC都大于0.9。AUC值表示标志物的预测能力,AUC=1表示能100%准确鉴定肺癌。因此,从表1可以看出本发明提供的肺癌诊断标志物具有确性高,敏感度高的特点。
所述11种肺癌标志物在正常组织和肿瘤组织中的详细变化见附图1-11A;所述11种肺癌标志物对应的ROC曲线见附图1-11B;由图1-图11可知,这11个肺癌诊断标志物在正常组织和肿瘤组织中具有显著的差异性,并且具有较好的预测精度。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例,但如前所述,应当理解发明并非局限于本文所披露的形式,不应看作是对其他实施例的排除,而可用于各种其他组合、修改和环境,并能够在本文所述发明构想范围内,通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围,则都应在发明所附权利要求的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 昆明医科大学第一附属医院
<120> 肺癌上调长链非编码RNA标志物及其应用
<130> 2018
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
aagacagtgg aatactgttt gtctccatac tgtcaatgcc cagcgtaatc tctgacaaat 60
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
acaatcctct tttcaataat aacggggagc tgggcatgtc ccattctgaa cgtgaaccat 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
ttacggatga gttctggaaa agacccagct atgattcata aaaacacttc tggatgaatc 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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aggtgtcgta cagtctttgt tgctgtcaac aggtactgat tcaggtgact ttatcttgca 60
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<212> DNA
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<400> 11
cccaaaatac agtctttgtg ttgccatctg ggaactggat ttggaattgt tcttccatga 60
Claims (5)
1.肺癌上调长链非编码RNA标志物的检测试剂在制备肺癌早期诊断产品中的应用,其特征在于,所述诊断产品包含检测AC089998.4标志物的试剂,所述试剂通过检测受试者标本中所述AC089998.4标志物的浓度来判断受试者是否患有肺癌,所述AC089998.4标志物的核苷酸探针序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述标本是肺组织。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述试剂是基于基因芯片检测或实时荧光定量PCR检测所述标志物浓度时所需的试剂。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述标志物AC089998.4在肺癌患者肺组织中的浓度与正常对照浓度相比显著增加。
5.一种肺癌早期诊断试剂盒,其特征在于,该试剂盒用于检测肺组织中AC089998.4。
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