CN110387421A - 用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术和DNA检测技术领域，尤其涉及一种用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及其使用方法，具体而言，涉及一种利用血浆游离DNA进行甲基化qPCR以确定一个或多个基因靶点(例如SHOX2和SOX17)的甲基化状态来用于肺癌检测或筛查的试剂盒及其使用方法，经实验测试，本发明试剂盒能够显著提高早期肺癌的阳性检出率和特异性，可将生物标记物的检测灵敏度提高到皮克/纳克级DNA分子，检测灵敏度的提高是通过优化特定核苷酸序列引物及DNA探针以及改进血浆游离DNA的亚硫酸氢盐处理方法来实现的。

Description

用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及使用方法
技术领域
本发明属于生物技术和DNA检测技术领域，尤其涉及一种用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及其使用方法，具体而言，涉及一种利用血浆游离DNA进行甲基化qPCR以确定一个或多个目标基因靶点(例如SHOX2和SOX17)的甲基化状态来用于肺癌检测或筛查的试剂盒及其使用方法，此外，本发明还涉及上述检测试剂盒在生物医学中的应用。
背景技术
肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率列癌症死亡第一位。据美国癌症协会统计，2018年仅在美国就有大约234030例新发肺癌病例和154050例肺癌死亡病例，估计肺癌死亡人数大约相当于结肠癌、乳腺癌、***癌、白血病和非霍奇金淋巴瘤死亡人数的总和。
临床数据显示，肺癌的预后与确诊时的临床分期密切相关，0期肺癌患者的术后5年生存率为90％，Ia期肺癌患者的术后5年生存率为60％，而II-IV期患者的5年生存率则从40％下降到5％以下。因此，争取“早期发现、早期诊断、早期治疗”，是降低肺癌死亡率的重要措施。然而目前的临床现实是，由于肺癌早期症状并不明显，且受到诊断手段的限制，约75％的患者在中晚期才被诊断出来，从而丧失了最佳的治疗窗口。
临床中肺癌的初步诊断主要通过影像学方法CT扫描发现肺结节进行判断，但CT扫描不能判断结节的良恶性。而肺癌组织病理活检作为肺癌诊断的金标准，往往需要通过CT引导下穿刺、胸膜腔穿刺技术、支气管镜下技术或胸腔镜技术等侵入性方法予以获得肿瘤组织或者细胞进而实施，然而，上述技术均存在感染、出血、气胸、甚至死亡等风险。因此，利用非侵入性方法辅助肺癌早期筛查及诊断在临床上有着极为广阔的应用前景。
液体活检是用检测分子生物标志物来替代传统组织活检的非侵入性方法，其用于分析的生物样品(如DNA)可以从血液、尿液、唾液、痰液或组织样本中获得。与传统的癌症诊断方法相比，液体活检具有以下优势：
1.易取得，液体活检样本可从尿液、唾液和胸腔积液中获得；
2.比传统的肿瘤活组织检查更少侵入性；
3.能取样所有可能的癌细胞，而非仅局限于肿瘤活检的某部分；
4.便于早期发现癌症；
5.能用于监测肿瘤动态(治疗前、治疗间和治疗后)；
6.具有能作为理想识别标靶治疗因子的潜力。
坏死或凋亡的细胞释放到血液中的DNA，被称为循环游离DNA(circulating freeDNA，cfDNA)，然而在肿瘤患者的血液中，一部分cfDNA来自死亡的肿瘤细胞，这部分DNA就被定义为循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)，其主要是由单链或双链DNA以及单链与双链DNA的混合物组成，以DNA蛋白质复合物或游离DNA两种形式存在，这些ctDNA多为大约134-144bp的DNA片段，并携带一定的肿瘤特征(包括异常甲基化、突变、缺少、***、拷贝数等)。较早期的癌症(意味着肿瘤尺寸较小且癌细胞较少)，释放较少的游离循环肿瘤ctDNA，而其浓度更小于游离cfDNA；当肿瘤负荷增加时，患者的ctDNA水平会升高。迄今为止，ctDNA是获得癌症患者血液中分子肿瘤相关改变的诊断、预后、以及预测信息的最佳材料。
DNA甲基化改变是癌症进程中最早发生的分子变化之一，且具有组织特异性，肿瘤抑制基因的高甲基化水平已被确定为抑制基因表达和促进癌细胞生长和扩增的重要机制。在肺癌中，TAC1、HOXA9、SHOX2、SOX17、PTGER4和其它基因中的CpG(胞嘧啶(C)后接续鸟苷(G))的高甲基化已被认为是癌症的生物标记之一。因此，对这些基因中的一种或多种的甲基化状态进行分析可用于诊断肺癌的状态。
ctDNA的甲基化分析可以为癌症诊断提供了一个可行的选择，但临床上使用ctDNA辅助癌症诊断和疗法选择的主要挑战，仍在于如何开发高灵敏度的检测方法以便在高cfDNA背景水平中区分微弱的ctDNA信号，特别是对于ctDNA浓度可能至pg/mL程度的早期诊断，对检测方法的灵敏度和选择性要求更高。然而，目前的检测试剂盒由于受到DNA提取方法不佳、亚硫酸氢盐处理量差、用于检测甲基化DNA的引物或者探针设计不佳等定量PCR方法的限制，并不能很好地利用ctDNA甲基化基因进行肺癌的早期筛查和辅助诊断。
Epigenomics公司生产的Epi proLung试剂盒，其检测针对肺癌的SHOX2和PTGER4的甲基化状态。然而，早期检测肺癌标记物的最佳方案来自Hulbert A等人2017年的报道(Hulbert A et.al.Early Detection of Lung Cancer Using DNA PromoterHypermethylation in Plasma and Sputum.Clin Cancer Res.2017,23(8):1998-2005.doi:10.1158/1078-0432)，该小组指出，SOX17、TAC1和CDO1的组合在预测早期患者的癌症方面表现最佳(IA-IIA期)，针对这三个基因的甲基化检测使得他们可以对肺癌早期检测达到93％和62％的特异性和敏感性。在上述资料的基础上，我们通过更加广泛和深入的研究，发现了可用于早期肺癌筛查的更好的甲基化基因靶点，并设计出数套可针对这些靶点进行甲基化检测的引物及探针组合，我们的方案可取得更高的检测特异性和敏感度，利用新发现的基因靶标检测组合制成了早期肺癌的检测和筛查试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于肺癌早期诊断、检测或者筛查的血液多基因联合检测引物探针组合试剂盒，以解决现有技术中存在的检测方法特异性和敏感性过低的缺陷。
为实现上述目的，一方面，本公开提供了一种用于肺癌早期诊断、检测或者筛查以及肺癌复发检测的试剂盒，其包含三组引物和探针的组合：(1)甲基化的SHOX2基因的正向引物、反向引物和探针；(2)甲基化的SOX17基因的正向引物、反向引物和探针；(3)内部参照基因ACTB的正向引物、反向引物和探针。
首先，本发明公开了一种用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒，其通过检测或测量受试样品DNA中一种或多种特定基因的甲基化状态或水平来筛查和诊断肺癌，本发明试剂盒中包含下述组成部分：
(1)用于检测SHOX2基因甲基化状态的特异性引物和探针选自下述三种特异性引物和探针组合中的任一种：特异性引物SEQ ID NO:1-2和探针SEQ ID NO:3、特异性引物SEQID NO:4-5和探针SEQ ID NO:6、特异性引物SEQ ID NO:7-8和探针SEQ ID NO:9；
(2)用于检测SOX17基因甲基化状态的特异性引物和探针选自下述三种特异性引物和探针组合中的任一种：特异性引物SEQ ID NO:10-11和探针SEQ ID NO:12、特异性引物SEQ ID NO:13-14和探针SEQ ID NO:15、特异性引物SEQ ID NO:16-17和探针SEQ ID NO:18；
(3)用于检测ACTB基因甲基化状态的特异性引物SEQ ID NO:19-20和探针SEQ IDNO:21。
进一步地，上述特异性引物SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20均经过硫代磷酸酯修饰，且在严格条件下与甲基化或非甲基化的目标基因区域杂交。
进一步地，上述探针SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21是基于TaqManTM设计的，且在严格条件下与甲基化或非甲基化的目标基因区域杂交。
具体的特异性引物和探针序列如下表1所示：
表1本发明试剂盒中包含的特异性引物和探针
进一步地，本发明试剂盒中包含的SHOX2基因探针SEQ ID NO:3、6、9核苷酸序列5’端标记FAM，3’端标记QSY；SOX17基因探针SEQ ID NO:12、15、18核苷酸序列5’端标记Cy5，3’端标记3IAbRQSp；ACTB基因探针SEQ ID NO:21核苷酸序列5’端标记VIC，3’端标记MGBNFQ。
进一步地，上述特异性引物SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20和探针SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21的长度为10-50nt。
进一步地，本发明试剂盒中还包含下述组成部分：dNTP混合溶液、MgCl2溶液、DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、PCR去离子水。
进一步地，本发明试剂盒中还包含下述组成部分：血浆游离DNA提取试剂和血浆游离DNA甲基化转化试剂。
优选地，上述血浆游离DNA甲基化转化试剂为亚硫酸氢盐。
优选地，本发明试剂盒所适用的受试样品DNA为完整基因组、无细胞DNA或循环肿瘤DNA。
本发明试剂盒的DNA甲基化检测系通过分析一个或多个特定基因检测区域的甲基化状态来对肺癌进行特异性检测与筛查。我们通过优化反应体系，使多个区域靶点的甲基化检测在一个反应中同时完成，其中对SHOX2和SOX17基因区域靶点的分析将用于肺癌检测，而对ACTB基因区域靶点的分析则用作内部对照以对DNA提取和亚硫酸氢盐转化是否成功进行检验。
另一方面，本发明还提供了上述用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)血浆游离DNA提取：利用血浆游离DNA提取试剂从待测样本中提取血浆游离DNA；
(2)血浆游离DNA甲基化转化：利用血浆游离DNA甲基化转化试剂对提取的血浆游离DNA进行亚硫酸氢盐处理并随后进行纯化；
(3)荧光定量PCR扩增：对亚硫酸氢盐处理过的血浆游离DNA进行PCR扩增，每个模板的PCR扩增做三个重复；每个反应体系10μL，其中含1xPCR反应缓冲液、400μm dNTPs、4mMMgCl2、2U AmpliTaq Gold DNA聚合酶；SHOX2和SOX17基因区域靶点的引物各800nM，SHOX2和SOX17基因区域靶点的探针各500nM；ACTB基因区域靶点的引物200nM，ACTB基因区域靶点的探针100nM；50nM ROX染料；
PCR扩增条件为：95℃预变性10min；
95℃变性15s，65℃退火和延伸30s，45个循环；
PCR反应结束后，将Ct阈值设定在线性扩增区间，Ct值小于40的扩增认定为阳性；
(4)结果判定：首先，每个靶点的三个重复扩增中至少两个为阳性则确定为该靶点结果阳性；其次，当内部参照位点ACTB检测结果阳性，且SHOX2和SOX17中至少1个靶点检测结果阳性则判定该样本为阳性。
优选地，上述使用方法第(3)步骤可选用下述方法中的任一种：甲基化特异性定量PCR、实时甲基化特异性PCR、使用甲基化DNA特异性结合蛋白的PCR。
经实验测试，本发明试剂盒能够显著提高早期肺癌的阳性检出率和特异性(真实阴性率)，可将生物标记物的检测灵敏度提高到皮克/纳克级DNA分子，检测灵敏度的提高是通过优化特定核苷酸序列引物及DNA探针以及改进血浆游离DNA的亚硫酸氢盐处理方法来实现的。
附图说明
图1：健康人血液样本的肺癌甲基化qPCR扩增曲线图。
图2：肺癌患者血液样本的肺癌甲基化qPCR扩增曲线图(原图为彩色，可以清楚地区分不同靶点的扩增曲线)。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例详细描述本发明的实施方式，但是以下具体实施方式本质上仅是示例，本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
为使本领域技术人员了解本发明的特点及效果，以下就说明书及权利要求书中提及的术语及用语进行一般性的说明及定义。除非另有指明，本发明中使用的所有技术和科学术语与本领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本领域技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
在本发明中，若无特别说明，所有的设备和原料均可从商业途径得到或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
定义
术语“患者”、“个体”或“受试者”可以在本文中互换使用，可以指哺乳动物，特别是人类。所述受试者可能有轻度、中度或重度疾病。所述患者可能是未治、易治或难治。所述患者可能是基于特定症状或家族病史需要治疗或需要诊断的个体。
术语“样本”、“患者样本”、“生物样本”等包括从患者、个体或受试者获得的各种样本类型，并且可用于诊断或监测检测。所述患者样本可以从健康受试者、患病患者或患有肺癌相关症状的患者获得。而且，从患者获得的样本可以被分割，并且只有一部分可以用于诊断。此外，所述样本或其一部分可以在保持样本用于以后分析的条件下储存。该定义具体包括血液和其他生物来源的液体样本(包括但不限于外周血、血清、血浆、尿、唾液、痰、粪便和滑液)，固体组织样本(如活检标本或组织培养物或由其衍生的细胞及其后代)。该定义还包括在获取后以任何方式操作的样本，如通过离心、过滤、沉淀、透析、色谱法、试剂处理、洗涤或富集某些细胞群。这些术语还包括临床样本、培养细胞、细胞上清液、组织样本、器官等。所述样本还可以包含新鲜冷冻和/或***固定的石蜡包埋组织块，例如由临床或病理活组织检查制备的块，其被制备用于病理分析或通过免疫组织化学研究。
术语“测量”、“确定”、“检测”或“检查”在全文中可互换使用，并且可以指包括获得患者样本和/或检测患者样本中的生物标志物甲基化状态或水平的方法。在一个实施方式中，这些术语是指获得患者样本并检测样本中一种或多种生物标志物的甲基化状态或水平。在另一个实施方式中，术语“测量”、“确定”或“检测”是指检测患者样本中一种或多种生物标志物的甲基化状态或水平。测量可以通过本领域已知的方法和本文进一步描述的方法完成，包括但不限于甲基化特异性定量聚合酶链式反应(qPCR)。
术语“甲基化”是指在胞嘧啶的C5或N4位置、腺嘌呤的N6位置的胞嘧啶甲基化或其他类型的核酸甲基化。体外扩增的DNA是未甲基化的，因为体外DNA扩增方法不保留扩增模板的甲基化模式。然而，“未甲基化的DNA”或“甲基化的DNA”也可以分别指其原始模板是未甲基化或甲基化的扩增DNA。
术语“CpG岛”是指具有高密度CpG的基因组DNA的连续区域。
术语“甲基化状态”或“甲基化水平”是指特定核苷酸或部分DNA中的核苷酸处的甲基化的存在、不存在和/或量。
应该理解的是，无论在何处使用语言“包括”描述实施例，还提供了以“由…组成”和/或“基本上由…组成”描述的其他类似实施例。
实施例1：利用本发明试剂盒对健康人cfDNA样本进行肺癌甲基化多重qPCR检测
(一)实验材料
1.健康人血浆(购自Bloodworks NW公司)；
2.QIAamp循环***核酸提取试剂盒(购自Qiagen公司，货号55114)；
3.EZ DNA Methylation-Lightning试剂盒(购自Zymo Research公司，货号D5031)；
4.本发明试剂盒(其中包含检测靶点SHOX2和SOX17的其中一套引物及探针组合、ACTB扩增引物及探针)；
5.AmpliTaq GoldTM DNA聚合酶及缓冲试剂(购自Thermo Fisher公司，货号4311806)。
(二)实验方法
1.血浆游离DNA提取
使用QIAamp循环***核酸提取试剂盒从5份健康人血浆样本中提取cfDNA，步骤按照试剂盒说明书进行。
2.游离DNA甲基化转化
使用Zymo Research公司的EZ DNA Methylation-Lightning试剂盒对提取的5份血浆cfDNA进行亚硫酸氢盐处理并随后进行纯化。
3.qPCR扩增
对亚硫酸氢盐处理过的血浆cfDNA使用Thermo Fisher公司Quant Studio 3instrument进行qPCR扩增，每个模板的PCR扩增做三个重复。每个反应体系10μL，其中含1xPCR反应缓冲液、400μm dNTPs、4mM MgCl2、2U AmpliTaq Gold DNA聚合酶；SHOX2和SOX17基因区域靶点的引物各800nM(每个靶点只选择一对引物)，SHOX2和SOX17基因区域靶点的探针各500nM(每个靶点选择一条与所选引物相对应的探针)；ACTB基因区域靶点的引物200nM，ACTB基因区域靶点的探针100nM；50nM ROX染料。
PCR扩增条件为：95℃预变性10min；
95℃变性15s，65℃退火和延伸30s，45个循环；
PCR反应结束后，将Ct阈值设定在线性扩增区间(本实验中，设定ΔRn为0.1)，Ct值小于40的扩增认定为阳性。
(三)实验结果
对于结果的判定标准是，首先每个检测位/靶点的三个重复扩增中至少两个为阳性则确定为该靶点结果阳性，其次，对于样本是否阳性的判定标准为，内部参照位点(ACTB)检测结果阳性，且两个靶点(SHOX2和SOX17)中至少1个靶点检测阳性则判定该样本为阳性。
下表2显示的是使用本发明的多重测定(SHOX2和SOX17)对从5个健康个体获得的5个血浆样品进行检测的结果(图1)。由表2可见，本方案检测特异性非常高。
表2利用本发明试剂盒对健康人血液样本的检测结果
样本阳性判定方法 检测样本数 阴性样本数 阴性率(％)
至少1个靶点阳性 5 5 100
实施例2：利用本发明试剂盒对肺癌患者ctDNA样本进行肺癌甲基化多重qPCR检测
(一)实验材料
1.肺癌患者血浆(购自Bloodworks NW公司)；
2.QIAamp循环***核酸提取试剂盒(购自Qiagen公司，货号55114)；
3.EZ DNA Methylation-Lightning试剂盒(购自Zymo Research公司，货号D5031)；
4.本发明试剂盒(其中包含检测靶点SHOX2和SOX17的其中一套引物及探针组合、ACTB扩增引物及探针)；
5.AmpliTaq GoldTM DNA聚合酶及缓冲试剂(购自Thermo Fisher公司，货号4311806)。
(二)实验方法
1.血浆游离DNA提取
使用QIAamp循环***核酸提取试剂盒从5份肺癌患者血浆样本中提取ctDNA，步骤按照试剂盒说明书进行。
2.游离DNA甲基化转化
使用Zymo Research公司的EZ DNA Methylation-Lightning试剂盒对提取的5份血浆ctDNA进行亚硫酸氢盐处理并随后进行纯化。
3.qPCR扩增
对亚硫酸氢盐处理过的血浆ctDNA使用Thermo Fisher公司Quant Studio 3instrument进行qPCR扩增，每个模板的PCR扩增做三个重复。每个反应体系10μL，其中含1xPCR反应缓冲液、400μm dNTPs、4mM MgCl2、2U AmpliTaq Gold DNA聚合酶；SHOX2和SOX17基因区域靶点的引物各800nM(每个靶点只选择一对引物)，SHOX2和SOX17基因区域靶点的探针各500nM(每个靶点选择一条与所选引物相对应的探针)；ACTB基因区域靶点的引物200nM，ACTB基因区域靶点的探针100nM；50nM ROX染料。
PCR扩增条件为：95℃预变性10min；
95℃变性15s，65℃退火和延伸30s，45个循环；
PCR反应结束后，将Ct阈值设定在线性扩增区间(本实验中，设定ΔRn为0.1)，Ct值小于40的扩增认定为阳性。
(三)实验结果
对于结果的判定标准是，首先每个检测位/靶点的三个重复扩增中至少两个为阳性则确定为该靶点结果阳性，其次，对于样本是否阳性的判定标准为，内部参照位点(ACTB)检测结果阳性，且两个靶点(SHOX2和SOX17)中至少1个靶点检测阳性则判定该样本为阳性。
下表3显示的是使用本发明的多重测定(SHOX2和SOX17)对从5个肺癌患者获得的5个血浆样品进行检测的结果(图2)。由表3可见，本方案阳性检出率非常高。
表3利用本发明试剂盒对肺癌患者血液样本的检测结果
样本阳性判定方法 检测样本数 阳性样本数 阳性率(％)
至少1个靶点阳性 5 5 100
综合实施例1和实施例2，可以看出，利用本发明试剂盒进行肺癌筛查，其阳性检出率为100％，特异性(真实阴性率)为100％。
以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。
序列表
<110> 深圳市新合生物医疗科技有限公司
<120> 用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及使用方法
<130> 2019
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
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cgggttagaa ggtaggaggc 20
<210> 5
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Claims (11)

1.一种用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒通过检测或测量受试样品DNA中一种或多种特定基因的甲基化状态或水平来筛查和诊断肺癌，所述试剂盒中包含下述组成部分：
(1)用于检测SHOX2基因甲基化状态的特异性引物和探针选自下述三种特异性引物和探针组合中的任一种：特异性引物SEQ ID NO:1-2和探针SEQ ID NO:3、特异性引物SEQ IDNO:4-5和探针SEQ ID NO:6、特异性引物SEQ ID NO:7-8和探针SEQ ID NO:9；
(2)用于检测SOX17基因甲基化状态的特异性引物和探针选自下述三种特异性引物和探针组合中的任一种：特异性引物SEQ ID NO:10-11和探针SEQ ID NO:12、特异性引物SEQID NO:13-14和探针SEQ ID NO:15、特异性引物SEQ ID NO:16-17和探针SEQ ID NO:18；
(3)用于检测ACTB基因甲基化状态的特异性引物SEQ ID NO:19-20和探针SEQ ID NO:21。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述特异性引物SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20均经过硫代磷酸酯修饰，且在严格条件下与甲基化或非甲基化的目标基因区域杂交。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述探针SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21是基于TaqManTM设计的，且在严格条件下与甲基化或非甲基化的目标基因区域杂交。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：SHOX2基因探针SEQ ID NO:3、6、9核苷酸序列5’端标记FAM，3’端标记QSY；SOX17基因探针SEQ ID NO:12、15、18核苷酸序列5’端标记Cy5，3’端标记3IAbRQSp；ACTB基因探针SEQ ID NO:21核苷酸序列5’端标记VIC，3’端标记MGBNFQ。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述特异性引物SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20和所述探针SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21的长度为10-50nt。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包含下述组成部分：dNTP混合溶液、MgCl2溶液、DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、PCR去离子水。
7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包含下述组成部分：血浆游离DNA提取试剂和血浆游离DNA甲基化转化试剂。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其中所述血浆游离DNA甲基化转化试剂为亚硫酸氢盐。
9.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述受试样品DNA为完整基因组、无细胞DNA或循环肿瘤DNA。
10.如权利要求1所述的用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)血浆游离DNA提取：利用血浆游离DNA提取试剂从待测样本中提取血浆游离DNA；
(2)血浆游离DNA甲基化转化：利用血浆游离DNA甲基化转化试剂对提取的血浆游离DNA进行亚硫酸氢盐处理并随后进行纯化；
(3)荧光定量PCR扩增：对亚硫酸氢盐处理过的血浆游离DNA进行PCR扩增，每个模板的PCR扩增做三个重复；每个反应体系10μL，其中含1xPCR反应缓冲液、400μm dNTPs、4mMMgCl2、2U AmpliTaq Gold DNA聚合酶；SHOX2和SOX17基因区域靶点的引物各800nM，SHOX2和SOX17基因区域靶点的探针各500nM；ACTB基因区域靶点的引物200nM，ACTB基因区域靶点的探针100nM；50nM ROX染料；
PCR扩增条件为：95℃预变性10min；
95℃变性15s，65℃退火和延伸30s，45个循环；
PCR反应结束后，将Ct阈值设定在线性扩增区间，Ct值小于40的扩增认定为阳性；
(4)结果判定：首先，每个靶点的三个重复扩增中至少两个为阳性则确定为该靶点结果阳性；其次，当内部参照位点ACTB检测结果阳性，且SHOX2和SOX17中至少1个靶点检测结果阳性则判定该样本为阳性。
11.如权利要求10所述的使用方法，其中第(3)步骤选用下述方法中的任一种：甲基化特异性定量PCR、实时甲基化特异性PCR、使用甲基化DNA特异性结合蛋白的PCR。
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Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110923320A (zh) * 2019-12-26 2020-03-27 益善生物技术股份有限公司 用于检测肺癌相关基因甲基化的核酸组合物、试剂盒和检测方法
CN111254199A (zh) * 2020-03-23 2020-06-09 郑州大学第一附属医院 与肺癌相关的keap1基因甲基化检测试剂盒
CN111500731A (zh) * 2020-05-20 2020-08-07 深圳市新合生物医疗科技有限公司 一种甲状腺癌早期诊断、检测或者筛查的试剂盒及其使用方法、应用
CN111549136A (zh) * 2020-05-20 2020-08-18 深圳市新合生物医疗科技有限公司 一种用于甲状腺癌检测的试剂盒及其使用方法、应用
CN112094912A (zh) * 2020-10-16 2020-12-18 中国药科大学 一种用于鉴别肺结节良恶性的血浆游离dna甲基化基因组合及其应用
CN112251514A (zh) * 2020-11-30 2021-01-22 深圳市龙岗中心医院 与肺癌相关的cmtm2基因甲基化检测引物、探针、检测试剂或试剂盒、反应体系和方法
CN113637746A (zh) * 2020-04-27 2021-11-12 广州市基准医疗有限责任公司 用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物或其组合和应用
CN113981046A (zh) * 2021-11-05 2022-01-28 朱运峰 一种基于定量pcr技术dna甲基化检测方法及其试剂盒
CN114277154A (zh) * 2022-01-27 2022-04-05 武汉康录生物技术股份有限公司 一种用于肺癌诊断和早期肺癌无创筛查的检测试剂盒
CN114645043A (zh) * 2020-12-17 2022-06-21 广州市基准医疗有限责任公司 用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物组合和应用
CN116219020A (zh) * 2023-03-02 2023-06-06 北京和瑞精湛医学检验实验室有限公司 一种甲基化内参基因及其应用

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102575284A (zh) * 2009-03-17 2012-07-11 MDx健康公司 改进的基因表达检测
CN105567639A (zh) * 2014-10-13 2016-05-11 上海市肿瘤研究所 人肺腺癌细胞lc-21细胞及用途
CN105925681A (zh) * 2016-05-06 2016-09-07 博尔诚（北京）科技有限公司 一种用于肺癌筛查的组合物及其应用
CN106232833A (zh) * 2014-01-30 2016-12-14 加利福尼亚大学董事会 用于非侵入性诊断的甲基化单体型分析(monod)
WO2017201606A1 (en) * 2016-05-04 2017-11-30 Queen's University At Kingston Cell-free detection of methylated tumour dna
CN109022567A (zh) * 2018-08-06 2018-12-18 北京艾克伦医疗科技有限公司 用于鉴定肺结节和/或肺癌状态的试剂盒及其应用
CN109072310A (zh) * 2016-04-01 2018-12-21 纳诺梅德诊断私人有限公司 在尿液中检测癌症
CN109504780A (zh) * 2019-01-21 2019-03-22 深圳市新合生物医疗科技有限公司 用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及使用方法
CN109825586A (zh) * 2019-03-11 2019-05-31 深圳市新合生物医疗科技有限公司 用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及使用方法

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102575284A (zh) * 2009-03-17 2012-07-11 MDx健康公司 改进的基因表达检测
CN106232833A (zh) * 2014-01-30 2016-12-14 加利福尼亚大学董事会 用于非侵入性诊断的甲基化单体型分析(monod)
CN105567639A (zh) * 2014-10-13 2016-05-11 上海市肿瘤研究所 人肺腺癌细胞lc-21细胞及用途
CN109072310A (zh) * 2016-04-01 2018-12-21 纳诺梅德诊断私人有限公司 在尿液中检测癌症
WO2017201606A1 (en) * 2016-05-04 2017-11-30 Queen's University At Kingston Cell-free detection of methylated tumour dna
CN105925681A (zh) * 2016-05-06 2016-09-07 博尔诚（北京）科技有限公司 一种用于肺癌筛查的组合物及其应用
CN109022567A (zh) * 2018-08-06 2018-12-18 北京艾克伦医疗科技有限公司 用于鉴定肺结节和/或肺癌状态的试剂盒及其应用
CN109504780A (zh) * 2019-01-21 2019-03-22 深圳市新合生物医疗科技有限公司 用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及使用方法
CN109825586A (zh) * 2019-03-11 2019-05-31 深圳市新合生物医疗科技有限公司 用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及使用方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LEI LI等: "Applying circulating tumor DNA methylation in the diagnosis of lung cancer", 《PRECISION CLINICAL MEDICINE》 *
SANDRA P.NUNES等: "Cell-Free DNA Methylation of Selected Genes Allows for Early Detection of the Major Cancers in Women", 《CANCERS》 *
杜洁等: "血浆游离DNA在非小细胞肺癌诊断中的价值", 《中华肺部疾病杂志》 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110923320A (zh) * 2019-12-26 2020-03-27 益善生物技术股份有限公司 用于检测肺癌相关基因甲基化的核酸组合物、试剂盒和检测方法
CN111254199A (zh) * 2020-03-23 2020-06-09 郑州大学第一附属医院 与肺癌相关的keap1基因甲基化检测试剂盒
CN113637746A (zh) * 2020-04-27 2021-11-12 广州市基准医疗有限责任公司 用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物或其组合和应用
CN111549136A (zh) * 2020-05-20 2020-08-18 深圳市新合生物医疗科技有限公司 一种用于甲状腺癌检测的试剂盒及其使用方法、应用
CN111500731A (zh) * 2020-05-20 2020-08-07 深圳市新合生物医疗科技有限公司 一种甲状腺癌早期诊断、检测或者筛查的试剂盒及其使用方法、应用
CN112094912A (zh) * 2020-10-16 2020-12-18 中国药科大学 一种用于鉴别肺结节良恶性的血浆游离dna甲基化基因组合及其应用
CN112251514A (zh) * 2020-11-30 2021-01-22 深圳市龙岗中心医院 与肺癌相关的cmtm2基因甲基化检测引物、探针、检测试剂或试剂盒、反应体系和方法
CN114645043A (zh) * 2020-12-17 2022-06-21 广州市基准医疗有限责任公司 用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物组合和应用
CN114645043B (zh) * 2020-12-17 2022-12-09 广州市基准医疗有限责任公司 用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物组合和应用
CN113981046A (zh) * 2021-11-05 2022-01-28 朱运峰 一种基于定量pcr技术dna甲基化检测方法及其试剂盒
CN114277154A (zh) * 2022-01-27 2022-04-05 武汉康录生物技术股份有限公司 一种用于肺癌诊断和早期肺癌无创筛查的检测试剂盒
CN116219020A (zh) * 2023-03-02 2023-06-06 北京和瑞精湛医学检验实验室有限公司 一种甲基化内参基因及其应用
CN116219020B (zh) * 2023-03-02 2023-11-07 北京和瑞精湛医学检验实验室有限公司 一种甲基化内参基因及其应用

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