JP5170734B2 - がんの検査に使用する遺伝子のスクリーニング方法と遺伝子セット - Google Patents
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大倉久直他 大腸がんの腫瘍マーカー、CRC1(4)、42-47、1992 Launoy G et al., Int. J. Cancer, 1997, 73: 220-224 Jack SM, et al., N. Engl. J. Med., 2000, 343(22):1603-1607
(i)検出の対象となる遺伝子群を、がん細胞及び正常細胞における発現分析の結果に基づいて選別する工程、
(ii)便中における前記選別された遺伝子群の発現を分析することで、正常細胞とのふるいわけをせずにがん細胞を検出する工程、
を有しており、
前記(i)の工程における遺伝子群の選別が、健常者とがん患者の便中の細胞の遺伝子の発現を比較することにより行われ、
該選別された遺伝子群が、表1に記載の77種の遺伝子から選択されるものであり、
JUNDおよびTPT1と、さらに表3に記載の26種の遺伝子から選択される2種とを少なくとも含む、
ことを特徴とする大腸がん細胞の検出方法である。
とも有する。
(i)以下の(1)〜(3)の条件を満たす遺伝子群を、がん細胞及び正常細胞における発現分析の結果に基づいて選別する工程。
(2)生存するがん細胞で発現が確認される、
(3)死滅した細胞では発現が確認されない。
(ii)便中における前記選別された遺伝子群の発現を分析することで、正常細胞とのふるいわけをせずにがん細胞を検出する工程。
但し、SEPP1(NM_005410)、RPL27A(NM_000990)、ATP1B1(NM_001677)、SFN(NM_006142)、RPS11(NM_001015)、RPL23(NM_000978)は工程(i)で選別される遺伝子群から除外する(遺伝子名カッコ内にAccession Numberを付す)。
タンパク質などを試料として分析してもよいが、好ましくは便に含まれる細胞を回収し、回収された細胞から調製したmRNAまたはタンパク質を試料として分析する。細胞の回収には、細胞表面に発現する蛋白質に対する抗体を用いたアフィニティー精製などの慣用技術を用いることができる。
写産物を特異的に増幅するためのプライマー、または遺伝子群の各遺伝子の転写産物に特異的にハイブリダイズするプローブを設計して用いることができる。便中のがん細胞検出用プローブには、遺伝子セットにおける各遺伝子の転写産物であるmRNAまたはそのcRNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列からなるプローブが好適である。ここで、遺伝子の転写産物には、mRNAのほかにmRNAから調製されるcDNA,cRNAの配列が含まれる。本発明は、これらのプライマーまたはプローブを含む、便中のがん細胞検出用キットを包含する。また本キットは、PCRあるいはハイブリダイゼーションに用いる試薬を含む構成とすることができる。
(1)生存する正常細胞で発現が確認される、
(2)生存するがん細胞で発現が確認される、
(3)死滅した細胞では発現が確認されない。
<(1)便からの細胞分離>
発現解析に用いるがん細胞を分離するために手術前の大腸がん患者由来便を検体として使用した。便の使用に関しては事前に被験者へ実験内容の説明を行い、同意を得た。
<(2)マイクロアレイによる約39000遺伝子の発現プロファイルの取得とマーカー遺伝子の選抜>
(1)で抽出したtotal RNAをターゲットとしてマイクロアレイ(human U133 oligonucleotide probe arrays (Affymetrix社 米国))を用いてゲノム網羅的遺伝子発現解析を行った。実験方法は製造会社の推奨する方法に従った。以下、これについて簡単に記述する。
大腸がん患者便から分離した細胞を用いたRT-PCR解析 実施例1で選抜した77遺伝子のうちランダムに4遺伝子(RPS20、RPS29、RPL38、TXN)を選抜し、それぞれに関して4人の健常人及び4人の大腸がん患者の便から分離した細胞中のRNAを用いてRT-PCRによる発現解析を行った。なお、上記4遺伝子のプライマーは表4に示す。また、実験手順は以下の通りである。
上記で得られたtotal RNAのうち1μgをInvitrogen社製 SUPER SCRIPT Choice Systemを用
いてオリゴ(dT)プライマーによる逆転写反応を行った。total RNA(10μl)に100μMのT7-oligo dT 24 primer を1μl (1 μg)加え、65℃で10分間保温する。その後、氷上にて2分以上置き、急冷させた後、表5に示した試薬を加えて、37℃で2分間保温した。
Ambion社製MEGAscriptT7Kitを用いて以下の反応を行った。(i)で作成した、cDNA溶液8μlに対し、表10に示した通りに試薬を加え、37℃で5時間保温した。次に、DNase ( RNase free ) 1μlを加え37℃で15分間保温し、DNAを除去した。
上記で得られたcRNA溶液に対し、ランダムヘキサマープライマーを用いて2回目の逆転写反応を行った。0.5μg/μl ランダムヘキサマーを1μl (1 μg)加え、65℃で10分間保温する。その後氷上にて2分以上置き、急冷させた後、前述の表12に示した通りに試薬を加えて、37℃で2分間保温する。その後、SuperScriptII RTを1μl加えて、37℃で1時間保温する。こうして、1st strand cDNA溶液約20μlを回収した。続いて、RNase H 1μlを加えてRNAの除去を行う。37℃で20分間保温し、RNAとDNAを離すため95℃で2分間保温し、その後氷上にて2分以上置き、急冷させる。
次に、2nd strand cDNAの精製を行う。
(iv) cRNAの合成:in vitro transcription (2回目)
(iii)で作成した、cDNA溶液22μlに対し、(ii)で行ったのと同様の方法でcRNAの合成を行った。ただし、最後は10μlの蒸留水に溶解させた(RNA量は5μg〜10μg)。
(v) 逆転写反応(1st strand cDNA合成)
(iv)で作成した、cRNA溶液10μlに対し、0.5μg/μl ランダムヘキサマーを1μl (1 μg)加え、65℃で10分間保温する。その後氷上にて2分以上置き、急冷させた後、表12に示した通りに試薬を加えて、逆転写反応が効率良く起きるように37℃で2分間保温する。
(vi)PCR増幅反応
回収された1st strand cDNA溶液をテンプレートとして、選抜した4遺伝子に関し、PCR増幅を行った。プライマーとしては表4に記載のプライマーセットを用いた。
得られた各PCR産物の10μlを用いて1.5%アガロースゲル電気泳動を行い、EtBr溶液で染色した。4遺伝子による結果として、4人の健常人の便はすべて陰性であったのに対して、4人の大腸がん患者の便では、1以上の遺伝子が陽性であった(表15)。すなわち、これらの遺伝子が大腸がんをスクリーニングするのに適していることが示された。
Claims (5)
- 便中の大腸がん細胞を検出する方法であって、
(i)検出の対象となる遺伝子群を、がん細胞及び正常細胞における発現分析の結果に基づいて選別する工程、
(ii)便中における前記選別された遺伝子群の発現を分析することで、正常細胞とのふるいわけをせずにがん細胞を検出する工程、
を有しており、
前記(i)の工程における遺伝子群の選別が、健常者とがん患者の便中の細胞の遺伝子の発現を比較することにより行われ、
該選別された遺伝子群が、表1に記載の77種の遺伝子から選択されるものであり、
JUNDおよびTPT1と、さらに表3に記載の26種の遺伝子から選択される2種とを少なくとも含む、
ことを特徴とする大腸がん細胞の検出方法。
- 前記選別された遺伝子群には、RPS29、RPL38、RPS20、TXNが含まれる請求項1に記載の大腸がん細胞の検出方法。
- 前記遺伝子群を選別する工程において、更に末梢血で発現が確認される遺伝子を排除する請求項1または2に記載の大腸がん細胞の検出方法。
- 前記(i)の工程における遺伝子群の選別が、健常者とがん患者の便中の細胞のリボソーム蛋白質遺伝子の発現を比較することにより行われることを特徴とする請求項1乃至4のいずれかに記載の大腸がん細胞の検出方法。
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