CN111763736B - 用于诊断甲状腺***状癌***转移的液体活检试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于诊断甲状腺***状癌***转移的液体活检试剂盒,包括:用于检测hsa‑circ‑UMAD1的试剂;和用于检测半乳糖凝集素3的试剂。本发明构建了血浆hsa‑circ‑UMAD1联合半乳糖凝集素3的组合检测技术,为评价甲状腺***状癌患者***转移提供重要证据。
Description
技术领域
本发明属于诊断试剂领域,具体而言,涉及用于诊断甲状腺***状癌***转移的液体活检试剂盒。
背景技术
近十年来,通常采用影像学和穿刺技术评估甲状腺***状癌(papillary thyroidcarcinoma,PTC)快速生长和早期转移危险因素。这些检测技术可有效地评估甲状腺切除术或***切除术患者术后是否会发生甲状腺***状癌***转移及预后程度,为指导手术的范围和手术方式提供了有力的证据。但由于这些检测手段具有的局限性,如所需设备价格昂贵又复杂以及穿刺对患者的身体具有创伤性,对寻找新的检测手段提出了迫切要求。因此,液体活检技术(即从患者血液中发现能准确预测甲状腺***状癌***转移的标志物)应运而生,且越来越受到国内外研究者的关注。但该技术在甲状腺***状癌中应用极少,目前仅限于检测miRNAs、BRAF和P53突变,如血清P53蛋白的表达。肿瘤发生发展过程中容易出现新的驱动基因及突变,因此,建立灵敏、方便、高效的外周循环标志物的检测***对甲状腺***状癌中***转移的预测具有一定的可行性和价值。
环状RNA广泛参与人类肿瘤组织、发育和疾病过程。环状RNA作为一种新发现的非编码RNA分子,其作用方式多种多样,如海绵吸附miRNA,释放miRNA靶标的抑制作用,翻译特定肽或与RNA结合蛋白相互作用调控蛋白。由于环状RNA在血液中表达很稳定,不容易降解,因而成为液体活检的重要领域。
发明内容
基于液体活检技术,本发明人建立了一种新的组合检测技术,即将甲状腺***状癌患者血液特异性环状RNA(circular RNA,简称circRNA)检测技术与半乳糖凝集素3(Galectin3,Gal-3)检测技术有效的结合,这种组合检测技术不仅能兼顾检测结果的特异性和敏感性两方面,而且能有效地判断甲状腺***状癌***的转移情况。
本发明人通过环状RNA测序,成功获取甲状腺***状癌肿瘤原发和***转移组织之间的差异环状RNA,发现了潜在的肿瘤生物标志物。本发明人同时筛选到了原发肿瘤和***转移的测序数据,发现hsa-circ-UMAD1是与***转移相关的环状RNA,它对miRNA-873起海绵吸附作用。
本发明人已有的研究显示,半乳糖凝集素3的分泌与肿瘤的恶性行为及肿瘤细胞的迁移密切相关,诱导分泌转移促进细胞因子参与肿瘤发生。因此,发明人构建了血浆hsa-circ-UMAD1联合半乳糖凝集素3的组合检测技术,为评价甲状腺***状癌患者***转移提供重要证据。
因此,本发明的一个目的是提供一种用于诊断甲状腺***状癌***转移的液体活检试剂盒。
本发明的另一个目的是提供用于检测hsa-circ-UMAD1的试剂和用于检测半乳糖凝集素3的试剂在制备用于诊断甲状腺***状癌***转移的液体活检制品中的用途。
本发明的再一个目的是提供一种诊断甲状腺***状癌***转移的液体活检方法。
一方面,本发明提供了一种用于诊断甲状腺***状癌***转移的液体活检试剂盒,包括:用于检测hsa-circ-UMAD1的试剂;和用于检测半乳糖凝集素3的试剂。
另一方面,本发明提供了用于检测hsa-circ-UMAD1的试剂和用于检测半乳糖凝集素3的试剂在制备用于诊断甲状腺***状癌***转移的液体活检制品中的用途。
本发明中,所述hsa-circ-UMAD1的序列如SEQ ID NO:1(5’-GGGAGAAGAGAAGGGATTTGACTGAGACAAGTTGATTTGAGTGAAGCCGCTACTCTTAGACAACTTTGCATAAAACAGCTGATTTTCTGTGATTTCTACAGGAAGCAAAGCCAGCAGTCAGTGACATCAAGACTTAAGAAGATTGAAAAATGTCCCATCTTCAGAGGAAATCTAGGAGATACAACAGATGAGCAAAGAATGACAGAAAGAGGCAAAACTTCGGACATAGAGGCCAACCAACCTTTGGAGA-3’)所示。
再一方面,本发明提供了一种诊断甲状腺***状癌***转移的液体活检方法,包括对受试者的血液样本进行血浆hsa-circ-UMAD1联合半乳糖凝集素3的组合检测的步骤。
具体地,本发明的诊断甲状腺***状癌***转移的液体活检方法包括以下步骤:
(1)取新鲜外周血标本以得到血浆样本;
(2)将上述血浆样本分成两份,一份用于hsa-circ-UMAD1的检测,另一份用于半乳糖凝集素3的检测。
优选地,步骤(1)中,在EDTA管中采集血浆样品,1500转离心分离,2小时内其中一份血浆样本不经冷冻立即用于RNA提取,另一份直接完成酶联免疫吸附(可冷冻,亦可不冷冻)。
优选地,步骤(2)中,可以联合使用两种试剂盒,一种是用于检测hsa-circ-UMAD1的实时定量试剂盒,另一种是用于检测半乳糖凝集素3的酶联免疫吸附试剂盒。
本发明中,用于检测hsa-circ-UMAD1的试剂可以使用领域中任何用于检测hsa-circ-UMAD1的试剂。例如,M-MLV逆转录试剂盒(Invitrogen,美国产)。在一个实施方式中,用于检测hsa-circ-UMAD1的试剂包括上游环状RNA circ-UMAD1引物(5’-CCAACCAACCTTTGGAGAGTG-3’(SEQ ID NO:2));下游环状RNA circ-UMAD1引物(5’-AGTCAAATCCCTTCTCTTCTCCC-3’(SEQ ID NO:3))。
附图说明
图1是显示甲状腺***状癌患者***转移呈显著性正相关的基因的图,图中英文为基因名称。
图2A至2F是血液循环中的环状RNA作为预测甲状腺***状癌***转移的生物标志物的图。
其中:2A:寻找策略;2B:免疫组化验证;2C:测序结果分析;2D:KEGG生物信息分类验证;2E:KEGG通路分析揭示miRNA在癌症及淋巴组织中参与了许多生物学过程;2F:KEGG通路分析揭示环状RNA在癌症及淋巴组织中参与了许多生物学过程。
图3是miR-873与半乳糖凝集素3相关图。
其中:A:TCGA分析数据表明9个miRNAs与发明人测序结果一致;B:通过多维分析得到miR-873为候选基因;C:甲状腺***状癌***转移患者的miR-873表达更高。
图4是环状RNA:circRNA-UMAD1与miR-873的关系图。
其中:A:数据库和测序结果定向表明3个候选分子;B:hsa_circ_0001676作为可能最有利的候选环状RNA;C:circRNA-UMAD1与miR-873的结合位点;D:双荧光素酶报告基因检测证实;E:circRNA-UMAD1表达越高,miR-873表达越低。
图5是血液循环中hsa-circ-UMAD1对甲状腺***状癌***转移的评价图。
其中:A:编码蛋白UMAD1在甲状腺***状癌样本中与***表达相关;B:50例患者临床病理特征与hsa-circ-UMAD1水平的相关性;C:hsa-circ-UMAD1表达越高,半乳糖凝集素3表达越高。
图6是hsa-circ-UMAD1和半乳糖凝集素3的ROC曲线分析图。
其中:A:hsa-circ-UMAD1 ROC曲线;B:半乳糖凝集素3ROC曲线;C:联合两者的ROC曲线。
具体实施方式
本发明中,用于检测半乳糖凝集素3的试剂可以使用领域中任何用于检测半乳糖凝集素3的试剂。例如,抗体稀释液,重组半乳糖凝集素3蛋白(Santa Cruz,美国)。
研究表明,半乳糖凝集素3在包括甲状腺***状癌在内的多种恶性肿瘤中均有高表达,因此半乳糖凝集素3可作为恶性肿瘤的预测指标之一。然而,半乳糖凝集素3在外周循环表达水平低,因此其测试的灵敏度不高。而且,半乳糖凝集素3也不是甲状腺***状癌***转移样本中表达最高的基因之一,发明人需要另外一个生物标志物联合检测来提高预测诊断的准确性,找到特异性和敏感性两者的平衡点。本研究通过RNA测序和生物信息学分析,发现了许多与半乳糖凝集素3的临床特性和病理特征高度相关的靶点。半乳糖凝集素3作为诊断PTC的生物标志物之一,对甲状腺***状癌的鉴别诊断准确率应大于65%。与最近报道的高达70.6%敏感度和96.8%特异度相比,半乳糖凝集素3的59.26%的敏感度和96.67%的特异度不足以准确检测微小***转移样本。因此,在没有足够的肿瘤组织用于检测的时候,要想半乳糖凝集素3能够在液体活检中得到广泛应用,还需要和另外一个标志物联合检测以提高其敏感度及特异度。
最新的研究发现环状RNA可以作为非侵入性检测的指标,因为其在血浆中稳定且特异性高。发明人决定探索影响miR-873-半乳糖凝集素3的新的环状RNA,因为环状RNA是RNA的闭合连续循环,具有miRNA结合位点,可以作为miRNA的海绵来调节miRNA功能。为此,环状RNA预测网站设计并分析了circRNA/miR-873/半乳糖凝集素3分子链的相互作用。与测序结果一致,hsa-circ-UMAD1被确定为进一步筛选的候选基因。发明人确定hsa-circ-UMAD1作为miR-873海绵在体外抑制miR-873的表达。由于环状RNA在肿瘤细胞内外相对稳定,甚至以核酶的形式存在,因此使用正确的技术从新鲜血液样本中提取环状RNA并不困难。通过RT-PCR扩增血浆中的环状RNA,分析其临床特征与病理特征的关系。hsa-circ-UMAD1在LNM样本中的高表达被确定为甲状腺***状癌患者***转移的一个新的生物标志物。幸运的是,hsa-circ-UMAD1和半乳糖凝集素3表达显著相关,且R值较高。这表明hsa-circ-UMAD1是一个很好的预测***转移的生物标志物。而hsa-circ-UMAD1的ROC曲线略小于半乳糖凝集素3(AUC:0.7531VS.0.8407)。结合hsa-circ-UMAD1和半乳糖凝集素3的ROC分析结果,特异性达到100%,敏感性从59.26%提高到74.07%。对于伴有***转移的甲状腺***状癌患者,hsa-circ-UMAD1和半乳糖凝集素3双高表达患者***转移机会风险增加。如果能够持续观测血液中的这两个指标,就能判断甲状腺***状癌患者***转移可能发生的时间,从而进行进一步的治疗。
在下文中,将通过实施例详细描述本发明。然而,在此提供的实施例仅用于说明目的,并不用于限制本发明。
下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例
实施例1:hsa-circ-UMAD1联合半乳糖凝集素3的组合检测方案的建立(一)使用酶联免疫吸附试剂盒检测外周血循环中半乳糖凝集素3与甲状腺***状癌患者***转移相关
使用酶联免疫吸附试剂盒(Bio-Swamp公司,中国北京)检测半乳糖凝集素3
试剂:酶标包被板;半乳糖凝集素3标准品;标准品稀释液;生物素标记的半乳糖凝集素3抗体;显色液A;显色液B;终止液;酶标试剂;浓缩洗涤液。
方法:
1.标准品的稀释:准备小试管6只,依次编好号码,先在各小试管中加入标准品稀释液100μl,然后取原浓度标准品100μl加入一只已编好号的试管中,充分混匀;再在该试管中取100μl加入第二支试管中,充分混匀;再在该试管中取100μl加入第三只试管中,充分混匀;再在该试管中取100μl加入第四只试管中,充分混匀;再在该试管中取100μl加入第五只试管中,充分混匀;然后在该试管中取100μl,弃掉。第六只试管作为0号标准品。稀释后各管浓度分别是:1200pg/ml,600pg/ml,300pg/ml,150pg/ml,75pg/ml在酶标包被板上设标准品孔,依次加入不同浓度的标准品50μl(建议每个浓度做2个平行孔)。
2.加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品、酶标试剂及生物素标记的抗LOX抗体,其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品40μl,然后再加生物素标记的半乳糖凝集素3抗体10μl。将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。
3.温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液:将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。
5.洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。
6.加酶:每孔加入酶标试剂50,空白孔除外。
7.温育:操作同3。
8.洗涤:操作同5。
9.显色:每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟。
10.终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。
11.测定:以空白空调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
实验结果计算:
以标准物的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,即为样品的实际浓度。
首先通过分析6个不同的数据库中的424名患者的研究数据,半乳糖凝集素3已被证明是在甲状腺***状癌患者***转移中的一个潜在的生物标志物。进一步分析来自8000名患者(17个主要癌症类型的细胞和组织)人类蛋白质图谱的数据,发明人发现相比其他实体肿瘤,半乳糖凝集素3高度表达在甲状腺***状癌中。基于这些观察,发明人决定验证乳糖凝集素3在甲状腺***状癌被诊断为伴有或不伴有***转移的甲状腺***状癌患者外周血循环中的表达。发明人选取了男性12例,女性38例,年龄24-63岁之间,确诊为单侧甲状腺***状癌44例,双侧甲状腺***状癌6例,行甲状腺切除术+***清扫27例,未行***清扫23例。如表1所示,通过检测患者血液中乳糖凝集素3的水平,发明人发现乳糖凝集素3水平与临床***转移特性显著相关。对甲状腺***状癌TCGA数据的分析显示,与正常组织相比,乳糖凝集素3不仅在甲状腺***状癌肿瘤中高表达,而且与肿瘤分期和LNM高度相关。这些数据表明,乳糖凝集素3是诊断甲状腺***状癌患者***转移的一个有用的生物标志物。然而,在所有与甲状腺***状癌患者***转移呈显著性正相关的基因中,它排名并不是最靠前的,仅仅位于前38位(图1),所以还需要找到一个在血液中更能代表甲状腺***状癌患者***转移的补充指标,作为共同标志物。
表1使用半乳糖凝集素3酶联免疫吸附试剂盒检测的病例标本
1qRT-PCR定量。将Gal-3定量以GAPDH为参照。2两组比较采用Mann-Whitney U检验或更多组采用Kruskal-Walis检验。3两组比较的采用非配对学生t检验。
(二)研究策略的选择
由于仅检测半乳糖凝集素3在甲状腺***状癌患者预测***转移方面存在局限性,发明人认为其它潜在的分子可能是***转移更敏感的生物标志物。为了明确循环***中是否存在这种环状RNA和MicroRNA(miRNA),发明人通过测序确定哪些环状RNA和miRNA在***转移样本中上调。最终目的是通过乳糖凝集素3找到对应下调的微小RNA,再从微小RNA出发,找到对应上调的环状RNA(图2A)。并经病理诊断证实具有***转移特性(图2B)。结果显示,在***转移样本中,总共有208个环状RNA和134个miRNA表达上调,184个环状RNA和86个miRNA表达下调。KEGG通路分析揭示了环状RNA和miRNA分别在癌症及淋巴组织中参与了许多生物学过程(图2E,F)。这些结果表明循环中的环状RNA和miRNA可以作为预测***转移的生物标志物。
(三)miR-873与半乳糖凝集素3相关
微小RNA是有用的诊断指标。利用TCGA分析数据(图3A),发明人发现miR-873是甲状腺***状癌***转移相关的首选基因之一,通过筛选miRNA测序数据和3个miRNA数据库的预测分析,预测miR-873靶向半乳糖凝集素3(图3B)。接下来,发明人使用含有半乳糖凝集素3的3'-UTR的载体进行荧光素酶报告基因检测,该载***于miR-873在半乳糖凝集素3中的假定结合位点两侧。因此,半乳糖凝集素3的3'-UTR中的miR-873结合位点负责抑制报告基因的活性,这表明miR-873通过其3'-UTR直接调节该基因的表达,甲状腺***状癌***转移患者的miR-873水平强于原发性PTC患者(图3C)。因此,miR-873是直接靶向半乳糖凝集素3的候选标志物。也是甲状腺***状癌***转移的潜在指标,但是由于miR-873低表达才能预示作用,所以,它不适合为血液检测指标。
(四)循环中circRNA-UMAD1扮演miR-873海绵吸附的角色,使得血液中很难检测出微小RNA。
在探索有无甲状腺***状癌***转移患者血液循环中miR-873表达差异的基础上,以fold change>2、P值<0.05为标准,通过网站预测工具筛选差异表达的环状RNA(图4A)。发明人利用生物信息学分析确定3个环状RNA,分别是hsa_circ_0000111,hsa_circ_0000277,hsa_circ_0001676。鉴于hsa_circ_0000111,hsa_circ_0000277在***中的高本底水平,这两个环状RNA未被考虑为靶标(图4B)。最终,hsa_circ_0001676被验证为候选,即hsa-circ-UMAD1。此外,通过双荧光素酶报告基因检测证实了hsa-circ-UMAD1和miR-873二者的互补结合(图4C,D)。通过Pearson相关分析确定了甲状腺***状癌样品中hsa-circ-UMAD1与miR-873的表达呈负相关(图4E)。因此,以上结果表明hsa-circ-UMAD1直接靶向miR-873,对miR-873起海绵抑制作用。
(五)血液循环中hsa-circ-UMAD1对甲状腺***状癌***转移的诊断有潜在的预后价值
使用实时定量试剂盒(Invitrogen美国公司)检测hsa-circ-UMAD1
试剂:裂解液(主要成分Trizol);提取总RNA的纯化柱(Qiagen miRNeasy MiniKit德国);RNA酶R;短片段RNA纯化柱(Qiagen RNeasy MiniElute Purification Kit德国);dNTP;随机引物;逆转录酶M-MLV;DTT;PCR混合试剂(PowerUptm SYBR Green MaterMix,美国);上游GAPDH引物(通用);下游GAPDH引物(通用);上游环状RNA circ-UMAD1引物(5’-CCAACCAACCTTTGGAGAGTG-3’(SEQ ID NO:2));下游环状RNA circ-UMAD1引物(5’-AGTCAAATCCCTTCTCTTCTCCC-3’(SEQ ID NO:3))。
方法:使用Trizol裂解液300μl新鲜血浆中提取总RNA,利用Qiagen miRNeasyMini Kit完成总RNA的纯化。将总RNA与5U RNase R共20μl反应体系,在37℃下反应30分钟。利用Qiagen RNeasy MiniElute Purification Kit完成段短片段RNA的纯化,得到实验所需的纯化RNA。接着,将10ng RNA混合dNTP和随机引物,加入逆转录酶M-MLV和DTT,在37℃下反应60分钟,将RNA逆转录为cDNA。逆转录后的cDNA加入PCR混合试剂后,分别给与GAPDH或环状RNA circ-UMAD1引物,在标准程序下进行PCR扩增,分析扩增效率。基于2-ΔCt=Ct值(目标)-Ct(参考),数据提出了相对量化。计算出2-ΔCt值。
circRNA-miRNA关联性的识别有助于甲状腺***状癌***转移的诊断,hsa-circ-UMAD1符合筛选标准。该环状RNA的亲本基因编码蛋白UMAD1,该蛋白在发明人的甲状腺***状癌样本中与***表达相关(图5A)。与测序结果一致,hsa-circ-UMAD1在***转移瘤中的表达高于原发瘤部位。通过RT-PCR分析50例患者临床病理特征与hsa-circ-UMAD1水平的相关性(图5B),结果表明hsa-circ-UMAD1的表达水平在性别、年龄、肿瘤大小和血管侵犯方面无显著差异。而在LNM样本中,hsa-circ-UMAD1的表达明显高于无局部肿瘤侵袭的原代样本(表2)。此外,hsa-circ-UMAD1和半乳糖凝集素3的表达水平与高R值显著相关(0.35,p<0.0138)(图5C)。因此,hsa-circ-UMAD1是预测甲状腺***状癌***转移潜在风险的候选生物标志物。
表2
(六)hsa-circ-UMAD1和半乳糖凝集素3的ROC曲线分析表明联合检测可以提高甲状腺***状癌***转移的检出灵敏性和特异性
为了评估所鉴定的循环中hsa-circ-UMAD1和半乳糖凝集素3是否能作为诊断甲状腺***状癌***转移的潜在生物标志物,发明人对验证的样本生成ROC曲线。在ROC分析中,如果只单独分析hsa-circ-UMAD1或半乳糖凝集素3,特异性和敏感性不理想。半乳糖凝集素3的ROC曲线下面积为0.8407,hsa-circ-UMAD1的ROC曲线下面积为0.7531(图6A,B)。半乳糖凝集素3组的ROC曲线的敏感度为59.26%,特异性为96.67%。此外,在hsa-circ-UMAD1组中,最高的似然比为18.18%的敏感性和97.83%的特异性。虽然每个目标都记录了高特异性,但敏感性仍然不令人满意。结合两组结果,预测甲状腺***状癌***转移的敏感性为74.07%,特异度为100%(图6C)。这些结果表明,hsa-circ-UMAD1和半乳糖凝集素3的联合表达是预测甲状腺***状癌***转移的一个敏感的新生物标志物。
实施例2:hsa-circ-UMAD1联合半乳糖凝集素3的组合检测方案的实施
研究方案:
1.取新鲜外周血标本。在EDTA管中采集血浆样品,1500转离心分离。2小时内其中一份血浆样本不经冷冻立即用于RNA提取,另一份直接完成酶联免疫吸附(可冷冻,亦可不冷冻)。
2.联合使用两种试剂盒,一种是实时定量试剂盒,另一种是酶联免疫吸附试剂盒。
具体方法:
2.1使用实时定量试剂盒(Invitrogen美国公司)检测hsa-circ-UMAD1
2.1.1试剂:裂解液(主要成分Trizol);提取总RNA的纯化柱(Qiagen miRNeasyMini Kit德国);RNA酶R;短片段RNA纯化柱(Qiagen RNeasy MiniElute Purification Kit德国);dNTP;随机引物;逆转录酶M-MLV;DTT;PCR混合试剂(PowerUptm SYBR Green MaterMix,美国);上游GAPDH引物(通用);下游GAPDH引物(通用);上游环状RNA circ-UMAD1引物(5’-CCAACCAACCTTTGGAGAGTG-3’(SEQ ID NO:2));下游环状RNA circ-UMAD1引物(5’-AGTCAAATCCCTTCTCTTCTCCC-3’(SEQ ID NO:3))。
2.1.2方法:使用Trizol裂解液300μl新鲜血浆中提取总RNA,利用QiagenmiRNeasy Mini Kit完成总RNA的纯化。将总RNA与5U RNase R共20μl反应体系,在37℃下反应30分钟。利用Qiagen RNeasy MiniElute Purification Kit完成段短片段RNA的纯化,得到实验所需的纯化RNA。接着,将10ng RNA混合dNTP和随机引物,加入逆转录酶M-MLV和DTT,在37℃下反应60分钟,将RNA逆转录为cDNA。逆转录后的cDNA加入PCR混合试剂后,分别给与GAPDH或环状RNA circ-UMAD1引物,在标准程序下进行PCR扩增,分析扩增效率。基于2-ΔCt=Ct值(目标)-Ct(参考),数据提出了相对量化。计算出2-ΔCt值。
2.2使用酶联免疫吸附试剂盒(Bio-Swamp公司,中国北京)检测半乳糖凝集素3
2.2.1试剂:酶标包被板;半乳糖凝集素3标准品;标准品稀释液;生物素标记的半乳糖凝集素3抗体;显色液A;显色液B;终止液;酶标试剂;浓缩洗涤液。
2.2.2方法:
1.标准品的稀释:准备小试管6只,依次编好号码,先在各小试管中加入标准品稀释液100μl,然后取原浓度标准品100μl加入一只已编好号的试管中,充分混匀;再在该试管中取100μl加入第二支试管中,充分混匀;再在该试管中取100μl加入第三只试管中,充分混匀;再在该试管中取100μl加入第四只试管中,充分混匀;再在该试管中取100μl加入第五只试管中,充分混匀;然后在该试管中取100μl,弃掉。第六只试管作为0号标准品。稀释后各管浓度分别是:1200pg/ml,600pg/ml,300pg/ml,150pg/ml,75pg/ml在酶标包被板上设标准品孔,依次加入不同浓度的标准品50μl(建议每个浓度做2个平行孔)。
2.加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品、酶标试剂及生物素标记的抗LOX抗体,其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品40μl,然后再加生物素标记的半乳糖凝集素3抗体10μl。将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。
3.温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液:将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。
5.洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。
6.加酶:每孔加入酶标试剂50,空白孔除外。
7.温育:操作同3。
8.洗涤:操作同5。
9.显色:每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟。
10.终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。
11.测定:以空白空调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
2.2.3实验结果计算
以标准物的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式y=a+bx,y:样品实际浓度;a标准品浓度;b标准品OD值;x:样品实际OD值
计算出样品浓度,即为样品的实际浓度。
如果上述两项结果数值持续增高,则表明具有发生甲状腺***状癌***转移的风险增高。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京市肿瘤防治研究所
<120> 用于诊断甲状腺***状癌***转移的液体活检试剂盒
<130> DI20-1169-XC37
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hsa-circ-UMAD1
<400> 1
gggagaagag aagggatttg actgagacaa gttgatttga gtgaagccgc tactcttaga 60
caactttgca taaaacagct gattttctgt gatttctaca ggaagcaaag ccagcagtca 120
gtgacatcaa gacttaagaa gattgaaaaa tgtcccatct tcagaggaaa tctaggagat 180
acaacagatg agcaaagaat gacagaaaga ggcaaaactt cggacataga ggccaaccaa 240
cctttggaga 250
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 上游环状RNA circ-UMAD1引物
<400> 2
ccaaccaacc tttggagagt g 21
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 下游环状RNA circ-UMAD1引物
<400> 3
agtcaaatcc cttctcttct ccc 23
Claims (4)
1.一种用于诊断甲状腺***状癌***转移的液体活检试剂盒,包括:
用于检测hsa-circ-UMAD1的试剂;和
用于检测半乳糖凝集素3的试剂,
其中,所述hsa-circ-UMAD1的序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其中,所述用于检测hsa-circ-UMAD1的试剂包括由SEQ ID NO:2所示的上游环状RNA circ-UMAD1引物;由SEQ ID NO:3所示的下游环状RNAcirc-UMAD1引物。
3.用于检测hsa-circ-UMAD1的试剂和用于检测半乳糖凝集素3的试剂在制备用于诊断甲状腺***状癌***转移的液体活检制品中的用途,其中,所述hsa-circ-UMAD1的序列如SEQ ID NO:1所示。
4.根据权利要求3所述的用途,其中,所述用于检测hsa-circ-UMAD1的试剂包括由SEQID NO:2所示的上游环状RNA circ-UMAD1引物;由SEQ ID NO:3所示的下游环状RNA circ-UMAD1引物。
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