CN108864052A - 一种针对gc33-3-1抗体具有特异性识别的荧光探针的合成以及应用 - Google Patents

一种针对gc33-3-1抗体具有特异性识别的荧光探针的合成以及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种针对GC33‑3‑1抗体具有特异性识别的荧光探针的合成以及应用。该探针合成路线简单，反应条件温和，后处理简单方便。该荧光探针标记人血清蛋白（HSA）后荧光强度大大增强，荧光探针标记HSA后再将其用于识别GC33‑3‑1抗体。与其他检测抗体的方法相比，该方法具有操作简便，响应灵敏，以及具有选择性等优点，在生物领域有较好的应用前景；。

Description

一种针对GC33-3-1抗体具有特异性识别的荧光探针的合成以 及应用
技术领域
本发明属于生物分析检测领域，具体涉及一种用于特异性识别GC33-3-1抗体荧光探针的合成及其应用。
背景技术
人血清蛋白（HSA）是血清中最丰富的蛋白质，也是最重要的药物载体蛋白。它对于许多内源性和外源性脂质的转运，分布和代谢，包括脂肪酸，氨基酸，金属离子和许多药物，并且对血液的混合渗透压有着中重要的作用。人血清白蛋白（HSA）是一种高分子量血浆蛋白。它是由585个氨基酸组成的单一链。像其他哺乳动物白蛋白一样，人体白蛋白含有17个二硫桥和一个游离硫醇Cys34。在大多数情况下，蛋白质与药物的相互结合作用会显著影响药物的表观分布容积，也会影响药物的清除率。因此，药物与蛋白结合的研究可以提供有关药物结构特征的信息，确定药物的治疗效果，在化学和临床研究领域研究药物与血清白蛋白的相互作用都是非常重要的。
Glypican-3（GCP3）是细胞膜表面糖蛋白，属于 glypican 家族中的一种，是肝细胞癌（Heptocellular carcinoma，HCC）表面特异性标志物。GCP3在HCC中会高度表达，在正常的肝组织中无表达，所以GCP3可以作为肝癌治疗的理想标志物。GCP3功能的缺失会导致过度生长和畸变（Simpson-Golabi-Behmel）综合征，这是一种X染色体异常的疾病。GCP3缺失小鼠表现出过度生长和一些畸变的表型。在小鼠中GCP3过表达会抑制肝细胞增殖和肝的再生。GC33-3-1抗体是高亲和力抗GCP3抗体，具有很强的抗肿瘤活性。因此，通过合成苯并咪唑酮类荧光探针标记人血清蛋白（HSA），再识别GC33-3-1抗体，从而检测到人体内的肝癌细胞。该荧光探针具有灵敏度高，选择性好，操作简单等优点。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种用于特异性识别GC33-3-1抗体的荧光探针，该荧光探针与超纯水溶液、Tris-HCl溶液按照1：1：1的比例配成混合溶液时荧光信号较微弱，当该荧光探针与人血清蛋白溶液、Tris-HCl溶液按照1：1：1的比例配成混合溶液荧光信号明显增强。
本发明的目的之一提供一种可用于特异性识别GC33-3-1抗体的荧光探针的合成方法和应用，该方法具有操作方便，原料易得，提纯简单等优点。
本发明所有的技术方案为：
本发明提供了一种可用于特异性识别GC33-3-1抗体的荧光探针，该探针的结构式如下：
本发明提供了所述荧光探针的制备方法，该方法步骤如下：
具体合成步骤如下：
（1）中间体化合物F1的合成
将4,6-二氯嘧啶和邻苯二胺溶于异丙醇中，并向该反应液中加入N,N-二异丙基乙胺，将反应液加入微波反应中，150℃反应10 min，减压除去异丙醇，得化合物F1。
（2）中间体化合物F2的合成
将化合物F1和羰基-2-咪唑溶于四氢呋喃溶液中，加入吡啶作催化剂，在氮气保护下65℃油浴回流，过夜，减压除去溶剂，经硅胶柱分离，得化合物F2。
（3）荧光探针F3的合成
将化合物F2和2-氨基吡啶溶于异丙醇中，加入对甲苯磺酸作催化剂，将反应液加入微波反应中，150 ℃反应10 min，减压除去溶剂，用饱和碳酸氢钠/二氯甲烷溶液萃取，收集有机层，旋干，经硅胶柱分离，得荧光探针F3。
步骤（1）中化合物F1的合成无需后处理，直接得到产物；
步骤（2）中硅胶柱以石油醚：乙酸乙酯体积比为4:1--1:1的展开剂；
步骤（3）中硅胶柱以石油醚：乙酸乙酯体积比为1:1的展开剂；
步骤（1）中4,6-二氯吡啶和邻苯二胺的摩尔质量比为1：1。
步骤（2）中化合物F2和羰基-2-咪唑以及吡啶的质量比为1:2:1。
步骤（3）化合物F2和2-氨基吡啶以及对甲苯磺酸的摩尔质量比1:1:2.5；
本发明还提供了上述荧光探针用于标记的人血清蛋白（HSA）和用于识别的GC33-3-1抗体。
本发明具有以下有益的效果：该探针分子的合成方法简便，原料易得，后处理简单；该探针直接识别抗体后结合并不明显，荧光信号弱，当探针先标记人血蛋白（HSA）后在识别抗体后，荧光信号在荧光倒置显微镜下可以明显看到荧光信号；该类探针可以通过抗体识别技术，对目标抗体进行标记，应用于生物荧光成像等领域。
附图说明
图1为本发明荧光探针的紫外吸收光谱图。
图2为本发明荧光探针的荧光光谱图。
图3为本发明荧光探针与人血清蛋白（HSA）结合前后的荧光光谱图。
图4为本发明荧光探针荧光倒置显微镜下的荧光成像图。
图5为本发明人血清蛋白与抗体结合的荧光倒置显微成像图。
图6为本发明荧光探针与抗体识别后在荧光倒置显微镜下的荧光成像图。
图7为本发明荧光探针标记人血蛋白（HSA）后识别抗体在荧光倒置显微镜下的荧光成像图。
图8为本发明荧光探针在不同PH的Tris-HCl溶液中与单独荧光探针的荧光信号的对比的荧光性质。
图9为本发明荧光探针标记人血清蛋白（HSA）后孵育不同时间荧光信号的变化。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
实施例1：用于抗体标记的小分子荧光探针的合成
（1）中间体化合物F1 的合成：
各称取15.7 mmol4,6-二氯嘧啶和邻苯二胺，17.5 mmolN,N--二异丙基乙胺于微波反应管中，加入10 ml异丙醇溶解，在微波中150℃反应10 min。后处理：薄层色谱法监测反应结果，将反应液减压旋蒸除去溶剂，得黄色油状物F1，产率100%，MS(m/z):220.5。
（2）中间体化合物F2 的合成：
称取1.6 mmol的F1，4.4 mmol羰基--2--咪唑，4.4 mmol吡啶于圆底烧瓶中，加入四氢呋喃作为溶剂，氮气保护，65 ℃油浴回流，过夜。后处理：薄层色谱法监测反应结果，将反应液减压旋蒸除去溶剂，过硅胶柱分离，得淡红色的固体，产率50%，MS(m/z):246.03。
（3）荧光探针F3 的合成：
称取0.41mmol F2，0.41 mmol2-氨基吡啶，1 mmol对甲苯磺酸于微波反应管中，加入10ml异丙醇溶解，在微波中150 ℃反应10 min，薄层色谱法监测反应结果，将反应液旋干，用饱和碳酸氢钠水溶液和乙酸乙酯萃取若干次，收集有机层，减压旋蒸除去溶剂，过硅胶柱分离，得淡黄色固体， MS(m/z):304.11，荧光探针谱图见图1和图2，图1为本发明荧光探针的紫外吸收光谱图，图2为本发明荧光探针的荧光光谱图。图4为本发明荧光探针荧光倒置显微镜下的荧光成像图。
实施例2：荧光探针标记人血清蛋白（HSA）反应后的荧光变化
样品溶液：将一定量的实施例1制得的荧光探针溶于适量的甲醇溶液并用超纯水稀释成浓度为1.5X10-5 mol/L；将人血清白蛋白（HSA）用超纯水稀释成浓度为1X10-5 mol/L；Tris-HCl溶液配制为0.05mol/LPH=7.4（内含浓度为0.1mol/L的NaCl）；在4 ml的EP管中加入1ml Tris-HCl溶液，1ml的荧光化合物和1 ml的HSA溶液,混匀。对照溶液：1 ml 荧光探针溶液，1 ml Tris-HCl 溶液，1 ml的超纯水混合配制成对照溶液。测定荧光光谱图得图3。
实施例3：荧光探针直接识别抗体
（1）包被：将抗体稀释成1 µg/ml，与包被液（碳酸盐缓冲液）混合加入到酶标版中，37℃孵育2 h，4℃过夜；
（2）洗涤：取40 ml PBS加入20 µl吐温20，配制成PBST溶液配制成PBST溶液，用PBST溶液洗涤酶标版，每孔300 µl，每次3 min，洗涤3次；
（3）封闭：将牛血清蛋白配制成0.02 mg/ml，加入酶标板中，37℃孵育2 h；
（4）洗涤：用PBST溶液洗涤酶标版，每孔300 µl，每次3 min，洗涤3次；
（5）结合：将一定量的实施例1制得的荧光探针化合物溶于适量的甲醇溶液并用超纯水稀释成浓度为1.5X10-5 mol/L；Tris-HCl溶液配制为0.05 mol/L PH=7.4（内含浓度为0.1mol/L的NaCl）；在4 ml的EP管中加入1 ml Tris-HCl溶液，1 ml的荧光化合物混匀，在37℃下孵育2 h。
（6）标记：将上述配制的混合溶液加入到96孔板上，每孔加100µl，在37℃下孵育2h，用PBST溶液洗涤酶标版，每孔300 µl，每次3 min，洗涤3次。
（7）用荧光倒置显微镜观察抗原抗体是否特异性结合，得图5。
实施例4：荧光探针标记人血蛋白（HSA）后用于识别抗体
（1）包被：将抗体稀释成1 µg/ml，与包被液（碳酸盐缓冲液）混合加入到酶标版中，37℃孵育2 h，4℃过夜；
（2）洗涤：取40 ml PBS加入20 µl吐温20，配制成PBST溶液配制成PBST溶液，用PBST溶液洗涤酶标版，每孔300 µl，每次3 min，洗涤3次；
（3）封闭：将牛血清蛋白配制成0.02 mg/ml，加入酶标板中，37℃孵育2 h；
（4）洗涤：用PBST溶液洗涤酶标版，每孔300 µl，每次3 min，洗涤3次；
（5）结合：将一定量的实施例1制得的荧光探针化合物溶于适量的甲醇溶液并用超纯水稀释成浓度为1.5X10-5 mol/L；将人血清白蛋白（HSA）用超纯水稀释成浓度为1X10-5 mol/L；Tris-HCl溶液配制为0.05mol/L PH=7.4（内含浓度为0.1 mol/L的NaCl）；在4 ml的EP管中加入1 ml Tris-HCl溶液，1 ml的荧光化合物和1 ml的HSA溶液,混匀，在37℃下孵育2 h。
（6）标记：将上述配制的荧光抗原混合物加入到96孔板上，每孔加100 µl，在37℃下孵育2 h，用PBST溶液洗涤酶标版，每孔300 µl，每次3 min，洗涤3次。
（7）用荧光倒置显微镜观察抗原抗体是否特异性结合，得图6。
实施例5：荧光探针在不同PH的Tris-HCl溶液的荧光性质
配制不同PH值的Tris-HCl 作为缓冲溶液对比测定前后荧光强度的变化值。实施例1制得的荧光探针单独的荧光强度稳定，且不会随着pH值的变化而明显改变，配制PH=6.4-12.4的Tris-HCl缓冲溶液，测定之间的荧光变化。其中荧光强度在PH=7.4时荧光强度差异最大，荧光探针在PH=7.4时与蛋白质结合最好得图7。
实施例6：不同孵育时间对荧光探针标记人血清蛋白（HSA）的荧光性质的变化
在4 ml的EP管中加入1ml Tris-HCl溶液，1 ml的实施例1制得的荧光探针化合物和1ml的HSA溶液,混匀，在37℃下孵育0 min、20 min、40 min、60 min、80 min、100min、120min、140 min、160 min，孵育120 min即2 h时荧光强度变化最大，因此选择孵育时间为2 h。得图8。图9为本发明荧光探针标记人血清蛋白（HSA）后孵育不同时间荧光信号的变化图
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种针对GC33-3-1抗体具有特异性识别的荧光探针，其特征在于：该荧光探针的结构式如下：
。
2.一种权利要求1所述针对GC33-3-1抗体具有特异性识别的荧光探针的合成方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）中间体化合物F1的合成
将4,6-二氯嘧啶和邻苯二胺溶于异丙醇中，并向该反应液中加入N,N-二异丙基乙胺，将反应液加入微波反应中，150 ℃反应10 min，减压除去异丙醇，得化合物F1；
（2）中间体化合物F2的合成
将化合物F1和羰基-2-咪唑溶于四氢呋喃溶液中，加入吡啶作催化剂，在氮气保护下65℃油浴回流，过夜，减压除去溶剂，经硅胶柱分离，得化合物F2；
（3）荧光探针F3的合成
将化合物F2和2-氨基吡啶溶于异丙醇中，加入对甲苯磺酸作催化剂，将反应液加入微波反应中，150 ℃反应10 min，减压除去溶剂，用饱和碳酸氢钠/二氯甲烷溶液萃取，收集有机层，旋干，经硅胶柱分离，得荧光探针F3。
3.如权利要求2所述的合成方法，其特征在于：
步骤（1）中化合物F1的合成无需后处理，直接得到产物；
步骤（2）中硅胶柱以石油醚：乙酸乙酯体积比为4:1--1:1的展开剂；
步骤（3）中硅胶柱以石油醚：乙酸乙酯体积比为1:1的展开剂。
4.如权利要求2所述的合成方法，其特征在于：步骤（1）中4,6-二氯吡啶和邻苯二胺的摩尔质量比为1：1。
5.如权利要求2所述的合成方法，其特征在于：步骤（2）中化合物F2和羰基-2-咪唑以及吡啶的质量比为1:2:1。
6.如权利要求2-5任一所述的合成方法，其特征在于：步骤（3）化合物F2和2-氨基吡啶以及对甲苯磺酸的摩尔质量比1:1:2.5。
7.一种权利要求1所述的荧光探针用于特异性识别GC33-3-1抗体。
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