CN104704366B - 异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁染料和它的生物共轭物 - Google Patents

异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁染料和它的生物共轭物 Download PDF

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Abstract

提供了异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉花菁染料、其共轭物和使用它们的方法。主题花菁染料包括具有异羟肟酸取代基的氮杂吲哚啉环。染料可以进一步包括反应性基团部分(RGM)和/或水溶性基团。还提供了主题染料的共轭物。还提供了串联共轭物，这些串联共轭物包括能够能量转移至染料的荧光蛋白。提供了通过使样品与检测试剂接触而检测所述样品中的分析物的方法。所述检测试剂可以是特异性结合所述分析物的染料共轭物，或可以是共轭至所述分析物的反应性染料。还提供的是并入了这样的染料的组合物，例如试剂盒等，这有助于在此类方法中的应用。

Description

异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁染料和它的生物共轭物
相关申请的引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请案要求2012年10月24日提交的美国临时专利申请序列号61/717,983的提交日期的优先权；将该申请案的披露通过引用结合于此。
引言
对于多种应用(包括组织学、细胞学、和免疫学应用)中的生物检测而言，荧光探针是有用的工具。确切地，在通过流式细胞术、荧光活化细胞分选法和荧光显微镜检术在细胞混合物中鉴定和分离细胞的亚群方面；在荧光免疫分析中确定结合部分(例如抗原-抗体结合)的浓度方面；在通过染色在凝胶或其他支持物中定位物质方面，荧光探针发现了功用。荧光化合物可以被共价地或非共价地附接至其他材料以赋予荧光。明亮的荧光染料允许以大的敏感性检测或定位附接的材料。
当采用用于以上目的的荧光染料时，对于荧光染料的选择存在很多注意事项。一个注意事项是荧光染料的吸收和发射特征，因为在测试下的样品(例如血液、尿、脑脊液)中的很多配体、受体、和材料将发出荧光并且干扰荧光标签的荧光的准确测定。这一现象称为自发荧光或背景荧光。另一注意事项是荧光染料共轭至配体和受体以及其他生物的和非生物的材料的能力，以及此类共轭对分子特性的潜在作用，例如荧光染料的荧光量子效率方面的变化。还可能的是，与荧光染料共轭将灭活标记的分子的功能。第三个注意事项是针对敏感的检测，荧光染料的量子效率应该是高的。第四个注意事项是荧光染料的光吸收能力、或消光系数还应该尽可能地大。还感兴趣的是，当极为贴近时，无论荧光分子是否将彼此相互作用，这将导致自淬灭。第五个注意事项是标记染料的光稳定性，这是由于为了最佳检测，染料共轭物通常经受反复照射。一个另外注意事项是无论通过自身或共轭与荧光染料共轭的化合物，是否存在荧光染料与其他化合物或容器壁的非特异性结合。
因此，具有一个或多个特性(例如高量子效率、良好的光稳定性、在更长波长的吸收和发射、更高共轭产率、低非特异性干扰、低淬灭和低自聚集)的荧光染料和共轭物是感兴趣的。
概述
提供了异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁染料、其生物共轭物和使用它的方法。主题染料包括具有氮杂吲哚啉环的花菁染料结构，其中吡啶鎓部分被并入吲哚啉环结构以形成氮杂吲哚啉环，并且异羟肟酸部分作为一个取代基被附接至氮杂吲哚啉环。在一些情况下，异羟肟酸部分在氮杂吲哚啉环的位置5被并入。该染料进一步包括在多个位置中的一个或多个处的反应基部分(RGM)。
本发明的方面包括反应性异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁染料和它们的共轭物，其中主题染料被共轭至感兴趣的底物。在一些情况下，底物包括特异性结合至感兴趣的分析物的结合部分。在某些情况下，染料共轭物是串联共轭物，其中染料被共轭至荧光蛋白。该染料会能够进行使用共轭的荧光蛋白的FRET。染料荧光蛋白共轭物可以被进一步共轭至特异性结合感兴趣的分析物的结合部分。
提供了检测样品中的分析物的方法。该方法的方面包括使样品与检测试剂接触。在一些情况下，检测剂是染料共轭物，该染料共轭物包括特异性地结合分析物的特异性结合部分。在一些情况下，检测剂是共轭至分析物的反应性染料。该方法的方面进一步包括用荧光检测分析物。在定位或检测样品中的分析物或配体的相互作用或存在方面，染料化合物和染料共轭物找到了用途。还提供的是组合物，例如试剂盒等，将这样的染料或染料共轭物并入有助于它们在此类方法中的应用。
附图简要说明
图1示出了在PBS缓冲液(pH＝7.4)中，化合物26(右)和Cy5(左)的吸收光谱。与Cy5相比，化合物26的最大吸收波长红移了约63nm。
图2示出了在PBS缓冲液(pH＝7.4，在630nm激发)中，化合物26(右)和Cy5(左)的荧光光谱。与Cy5相比，化合物26的最大荧光波长红移了约66nm。
图3说明了在PBS缓冲液(pH＝7.4)中，化合物12、48和55与Alexa700NHS酯的光稳定性比较(实例43)。
图4说明了在PBS缓冲液(pH＝7.4)中，APC化合物12、48、50、53和54串联物与APC-Alexa700串联物的光稳定性比较(实例43)。
图5示出了包括附接至异羟肟酸的接头反应基部分(L-RGM)的异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁染料的合成方案。
图6示出了包括L-RGM取代的吲哚啉环的异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁的合成。
图7示出了包括分别位于异羟肟酸和吲哚啉部分的两个L-RGM基团的异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁的合成。
图8示出了与CD8-Alexa700共轭物相比，使用CD8抗体分别与化合物12和48的染料-抗体共轭物所获得的免疫染色数据。
图9示出了与APC-H7相比，使用CD20抗体与化合物12的染料-抗体共轭物所获得的免疫染色数据。
图10示出了与APC-Cy5.5和APC-Alexa700相比，使用标记有APC化合物12的CD8抗体的串联染料-抗体共轭物所获得的免疫染色数据。
图11示出了与CD19抗体标记的Alexa相比，使用标记有APC化合物12串联物的CD19抗体的染料-抗体共轭物所获得的免疫染色数据。
图12示出了化合物12(R700)串联物和直接的CD8共轭物对比APC和APC-H7共轭物的亮度比较。与R700直接共轭物和传统染料共轭物二者相比，APC-R700串联共轭物要更加明亮。
图13示出与Alexa 700染料相比，化合物12(R700)的串联共轭物具有更少％溢出进入APC和APC-Cy7、以及PerCP-Cy5.5共轭物。
定义
以下术语具有以下意义，除非另外指明。任何未定义的术语都具有它们的本领域公认的意义。
“烷基”是指具有从1至10个碳原子并且例如是1至6个碳原子、或1至5、或1至4、或1至3个碳原子的一价饱和脂肪族烃基。通过举例，这一术语包括直链的和支链的烃基，例如甲基(CH3-)、乙基(CH3CH2-)、正丙基(CH3CH2CH2-)、异丙基((CH3)2CH-)、正丁基(CH3CH2CH2CH2-)、异丁基((CH3)2CHCH2-)、仲丁基((CH3)(CH3CH2)CH-)、叔丁基((CH3)3C-)、正戊基(CH3CH2CH2CH2CH2-)、和新戊基((CH3)3CCH2-)。
术语“取代的烷基”是指如在此定义的烷基，其中烷基链中的一个或多个碳原子已经任选地被以下取代：杂原子(例如-O-、-N-、-S-)，-S(O)n-(其中n是0至2)，-NR-(其中R是氢或烷基)，并且具有从1至5个选自下组的取代基，该组由以下各项组成：烷氧基、取代的烷氧基，环烷基，取代的环烷基，环烯基，取代的环烯基，酰基，酰氨基，酰氧基，氨基，氨酰基，氨基酰氧基，氧氨基酰基，叠氮基，氰基，卤素，羟基，氧代，硫酮(thioketo)，羧基，羧烷基，硫代芳氧基，硫代杂芳氧基，硫代杂环氧基，硫醇，硫代烷氧基，取代的硫代烷氧基，芳基，芳氧基，杂芳基，杂芳基氧基，杂环基，杂环氧基，羟氨基，烷氧基氨基，硝基，-SO-烷基，-SO-芳基，-SO-杂芳基，-SO2-烷基，-SO2-芳基，-SO2-杂芳基，以及-NRaRb，其中R’和R”可以是相同的或不同的并且选自氢，任选取代的烷基，环烷基，烯基，环烯基，炔基，芳基，杂芳基和杂环。
“亚烷基”是指二价脂肪族烃基，该烃基具有直链的或支链的优选从1至6个并且更优选1至3个碳原子，并且该烃基任选地被选自以下项的一个或多个基团中断：-O-、-NR10-、-NR10C(O)-、-C(O)NR10-等。通过举例，这一术语包括亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2CH2-)、正亚丙基(-CH2CH2CH2-)、异亚丙基(-CH2CH(CH3)-)、((-C(CH3)2CH2CH2-)、(-C(CH3)2CH2C(O)-)、(-C(CH3)2CH2C(O)NH-)、(-CH(CH3)CH2-)、等。
“取代的亚烷基”是指如在以下“取代的”定义中对碳所做描述，具有1至3个氢被取代基取代的亚烷基。
如在此定义，术语“烷烃”是指烷基和亚烷基。
术语“烷基氨基烷基”、“烷基氨基烯基”和“烷基氨基炔基”是指基团R’NHR”—其中R’是如在此定义的烷基并且R”是如在此定义的亚烷基、亚烯基或亚炔基。
术语“烷芳基”或“芳烷基”是指基团-亚烷基-芳基和-取代的亚烷基-芳基，其中在此定义了亚烷基、取代的亚烷基和芳基。
“烷氧基”是指基团–O-烷基，其中烷基如在此定义。通过举例，烷氧基包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、等。术语“烷氧基”还指基团烯基-O-、环烷基-O-、环烯基-O-、和炔基-O-，其中烯基、环烷基、环烯基、和炔基如在此定义。
术语“取代的烷氧基”是指基团取代的烷基-O-、取代的烯基-O-、取代的环烷基-O-、取代的环烯基-O-、和取代的炔基-O-，其中取代的烷基，取代的烯基，取代的环烷基，取代的环烯基和取代的炔基如在此定义。
如在此定义，术语“烷氧基氨基”是指基团–NH-烷氧基，其中在此定义了烷氧基。
术语“卤代烷氧基”是指基团烷基-O-，其中烷基上的一个或多个氢原子已经被卤素基团取代，并且通过举例，包括基团，例如三氟甲氧基等。
术语“卤烷基”是指如以上所述的取代的烷基，其中烷基上的一个或多个氢原子已经被卤素基团取代。此类基团的实例包括但不局限于氟烷基，例如三氟甲基、二氟甲基、三氟乙基等。
术语“烷基烷氧基”是指基团-亚烷基-O-烷基、亚烷基-O-取代的烷基、取代的亚烷基-O-烷基、和取代的亚烷基-O-取代的烷基，其中烷基、取代的烷基、亚烷基和取代的亚烷基如在此定义。
术语“烷基硫代烷氧基”是指基团-亚烷基-S-烷基、亚烷基-S-取代的烷基、取代的亚烷基-S-烷基、和取代的亚烷基-S-取代的烷基，其中烷基、取代的烷基、亚烷基和取代的亚烷基如在此定义。
“烯基”是指直链的或支链的烃基，该烃基具有从2至6个碳原子并且优选是2至4个碳原子，并且具有至少1个并且优选是从1至2个位点的双键不饱和度。通过举例，这一术语包括二-乙烯基、烯丙基、以及丁-3-烯-1-基。包括在这一术语内的是顺反异构体或这些异构体的混合物。
术语“取代的烯基”是指具有选自以下项的从1至5个取代基、或从1至3个取代基的如在此定义的烯基：烷氧基、取代的烷氧基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、取代的氨基、氨酰基、氨基酰氧基、氧氨基酰基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、氧代、硫酮(thioketo)、羧基、羧烷基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、硫代杂环氧基、硫醇、硫代烷氧基、取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳基氧基、杂环基、杂环氧基、羟氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-取代的烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、-SO2-取代的烷基、-SO2-芳基和-SO2-杂芳基。
“炔基”是指直链的或支链的一价烃基，该烃基具有从2至6个碳原子并且优选是2至3个碳原子，并且具有至少1个并且优选是从1至2个位点的三键不饱和度。此类炔基的实例包括乙炔基(-C≡CH)、和炔丙基(-CH2C≡CH)。
术语“取代的炔基”是指具有选自以下项的从1至5个取代基、或从1至3个取代基的如在此定义的炔基：烷氧基、取代的烷氧基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、取代的氨基、氨酰基、氨基酰氧基、氧氨基酰基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、氧代、硫酮(thioketo)、羧基、羧烷基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、硫代杂环氧基、硫醇、硫代烷氧基、取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳基氧基、杂环基、杂环氧基、羟氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-取代的烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、-SO2-取代的烷基、SO2-芳基和-SO2-杂芳基。
“炔氧基”是指基团–O-炔基，其中炔基如在此定义。通过举例，炔氧基包括乙炔氧基、丙炔氧基、等。
“酰基”是指基团H-C(O)-、烷基-C(O)-、取代的烷基-C(O)-、烯基-C(O)-、取代的烯基-C(O)-、炔基-C(O)-、取代的炔基-C(O)-、环烷基-C(O)-、取代的环烷基-C(O)-、环烯基-C(O)-、取代的环烯基-C(O)-、芳基-C(O)-、取代的芳基-C(O)-、杂芳基-C(O)-、取代的杂芳基-C(O)-、杂环基-C(O)-、和取代的杂环基-C(O)-，其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环、和取代的杂环如以上定义。例如，酰基包括“乙酰基”CH3C(O)-。
“酰氨基”是指基团–NR20C(O)烷基、–NR20C(O)取代的烷基、NR20C(O)环烷基、–NR20C(O)取代的环烷基、–NR20C(O)环烯基、NR20C(O)取代的环烯基、-NR20C(O)烯基、-NR20C(O)取代的烯基、NR20C(O)炔基、-NR20C(O)取代的炔基、NR20C(O)芳基、NR20C(O)取代的芳基、NR20C(O)杂芳基、NR20C(O)取代的杂芳基、NR20C(O)杂环、和NR20C(O)取代的杂环的，其中R20是氢或烷基并且其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环、和取代的杂环如在此定义。
“氨羰基”或术语“氨酰基”是指基团-C(O)NR21R22，其中R21和R22独立地选自下组，该组由以下各项组成：氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环、和取代的杂环，并且其中R21和R22任选地与结合至其的氮连接在一起来形成杂环的或取代的杂环的基团，并且其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环、和取代的杂环如在此定义。
“氨羰基氨基”是指基团–NR21C(O)NR22R23，其中R21、R22、和R23独立地选自氢、烷基、芳基或环烷基，或其中两个R基团结合以形成杂环基。
术语“烷氧基羰基氨基”是指基团-NRC(O)OR，其中每个R独立地是氢、烷基、取代的烷基、芳基、杂芳基、或杂环基，其中烷基、取代的烷基、芳基、杂芳基、和杂环基如在此定义。
术语“酰氧基”是指基团烷基-C(O)O-、取代的烷基-C(O)O-、环烷基-C(O)O-、取代的环烷基-C(O)O-、芳基-C(O)O-、杂芳基-C(O)O-、和杂环基-C(O)O-，其中烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、芳基、杂芳基、和杂环基如在此定义。
“氨基磺酰基”是指基团–SO2NR21R22，其中R21和R22独立地选自下组，该组由以下各项组成：氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环、取代的杂环，并且其中R21和R22任选地与结合至其的氮连接在一起来形成杂环的或取代的杂环的基团，并且烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环、和取代的杂环如在此定义。
“磺酰基氨基”是指基团–NR21SO2R22，其中R21和R22独立地选自下组，该组由以下各项组成：氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环、和取代的杂环，并且其中R21和R22任选地与结合至其的原子连接在一起来形成杂环的或取代的杂环的基团，并且其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环、和取代的杂环如在此定义。
“芳基”或“Ar”是指具有从6至18个碳原子的一价芳香族碳环基团，该基团具有单环(例如存在于苯基中)或环***，该环***具有多个稠环(此类芳香族环***的实例包括萘基、蒽基和茚满基)，其中稠环可以是或可以不是芳香族的，其条件是附着点是通过芳香族环的原子。通过举例，这一术语包括苯基和萘基。除非另外受对芳基取代基的定义的约束，此类芳基可以任选地被从1至5个取代基、或从1至3个取代基取代，这些取代基选自酰氧基、羟基、硫醇、酰基、烷基、烷氧基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、取代的烷基、取代的烷氧基、取代的烯基、取代的炔基、取代的环烷基、取代的环烯基、氨基、取代的氨基、氨酰基、酰氨基、烷芳基、芳基、芳氧基、叠氮基、羧基、羧烷基、氰基、卤素、硝基、杂芳基、杂芳基氧基、杂环基、杂环氧基、氨基酰氧基、氧基酰基氨基、硫代烷氧基、取代的硫代烷氧基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、-SO-烷基、-SO-取代的烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、-SO2-取代的烷基、-SO2-芳基、-SO2-杂芳基和三卤甲基。
“芳氧基”是指基团–O-芳基，其中芳基如在此定义，通过举例，芳氧基包括苯氧基、萘氧基、等，包括也如在此定义的任选地取代的芳基。
“氨基”是指基团–NH2。
术语“取代的氨基”是指基团-NRR，其中每个R独立地选自下组，该组由以下各项组成：氢、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、烯基、取代的烯基、环烯基、取代的环烯基、炔基、取代的炔基、芳基、杂芳基、和杂环基，其条件是至少一个R不是氢。
术语“叠氮基”是指基团–N3。
“羧基(Carboxyl和carboxy)”或“羧化物”是指–CO2H或它们的盐。
“羧基酯(Carboxyl ester和carboxy ester)”或术语“羧烷基(carboxyalkyl和carboxylalkyl)”是指基团-C(O)O-烷基、-C(O)O-取代的烷基、-C(O)O-烯基、-C(O)O-取代的烯基、-C(O)O-炔基、-C(O)O-取代的炔基、-C(O)O-芳基、-C(O)O-取代的芳基、-C(O)O-环烷基、-C(O)O-取代的环烷基、-C(O)O-环烯基、-C(O)O-取代的环烯基、-C(O)O-杂芳基、-C(O)O-取代的杂芳基、-C(O)O-杂环、和-C(O)O-取代的杂环，其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环、和取代的杂环如在此定义。
“(羧基酯)氧基”或“碳酸酯”是指基团–O-C(O)O-烷基、-OC(O)O-取代的烷基、-O-C(O)O-烯基、-O-C(O)O-取代的烯基、-O-C(O)O-炔基、-OC(O)O-取代的炔基、-O-C(O)O-芳基、-O-C(O)O-取代的芳基、-O-C(O)O-环烷基、-O-C(O)O-取代的环烷基、-O-C(O)O-环烯基、-O-C(O)O-取代的环烯基、-OC(O)O-杂芳基、-O-C(O)O-取代的杂芳基、-O-C(O)O-杂环、和-OC(O)O-取代的杂环，其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环、和取代的杂环如在此定义。
“氰基”或“腈”是指基团–CN。
“环烷基”是指具有单个或多个环的从3至10个碳原子的环状烷基，该环烷基包括稠环***、桥环***、和螺环***。适合的环烷基的实例包括例如金刚烷基、环丙基、环丁基、环戊基、环辛基等。通过举例，此类环烷基包括单环结构，例如环丙基、环丁基、环戊基、环辛基、等，或多环结构，例如金刚烷基、等。
术语“取代的环烷基”是指具有选自以下项的从1至5个取代基、或从1至3个取代基的环烷基：烷基、取代的烷基、烷氧基、取代的烷氧基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、取代的氨基、氨酰基、氨基酰氧基、氧氨基酰基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、氧代、硫酮(thioketo)、羧基、羧烷基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、硫代杂环氧基、硫醇、硫代烷氧基、取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳基氧基、杂环基、杂环氧基、羟氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-取代的烷基、SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、-SO2-取代的烷基、-SO2-芳基和-SO2-杂芳基。
“环烯基”是指具有从3至10个碳原子的非芳香族的环烷基，其具有单个的或多个的环并且具有至少一个双键，并且优选是从1至2个双键。
术语“取代的环烯基”是指具有选自以下项的从1至5个取代基、或从1至3个取代基的环烯基：烷氧基、取代的烷氧基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、取代的氨基、氨酰基、氨基酰氧基、氧氨基酰基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、酮基、硫酮(thioketo)、羧基、羧烷基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、硫代杂环氧基、硫醇、硫代烷氧基、取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳基氧基、杂环基、杂环氧基、羟氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-取代的烷基、SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、-SO2-取代的烷基、-SO2-芳基和-SO2-杂芳基。
“环炔基”是指具有从5至10个碳原子的非芳香族的环烷基，其具有单个的或多个的环并且具有至少一个三键。
“环烷氧基”是指–O-环烷基。
“环烯氧基”是指–O-环烯基。
“卤代”或“卤素”是指氟、氯、溴、和碘。
“羟基”或“氢氧基”是指基团–OH。
“杂芳基”是指在环内具有从1至15个碳原子(例如从1至10个碳原子)和1至10个选自下组的杂原子的芳香族基团，该组由以下各项组成：氧、氮、和硫。此类杂芳基可以具有单个环(例如吡啶基、咪唑基或呋喃基)或环***中的多个稠环(例如，如在以下基团中，例如吲嗪基、喹啉基、苯并呋喃、苯并咪唑基或苯并噻吩基)，其中环***内的至少一个环是芳香族的，并且环***内的至少一个环是芳香族的，其条件是附着点是通过芳香族环的原子。在某些实施例中，杂芳基的一个或多个氮环原子和/或硫环原子被任选地氧化，以提供N-氧化物(N→O)、亚磺酰基、或磺酰基部分。通过举例，这一术语包括吡啶基、吡咯基、吲哚基、苯硫基、和呋喃基。除非另外受对杂芳基取代基的定义的约束，此类杂芳基可以任选地被1至5个取代基、或从1至3个取代基取代，这些取代基选自酰氧基、羟基、硫醇、酰基、烷基、烷氧基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、取代的烷基、取代的烷氧基、取代的烯基、取代的炔基、取代的环烷基、取代的环烯基、氨基、取代的氨基、氨酰基、酰氨基、烷芳基、芳基、芳氧基、叠氮基、羧基、羧烷基、氰基、卤素、硝基、杂芳基、杂芳基氧基、杂环基、杂环氧基、氨基酰氧基、氧基酰基氨基、硫代烷氧基、取代的硫代烷氧基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、-SO-烷基、-SO-取代的烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、-SO2-取代的烷基、-SO2-芳基和-SO2-杂芳基以及三卤甲基。
在某些实施例中，任何芳基的或杂芳基的环***可以是未被取代的或任选地并且独立地被取代基的任何合成上可及的和化学上稳定的组合所取代，这些取代基例如是H、卤素、氰基、磺酸基、磺酸基的碱或铵盐、硝基、羧基、烷基、全氟烷基、烷氧基、烷硫基、氨基、单烷基氨基、二烷氨基或烷基酰胺基，其烷基部分具有18个或更少的碳。
术语“杂芳烷基”是指基团-亚烷基-杂芳基，其中在此定义了亚烷基和杂芳基。通过举例，这一术语包括吡啶基甲基、吡啶基乙基、吲哚基甲基、等。
“杂芳基氧基”是指–O-杂芳基。
如在此使用，术语“杂原子”，独自地或作为另一基团的一部分，是指氧原子(“O”)、硫原子(“S”)或氮原子(“N”)。将公认的是，当杂原子是氮时，它可以形成一个NR1R2部分，其中R1和R2彼此独立地是氢或烷基，或与结合至其的氮一起形成一饱和的或不饱和的5-、6-、或7-元环。
“杂环”、“杂环的”、“杂环烷基”、和“杂环基”是指具有单环或多个稠环的饱和的或不饱和的基团，包括稠环***、桥环***和螺环***，并且具有从3至20个环原子(例如从5至14个环原子)，包括1至10个杂原子(例如1、2、3或4个氧、氮、或硫杂原子)。这些环原子选自下组，该组由以下各项组成：氮、硫、或氧，其中在稠环***中，这些环中的一个或多个可以是环烷基、芳基、或杂芳基，其条件是附着点是通过非芳香族环。在某些实施例中，杂环基团的一个或多个氮环原子和/或硫环原子被任选地氧化，以提供N-氧化物、-S(O)-、或–SO2-部分。
杂环和杂芳基的实例包括但不局限于吖丁啶、吡咯、咪唑、吡唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、吲嗪、异吲哚、吲哚、二氢吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、异喹啉、喹啉、酞嗪、萘基吡啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、菲咯啉、异噻唑、吩嗪、异噁唑、吩噁嗪、吩噻嗪、咪唑烷、咪唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚啉、邻苯二甲酰亚胺、1,2,3,4-四氢异喹啉、4,5,6,7-四氢苯并[b]噻吩、噻唑、噻唑烷、噻吩、苯并[b]噻吩、吗啉基、硫代吗啉基(thiomorpholinyl)(也称为硫代吗啉基(thiamorpholinyl))、1,1-二氧硫代吗啉基、哌啶基、吡咯烷、四氢呋喃基、等。
杂环基的实例包括噻吩基、苯并[b]噻吩基、萘并[2、3-b]噻吩基、噻蒽基、呋喃基、吡喃基、异苯并呋喃基、苯并噁唑基、色烯基、氧杂蒽基、啡噻基、2H-吡咯基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吲嗪基、异吲哚基、3H-吲哚基、吲哚基、吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、异喹啉基、喹啉基、酞嗪基、萘啶基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、咔唑基、菲啶基、吖啶基、咟啶基(perimidinyl)、菲咯啉基、吩嗪基、异噻唑基、吩噻嗪基、异噁唑基、呋咱基、吩噁嗪基、和四唑基)。
除非另外受对杂环取代基的定义的约束，此类杂环基可以任选地被1至5个取代基、或从1至3个取代基取代，这些取代基选自烷氧基、取代的烷氧基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、取代的氨基、氨酰基、氨基酰氧基、氧氨基酰基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、氧代、硫酮(thioketo)、羧基、羧烷基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、硫代杂环氧基、硫醇、硫代烷氧基、取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳基氧基、杂环基、杂环氧基、羟氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-取代的烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、-SO2-取代的烷基、-SO2-芳基、-SO2-杂芳基、和稠杂环。
“杂环氧基”是指基团–O-杂环基。
术语“杂环硫基”是指基团杂环的-S-。
术语“杂环烯基(heterocyclene)”是指如在此定义，形成自杂环的二价基团。
术语“羟氨基”是指基团-NHOH。
“硝基”是指基团–NO2。
“氧代”是指原子(＝O)。
“磺酰基”是指基团SO2-烷基、SO2-取代的烷基、SO2-烯基、SO2-取代的烯基、SO2-环烷基、SO2-取代的环烷基、SO2-环烯基、SO2-取代的环烯基、SO2-芳基、SO2-取代的芳基、SO2-杂芳基、SO2-取代的杂芳基、SO2-杂环、和SO2-取代的杂环，其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环、和取代的杂环如在此定义。通过举例，磺酰基包括甲基-SO2-、苯基-SO2-、和4-甲基苯基-SO2-。
“磺酰基氧基”是指基团–OSO2-烷基、OSO2-取代的烷基、OSO2-烯基、OSO2-取代的烯基、OSO2-环烷基、OSO2-取代的环烷基、OSO2-环烯基、OSO2-取代的环烯基、OSO2-芳基、OSO2-取代的芳基、OSO2-杂芳基、OSO2-取代的杂芳基、OSO2-杂环、和OSO2-取代的杂环，其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环、和取代的杂环如在此定义。
术语“氨基羰基氧基”是指基团-OC(O)NRR，其中每个R独立地是氢、烷基、取代的烷基、芳基、杂芳基、或杂环，其中烷基、取代的烷基、芳基、杂芳基、和杂环如在此定义。
“硫醇”是指基团-SH。
“硫氧(Thioxo)”或术语“硫酮(thioketo)”是指原子(＝S)。
“烷硫基”或术语“硫代烷氧基”是指基团-S-烷基，其中烷基如在此定义。在某些实施例中，硫可以被氧化为-S(O)-。亚砜可以存在为一种或多种立体异构体。
术语“取代的硫代烷氧基”是指基团-S-取代的烷基。
术语“硫代芳氧基”是指基团芳基-S-，其中芳基如在此定义，包括也在此定义的任选地取代的芳基。
术语“硫代杂芳基氧基”是指基团杂芳基-S-，其中杂芳基如在此定义，包括也如在此定义的任选地取代的芳基。
术语“硫代杂环氧基”是指基团杂环基-S-，其中杂环基如在此定义，包括也如在此定义的任选地取代的杂环基。
除了在此的披露内容，当用于修饰指定基团或基时，术语“取代的”还可以指指定基团或基的一个或多个氢原子，每一个彼此独立地被如以下定义的相同或不同的取代基取代。
除了关于在此的单独术语所披露的基团，除非另外指明，用于取代在指定基团或基中的饱和碳原子上的一个或多个氢(单个碳上的任何两个氢可以被取代为＝O、＝NR70、＝N-OR70、＝N2或＝S)的取代基是-R60、卤代、＝O、-OR70、-SR70、-NR80R80、三卤甲基、-CN、-OCN、-SCN、-NO、-NO2、＝N2、-N3、-SO2R70、-SO2O–M、-SO2OR70、-OSO2R70、-OSO2O–M+、-OSO2OR70、-P(O)(O–)2(M+)2、-P(O)(OR70)O–M+、-P(O)(OR70)2、-C(O)R70、-C(S)R70、-C(NR70)R70、-C(O)O–M+、-C(O)OR70、-C(S)OR70、-C(O)NR80R80、-C(NR70)NR80R80、-OC(O)R70、-OC(S)R70、-OC(O)O-M+、-OC(O)OR70、-OC(S)OR70、-NR70C(O)R70、-NR70C(S)R70、-NR70CO2 –M+、-NR70CO2R70、-NR70C(S)OR70、-NR70C(O)NR80R80、-NR70C(NR70)R70和-NR70C(NR70)NR80R80，其中R60选自下组，该组由以下各项组成：任选地取代的烷基、环烷基、杂烷基、杂环烷基烷基、环烷基烷基、芳基、芳烷基、杂芳基和杂芳基烷基，每个R70独立地是氢或R60；每个R80独立地是R70，或可替代地，两个R80’，与结合至其的氮原子综合起来，形成一个5-、6-或7-元杂环烷基，该杂环烷基可以任选地包括从1至4个选自下组的相同的或不同的另外的杂原子，该组由以下各项组成：O、N和S，其中N可以具有–H或C1-C3烷基取代；并且每个M+是具有净单个正电荷的反离子。例如，每个M+可以独立地是碱离子，例如K+、Na+、Li+；铵离子，例如+N(R60)4；或碱土金属离子，例如[Ca2+]0.5，[Mg2+]0.5，或[Ba2+]0.5(“下标0.5是指针对此类二价碱土金属离子的反离子可以是本发明的化合物的电离形式，并且另一种典型反离子，例如氯，或在此披露的两种电离化合物可以用作针对此类二价碱土金属离子的反离子，或本发明的双电离化合物可以用作针对此类二价碱土金属离子的反离子)。作为特定实例，-NR80R80是指包括-NH2、-NH-烷基、N-吡咯烷基、N-哌嗪基、4N-甲基-哌嗪-1-基和N-吗啉基。
除了在此的披露内容，除非另外指明，针对“取代的“烯、炔、芳基和杂芳基中的不饱和碳原子上的氢的取代基是-R60、卤素、-O-M+、-OR70、-SR70、-S–M+、-NR80R80、三卤甲基、-CF3、-CN、-OCN、-SCN、-NO、-NO2、-N3、-SO2R70、-SO3 –M+、-SO3R70、-OSO2R70、-OSO3 –M+、-OSO3R70、-PO3-2(M+)2、-P(O)(OR70)O–M+、-P(O)(OR70)2、-C(O)R70、-C(S)R70、-C(NR70)R70、-CO2 –M+、-CO2R70、-C(S)OR70、-C(O)NR80R80、-C(NR70)NR80R80、-OC(O)R70、-OC(S)R70、-OCO2 –M+、-OCO2R70、-OC(S)OR70、-NR70C(O)R70、-NR70C(S)R70、-NR70CO2 –M+、-NR70CO2R70、-NR70C(S)OR70、-NR70C(O)NR80R80、-NR70C(NR70)R70和-NR70C(NR70)NR80R80，其中R60、R70、R80和M+如先前定义，其条件是，在取代的烯或炔的情况下，取代基不是-O-M+、-OR70、-SR70、或-S–M+。
除了关于在此的单独术语所披露的基团，除非另外指明，针对“取代的“杂烷基和环杂烷基中的氮原子上的氢的取代基是-R60、-O-M+、-OR70、-SR70、-S-M+、-NR80R80、trihalomethyl、-CF3、-CN、-NO、-NO2、-S(O)2R70、-S(O)2O-M+、-S(O)2OR70、-OS(O)2R70、-OS(O)2O-M+、-OS(O)2OR70、-P(O)(O-)2(M+)2、-P(O)(OR70)O-M+、-P(O)(OR70)(OR70)、-C(O)R70、-C(S)R70、-C(NR70)R70、-C(O)OR70、-C(S)OR70、-C(O)NR80R80、-C(NR70)NR80R80、-OC(O)R70、-OC(S)R70、-OC(O)OR70、-OC(S)OR70、-NR70C(O)R70、-NR70C(S)R70、-NR70C(O)OR70、-NR70C(S)OR70、-NR70C(O)NR80R80、-NR70C(NR70)R70和-NR70C(NR70)NR80R80，其中R60、R70、R80和M+如先前定义。
除了在此的披露内容，在某些实施例中，被取代的基团具有1、2、3、或4个取代基，1、2、或3个取代基，1或2个取代基，或1个取代基。
在一些实施例中，在化合物、化学部分或官能团被描述为取代的情况下，替代基取代基部分一般选自下组，该组由以下各项组成：羟基、氧代、硝基、三氟甲基、卤素、烷氧基、亚烷二氧基、氨基烷基、氨基烷氧基、氨基、单烷基氨基、二烷氨基、烷基羰基氨基、烷氧基羰基氨基、烷氧基羰基、羧基、羟基烷氧基、烷氧基烷氧基、单烷基氨基烷氧基、二烷基氨基烷氧基单(羧烷基)氨基、双(羧烷基)氨基、烷氧基羰基、炔基羰基、烷基磺酸盐(酯)、烯基磺酸盐(酯)、炔基磺酸盐(酯)、芳基磺酸盐(酯)、烷基亚磺酰基、烷基磺酰胺基、芳基磺酰胺基、烷基磺酰胺基、羧基烷氧基、羧烷基、羧烷基氨基、氰基、三氟甲氧基、全氟乙氧基、胍、脒基、氧代胍基、烷基亚氨基、甲酰基亚氨基、酰基腈、酰叠氮、乙酰叠氮、二氯三嗪、异硫氰酸、磺酰卤、磺基琥珀酰亚胺基酯、异氰酸酯、酰卤、醛、卤代乙酰胺、马来酰亚胺、吖丙啶基、烷硫基(二硫化物)、丙烯酰基、卤烷基羰基、硼酸盐、酰肼、氨基甲酰肼、卡巴肼、芳烷基、杂芳基烷基、环烷基烷基、环链烯基烷基、环杂烷基烷基、和环杂烯基烷基。
应理解，在所有以上定义的取代的基团中，通过定义自身具有另外的取代基的取代基而达到的聚合物(例如，具有经取代的芳基(其本身被经取代的芳基取代(其进一步被经取代的芳基取代))作为取代基的经取代的芳基，它另外被取代的芳基、等取代)并不旨在用于包括在此。在此类情况下，此类取代的最大数是三。例如，在此确切地预期的取代的芳基的若干取代局限于取代的芳基-(取代的芳基)-取代的芳基。
除非另外指明，并未明确地在此定义的取代基的命名法是通过命名官能度的末端部分，随后是朝向附着点的邻近官能度而达到的。例如，取代基“芳基烷氧基羰基”是指基团(芳基)-(烷基)-O-C(O)-。
关于包含一个或多个取代基的在此披露的基团中的任一个，当然应理解，此类基团并不包含空间上不现实的和/或合成上不可行的任何取代或取代模式。此外，主题化合物包括生成自这些化合物的取代的所有立体化学异构体。
术语“药学上可接受的盐”是指可为给予患者(例如哺乳动物)所接受的盐(具有反离子的盐，对于给定给药方案，这些盐具有可接受的哺乳动物安全性)。此类盐可以衍生自药学上可接受的无机的或有机的碱，以及衍生自药学上可接受的无机的或有机的酸。“药学上可接受的盐”是指化合物的药学上可接受的盐，该盐衍生自本领域熟知的多种有机的和无机的反离子，并且仅通过举例，包括钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵、等；并且是在当分子包含碱性官能度时，有机酸或无机酸的盐(例如盐酸盐、氢溴化物、甲酸盐、酒石酸盐、苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、草酸盐、等)。
术语“它们的盐”是指当酸的质子被阳离子(例如金属阳离子或有机阳离子等)替代时形成的化合物。在可应用的情况下，该盐是药学上可接受的盐，虽然对于不旨在用于给予患者的中间体化合物的盐而言并不要求这一点。通过举例，本发明的化合物的盐包括以下那些：其中该化合物被无机酸或有机酸质子化以形成阳离子，具有作为该盐的阴离子组分的无机酸或有机酸的共轭碱。
“溶剂化物”是指通过使溶剂分子与溶质的分子或离子结合而形成的复合物。溶剂可以是无机化合物、有机化合物、或二者的混合物。溶剂的一些实例包括但不局限于甲醇、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃四氢呋喃、二甲亚砜、和水。当溶剂是水时，形成的溶剂化物是水合物。
“立体异构体(Stereoisomer)”和“立体异构体(stereoisomers)”是指具有相同原子连接性但是空间上不同原子排列的化合物。立体异构体包括顺反式异构体、E和Z异构体、对映体、和非对映体。
“互变异构体”是指不同之处仅在于原子的电子结合和/或质子的位置的分子的交替形式(例如烯醇-酮和亚胺-烯胺互变异构体)，或包含-N＝C(H)-NH-环原子安排的杂芳基的互变异构形式，例如吡唑、咪唑、苯并咪唑、***、和四唑。本领域普通技术人员将认识到，其他互变异构环原子安排是可能的。
将理解的是，术语“或它们的盐或溶剂化物或立体异构体”旨在包括盐、溶剂化物和立体异构体的全排列，例如主题化合物的立体异构体的药学上可接受的盐的溶剂化物。
如在此使用，术语“生物聚合物”一般用于指氨基酸聚合物、核酸聚合物、碳水化合物、多糖、和脂，每一种都被在此宽泛地定义。
术语“氨基酸聚合物”、“多肽”、“肽”、和“蛋白”在此可互换地使用，是指任何长度的氨基酸的聚合形式，包括已经历共翻译修饰或翻译后修饰的蛋白，例如糖蛋白。氨基酸聚合物可以包括标准的(即由标准遗传密码编码的20种氨基酸之一，也称为蛋白的)和非标准的氨基酸，可以例如由磷酸酯(盐)、碳水化合物、或C1至C25羧酸衍生、保护、或取代。术语“肽”、“多肽”、和“蛋白”在此无差别可互换地使用，关于聚合物的长度，虽然氨基酸的短聚合物典型地称为肽或多肽，并且氨基酸的更长聚合物，具体地是天然发生的和/或具有生物学功能的那些称为蛋白。该术语包括融合蛋白，包括但不局限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白、具有异源的和同源的前导序列的融合、包含至少一个N端蛋氨酸残基的蛋白(例如用于协助重组细菌宿主细胞中的生产)；免疫标记的蛋白；等。
“天然氨基酸序列”或“亲本氨基酸序列”在此可互换地使用，指在进行包括修饰的氨基酸残基的修饰之前的多肽的氨基酸序列。
术语“氨基酸类似物”、“非天然氨基酸”、等可以可互换地使用，并且包括在结构和/或总体形状方面类似于天然发生的蛋白中常见的一个或多个氨基酸(例如Ala或A、Cys或C、Asp或D、Glu或E、Phe或F、Gly或G、His或H、Ile或I、Lys或K、Leu或L、Met或M、Asn或N、Pro或P、Gln或Q、Arg或R、Ser或S、Thr或T、Val或V、Trp或W、Tyr或Y)的氨基酸样化合物。氨基酸类似物还包括具有修饰的侧链或主链的天然氨基酸。氨基酸还包括处于D-式，而不是L-式的天然发生的氨基酸。在一些实例中，氨基酸类似物共享一个或多个天然氨基酸的主链结构、和/或侧链结构，其中一个或多个差异在于分子中的一个或多个修饰的基团。此类修饰可以包括但不局限于用原子(例如N)取代相关原子(例如S)、基团(例如甲基、或羟基、等)或原子(例如Cl或Br、等)的添加、基团的删除、共价键的取代(单键取代双键、等)、或它们的组合。例如，氨基酸类似物可以包括α-羟基酸、和α-氨基酸、等。
如在此使用，术语“抗体”包括衍生自或可衍生自抗体或抗体基因的所有产物，它们作为靶特异性结合试剂是有用的。术语“抗体”被以最广意义使用，并且包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、和多特异性抗体(例如双特异性抗体)、遗传学上工程化的抗体、人源化抗体、单链抗体、嵌合抗体、抗体片段(例如Fab片段)抗体衍生物等。抗体能够结合靶抗原。(Janeway,C.(詹韦)、Travers,P.(特拉弗斯)、Walport,M.(沃尔波特)、Shlomchik(舍罗姆切克)(2001)Immuno Biology(免疫生物学)，第5版，GarlandPublishing(加兰出版社)，纽约)。靶抗原可以具有一个或多个结合位点，也称为表位，由抗体的一个或多个可变区形成的互补决定区(CDR)识别。
术语“天然抗体”是指以下抗体：其中已经由多细胞有机体的免疫***制造并且配对了抗体的重链和轻链。脾、***、骨髓、和血清是生产天然抗体的组织的实例。例如，由分离自用抗原免疫的第一动物的抗体生成细胞生产的抗体是天然抗体。
术语“人源化抗体”或“人源化免疫球蛋白”是指非人类(例如小鼠或兔)抗体，该非人类抗体包含已经用来自人抗体的对应地定位的氨基酸取代的一个或多个氨基酸(例如在框架区、恒定区或CDR中)。总的来说，如与相同抗体的非人源化版本相比，人源化抗体产生人类宿主中减少的免疫反应。可以使用本领域已知的多种技术将抗体人源化，这些技术包括例如CDR-移植(EP 239,400；PCT公开WO 91/09967；美国专利号5,225,539；5,530,101；和5,585,089)，镶饰或表面再塑(EP 592,106；EP 519,596；Padlan(帕朗)，MolecularImmunology(分子免疫学)28(4/5):489-498(1991)；Studnicka(斯图丁尼卡)等人，ProteinEngineering(蛋白工程)7(6):805-814(1994)；Roguska(罗古丝卡)等人，PNAS 91:969-973(1994))，以及链替换(美国专利号5,565,332)。在某些实施例中，通过以下来鉴定框架取代：对CDR和框架残基的相互作用进行建模来鉴定对于抗原结合而言重要的框架残基和进行序列比较来鉴定在具***置的不常见框架残基(参见例如美国专利号5,585,089；Riechmann(齐曼)等人，Nature(自然)332:323(1988))。针对在本发明中使用而预期的用于人源化抗体的另外方法描述于美国专利号5,750,078；5,502,167；5,705,154；5,770,403；5,698,417；5,693,493；5,558,864；4,935,496；和4,816,567，以及专利公开WO 98/45331和WO 98/45332中。在具体实施例中，可以根据在US 20040086979和US 20050033031中列出的方法，将主题兔抗体人源化。相应地，可以使用本领域熟知的方法将上述抗体人源化。
术语“嵌合抗体”是指已经从属于不同物种的抗体可变区和恒定区构建(典型地通过基因工程)轻链和重链的抗体。例如，来自小鼠单克隆抗体的基因的可变区段可以被连接至人类恒定区段，例如γ1和γ3。治疗嵌合抗体的实例是杂合蛋白，该杂合蛋白组成为：来自小鼠抗体的可变结构域或抗原结合结构域和来自人抗体的恒定结构域或效应子结构域，虽然可以使用来自其他哺乳动物物种的结构域。
如在此使用，术语“核酸聚合物”、“核酸”、和“寡核苷酸”是指多脱氧核糖核苷酸(包含2-脱氧-D-核糖)，指多核糖核苷酸(包含D-核糖)，并且指任何其他类型的多核苷酸，其是嘌呤或嘧啶碱，或修饰的嘌呤或嘧啶碱的N糖苷。在术语“核酸”和“寡核苷酸”之间的长度方面不存在有意的区别，并且这些术语将可互换地使用。这些术语仅指分子的一级结构。因此，这些术语包括双链的和单链的DNA，连同双链的和单链的RNA。核酸聚合物旨在包括肽核酸，例如N-(2-氨乙基)甘氨酸单元(参见Nielsen(尼尔森)等人，美国专利5,539,082)。
如关于多肽、肽或蛋白的氨基酸序列使用“遗传学上可编码的”是指氨基酸序列组成为：能够由编码氨基酸序列的核酸的转录和翻译产生的氨基酸残基，其中转录和/或翻译可以发生在细胞中或在无细胞的体外转录/翻译***中。
术语“控制序列”是在具体表达***中协助可操作地连接的编码序列的表达的DNA序列，该表达***例如是哺乳动物细胞、细菌细胞、无细胞合成等。适合原核生物***的控制序列，例如包括启动子、任选地操纵子序列、和核糖体结合位点。真核细胞***可以利用启动子、多腺苷酸化信号、和增强子。
当核酸被放置在与另一核酸序列的功能关系中时，它是“可操作地连接的”。例如，用于前序列或分泌前导子的DNA被可操作地连接至用于多肽的DNA，其条件是它被表达为参与多肽的分泌的前蛋白；启动子或增强子被可操作地连接至编码序列，其条件是它影响该序列的转录；或核糖体结合位点被可操作地连接至编码序列，其条件是它被定位，以便协助翻译的起始。一般地，“可操作地连接”是指被连接的DNA序列是紧接的，并且在分泌前导子的情况下，是紧接的并且在阅读框中。通过连接或通过扩增反应完成连接。根据常规实践，合成寡核苷酸适配子或接头可以被用于连接序列。
如在此使用，术语“表达盒”是指核酸(通常是DNA)的区段，该区段可以***核酸(例如通过使用与连接进入感兴趣的构建体相容的限制位点或通过进入感兴趣的构建体或进入宿主细胞基因组的同源重组)。总的来说，核酸区段包括编码感兴趣的多肽的多核苷酸，并且盒和限制位点被设计为协助将该盒***适当阅读框中，以便转录和翻译。表达盒还可以包括在宿主细胞中协助编码感兴趣的多肽的多核苷酸的表达的元件。这些元件可以包括但不局限于启动子、最小启动子、增强子、反应元件、终止序列、多腺苷酸化序列、等。
如在此使用，术语“分离的”是指用来描述在不同于化合物天然发生的环境中的感兴趣的化合物。“分离的”是指包括在基本上富集感兴趣的化合物和/或在感兴趣的化合物被部分地或基本上地纯化的样品内的化合物。
如在此使用，术语“基本上纯化”是指被从其天然环境移出并且至少60％不含、至少75％不含、至少80％不含、至少85％不含、至少90％不含、至少95％不含、至少98％不含、或多于98％不含与其天然关联的其他组分的化合物。
术语“生理条件”是指涵盖与活细胞相容的那些条件，例如与活细胞相容的温度、pH、盐度、等的主要含水条件。
“反应性配偶子”是指确切地与另一反应性配偶子反应以产生反应产物的分子或分子部分。示例性反应性配偶子包括硫酸酯酶基序和甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的半胱氨酸或丝氨酸，它们反应以形成在该基序中包含替代半胱氨酸或丝氨酸的甲酰甘氨酸(fGly)的转化的醛标记的反应产物。其他示例性反应性配偶子包括转化的醛标记的fGly残基的醛，并且“醛反应性配偶子”，它包括醛反应性基团和感兴趣的部分，并且它反应以形成具有修饰的醛标记的多肽的反应产物，其具有通过修饰的fGly残基共轭至修饰的多肽的感兴趣的部分。
“N-端”是指具有游离胺基的多肽的末端氨基酸残基，在N-端氨基酸残基中的该胺基正常地形成多肽的共价主链的一部分。
“C-端”是指具有游离羧基的多肽的末端氨基酸残基，在C-端氨基酸残基中的该羧基正常地形成多肽的共价主链的一部分。
如关于多肽或多肽的氨基酸序列使用，“内部位点”是指不在N-端或C-端的多肽的区域。
在进一步描述本发明之前，应理解的是本发明不被限制于描述的具体实施例，因为这些当然可以改变。还应理解的是，在此使用的术语仅是出于描述具体实施例的目的，并且不旨在限制，因为本发明的范围将仅由所附权利要求书限制。
在提供了一个范围的值时，应理解每个中间值，到下限的第十个单位(除非上下文清晰地另外指示)，该范围的上限与下限之间以及任何其他陈述的或在陈述范围内的中间值均被涵盖在本发明之内。这些更小范围的上限和下限可以独立地被包括在更小范围之内，并且也被涵盖在本发明之内，服从于在所陈述范围内任何确切排除的限制。在所陈述的范围包括一个或两个限制时，排除了那些被包括的限制的任一个或两者的范围也被包括在本发明之内。
某些范围在此以数值前面加术语“大约”的方式呈现。术语“大约”在此用于为其后面的准确数字以及接近或近似于该术语后面的数字的数字提供字面支持。在判定数字是否接近或近似于特定叙述的数字时，接近或近似的未叙述的数字可以是在呈现其的上下文中提供特定叙述的数字的实质性等效物的数字。
应理解，出于清楚的目的描述于分开的实施例的情形中的本发明某些特征还可以按组合形式提供于单个实施例中。相反，为简便起见，在单一实施例的背景下描述的本发明的不同特征也可以单独地或者以任何适合的子组合提供。适合本发明的实施例的所有组合都确切地由本发明所包涵并且都在此做了披露，正如每个以及每一个组合都单独并且明确地做了披露一样，达到这样的程度以至此类组合包涵了以下主题，该主题例如是化合物，这些化合物是稳定化合物(即可以制造、分离、表征、并且测试生物活性的化合物)。此外，不同实施例和它们的要素(例如在描述此类变量的实施例中所列的化学基团的要素)的所有子组合也确切地被本发明包涵并且被在此披露，正如每个以及每一个此类子组合被在此单独且明确披露一样。
除非另外限定，在此使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员所一般理解的具有相同含义。虽然类似于或等同于在此描述的那些的任何方法和材料也可以用于本发明的实践或测试中，现在将对优选方法和材料进行描述。
在本说明书中引用的所有公开物和专利通过引用结合于此，就像每个单独公开物或专利被确切地并且单独地指示为通过引用被结合并且通过引用结合于此，以结合所引用的这些公开物来披露和描述这些方法和/或材料。任何公开物的引用内容是针对在提交日之前的披露，并且不能理解为承认因为先前发明而本发明不能获得比这些公开物更早的申请日。另外，提供的公开物的日期可以不同于实际公开日期，实际公开日期可能需要被独立核实。
应指出，如在此使用的，并且在所附权利要求书中，单数形式“一个”、“一种”、以及“该”包括复数指代物，除非上下文另外清晰地指示。另外指出的是，权利要求书可以撰写以排除任何可选择的要素。这样的陈述旨在作为使用与权利要求要素的叙述有关的排他性术语诸如“单独”、“仅”等或利用“否定型”限定的前提基础。
应理解，出于清楚的目的描述于分开的实施例的情形中的本发明某些特征还可以按组合形式提供于单个实施例中。相反，为简便起见，在单一实施例的背景下描述的本发明的不同特征也可以单独地或者以任何适合的子组合提供，而不偏离本发明的范围或精神。可以按照所叙述的事件的顺序或按照逻辑上可行的任何其他顺序来进行任何叙述的方法。
详细说明
本披露提供了异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁染料、染料共轭物、和制造与使用它们的方法。在以下部分中更详细地描述了各自的实施例。
在一些情况下，将异羟肟酸和氮杂吲哚啉环***并入花菁染料生成染料-底物共轭物(例如蛋白、核酸和其他生物聚合物共轭物)，如与标记有常规染料的共轭物相比，该共轭物实质性地荧光更多、并且具有多个改进的荧光特性中的任一个。主题染料的共轭物可以提供减少的不希望的效果，例如淬灭、缺乏光稳定性、低量子效率、或染料的荧光特性中的不希望的变化。本发明的染料-生物分子共轭物的增强的荧光强度导致当共轭至生物聚合物后，它们的吸收光谱中的更大的测定敏感性和减少的假象。此外，主题染料还可以具有显著增强的光稳定性。异羟肟酸取代基的添加增加了主题染料的光稳定性。这些改进导致使用主题染料和它们的共轭物的测定中显著更大的敏感性，同时利用了用于与类似染料(例如Cy5、Cy5.5、Alexa Fluor 700和Cy7)一起使用的已经可商购的现有滤光器和仪器装备。
另外，在一些情况下，主题染料显示出长于常见碳菁染料的吸收最大值，所以可以选择这些染料来匹配氦氖激光器(633nm)或更长波长激光二极管的主要发射谱线。这对于在红外波长下透明的样品而言是有用的。在一些实例中，本发明的染料具有在氦氖激光器的30nm的发射谱线内(例如20nm内、10nm内、或5nm内)的吸收最大值。
在一些实例中，这些染料具有550nm或更大，例如580nm或更大、590nm或更大、600nm或更大、610nm或更大、620nm或更大、630nm或更大、640nm或更大、650nm或更大、660nm或更大、680nm或更大、690nm或更大、700nm或更大、710nm或更大、720nm或更大、730nm或更大、740nm或更大、750nm或更大、或甚至更大的吸收最大值。
在一些实例中，这些染料具有600nm或更大，例如620nm或更大、640nm或更大、650nm或更大、660nm或更大、680nm或更大、700nm或更大、720nm或更大、740nm或更大、750nm或更大、760nm或更大、780nm或更大、800nm或更大、或甚至更大的发射最大值。
主题染料和它们的共轭物可以具有用于生物检测的多个有用特性。在一些实施例中，染料化合物和/或共轭物具有高的光稳定性(例如是光稳定的)。在一些实施例中，染料化合物和/或共轭物在更长波长具有希望的吸收和发射特征，这减少了来自测试下的样品(例如血液、尿、脑脊液)中的许多配体、受体、和材料的自发荧光或背景荧光的干扰。在一些实施例中，染料化合物以高产率被容易地共轭至生物分子(例如抗体)，在染料的荧光特性和配体的结合特性方面具有很小变化或没有变化。在一些实施例中，这些染料具有高量子效率。在一些实施例中，这些染料具有大消光系数。
异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁染料化合物
异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁染料是花菁基染料，该染料包括经由聚甲炔连接基团连接的第一环***和第二环***。第一环***可以是在任何方便位置被异羟肟酸基团取代的氮杂吲哚啉环***。第二环***可以是任何方便的环***。在一些实施例中，第二环***包括5元杂环。染料可以进一步包括一个或多个反应性基团部分，用于将染料共轭至底物。染料可以包括在任何方便位置的一个或多个水溶性基团。
氮杂吲哚啉环***可以在任何方便位置被连接至聚甲炔连接基团。在一些情况下，氮杂吲哚啉环***在位置2被连接至聚甲炔连接基团。在一些情况下，氮杂吲哚啉环***包括被并入吲哚啉环结构的吡啶鎓部分，以形成氮杂吲哚啉环。如在此使用，术语“氮杂吲哚啉环***”、“氮杂吲哚啉”和“氮杂吲哚啉衍生物”可互换地使用，并且独自地或作为另一基团的一部分，是指包含以下稠合的环结构之一的任何部分或它的衍生物：
氮杂吲哚啉结构(R是N取代基)
应理解的是，本发明的氮杂吲哚啉部分已经在一个或另一个具体的电子共振结构中绘出。本发明的每个方面同样应用至形式上与其他允许的共振结构绘出的染料，因为主题染料上的电荷是贯穿该染料自身离域的。
在一些实施例中，氮杂吲哚啉环***在位置4被异羟肟酸基团取代。在一些实施例中，氮杂吲哚啉环***在位置5被异羟肟酸基团取代。在一些实施例中，氮杂吲哚啉环***在位置6被异羟肟酸基团取代。如在此使用，术语“异羟肟酸(hydroxamate)”、“异羟肟酸(hydroxamic acid)”、“异羟肟酸酯(hydroxamic ester)”、“异羟肟酸的(hydroxamic)”和“异羟肟酸衍生物(hydroxamic derivative)”可互换地使用，并且独自地或作为另一基团的一部分，是指包含以下结构的部分或它的衍生物：
其中R和R”独立地是氢或取代基。像这样，如在此使用，术语异羟肟酸(hydroxamate)涵盖异羟肟酸(hydroxamic acid)和异羟肟酸酯(hydroxamic ester)二者。异羟肟酸基团可以经由任何方便的原子，异羟肟酸的O、N或羰基被附接至染料的环***。在一些情况下，异羟肟酸基团经由至氮杂吲哚啉环***的羰基被附接。在一些情况下，染料是5-异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁染料化合物，例如，其中在位置5被异羟肟酸基团取代第一氮杂吲哚啉环***。
在一些实施例中，第二环***包括5元杂环，该杂环经由该环的任何方便位置被连接至聚甲炔连接基团。在某些实施例中，5元杂环包括形成至二价聚甲炔连接基团的双键的环中的碳原子。在一些实例中，五元杂环包括该环中的一个或多个氮原子。在一些情况下，五元杂环的每个原子独立地选自下组，该组由以下各项组成：C、CH、C(烷基)、C(芳基)、O、S、N、N(芳基)、N(酰基)和N(烷基)。在某些实例中，五元杂环包含一个氮原子。在一些实施例中，五元杂环是稠合至不饱和的芳香族环或环***的饱和的五元杂环。在一些实例中，五元杂环是吡咯烷环。在一些实例中，在位置4/5，吡咯烷环任选地稠合至芳基的或杂芳基的环或环***。在一些实例中，在位置2，该吡咯烷环被染料的聚甲炔连接基团取代。
5元杂环可以在任何方便位置被任选地稠合至一个或多个芳香族环，例如一个或多个如以上所述的芳基的或杂芳基的环，以提供染料化合物的第二环***。可以选择任何方便的芳基的或杂芳基的环，用于包含在第二环***中。在一些情况下，稠合至5元杂环的一个或多个芳基的或杂芳基的环仅包括六元环。用于包括在染料化合物的第二环***中的感兴趣的芳基的或杂芳基的环和环***包括但不局限于吡啶基、吡咯基、吲哚基，在某些实例中，在式I中，B被任选地稠合至一个芳基的或杂芳基的环。在一些实例中，5元杂环被任选地稠合至两个芳基的和/或杂芳基的环。在某些情况中，5元杂环被任选地稠合至三个芳基的和/或杂芳基的环。在一些实施例中，5元杂环被稠合至苯并环。在一些实例中，5元杂环被稠合至吡啶环。在一些实施例中，第二环***是吲哚啉的或氮杂吲哚啉的环***。在某些实例中，5元杂环被稠合至多环芳基。在某些实例中，5元杂环被稠合至萘。在某些实例中，5元杂环被稠合至蒽。五元杂环和零至三个芳香族环各自任选地被一个或多个取代基取代。
在一些实例中，选择聚甲炔连接基团以形成在第一氮杂吲哚啉环***和包括5元杂环的第二环***之间具有不饱和键的共轭***。二价聚甲炔连接基团可以包括具有1至15个碳原子(例如1、3、5、7、9、11、13或15个原子)的主链，其中该主链的每个碳原子可以任选独立地被取代。如在此使用，二价聚甲炔连接基团涵盖包括一个次甲基(例如1个碳原子)的连接基团。在一些实施例中，聚甲炔连接基团包括具有3个碳原子的主链。在某些实施例中，聚甲炔连接基团包括具有5个碳原子的主链。在某些实施例中，聚甲炔连接基团包括具有7个碳原子的主链。在一些实例中，聚甲炔连接基团被RGM取代。在某些实例中，经由主链的非末端碳原子连接RGM基团。
异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁染料可以进一步在任何方便位置被一个或多个取代基取代。可以包括任何方便的取代基。在一些实例中，化合物包括一个或多个取代基，这些取代基包括反应性基团部分(RGM)。在一些情况下，化合物包括一个或多个取代基，这些取代基包括底物。在某些实例中，化合物包括一个或多个取代基(例如1、2、3或更多个取代基)，这些取代基包括水溶性基团(极性基团或带电基团，例如磺酸盐、羧基、铵或磷酸酯(盐)基团)。
可以在染料结构的任何方便位置直接地或间接地包括一个或多个RGM基团。在一些实例中，5元杂环包括一个N原子，并且该N原子被接头-RGM取代。在某些情况下，氮杂吲哚啉基团的5-异羟肟酸取代基进一步被接头-RGM取代。在一些情况下，聚甲炔连接基团被取代以包括接头-RGM。
如在此使用，“反应性基团部分”表示“RGM”，是指能够与不同化合物上的官能团化学反应以形成共价键(例如共轭)的化合物上的一个部分。如将在以下更详细描述，可以在主题染料化合物和它们的共轭物中利用多种反应性基团部分(RGM)和共轭化学品。感兴趣的RGM包括但不局限于丙烯酰胺、胺、羧酸、羧酸的活化酯、酰叠氮、酰基腈、醛、卤代烷、酸酐、芳基卤、叠氮化物、吖丙啶、硼酸盐、重氮烷、卤代乙酰胺、卤代三嗪、肼、羟胺、亚胺基酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、反应性铂复合物、磺酰卤或补骨脂内酯衍生物。在某些情况下，RGM是琥珀酰亚胺基酯、或马来酰亚胺。在一些情况下，反应性基团部分是可以通过分别暴露于是相容的亲核体或亲电体的底物的对应官能团而形成共价连接的亲电体或亲核体。在其他情况下，反应性基团部分可以是一个可光活化基团，仅在用适当波长的光照射后，它才变为化学反应性的。在一些实例中，反应性染料和待共轭的物质之间的共轭反应生成待并入将染料附接至共轭物质的新连接L的反应性基团RGM的一个或多个原子。在表3中示出了反应性基团和连接的一些实例，其中亲电基团和亲核基团的反应生成一个共价连接。
L是可以连接花菁染料部分和RGM的一个接头。在一些情况下，花菁染料化合物可以直接共轭至RGM或底物，抑或可替代地，通过接头L间接共轭至RGM或底物。为了注释的经济，在此通过具有任选接头的单个结构描述全部两个替代方案。具有任选接头L的结构的一个实施例，其中可以将不存在接头描述为其中L为“无”或“缺失”的结构。如在此使用，如果两个部分可以直接地抑或通过作为中间体的接头彼此结合，则两个部分之间的“接头”，表示“L”，被称为“任选的”。这一语言被用来简化仅不同在于接头的存在或不存在的替代结构的描述。在本发明中，例如，花菁染料分子可以直接共轭至生物聚合物，抑或可替代地，通过一个接头L间接地共轭至生物聚合物。为了注释的经济，在此通过具有任选接头的单个结构描述全部两个替代方案。具有任选接头L的结构的一个实施例，其中可以将不存在接头描述为其中L为“无”的结构。在主题染料中可以利用任何方便的接头基团。例如，接头部分可以包括一个或多个单体单元，例如具有式-(CH2-CH2-O)-或-(O-CH2-CH2)-的乙撑氧。此类单元的数目可以变化，其中此类单元的数目是从2至10、2至8、2至6、2至4，例如一些实施例包括2个单元。另外，接头基团中的最后一个单体单元(例如乙撑氧基团)可以进一步被如在此定义的一个或多个官能团取代，这些官能团例如像烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、氨基、取代的氨基、酰基、羧基、羧基酯、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、取代的烷基酰胺、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、或取代的杂环基。在一些实例中，接头基团中的最后一个单体单元(例如最后一个乙撑氧基团)可以进一步被羧基，或保护的羧基(例如全氟苯基保护的羧基)取代。在一些情况下，L是无、烷基、烷氧基、硫代烷基、氨基酸、磺基氨基酸、多胺、聚乙二醇、芳基、芳烷基、杂芳基烷基、或杂芳基。在某些实施例中，连接基团包括10-15个碳原子和/或0-6个杂原子。另外地，接头可以包括修饰或未修饰的核苷酸、核苷、聚合物、糖和其他碳水化合物、聚醚，例如像聚乙二醇、多元醇、聚丙烯、丙二醇、乙二醇和丙二醇的混合物、聚烷基胺、聚胺(例如精脒)、聚酯(例如聚(丙烯酸乙脂))、聚磷酸二酯、和烯烃。在某些实施例中，L是无、烷基、或聚乙二醇。接头可以是可切割的或非可切割的。
在一些实施例中，染料化合物包含一个或多个L-RGM取代基，其中RGM是经由共价连接L附接至染料的反应性基团部分。在某些实施例中，染料化合物仅被一个RGM或共轭的底物取代。在一些实施例中，染料化合物包含两个或更多个L-RGM基团，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、30、40、50个或甚至更多个L-RGM基团，其中RGM是经由共价连接L附接至染料的反应性基团。在某些实施例中，L是将染料附接至包含用作间隔子的多个中间原子的RGM的共价连接。
染料化合物可以在任何方便位置包括一个或多个水溶性取代基(例如极性的或带电的取代基)，这些取代基可以被包括以赋予染料增加的水溶性。在一些实例中，这些化合物合并至少一个带电基团，以增加水溶性。可以合并任何方便的带电基团。感兴趣的带电基团包括但不局限于磺酸盐、铵、羧基、磷酸酯(盐)、氨基、取代的氨基等。独自地或作为另一基团的一部分，术语“磺酸根基团(sulphonate)”是指包含磺酸或它的盐的任何化合物或取代基，例如具有以下结构的一个或多个部分：其中R是氢或一个反离子，例如金属离子或铵离子。类似地，“羧基”是指羧酸或羧酸的盐。如在此使用，“磷酸酯基团(phosphate)”是磷酸的酯，并且包括磷酸酯基团的盐。如在此使用，“膦酸根基团(phosphonate)”是指膦酸并且包括膦酸根基团的盐。如在此使用，除非另外指明，取代基(例如烷基、烷氧基、芳烷基、烷氨基、二烷氨基、三烷基铵、或全氟烷基)的烷基部分是任选地饱和的、不饱和的、直链的或支链的，并且所有烷基、烷氧基、烷氨基、和二烷氨基取代基自身任选地被羧基、磺酸盐、氨基、或羟基进一步取代。可以合并任何方便的极性取代基。感兴趣的极性取代基包括但不局限于含羟基取代基、碳水化合物、和聚乙二醇基团或接头。
在一些实施例中，染料是异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁染料，包括经由二价聚甲炔连接基团连接至5元杂环的5-异羟肟酸-氮杂吲哚啉基团，其中5-异羟肟酸-氮杂吲哚啉基团、二价聚甲炔连接基团和5元杂环中的一个或多个被反应性基团部分(RGM)取代。
在一些情况下，用式I描述染料：
其中环B表示对于形成含氮五元杂环所必需的原子并且进一步包括零至三个稠合的芳香族环；其中该五元杂环和该零至三个稠合的芳香族环的每个原子独立地选自下组，该组由以下各项组成：C、CH、C(烷基)、C(芳基)、O、S、N、N(芳基)、N(酰基)和N(烷基)，并且该五元杂环和该零至三个芳香族环任选地被选自下组的一个或多个取代基取代，该组由以下各项组成：氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、羰基、氨基、硫醇、磺酸盐、膦酰基、和L-RGM；n是0至3；R1–R3各自独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、羧烷基、膦酰基烷基、磺酰基烷基、或L-RGM；R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、羧烷基、膦酰基烷基、磺烷基、或L-RGM；R6和R7各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、膦酰基烷基、磺烷基、或L-RGM；R8和R9各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、羰基、氨基、硫醇、磺酸盐、膦酰基或L-RGM；R10和R11各自独立地是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、膦酰基烷基、磺烷基、或L-RGM；RGM是化学反应性基团；并且L是一个接头。
在一些实例中，在式I中，环B表示对于形成含氮五元杂环所必需的原子并且进一步包括零至三个稠合的芳香族环；其中该五元杂环和该零至三个稠合的芳香族环的每个原子独立地选自下组，该组由以下各项组成：C、CH、C(烷基)、C(芳基)、O、S、N、N(芳基)、N(酰基)和N(烷基)。在在某些实例中，B是包含一个氮原子的五元杂环。在一些实施例中，B是稠合至不饱和的芳香族环的饱和五元杂环。在某些情况下，B环的每个原子独立地选自下组，该组由以下各项组成：C、CH、C(烷基)、C(芳基)、N、N(芳基)、N(酰基)和N(烷基)。在一些实例中，B是吡咯烷环。在一些实例中，B是在位置4/5任选地稠合至芳基的或杂芳基的环或环***的吡咯烷环。在一些实例中，环B是在位置2被聚甲炔基团取代的吡咯烷环。
环B可以被任选地稠合至一个或多个芳香族环，例如一个或多个如以上所述的芳基的或杂芳基的环，以提供染料化合物的第二环***。可以选择任何方便的芳基的或杂芳基的环，用于包含在第二环***中。在一些情况下，稠合至B的一个或多个芳基的或杂芳基的环仅包括六元环。用于包括在染料化合物的第二环***中的感兴趣的芳基的或杂芳基的环和环***包括但不局限于吡啶基、吡咯基、吲哚基，在某些实例中，在式I中，B被任选地稠合至一个芳基的或杂芳基的环。在一些实例中，在式I中，B被任选地稠合至两个芳基的和/或杂芳基的环。在某些实例中，在式I中，B被任选地稠合至三个芳基的和/或杂芳基的环。在一些实例中，环B被稠合至苯并环。在一些实例中，B被稠合至吡啶环。在一些实施例中，第二环***是吲哚啉的或氮杂吲哚啉的环***。在某些实例中，环B被稠合至多环芳基。在某些实例中，环B被稠合至萘。在某些实例中，环B被稠合至蒽。
该五元杂环和该零至三个芳香族环任选地被独立地选自下组的一个或多个取代基取代，该组由以下各项组成：氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、羰基、氨基、硫醇、磺酸盐、膦酰基、和L-RGM。
在一些实施例中，在式I中，n是0。在一些实施例中，在式I中，n是1。在一些实施例中，在式I中，n是2。在一些实施例中，在式I中，n是3。
在一些情况下，在式I中，R1–R3独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、羧烷基、或L-RGM。在某些情况下，R1–R3各自是氢。在某些情况下，在式I中，R1–R3中的两个被环状地连接以形成一个六元碳环或杂环。在某些实施例中，在式I中，R1–R3之一是烷氧基、芳氧基、或L-RGM。
在一些情况下，在式I中，R4和R5独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM。
在一些情况下，在式I中，R4和R5各自独立地选自具有1-20个碳的烷基，其中烷基可以被选自以下项的一个或多个取代基取代：RGM、磺酸盐、磷酸酯(盐)、氨基、取代的氨基、铵、羧基、和羟基。在某些实施例中，R4和R5各自独立地选自–(CH2)m-Z，其中m是1-12并且Z选自-H、-CO2H、-NH2、-SO3 -、-PO3H和RGM。
在某些实例中，在式I中，R6和R7独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-RGM。在某些实例中，在式I中，R6和R7各自独立地是具有1-20个碳的烷基。在某些实例中，在式I中，R6和R7各自独立地是低级烷基。在某些实例中，在式I中，R6和R7各自是甲基。在一些实施例中，R6是低级烷基(例如甲基或乙基)并且R7是L-RGM。在一些实施例中，R7是L-Z(例如–(CH2)m-Z，其中m是1-12并且Z选自-H、-CO2H、-NH2、-SO3 -、-PO3H和RGM)。
在一些实例中，在式I中，R8和R9独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、磺酸盐、羰基、羟基、氨基、硫醇、膦酰基、或L-RGM。在一些实例中，在式I中，R8和R9各自独立地是氢或具有1-20个碳的烷基。在一些实例中，在式I中，R8和R9各自独立地是氢或L-RGM。在一些实例中，在式I中，R8和R9各自是氢。在某些实施例中，R9被环状地连接至氮杂吲哚啉环的邻近的N，例如以形成一个6元环。
在一些实施例中，在式I中，R10和R11各自独立地是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM。在某些实施例中，在式I中，R10和R11各自独立地是氢、烷基、芳基或L-RGM。在一些实例中，在式I中，R10和R11各自独立地是烷基，例如低级烷基(例如甲基、乙基、丙基、异丙基、等)。在某些实例中，在式I中，R10是L-RGM。在某些情况下，在式I中，R11是L-RGM。
在一些情况下，L是无、烷基、或聚乙二醇。
在某些实施例中，RGM是琥珀酰亚胺基酯、或马来酰亚胺。
在某些实施例中，在式I中，R1–R11中至少一个包括L-RGM。在某些实例中，在式I中，B包括L-RGM。在某些实施例中，在式I中，R1–R11中的两个包括L-RGM。在其他实例中，在式I中，–RGM是任选的。
在一些实施例中，用式II描述染料化合物：
其中n是0至3；R1–R3各自独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、羧烷基、膦酰基烷基、磺酰基烷基、或L-RGM；R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、芳烷基、羧烷基、膦酰基烷基、磺烷基、或L-RGM；R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-RGM；R8、R9和R17–R20各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、羰基、氨基、硫醇、磺酸盐、膦酰基、或L-RGM；R10和R11各自独立地是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、膦酰基烷基、磺烷基、或L-RGM；RGM是化学反应性基团；L是接头；并且任选地，R4和R5、R6和R7、R5和R9、R15和R16、R4和R20、R4和R6/R7、或R6/R7和R15/R16中的一个或多个按组合而取，以形成5–至50–元环。
在一些实例中，在式II中，R1–R3各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、烷氨基、芳氨基、硫代烷基、硫代芳基、芳氧基、或L-RGM；R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM；R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-RGM；R8、R9和R17–R20各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、卤素、磺酸盐、或L-RGM；R10和R11各自独立地是烷基、芳基、芳烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM。
在某些实例中，在式II中，R1–R3各自是氢；R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM；R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-RGM；R8、R9和R17–R20各自独立地是氢、卤素、磺酸盐、或L-RGM；并且R10和R11各自独立地是烷基、或L-RGM。
在一些情况下，在式II中，R1–R3各自是氢；R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM；R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-RGM；R8、R9、R17、R19和R20各自是氢；R18是磺酸盐；并且R10和R11各自独立地是烷基、或L-RGM。
在某些情况下，在式II中，L是无、烷基、烷氧基、硫代烷基、氨基酸、磺基氨基酸、多胺、聚乙二醇、芳基、芳烷基、杂芳基烷基、或杂芳基。在一些实施例中，在式II中，L是无、烷基、或聚乙二醇。
在一些实施例中，在式II中，n是0。在一些实施例中，在式II中，n是1。在一些实施例中，在式II中，n是2。在一些实施例中，在式II中，n是3。
在某些实例中，在式II中，R1–R3独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、羧烷基、或L-RGM。在某些情况下，R1–R3各自是氢。在某些情况下，在式II中，R1–R3中的两个被环状地连接以形成一个六元碳环或杂环。在某些实施例中，在式II中，R1–R3之一是烷氧基、芳氧基、或L-RGM。
在一些情况下，在式II中，R4和R5独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM。在一些情况下，在式II中，R4和R5各自独立地选自具有1-20个碳的烷基，其中烷基可以被选自以下项的一个或多个取代基取代：RGM、磺酸盐、磷酸酯(盐)、氨基、取代的氨基、铵、羧基、和羟基。在某些实施例中，R4和R5各自独立地选自–(CH2)m-Z，其中m是1-12并且Z选自-H、-CO2H、-NH2、-SO3 -、-PO3H和RGM。
在一些实施例中，在式II中，R6、R7、R15和R16独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-RGM。在某些实例中，在式II中，R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基。在某些实例中，在式II中，R6、R7、R15和R16各自独立地是低级烷基。在某些实例中，在式II中，R6和R7各自是甲基。在某些实例中，在式II中，R15和R16各自是甲基。在一些实施例中，R6是低级烷基(例如甲基或乙基)并且R7是L-RGM。在一些实施例中，R7是L-Z(例如–(CH2)m-Z，其中m是1-12并且Z选自-H、-CO2H、-NH2、-SO3 -、-PO3H和RGM)。在一些实施例中，R15是低级烷基(例如甲基或乙基)并且R16是L-RGM。在一些实施例中，R16是L-Z(例如–(CH2)m-Z，其中m是1-12并且Z选自-H、-CO2H、-NH2、-SO3 -、-PO3H和RGM)。
在一些实例中，在式II中，R8、R9和R17–R20各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、羰基、氨基、硫醇、磺酸盐、膦酰基、或L-RGM。在一些实例中，在式II中，R8、R9和R17–R20各自独立地是氢或具有1-20个碳的烷基。在一些实例中，在式II中，R8、R9和R17–R20各自独立地是氢或L-RGM。在一些实例中，在式II中，R8和R9各自是氢。在一些实例中，在式II中，R17–R20各自是氢。在某些实施例中，R9被环状地连接至氮杂吲哚啉环的邻近的N，例如以形成一个6元环。
在一些情况下，在式II中，R10和R11各自独立地是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM。在某些实施例中，在式II中，R10和R11各自独立地是氢、烷基、芳基或L-RGM。在一些实例中，在式II中，R10和R11各自独立地是烷基，例如低级烷基(例如甲基、乙基、丙基、异丙基、等)。在某些实例中，在式II中，R10是L-RGM。在某些情况下，在式II中，R11是L-RGM。
R4和R5、R6和R7、R5和R9、R15和R16、R4和R20、R4和R6/R7、或R6/R7和R15/R16中的一个或多个可能按组合而取，以形成5–至50–元环(例如5-至12-元环，例如5、6、7或8-元环)。
在一些情况下，L是无、烷基、或聚乙二醇。
在某些实施例中，RGM是琥珀酰亚胺基酯、或马来酰亚胺。
在某些实施例中，在式II中，R1–R11和R15–R20中至少一个包括L-RGM。在某些实施例中，在式II中，R1–R11和R15–R20中的两个包括L-RGM。在其他实例中，在式II中，–RGM是任选的。
在一些实施例中，用式III描述染料化合物：
其中n是0至3；R1–R3各自独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、羧烷基、膦酰基烷基、磺酰基烷基、或L-RGM；R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、羧烷基、膦酰基烷基、磺酰基烷基、或L-RGM；R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、膦酰基烷基、磺酰基烷基、或L-RGM；R8、R9和R17–R22各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、羰基、氨基、硫醇、磺酸盐、膦酰基、或L-RGM；R10和R11是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM；RGM是化学反应性基团；L是接头；并且任选地，R4和R5、R6和R7、R5和R9、R15和R16、R4和R22、R4和R6/R7、或R6/R7和R15/R16中的一个或多个按组合而取，以形成5–至50–元环。
在一些实施例中，在式III中，n是0。在一些实施例中，在式III中，n是1。在一些实施例中，在式III中，n是2。在一些实施例中，在式III中，n是3。
在某些情况下，在式III中，R1–R3独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、羧烷基、或L-RGM。在某些实例中，在式III中，R1–R3各自是氢。在某些情况下，在式III中，R1–R3中的两个被环状地连接以形成一个六元碳环或杂环。在某些实施例中，在式III中，R1–R3之一是烷氧基、芳氧基、或L-RGM。
在一些实施例中，在式III中，R4和R5独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM。在某些实施例中，在式III中，R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM。在一些情况下，在式III中，R4和R5各自独立地选自具有1-20个碳的烷基，其中烷基可以被选自以下项的一个或多个取代基取代：RGM、磺酸盐、磷酸酯(盐)、氨基、取代的氨基、铵、羧基、和羟基。在某些实施例中，R4和R5各自独立地选自–(CH2)m-Z，其中m是1-12并且Z选自-H、-CO2H、-NH2、-SO3 -、-PO3H和RGM。
在一些实施例中，在式III中，R6、R7、R15和R16独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-RGM。在某些实例中，在式III中，R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基。在某些实例中，在式III中，R6、R7、R15和R16各自独立地是低级烷基。在某些实例中，在式III中，R6和R7各自是甲基。在某些实例中，在式III中，R15和R16各自是甲基。在一些实施例中，R6是低级烷基(例如甲基或乙基)并且R7是L-RGM。在一些实施例中，R7是L-Z(例如–(CH2)m-Z，其中m是1-12并且Z选自-H、-CO2H、-NH2、-SO3 -、-PO3H和RGM)。在一些实施例中，R15是低级烷基(例如甲基或乙基)并且R16是L-RGM。在一些实施例中，R16是L-Z(例如–(CH2)m-Z，其中m是1-12并且Z选自-H、-CO2H、-NH2、-SO3 -、-PO3H和RGM)。
在一些实施例中，在式III中，R8、R9和R17–R22独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、羰基、氨基、硫醇、磺酸盐、膦酰基、或L-RGM。在一些实例中，在式III中，R8、R9和R17–R22各自独立地是氢或具有1-20个碳的烷基。在一些实例中，在式III中，R8、R9和R17–R22各自独立地是氢或L-RGM。在一些实例中，在式III中，R8和R9各自是氢。在一些实例中，在式III中，R17–R22各自是氢。在某些实施例中，R9被环状地连接至氮杂吲哚啉环的邻近的N，例如以形成一个6元环。
在一些实施例中，在式III中，R10和R11各自独立地是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM。在某些实施例中，在式III中，R10和R11各自独立地是氢、烷基、芳基或L-RGM。在一些实例中，在式III中，R10和R11各自独立地是烷基，例如低级烷基(例如甲基、乙基、丙基、异丙基、等)。在某些实例中，在式III中，R10是L-RGM。在某些情况下，在式II中，R11是L-RGM。
在一些实施例中，在式III中，R4和R5、R6和R7、R5和R9、R15和R16、R4和R22、R4和R6/R7、或R6/R7和R15/R16中的一个或多个可能按组合而取，以形成5–至50–元环(例如5-至12-元环，例如5、6、7或8-元环)。
在一些情况下，L是无、烷基、或聚乙二醇。
在某些实施例中，RGM是琥珀酰亚胺基酯、或马来酰亚胺。
在一些实例中，在式III中，R1–R11和R15–R22中至少一个包括L-RGM。在某些实施例中，在式III中，R1–R11和R15–R22中的两个包括L-RGM。在其他实例中，在式III中，–RGM是任选的。
在一些实例中，用式IV描述染料化合物：
其中R1–R3各自独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、羧烷基、或L-RGM；R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM；R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-RGM；R8、R9和R17–R22各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、羰基、氨基、硫醇、磺酸盐、膦酰基、或L-RGM；R10和R11是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM；R4和R5、R6和R7、R5和R9、R15和R16、R4和R18、R4和R6/R7，或R6/R7和R15/R16中的一个或多个可能按组合而取，以形成5–至50–元环。
在一些实施例中，在式IV中，n是0。在一些实施例中，在式IV中，n是1。在一些实施例中，在式IV中，n是2。在一些实施例中，在式IV中，n是3。
在某些情况下，在式IV中，R1–R3独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、羧烷基、或L-RGM。在某些实例中，在式IV中，R1–R3各自是氢。在某些情况下，在式IV中，R1–R3中的两个被环状地连接以形成一个六元碳环或杂环。在某些实施例中，在式IV中，R1–R3之一是烷氧基、芳氧基、或L-RGM。
在一些实施例中，在式IV中，R4和R5独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM。在某些实施例中，在式IV中，R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM。在一些情况下，在式IV中，R4和R5各自独立地选自具有1-20个碳的烷基，其中烷基可以被选自以下项的一个或多个取代基取代：RGM、磺酸盐、磷酸酯(盐)、氨基、取代的氨基、铵、羧基、和羟基。在某些实施例中，R4和R5各自独立地选自–(CH2)m-Z，其中m是1-12并且Z选自-H、-CO2H、-NH2、-SO3 -、-PO3H和RGM。
在一些实施例中，在式IV中，R6、R7、R15和R16独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-RGM。在某些实例中，在式IV中，R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基。在某些实例中，在式IV中，R6、R7、R15和R16各自独立地是低级烷基。在某些实例中，在式IV中，R6和R7各自是甲基。在某些实例中，在式IV中，R15和R16各自是甲基。在一些实施例中，R6是低级烷基(例如甲基或乙基)并且R7是L-RGM。在一些实施例中，R7是L-Z(例如–(CH2)m-Z，其中m是1-12并且Z选自-H、-CO2H、-NH2、-SO3 -、-PO3H和RGM)。在一些实施例中，R15是低级烷基(例如甲基或乙基)并且R16是L-RGM。在一些实施例中，R16是L-Z(例如–(CH2)m-Z，其中m是1-12并且Z选自-H、-CO2H、-NH2、-SO3 -、-PO3H和RGM)。
在一些实施例中，在式IV中，R8、R9和R17–R22独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、羰基、氨基、硫醇、磺酸盐、膦酰基、或L-RGM。在一些实例中，在式IV中，R8、R9和R17–R22各自独立地是氢或具有1-20个碳的烷基。在一些实例中，在式IV中，R8、R9和R17–R22各自独立地是氢或L-RGM。在一些实例中，在式IV中，R8和R9各自是氢。在一些实例中，在式IV中，R17–R22各自是氢。在某些实施例中，R9被环状地连接至氮杂吲哚啉环的邻近的N，例如以形成一个6元环。
在一些实施例中，在式IV中，R10和R11各自独立地是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM。在某些实施例中，在式IV中，R10和R11各自独立地是氢、烷基、芳基或L-RGM。在一些实例中，在式IV中，R10和R11各自独立地是烷基，例如低级烷基(例如甲基、乙基、丙基、异丙基、等)。在某些实例中，在式IV中，R10是L-RGM。在某些情况下，在式II中，R11是L-RGM。
在一些实施例中，在式IV中，R4和R5、R6和R7、R5和R9、R15和R16、R4和R22、R4和R6/R7、或R6/R7和R15/R16中的一个或多个可能按组合而取，以形成5–至50–元环(例如5-至12-元环，例如5、6、7或8-元环)。
在一些情况下，L是无、烷基、或聚乙二醇。
在某些实施例中，RGM是琥珀酰亚胺基酯、或马来酰亚胺。
在一些实例中，在式IV中，R1–R11和R15–R22中至少一个包括L-RGM。在某些实施例中，在式IV中，R1–R11和R15–R22中的两个包括L-RGM。在其他实例中，在式IV中，–RGM是任选的。
在一些实施例中，用式V描述染料化合物：
其中n是0至3；R1–R3各自独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、羧烷基、膦酰基烷基、磺酰基烷基、或L-RGM；R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、羧烷基、磺烷基、膦酰基烷基、或L-RGM；R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、膦酰基烷基、磺烷基、或L-RGM；R8、R9和R17–R22各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、羰基、氨基、硫醇、磺酸盐、膦酰基、或L-RGM；R10和R11各自独立地是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、膦酰基烷基、磺烷基、或L-RGM；RGM是化学反应性基团；L是接头；并且任选地，R4和R5、R6和R7、R5和R9、R15和R16、R4和R18、R4和R6/R7、或R6/R7和R15/R16中的一个或多个按组合而取，以形成5–至50–元环。
在某些情况下，在式V中，R1–R3各自独立地是氢、或L-RGM；R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM；R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-RGM；R8、R9和R17–R22各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、磺酸盐、或L-RGM；并且R10和R11各自独立地是烷基、羧烷基、或L-RGM。
在一些实施例中，在式V中，R1–R3各自是氢；R4和R5独立地是具有1-20个碳的烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM；R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-RGM；R8、R9和R17–R22各自独立地是氢、或磺酸盐；并且R10和R11各自独立地是烷基、或L-RGM。
在一些情况下，L是无、烷基、或聚乙二醇。
在某些实施例中，RGM是琥珀酰亚胺基酯、或马来酰亚胺。
在一些实施例中，在式V中，n是0。在一些实施例中，在式V中，n是1。在一些实施例中，在式V中，n是2。在一些实施例中，在式V中，n是3。
在某些情况下，在式V中，R1–R3独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、羧烷基、或L-RGM。在某些实例中，在式V中，R1–R3各自是氢。在某些情况下，在式V中，R1–R3中的两个被环状地连接以形成一个六元碳环或杂环。在某些实施例中，在式V中，R1–R3之一是烷氧基、芳氧基、或L-RGM。
在一些实施例中，在式V中，R4和R5独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM。在某些实施例中，在式V中，R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM。在一些情况下，在式V中，R4和R5各自独立地选自具有1-20个碳的烷基，其中烷基可以被选自以下项的一个或多个取代基取代：RGM、磺酸盐、磷酸酯(盐)、氨基、取代的氨基、铵、羧基、和羟基。在某些实施例中，R4和R5各自独立地选自–(CH2)m-Z，其中m是1-12并且Z选自-H、-CO2H、-NH2、-SO3 -、-PO3H和RGM。
在一些实施例中，在式V中，R6、R7、R15和R16独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-RGM。在某些实例中，在式V中，R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基。在某些实例中，在式V中，R6、R7、R15和R16各自独立地是低级烷基。在某些实例中，在式V中，R6和R7各自是甲基。在某些实例中，在式V中，R15和R16各自是甲基。在一些实施例中，R6是低级烷基(例如甲基或乙基)并且R7是L-RGM。在一些实施例中，R7是L-Z(例如–(CH2)m-Z，其中m是1-12并且Z选自-H、-CO2H、-NH2、-SO3 -、-PO3H和RGM)。在一些实施例中，R15是低级烷基(例如甲基或乙基)并且R16是L-RGM。在一些实施例中，R16是L-Z(例如–(CH2)m-Z，其中m是1-12并且Z选自-H、-CO2H、-NH2、-SO3 -、-PO3H和RGM)。
在一些实施例中，在式V中，R8、R9和R17–R22独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、羰基、氨基、硫醇、磺酸盐、膦酰基、或L-RGM。在一些实例中，在式V中，R8、R9和R17–R22各自独立地是氢或具有1-20个碳的烷基。在一些实例中，在式V中，R8、R9和R17–R22各自独立地是氢或L-RGM。在一些实例中，在式V中，R8和R9各自是氢。在一些实例中，在式V中，R17–R22各自是氢。在某些实施例中，R9被环状地连接至氮杂吲哚啉环的邻近的N，例如以形成一个6元环。
在一些实施例中，在式V中，R10和R11各自独立地是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM。在某些实施例中，在式V中，R10和R11各自独立地是氢、烷基、芳基或L-RGM。在一些实例中，在式V中，R10和R11各自独立地是烷基，例如低级烷基(例如甲基、乙基、丙基、异丙基、等)。在某些实例中，在式V中，R10是L-RGM。在某些情况下，在式II中，R11是L-RGM。
在一些实施例中，在式V中，R4和R5、R6和R7、R5和R9、R15和R16、R4和R22、R4和R6/R7、或R6/R7和R15/R16中的一个或多个可能按组合而取，以形成5–至50–元环(例如5-至12-元环，例如5、6、7或8-元环)。
在一些实例中，在式V中，R1–R11和R15–R22中至少一个包括L-RGM。在某些实施例中，在式V中，R1–R11和R15–R22中的两个包括L-RGM。在其他实例中，在式V中，–RGM是任选的。
在某些实例中，用式VI描述染料化合物：
其中n是0、1、2或3；R1–R3各自独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、羧烷基、或L-RGM；R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM；R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-RGM；R8、R9、R17和R18各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、羰基、氨基、硫醇、磺酸盐、膦酰基、或L-RGM；R10、R11、R20和R21各自独立地是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM；RGM是化学反应性基团；L是接头；并且任选地，R4和R5、R6和R7、R5和R9、R15和R16、R4和R18、R4和R6/R7、或R6/R7和R15/R16中的一个或多个按组合而取，以形成5–至50–元环。
在某些情况下，R1–R3各自是氢。在某些情况下，在式VI中，R1–R3中的两个被环状地连接以形成一个六元碳环或杂环。在某些实施例中，在式VI中，R1–R3之一是烷氧基、芳氧基、或L-RGM。
在一些情况下，在式VI中，R4和R5各自独立地选自具有1-20个碳的烷基，其中烷基可以被选自以下项的一个或多个取代基取代：RGM、磺酸盐、磷酸酯(盐)、氨基、取代的氨基、铵、羧基、和羟基。在某些实施例中，R4和R5各自独立地选自–(CH2)m-Z，其中m是1-12并且Z选自-H、-CO2H、-NH2、-SO3 -、-PO3H和RGM。
在某些实例中，在式VI中，R6和R7各自独立地是具有1-20个碳的烷基。在某些实例中，在式VI中，R6和R7各自独立地是低级烷基。在某些实例中，在式VI中，R6和R7各自是甲基。在一些实施例中，R6是低级烷基(例如甲基或乙基)并且R7是L-RGM。在一些实施例中，R7是L-Z(例如–(CH2)m-Z，其中m是1-12并且Z选自-H、-CO2H、-NH2、-SO3 -、-PO3H和RGM)。
在一些实例中，在式VI中，R8和R9各自独立地是氢或具有1-20个碳的烷基。在一些实例中，在式VI中，R8和R9各自独立地是氢或L-RGM。在一些实例中，在式VI中，R8和R9各自是氢。在某些实施例中，R9被环状地连接至氮杂吲哚啉环的邻近的N，例如以形成一个6元环。
在一些实例中，在式VI中，R17和R18各自独立地是氢或具有1-20个碳的烷基。在一些实例中，在式VI中，R17和R18各自独立地是氢或L-RGM。在一些实例中，在式VI中，R17和R18各自是氢。在某些实施例中，R18被环状地连接至氮杂吲哚啉环的邻近的N–R4，例如以形成一个6元环。
在一些实例中，在式VI中，R1–R3各自独立地是氢、或L-RGM；R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM；R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-RGM；R8、R9和R17–R22各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、磺酸盐、膦酰基或L-RGM；并且R10和R11各自独立地是烷基、芳基、芳烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM。
在某些实例中，在式VI中，R1–R3各自是氢；R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM；R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-RGM；R8、R9、R17、和R18各自独立地是氢、或磺酸盐；并且R10和R11各自独立地是烷基、或L-RGM。
在某些情况下，在式VI中，L是无、烷基、或聚乙二醇。
在某些实施例中，在式VI中，RGM是琥珀酰亚胺基酯、或马来酰亚胺。
在一些情况下，在式VI中，n是0。在一些实例中，在式VI中，n是1。在某些情况下，在式VI中，n是2。在一些情况下，在式VI中，n是3。
在某些实施例中，在式VI中，R1–R11、R15–R18和R17–R21中至少一个包括L-RGM。在某些实施例中，在式VI中，R1–R11、R15–R18和R17–R21中的两个包括L-RGM。
在某些实施例中，在式I-VI中，R11包括L-RGM。在某些实施例中，在式I-VI中，R4包括L-RGM。在某些实例中，在式I-VI中，R15和R16中至少一个包括L-RGM。
在某些实例中，在式I-VI中，R6和R7是甲基。在某些实例中，在式I-VI中，R15和R16是甲基。
在一些实施例中，在式I-VI中，R4和R5各自独立地是–(CH2)q-Z，其中Z是水溶性基团并且q是从1至12的整数。在某些实施例中，Z是SO3H并且n是3。
在一些实施例中，在式II-VI中，R15是低级烷基并且R16是–(CH2)m-Y-RGM，其中Y是环烷基、杂环烷基、杂环、或芳基，并且m是0或从1至6的整数。在一些实例中，Y是苯基、吡啶基、环己基、或哌啶基。在某些实施例中，R15是甲基。在某些实例中，RGM是活性酯。在一些情况下，Y是苯基。在某些实施例中，R16是(CH2)m-Ph-C(O)-NHS，其中m是0或1并且NHS是N-羟基-琥珀酰亚胺基。
在某些实例中，在式I-VI中，R6和R7各自独立地是低级烷基。在某些实例中，R6和R7各自是甲基。
在某些实施例中，染料化合物并不包括含PEG取代基。在某些实施例中，染料化合物并不包括MW 300至5000的水溶性聚环氧烷烃聚合物。
在某些实施例中，染料化合物并不包括可切割接头。在某些实施例中，染料化合物并不包括含易变–C＝N-基团的接头。在一些实例中，用以下结构之一描述染料化合物：
具有L-RGM的染料标记了包含或被修饰为包含具有适合反应性的官能团的广泛多样的有机的或无机的物质，导致共轭的物质的化学附接。在下表1中给出了本披露的反应性染料的一些实施例。在表1中的反应性染料的编号对应于实例中描述的化合物的编号。
表1：示例性反应性花菁染料
本发明的化合物和共轭物的很多实施例拥有总电子电荷。应理解的是，当此类电子电荷被示出为存在时，是通过可以或可以不明确鉴定的适当反离子的存在来平衡它们的。对于一些应用而言是优选的生物学相容的反离子在生物应用中是无毒的，并且对生物分子基本上不具有损害作用。在本发明的化合物带正电时，反离子典型地选自，但不局限于氯、溴、碘、硫酸根、链烷磺酸根、芳基磺酸根、磷酸根、高氯酸根、四氟硼酸根、四芳基硼、硝酸根和芳香族的或脂肪族的羧酸的阴离子。当本发明的化合物带负电时，反离子典型地选自，但不局限于碱金属离子、碱土金属离子、过渡金属离子、铵或取代的铵或吡啶鎓离子。优选地，任何必需的反离子都是生物学相容的，在使用时是无毒的，并且对生物分子基本上不具有损害作用。反离子易于通过本领域熟知的方法改变，这些方法例如是离子交换层析术、或选择性沉淀。
应理解的是，本发明的染料已经在一个或另一个具体的电子共振结构中绘出。本发明的每个方面同样应用至形式上与其他允许的共振结构绘出的染料，因为主题染料上的电荷是贯穿该染料自身离域的。
反应性染料的合成
提供了对于合成披露的染料化合物有用的常见已知化学合成方案和条件的很多普通参考文献是可获得的(参见例如Smith(史密斯)和March(玛奇)，March’s AdvancedOrganic Chemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure(March(玛奇)的高等有机化学：反应、机制、和结构)，第五版，Wiley-Interscience(威利跨学科出版社)，2001；或Vogel(沃格尔)，Textbook of Practical Organic Chemistry,Including QualitativeOrganic Analysis(使用有机化学的教科书，包括定量有机分析)，第四版，纽约，Longman(朗文出版社)，1978)。提供用于制备核苷类似物的方法的普通参考文献是可获得的(参见例如“Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry(核酸化学中的合成程序)”的综述，Zorbach(佐尔巴赫)和Tipson(蒂松)编辑，Wiley(威利出版社)，纽约，1973，卷1和2)。
可以通过本领域已知的任何纯化实验方案来纯化如在此描述的染料化合物，这些纯化实验方案包括色谱法，例如HPLC、制备薄层色潜法、快速柱色谱法和离子交换色谱法。可以使用任何适合的固定相，包括正相和反相连同离子型树脂。在某些实施例中，经由硅胶和/或氧化铝色谱法来纯化披露的化合物。参见例如Introduction to Modern LiquidChromatography(现代液相色谱法引言)，第2版，L.R.Snyder(斯奈德)和J.J.Kirkland(柯克兰)，John Wiley and Sons(约翰威利父子公司)，1979；和Thin Layer Chromatography(薄层色谱法)，E.Stahl(斯特尔)编辑，Springer-Verlag(斯普林格出版社)，纽约，1969。
在任何用于制备主题染料化合物的过程期间，可能必需和/或希望保护任何相关分子上的敏感性或反应性基团。可以借助如在标准著作中描述的常规保护基团来达到这一点，这些标准著作例如J.F.W.McOmie(麦科米)，“Protective Groups in OrganicChemistry(有机化学中的保护基团)”，Plenum Press(殷实出版社)，伦敦和纽约，1973，在以下中：T.W.Greene(格林)和P.G.M.Wuts(伍兹)，“Protective Groups in OrganicSynthesis(有机合成中的保护基团)”，第三版，Wiley(威利出版社)，纽约，1999，在以下中“The Peptides(肽)”；卷3(编辑：E.Gross(格罗斯)和J.Meienhofer(梅恩霍菲尔))，Academic Press(学术出版社)，伦敦和纽约，1981，在以下中：“Methoden der organischenChemie(有机化学方法)”，Houben(霍本)-Weyl(韦耳)，第4版，卷15/l，Georg ThiemeVerlag出版社，斯图加特，1974，在以下中：H.-D.Jakubke(贾库布克)和H.Jescheit(雅思切特)，“Aminosauren,Peptide,Proteine(氨基酸、肽、蛋白)”，Verlag Chemie(化学出版社)，魏因海姆，迪尔菲尔德比奇，和巴塞尔，1982，和/或在以下中：Jochen Lehmann(约亨莱曼)，“Chemie der Kohlenhydrate:Monosaccharide and Derivate(碳水化合物化学：单糖和衍生物)”，Georg Thieme Verlag出版社，斯图加特，1974。可以使用从本领域已知的方法，在方便的随后阶段除去保护基团。
可以使用可商购的起始材料和/或通过任何方便的合成方法制备的起始材料，经由多个不同合成路线来合成主题染料化合物。以下描述了可以被改变来合成在此披露的化合物的方法的实例。本领域普通技术人员还将能够易于改编这些方法，以便合成如在此描述的任何的特定化合物。
在制备主题染料化合物中，可以利用有机化学和杂环化学中的任何方便的方法。可以经由某些中间体的初始制备来达到合成主题染料化合物。一些感兴趣的中间体具有以下一般结构(为简单起见，此类结构的所有可能取代基除了少数都被示出为氢)：
方案1.示出感兴趣的RGM位置的反应性染料化合物的中间结构
在合成期间或合成后，这些结构可以任选地被进一步取代，以给出如以上定义的对应染料取代基。对于碳菁，可以通过如在方案2中所示的类似于费歇尔吲哚合成(参见例如Sundberg RJ(松德贝里)，THE CHEMISTRY OF INDOLES(吲哚的化学)，Organicchemistry(有机化学)，a series of monographs(一系列专著)，1970，Academic Press(学术出版社)的反应容易地合成吲哚啉中间体。在一些情况下，使用如在图5-7中说明的方案来达到合成不同的取代的碳菁。
方案2.合成氮杂吲哚啉中间体
本发明的花菁染料的合成(其中RGM基团被附接至氮杂吲哚啉环、吲哚鎓环或聚甲炔接头)可以通过初始制备对应的吲哚啉中间体亦或通过经由常见官能团转化(Larock(拉罗克)，“Comprehensive Organic Transformations(综合有机转化)”，1999，John Wiley&Sons(约翰威利父子公司))的碳菁的后修饰来达到。可以按照任何方便的方法，容易地将吲哚啉转化为希望的碳菁。例如，N,N'-二苯甲脒、原甲酸三乙酯、丙二醛二(苯亚胺)盐酸化物、1,1,3-三甲氧基丙烷、1,1,3,3-四甲氧基丙烷和戊烯二醛双苯胺一氯化物是在合成碳菁中使用的方便的中间体。在Ollmann,Jr(欧乐曼)的美国专利号5,831,098(1988)；Patonay(帕托尼)等人的美国专利号6,086,737(2000)；Waggoner(瓦格纳)的美国专利号6,048,982(2000)；和Lee(李)等人的美国专利号5,453,505(1995)；Middendorf(米登多夫)等人的美国专利号5,639,874(1997)；Lincoln(林肯)等人的美国专利号3,864,644(1975)；Simson(西姆森)的美国专利号4,011,086(1977)中描述了具有共轭双键的示例性碳菁。
为了合成碳菁，将可以是取代的吡啶肼的取代的芳基肼(为简单起见，所有可能取代基除了少数都被示出为氢)与取代的甲基酮反应，以生成3,3-双取代的2-甲基吲哚衍生物(参见方案2)。可能利用磺化的吡啶肼衍生物或磺化的喹啉肼衍生物，以增加最终染料的可溶性。然后用可以是卤代烷(例如碘乙烷)、烷基磺酸酯(例如对甲苯磺酸甲酯)或环状磺酸酯(例如丙磺酸内酯或丁磺酸内酯)的烷化剂将3,3-双取代的-2-甲基氮杂吲哚啉在氮原子上季铵化为吡啶鎓衍生物。在一些情况下，在季铵化和随后与吲哚鎓部分和聚甲炔部分缩合之前或之后，关键的氮杂吲哚啉或苯并氮杂吲哚啉中间体被磺化一次或多次，以形成主题染料。可以使用关于这些方法的变化，在聚甲炔桥上或在染料前体的吲哚鎓或氮杂吲哚啉部分上生成取代基。参见例如Leung W(梁)等人，WO 02/26891；Brooker(布鲁克)，J.AM.CHEM.SOC.(美国化学会会志)，64,199(1942)；Chu-Moyer(朱-迈尔)等人，J.ORG.CHEM.(有机化学杂志)，60,5721(1995)；Turner(特纳)，J.ORG.CHEM.(有机化学杂志)，48,3401(1983)；Couture(科图雷)等人，J.HETEROCYCLIC CHEM.(杂环化学杂志)，24,1765(1987)；Petric(佩特里奇)等人，J.HETEROCYCLIC CHEM.(杂环化学杂志)，14,1045，(1977)；Barlin(巴林)等人，AUST.J.CHEM.(澳大利亚化学杂志)，37,1729(1984)；Saikachi(槐)等人，CHEM.&PHARM.BULL.(化学和药学公报)，9,941(1961)；Barlin(巴林)，AUST.J.CHEM.(澳大利亚化学杂志)，36,983(1983)；Foye(福伊)等人，J.PHARM.SCI.(药物科学杂志)，64,1371(1975)；Khanna(康纳)等人，J.ORG.CHEM.(有机化学杂志)，60,960(1995))；Ficken(菲肯)等人的英国专利号870,753(1961)。
在一些情况下，主题染料的合称涉及三个前体：适当的苯并噁唑鎓(benzazolium)或氮杂苯并噁唑鎓盐和聚甲炔间隔子来源。典型地选择每一组分，以便合并希望的化学取代基，或可以被转化为适当取代基的官能团(例如RGM)。可以将多种化学品和材料用来制备并且组合这些前体，以便生成任何主题染料化合物。
应认识到，存在可能生成等价结果的很多可能的变化。在用烷化剂季铵化之前，氮杂苯并噁唑鎓部分的芳香族碳上的取代基可以被并入亲本氮杂的或聚氮杂的苯并吡咯分子。然而，在氮杂苯并吡咯部分的合成期间，还可以合并此类取代基。在芳香族碳上的烷基、烷氧基、羧基、和卤素取代基可能已经呈现为苯并吡咯或氮杂苯并吡咯前体上、或已经使用任何方便的方法转化为此类前体的化合物上的取代基。在花菁染料的缩合之前，可以将磺酸基团引入到前体上[参见例如Bobrow(博布罗)等人的美国专利号5,767,287，(1998)]。当它们被首次引入时(例如通过取代到苯并吡咯或氮杂苯并吡咯前体上)，氨基烷基基团可以包含一个保护基团。然后在花菁染料的缩合之后，可以除去保护基团。可以经由硝基取代的苯并噁唑鎓前体(它转而是通过苯并吡咯前体的硝化制备的)的还原来制备芳族氨基。
可以使用任何方便的方法，以便合成包含多种反应性基团(例如在表3中描述的那些)的染料。在一些情况下，可以通过将羧酸偶联至相对酸性的“离去基团”，合成胺反应性染料，例如羧酸的“活化酯”。其他感兴趣的胺反应性基团包括但不局限于磺酰卤(它可以使用卤化剂，例如PCl5或POCl3，制备自磺酸)；卤代三嗪(它可以通过氰尿酸酰卤与胺反应而进行制备)；和异氰酸酯或异硫氰酸酯(它们可以分别制备自胺和碳酰氯或二氯硫化碳)。
对于共轭至羧酸、醛和酮，包含胺和酰肼的染料是有用的。在一些情况下，通过羧酸的活化酯或磺酰卤与二胺(例如尸胺)或与肼的反应来合成这些。可替代地，可以通过硝基芳香族化合物的化学还原来合成芳香胺。对于通过任何方便的方法合成硫醇反应性卤代乙酰胺或马来酰亚胺，胺和肼是有用的前体。
对于核酸标记的一些应用，用本发明的染料标记的核苷和核苷酸是有用的。在一些情况下，使用碳菁-亚酰胺(carbocyanine-amidite)，利用类似于由Brush(布拉什)等人的美国专利号5,986,086(1999)；Brush(布拉什)等人的美国专利号5,808,044(1998)；和Brush(布拉什)等人的美国专利号5,556,959(1996)所描述的那些的方法，标记核苷酸和核苷。
染料共轭物
本披露提供了共轭物。“共轭物”是指稳定地关联第二部分的第一部分。“稳定地关联”是指在标准条件下，一个部分结合至另一部分或结构。在某些实施例中，第一部分和第二部分通过一个或多个共价键彼此结合。在一些情况下，通过一个或多个化学反应性基团(RGM)，将本发明的染料偶联至底物，以产生染料共轭物。本发明的反应性染料可以与包含或被修饰为包含具有适合的反应性的官能团的广泛多样的底物进行反应，导致将染料共轭至该物质。
可以利用任何方便的物质(例如有机的或无机的物质)作为主题染料共轭物中的底物。在一些情况下，底物是生物聚合物。如将在以下进一步详细描述，感兴趣的底物包括氨基酸、肽、蛋白、酪胺、多糖、离子复合部分、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、抗体或抗体片段或衍生物、半抗原、补骨脂内酯、药物、激素、脂、脂质组件、聚合物、聚合物微粒、生物细胞或病毒。有用的染料共轭物还包括但不局限于共轭物，在这些共轭物中，底物是氨基酸，核苷酸，生物聚合物(例如氨基酸聚合物，核酸聚合物，多糖，碳水化合物，或脂)，抗原，类固醇，维生素，药物，半抗原，代谢物，毒素，环境污染物，离子复合部分，或玻璃，塑料，或其他非生物聚合物。在一些实施例中，底物是细胞，细胞***，细胞片段或组分，或亚细胞颗粒(例如病毒颗粒、细菌颗粒、或它们的组分)，病毒颗粒，细菌颗粒，病毒组分，生物细胞(例如动物细胞、植物细胞、细菌、酵母、或源生生物)，或细胞组分。反应性染料还可以用于标记在细胞表面上的，在细胞膜、细胞器、或细胞质中的官能团。
在某些实例中，这些共轭物是R-藻红蛋白与和别藻蓝蛋白与用作激发态能量受体或供体的本发明的选择的染料的共轭物。在这些共轭物中，激发态能量转移导致当在较短波长激发时，长波长荧光发射。
在一些实施例中，染料共轭物是异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁染料共轭物，其中该共轭物包括经由二价聚甲炔连接基团连接至5-元杂环的5-异羟肟酸-氮杂吲哚啉基团，其中将5-异羟肟酸-氮杂吲哚啉基团、二价聚甲炔连接基团和5元杂环中的一个或多个共轭至底物。
在一些实例中，染料共轭物包括具有式I至VI之一的染料(例如，如以上所述)，其中将RGM共轭至感兴趣的底物，以产生共轭物。在某些实施例中，通过将具有式I、II、III、IV、V或VI之一的染料化合物与抗体偶联，制备染料生物共轭物。
在一些情况下，用式VII描述染料共轭物：
其中B、n和R1-R11如以上对式I所述，除了RGM是底物，并且m是1至50。
在某些实例中，在式VII中，环B表示对于形成含氮五元杂环所必需的原子并且进一步包括零至三个稠合的芳香族环；其中该五元杂环和该零至三个稠合的芳香族环的每个原子独立地选自下组，该组由以下各项组成：C、CH、C(烷基)、C(芳基)、O、S、N、N(芳基)、N(酰基)和N(烷基)，并且该五元杂环和该零至三个芳香族环任选地被独立地选自下组的一个或多个取代基取代，该组由以下各项组成：氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、磺酸盐、羰基、氨基、硫醇、膦酸盐、和L-底物。
在某些实施例中，在式VII中，m是1至50，例如3至35、6至35、10至35或15至20。在一些实例中，1至约50个染料分子被共轭至底物，例如每个底物约3至约35个染料分子、约6至约35个染料分子、约10至约35个染料分子、或约15至约20个染料分子。在一些实施例中，多达约35个染料分子可以被共轭至底物而没有显著的自淬灭。在某些实例中，m是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50。在某些实例中，m是约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45或约50。
在一些实施例中，在式VII中，n是0。在一些实施例中，在式VII中，n是1。在一些实施例中，在式VII中，n是2。在一些实施例中，在式VII中，n是3。
在一些情况下，在式VII中，R1–R3独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、羧烷基、或L-底物。在某些情况下，R1–R3各自是氢。在某些情况下，在式VII中，R1–R3中的两个被环状地连接以形成一个六元碳环或杂环。在某些实施例中，在式VII中，R1–R3之一是烷氧基、芳氧基、或L-底物。
在一些情况下，在式VII中，R4和R5独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、羧烷基、磺烷基、或L-底物。
在一些情况下，在式VII中，R4和R5各自独立地选自具有1-20个碳的烷基，其中烷基可以被选自以下项的一个或多个取代基取代：底物、磺酸盐、磷酸酯(盐)、氨基、取代的氨基、铵、羧基、和羟基。在某些实施例中，R4和R5各自独立地选自–(CH2)m-Z，其中m是1-12并且Z选自-H、-CO2H、-NH2、-SO3 -、-PO3H和底物。
在某些实例中，在式VII中，R6和R7独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-底物。在某些实例中，在式VII中，R6和R7各自独立地是具有1-20个碳的烷基。在某些实例中，在式VII中，R6和R7各自独立地是低级烷基。在某些实例中，在式VII中，R6和R7各自是甲基。在一些实施例中，R6是低级烷基(例如甲基或乙基)并且R7是L-底物。在一些实施例中，R7是L-Z(例如–(CH2)m-Z，其中m是1-12并且Z选自-H、-CO2H、-NH2、-SO3 -、-PO3H和底物)。
在一些实例中，在式VII中，R8和R9独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、磺酸盐、羰基、羟基、氨基、硫醇、膦酰基、或L-底物。在一些实例中，在式VII中，R8和R9各自独立地是氢或具有1-20个碳的烷基。在一些实例中，在式VII中，R8和R9各自独立地是氢或L-底物。在一些实例中，在式VII中，R8和R9各自是氢。在某些实施例中，R9被环状地连接至氮杂吲哚啉环的邻近的N，例如以形成一个6元环。
在一些实施例中，在式VII中，R10和R11各自独立地是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、磺烷基、或L-底物。在某些实施例中，在式VII中，R10和R11各自独立地是氢、烷基、芳基或L-底物。在一些实例中，在式VII中，R10和R11各自独立地是烷基，例如低级烷基(例如甲基、乙基、丙基、异丙基、等)。在某些实例中，在式VII中，R10是L-底物。在某些情况下，在式VII中，R11是L-底物。
在一些情况下，L是无、烷基、或聚乙二醇。在某些实例中，底物是生物分子:小的生物活性配体、抑或生物聚合物。
在某些实施例中，在式VII中，R1–R11中的一个或多个包括L-底物。在某些实施例中，在式VII中，R1–R11中的两个包括L-底物。在某些情况下，在式VII中，B包括L-底物。
在一些实施例中，用式VII描述染料共轭物：
其中n和R1-R1以及R15-R20如以上对式II所述，除了RGM是底物，并且m是1至50。
在某些实施例中，在式VIII中，m是1至50，例如3至35、6至35、10至35或15至20。在一些实例中，1至约50个染料分子被共轭至底物，例如每个底物约3至约35个染料分子、约6至约35个染料分子、约10至约35个染料分子、或约15至约20个染料分子。在一些实施例中，多达约35个染料分子可以被共轭至底物而没有显著的自淬灭。在某些实例中，m是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50。在某些实例中，m是约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45或约50。
在一些实例中，在式VIII中，R1–R3各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、烷氨基、芳氨基、硫代烷基、硫醇芳基、芳氧基、或L-底物；R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、羧烷基、磺烷基、或L-底物；R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-底物；R8、R9和R17–R20各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、卤素、磺酸盐、或L-底物；R10和R11各自独立地是烷基、芳基、芳烷基、羧烷基、磺烷基、或L-底物。
在某些实例中，在式VIII中，R1–R3各自是氢；R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、羧烷基、磺烷基、或L-底物；R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-底物；R8、R9和R17–R20各自独立地是氢、卤素、磺酸盐、或L-底物；并且R10和R11各自独立地是烷基、或L-底物。
在一些情况下，在式VIII，中，R1–R3各自是氢；R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、羧烷基、磺烷基、或L-R底物；R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-底物；R8、R9、R17、R19和R20各自是氢；R18是磺酸盐；并且R10和R11各自独立地是烷基、或L-底物。
在某些情况下，在式VIII中，L是无、烷基、烷氧基、硫代烷基、氨基酸、磺基氨基酸、多胺、聚乙二醇、芳基、芳烷基、杂芳基烷基、或杂芳基。在一些实施例中，在式VIII中，L是无、烷基、或聚乙二醇。
在一些实施例中，在式VIII中，n是0。在一些实施例中，在式VIII中，n是1。在一些实施例中，在式VIII中，n是2。在一些实施例中，在式VIII中，n是3。
在某些实例中，在式VIII中，R1–R3独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、羧烷基、或L-底物。在某些情况下，R1–R3各自是氢。在某些情况下，在式VIII中，R1–R3中的两个被环状地连接以形成一个六元碳环或杂环。在某些实施例中，在式VIII中，R1–R3之一是烷氧基、芳氧基、或L-底物。
在一些情况下，在式VIII中，R4和R5独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、羧烷基、磺烷基、或L-底物。在一些情况下，在式VIII中，R4和R5各自独立地选自具有1-20个碳的烷基，其中烷基可以被选自以下项的一个或多个取代基取代：底物、磺酸盐、磷酸酯(盐)、氨基、取代的氨基、铵、羧基、和羟基。在某些实施例中，R4和R5各自独立地选自–(CH2)m-Z，其中m是1-12并且Z选自-H、-CO2H、-NH2、-SO3 -、-PO3H和底物。
在一些实施例中，在式VIII中，R6、R7、R15和R16独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-底物。在某些实例中，在式VIII中，R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基。在某些实例中，在式VIII中，R6、R7、R15和R16各自独立地是低级烷基。在某些实例中，在式VIII中，R6和R7各自是甲基。在某些实例中，在式VIII中，R15和R16各自是甲基。在一些实施例中，R6是低级烷基(例如甲基或乙基)并且R7是L-底物。在一些实施例中，R7是L-Z(例如–(CH2)m-Z，其中m是1-12并且Z选自-H、-CO2H、-NH2、-SO3 -、-PO3H和底物)。在一些实施例中，R15是低级烷基(例如甲基或乙基)并且R16是L-底物。在一些实施例中，R16是L-Z(例如–(CH2)m-Z，其中m是1-12并且Z选自-H、-CO2H、-NH2、-SO3 -、-PO3H和底物)。
在一些实例中，在式VIII中，R8、R9和R17–R20各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、羰基、氨基、硫醇、磺酸盐、膦酰基、或L-底物。在一些实例中，在式VIII中，R8、R9和R17–R20各自独立地是氢或具有1-20个碳的烷基。在一些实例中，在式VIII中，R8、R9和R17–R20各自独立地是氢或L-底物。在一些实例中，在式VIII中，R8和R9各自是氢。在一些实例中，在式VIII中，R17–R20各自是氢。在某些实施例中，R9被环状地连接至氮杂吲哚啉环的邻近的N，例如以形成一个6元环。
在一些情况下，在式VIII中，R10和R11各自独立地是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、磺烷基、或L-底物。在某些实施例中，在式VIII中，R10和R11各自独立地是氢、烷基、芳基或L-底物。在一些实例中，在式VIII中，R10和R11各自独立地是烷基，例如低级烷基(例如甲基、乙基、丙基、异丙基、等)。在某些实例中，在式VIII中，R10是L-底物。在某些情况下，在式VIII中，R11是L-底物。
R4和R5、R6和R7、R5和R9、R15和R16、R4和R20、R4和R6/R7、或R6/R7和R15/R16中的一个或多个可能按组合而取，以形成5–至50–元环(例如5-至12元环，例如5、6、7或8-元环)。
在一些情况下，L是无、烷基、或聚乙二醇。在某些实例中，底物是生物分子:小的生物活性配体、抑或生物聚合物。
在某些实施例中，在式VIII中，R1–R11和R15–R20中的一个或多个包括L-底物。在某些实施例中，在式VIII中，R1–R11和R15–R20中的两个包括L-底物。
在一些实施例中，用式IX描述染料共轭物：
其中n和R1-R1并且R15-R22如以上对式III所述，除了RGM是底物，并且m是1至50。
在某些实施例中，在式X中，m是1至50，例如3至35、6至35、10至35或15至20。在一些实例中，1至约50个染料分子被共轭至底物，例如每个底物约3至约35个染料分子、约6至约35个染料分子、约10至约35个染料分子、或约15至约20个染料分子。在一些实施例中，多达约35个染料分子可以被共轭至底物而没有显著的自淬灭。在某些实例中，m是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50。在某些实例中，m是约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45或约50。
在一些实施例中，在式IX中，n是0。在一些实施例中，在式IX中，n是1。在一些实施例中，在式IX中，n是2。在一些实施例中，在式IX中，n是3。
在某些情况下，在式IX中，R1–R3独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、羧烷基、或L-RGM。在某些实例中，在式IX中，R1–R3各自是氢。在某些情况下，在式IX中，R1–R3中的两个被环状地连接以形成一个六元碳环或杂环。在某些实施例中，在式IX中，R1–R3之一是烷氧基、芳氧基、或L-RGM。
在一些实施例中，在式IX中，R4和R5独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM。在某些实施例中，在式IX中，R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM。在一些情况下，在式IX中，R4和R5各自独立地选自具有1-20个碳的烷基，其中烷基可以被选自以下项的一个或多个取代基取代：RGM、磺酸盐、磷酸酯(盐)、氨基、取代的氨基、铵、羧基、和羟基。在某些实施例中，R4和R5各自独立地选自–(CH2)m-Z，其中m是1-12并且Z选自-H、-CO2H、-NH2、-SO3 -、-PO3H和RGM。
在一些实施例中，在式IX中，R6、R7、R15和R16独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-RGM。在某些实例中，在式IX中，R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基。在某些实例中，在式IX中，R6、R7、R15和R16各自独立地是低级烷基。在某些实例中，在式IX中，R6和R7各自是甲基。在某些实例中，在式IX中，R15和R16各自是甲基。在一些实施例中，R6是低级烷基(例如甲基或乙基)并且R7是L-RGM。在一些实施例中，R7是L-Z(例如–(CH2)m-Z，其中m是1-12并且Z选自-H、-CO2H、-NH2、-SO3 -、-PO3H和RGM)。在一些实施例中，R15是低级烷基(例如甲基或乙基)并且R16是L-RGM。在一些实施例中，R16是L-Z(例如–(CH2)m-Z，其中m是1-12并且Z选自-H、-CO2H、-NH2、-SO3 -、-PO3H和RGM)。
在一些实施例中，在式IX中，R8、R9和R17–R22独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、羰基、氨基、硫醇、磺酸盐、膦酰基、或L-RGM。在一些实例中，在式IX中，R8、R9和R17–R22各自独立地是氢或具有1-20个碳的烷基。在一些实例中，在式IX中，R8、R9和R17–R22各自独立地是氢或L-RGM。在一些实例中，在式IX中，R8和R9各自是氢。在一些实例中，在式IX中，R17–R22各自是氢。在某些实施例中，R9被环状地连接至氮杂吲哚啉环的邻近的N，例如以形成一个6元环。
在一些实施例中，在式IX中，R10和R11各自独立地是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM。在某些实施例中，在式IX中，R10和R11各自独立地是氢、烷基、芳基或L-RGM。在一些实例中，在式IX中，R10和R11各自独立地是烷基，例如低级烷基(例如甲基、乙基、丙基、异丙基、等)。在某些实例中，在式IX中，R10是L-RGM。在某些情况下，在式II中，R11是L-RGM。
在一些实施例中，在式IX中，R4和R5、R6和R7、R5和R9、R15和R16、R4和R22、R4和R6/R7、或R6/R7和R15/R16中的一个或多个可能按组合而取，以形成5–至50–元环(例如5-至12元环，例如5、6、7或8-元环)。
在一些情况下，L是无、烷基、或聚乙二醇。在某些实例中，底物是生物分子：小的生物活性配体、抑或生物聚合物。
在一些实例中，在式IX中，R1–R11和R15–R20中至少一个包括L-底物。在某些实施例中，在式III中，R1–R11和R15–R22中的两个包括L-底物。
在一些实例中，用式X描述染料共轭物：
其中n和R1-R1并且R15-R22如以上对式IV所述，除了RGM是底物，并且m是1至50。
在某些实施例中，在式X中，m是1至50，例如3至35、6至35、10至35或15至20。在一些实例中，1至约50个染料分子被共轭至底物，例如每个底物约3至约35个染料分子、约6至约35个染料分子、约10至约35个染料分子、或约15至约20个染料分子。在一些实施例中，多达约35个染料分子可以被共轭至底物而没有显著的自淬灭。在某些实例中，m是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50。在某些实例中，m是约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45或约50。
在一些实施例中，在式X中，n是0。在一些实施例中，在式X中，n是1。在一些实施例中，在式X中，n是2。在一些实施例中，在式X中，n是3。
在某些情况下，在式X中，R1–R3独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、羧烷基、或L-底物。在某些实例中，在式X中，R1–R3各自是氢。在某些情况下，在式X中，R1–R3中的两个被环状地连接以形成一个六元碳环或杂环。在某些实施例中，在式X中，R1–R3之一是烷氧基、芳氧基、或L-底物。
在一些实施例中，在式X中，R4和R5独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、羧烷基、磺烷基、或L-底物。在某些实施例中，在式X中，R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、羧烷基、磺烷基、或L-底物。在一些情况下，在式X中，R4和R5各自独立地选自具有1-20个碳的烷基，其中烷基可以被选自以下项的一个或多个取代基取代：底物、磺酸盐、磷酸酯(盐)、氨基、取代的氨基、铵、羧基、和羟基。在某些实施例中，R4和R5各自独立地选自–(CH2)m-Z，其中m是1-12并且Z选自-H、-CO2H、-NH2、-SO3 -、-PO3H和底物。
在一些实施例中，在式X中，R6、R7、R15和R16独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-底物。在某些实例中，在式X中，R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基。在某些实例中，在式X中，R6、R7、R15和R16各自独立地是低级烷基。在某些实例中，在式X中，R6和R7各自是甲基。在某些实例中，在式X中，R15和R16各自是甲基。在一些实施例中，R6是低级烷基(例如甲基或乙基)并且R7是L-底物。在一些实施例中，R7是L-Z(例如–(CH2)m-Z，其中m是1-12并且Z选自-H、-CO2H、-NH2、-SO3 -、-PO3H和底物)。在一些实施例中，R15是低级烷基(例如甲基或乙基)并且R16是L-底物。在一些实施例中，R16是L-Z(例如–(CH2)m-Z，其中m是1-12并且Z选自-H、-CO2H、-NH2、-SO3 -、-PO3H和底物)。
在一些实施例中，在式X中，R8、R9和R17–R22各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、羰基、氨基、硫醇、磺酸盐、膦酰基、或L-底物。在一些实例中，在式X中，R8、R9和R17–R22各自独立地是氢或具有1-20个碳的烷基。在一些实例中，在式X中，R8、R9和R17–R22各自独立地是氢或L-底物。在一些实例中，在式X中，R8和R9各自是氢。在一些实例中，在式X中，R17–R22各自是氢。在某些实施例中，R9被环状地连接至氮杂吲哚啉环的邻近的N，例如以形成一个6元环。
在一些实施例中，在式X中，R10和R11各自独立地是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、磺烷基、或L-底物。在某些实施例中，在式X中，R10和R11各自独立地是氢、烷基、芳基或L-底物。在一些实例中，在式X中，R10和R11各自独立地是烷基，例如低级烷基(例如甲基、乙基、丙基、异丙基、等)。在某些实例中，在式X中，R10是L-底物。在某些情况下，在式II中，R11是L-底物。
在一些实施例中，在式X中，R4和R5、R6和R7、R5和R9、R15和R16、R4和R22、R4和R6/R7、或R6/R7和R15/R16中的一个或多个可能按组合而取，以形成5–至50–元环(例如5-至12元环，例如5、6、7或8-元环)。
在一些情况下，L是无、烷基、或聚乙二醇。在某些实例中，底物是生物分子:小的生物活性配体、抑或生物聚合物。
在某些实施例中，在式X中，R1–R11和R15–R22中至少一个包括L-底物。在某些实施例中，在式X中，R1–R11和R15–R22中的两个包括L-底物。
在一些实施例中，共轭物是式XI的化合物：
其中n和R1-R1并且R15-R22如以上对式V所述，除了RGM是底物，并且m是1至50。
在某些实施例中，在式XI中，m是1至50，例如3至35、6至35、10至35或15至20。在一些实例中，1至约50个染料分子被共轭至底物，例如每个底物约3至约35个染料分子、约6至约35个染料分子、约10至约35个染料分子、或约15至约20个染料分子。在一些实施例中，多达约35个染料分子可以被共轭至底物而没有显著的自淬灭。在某些实例中，m是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50。在某些实例中，m是约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45或约50。
在某些情况下，在式XI中，R1–R3各自独立地是氢、或L-底物；R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、羧烷基、磺烷基、或L-底物；R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-底物；R8、R9和R17–R22各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、磺酸盐、或L-底物；并且R10和R11各自独立地是烷基、羧烷基、或L-底物。
在一些实施例中，在式XI中，R1–R3各自是氢；R4和R5独立地是具有1-20个碳的烷基、羧烷基、磺烷基、或L-底物；R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-底物；R8、R9和R17–R22各自独立地是氢或磺酸盐；并且R10和R11各自独立地是烷基、或L-底物。
在一些情况下，L是无、烷基、或聚乙二醇。在某些实例中，底物是生物分子:小的生物活性配体、抑或生物聚合物。
在一些实施例中，在式XI中，n是0。在一些实施例中，在式XI中，n是1。在一些实施例中，在式XI中，n是2。在一些实施例中，在式XI中，n是3。
在某些情况下，在式XI中，R1–R3独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、羧烷基、或L-底物。在某些实例中，在式XI中，R1–R3各自是氢。在某些情况下，在式XI中，R1–R3中的两个被环状地连接以形成一个六元碳环或杂环。在某些实施例中，在式XI中，R1–R3之一是烷氧基、芳氧基、或L-底物。
在一些实施例中，在式XI中，R4和R5独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、羧烷基、磺烷基、或L-底物。在某些实施例中，在式XI中，R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、羧烷基、磺烷基、或L-底物。在一些情况下，在式XI中，R4和R5各自独立地选自具有1-20个碳的烷基，其中烷基可以被选自以下项的一个或多个取代基取代：底物、磺酸盐、磷酸酯(盐)、氨基、取代的氨基、铵、羧基、和羟基。在某些实施例中，R4和R5各自独立地选自–(CH2)m-Z，其中m是1-12并且Z选自-H、-CO2H、-NH2、-SO3 -、-PO3H和底物。
在一些实施例中，在式XI中，R6、R7、R15和R16独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-底物。在某些实例中，在式XI中，R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基。在某些实例中，在式XI中，R6、R7、R15和R16各自独立地是低级烷基。在某些实例中，在式XI中，R6和R7各自是甲基。在某些实例中，在式XI中，R15和R16各自是甲基。在一些实施例中，R6是低级烷基(例如甲基或乙基)并且R7是L-底物。在一些实施例中，R7是L-Z(例如–(CH2)m-Z，其中m是1-12并且Z选自-H、-CO2H、-NH2、-SO3 -、-PO3H和底物)。在一些实施例中，R15是低级烷基(例如甲基或乙基)并且R16是L-底物。在一些实施例中，R16是L-Z(例如–(CH2)m-Z，其中m是1-12并且Z选自-H、-CO2H、-NH2、-SO3 -、-PO3H和底物)。
在一些实施例中，在式XI中，R8、R9和R17–R22各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、羰基、氨基、硫醇、磺酸盐、膦酰基、或L-底物。在一些实例中，在式XI中，R8、R9和R17–R22各自独立地是氢或具有1-20个碳的烷基。在一些实例中，在式XI中，R8、R9和R17–R22各自独立地是氢或L-底物。在一些实例中，在式XI中，R8和R9各自是氢。在一些实例中，在式XI中，R17–R22各自是氢。在某些实施例中，R9被环状地连接至氮杂吲哚啉环的邻近的N，例如以形成一个6元环。
在一些实施例中，在式XI中，R10和R11各自独立地是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、磺烷基、或L-底物。在某些实施例中，在式XI中，R10和R11各自独立地是氢、烷基、芳基或L-底物。在一些实例中，在式XI中，R10和R11各自独立地是烷基，例如低级烷基(例如甲基、乙基、丙基、异丙基、等)。在某些实例中，在式XI中，R10是L-底物。在某些情况下，在式II中，R11是L-底物。
在一些实施例中，在式XI中，R4和R5、R6和R7、R5和R9、R15和R16、R4和R22、R4和R6/R7、或R6/R7和R15/R16中的一个或多个可能按组合而取，以形成5–至50–元环(例如5-至12元环，例如5、6、7或8-元环)。
在某些实施例中，在式XI中，R1–R11和R15–R22中至少一个包括L-底物。在某些实施例中，在式XI中，R1–R11和R15–R22中的两个包括L-底物。
在某些实例中，共轭物是式XII的化合物：
其中n和R1-R11、R15-R18、R20和R21如以上对式VI所述，除了RGM是底物，并且m是1至50。
在一些情况下，在式XII中，m是1至50，例如3至35、6至35、10至35或15至20。在一些实例中，1至约50个染料分子被共轭至底物，例如每个底物约3至约35个染料分子、约6至约35个染料分子、约10至约35个染料分子、或约15至约20个染料分子。在一些实施例中，多达约35个染料分子可以被共轭至底物而没有显著的自淬灭。在某些实例中，m是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50。在某些实例中，m是约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45或约50。
在一些实例中，在式XII中，R1–R3独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、羧烷基、或L-底物；R4和R5独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、羧烷基、或L-底物；R6、R7、R15和R16独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、或L-底物；R8、R9、R17和R18独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、磺酸盐、羰基、氨基、硫醇、磷酸酯(盐)、或L-底物；R10、R11、R20和R21是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、磺酰基烷基、或L-底物；L是底物和染料之间的接头；底物是生物分子:小的生物活性配体、抑或生物聚合物；R4和R5、R6和R7、R5和R9、R15和R16、R4和R18、R4和R6/R7，或R6/R7和R15/R16中的一个或多个可能按组合而取，以形成5-50元环。
在某些情况下，R1–R3各自是氢。在某些情况下，在式XII中，R1–R3中的两个被环状地连接以形成一个六元碳环或杂环。在某些实施例中，在式XII中，R1–R3之一是烷氧基、芳氧基、或L-底物。
在一些情况下，在式XII中，R4和R5各自独立地选自具有1-20个碳的烷基，其中烷基可以被选自以下项的一个或多个取代基取代：底物、磺酸盐、磷酸酯(盐)、氨基、取代的氨基、铵、羧基、和羟基。在某些实施例中，R4和R5各自独立地选自–(CH2)m-Z，其中m是1-12并且Z选自-H、-CO2H、-NH2、-SO3 -、-PO3H和底物。
在某些实例中，在式XII中，R6和R7各自独立地是具有1-20个碳的烷基。在某些实例中，在式XII中，R6和R7各自独立地是低级烷基。在某些实例中，在式XII中，R6和R7各自是甲基。在一些实施例中，R6是低级烷基(例如甲基或乙基)并且R7是L-底物。在一些实施例中，R7是L-Z(例如–(CH2)m-Z，其中m是1-12并且Z选自-H、-CO2H、-NH2、-SO3 -、-PO3H和底物)。
在一些实例中，在式XII中，R8和R9各自独立地是氢或具有1-20个碳的烷基。在一些实例中，在式XII中，R8和R9各自独立地是氢或L-底物。在一些实例中，在式XII中，R8和R9各自是氢。在某些实施例中，R9被环状地连接至氮杂吲哚啉环的邻近的N，例如以形成一个6元环。
在一些实例中，在式XII中，R17和R18各自独立地是氢或具有1-20个碳的烷基。在一些实例中，在式XII中，R17和R18各自独立地是氢或L-底物。在一些实例中，在式XII中，R17和R18各自是氢。在某些实施例中，R18被环状地连接至氮杂吲哚啉环的邻近的N–R4，例如以形成一个6元环。
在一些实例中，在式XII中，R1–R3各自独立地是氢、或L-底物；R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、羧烷基、磺烷基、或L-底物；R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-底物；R8、R9和R17–R22各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、磺酸盐、膦酰基或L-底物；并且R10和R11各自独立地是烷基、芳基、芳烷基、羧烷基、磺烷基、或L-底物。
在某些实例中，在式XII中，R1–R3各自是氢；R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、羧烷基、磺烷基、或L-底物；R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-底物；R8、R9、R17、和R18各自独立地是氢、或磺酸盐；并且R10和R11各自独立地是烷基、或L-底物。
在某些情况下，在式XII中，L是无、烷基、或聚乙二醇。在某些实例中，底物生物分子，例如小的生物活性配体、或生物聚合物。
在一些情况下，在式XII中，n是0。在一些实例中，在式XII中，n是1。在某些情况下，在式XII中，n是2。在一些情况下，在式XII中，n是3。
在某些实施例中，在式XII中，R1–R11、R15–R18和R20–R21中的一个或多个包括L-底物。在某些实施例中，在式XII中，R1–R11、R15–R18和R20–R21中的两个包括L-底物。
在一些实施例中，染料共轭物衍生自表1的反应性染料中的任一种与感兴趣的底物的相容官能团的共轭(例如，如在此描述)。
在一些实施例中，在染料共轭物中，R4和R5各自独立地是–(CH2)q-Z，其中Z是水溶性基团并且q是从1至12的整数。在某些实施例中，Z是SO3H并且n是3。
在一些实施例中，在染料共轭物中，R15是低级烷基并且R16是–(CH2)m-Y-RGM，其中Y是环烷基、杂环烷基、杂环、或芳基，并且m是0或从1至6的整数。在一些实例中，Y是苯基、吡啶基、环己基、或哌啶基。在某些实施例中，R15是甲基。在某些实例中，RGM是活性酯。在一些情况下，Y是苯基。在某些实施例中，R16是(CH2)m-Ph-C(O)-NHS，其中m是0或1并且NHS是N-羟基-琥珀酰亚胺基。
在某些情况下，在染料共轭物中，R6和R7各自独立地是低级烷基。在某些实例中，R6和R7各自是甲基。
在某些实施例中，染料共轭物并不包括含PEG取代基。在某些实施例中，染料共轭物并不包括MW 300至5000的水溶性聚环氧烷烃聚合物。
在某些实施例中，染料共轭物并不包括可切割接头。在某些实施例中，染料共轭物并不包括含易变–C＝N-基团的接头。
在某些实施例中，共轭物是多肽共轭物，该共轭物包括共轭至染料化合物的多肽(例如，如以上所述)。可以在多肽的任何希望的位点，将感兴趣的染料共轭至该多肽。因此，例如本披露提供了具有共轭在多肽的C端的位点或在C端附近的染料的修饰的多肽。其他实例包括具有共轭在多肽的N端或在N端附近的位置的染料的修饰的多肽。实例还包括具有共轭在多肽的C端和N端之间的位置(例如在多肽的内部位点)的染料的修饰的多肽。以上的组合还可能是在修饰的多肽被共轭至两种或更多种染料的情况下。
本披露的实施例包括共轭物，其中多肽被共轭至一种或多种染料，例如2种染料、3种染料、4种染料、5种染料、6种染料、7种染料、8种染料、9种染料、或10种或更多种染料。可以在多肽的一个或多个位点，将染料共轭至该多肽。例如，可以将一种或多种染料共轭至该多肽的单个氨基酸残基。在一些情况下，将一种染料共轭至该多肽的氨基酸残基。在其他实施例中，可以将两种染料共轭至该多肽的同一氨基酸残基。在其他实施例中，第一染料共轭至该多肽的第一氨基酸残基，并且第二染料共轭至该多肽的第二氨基酸残基。以上的组合也是可能的，例如其中多肽在第一氨基酸残基被共轭至第一染料，并且在第二氨基酸残基被共轭至两种其他染料。其他组合也是可能的，例如但不局限于，多肽在第一氨基酸残基被共轭至第一和第二染料，并且在第二氨基酸残基被共轭至第三和第四部分，等。在一些实例中，该多肽是抗体。
在一些实施例中，在生物测定中发现了这些染料共轭物的用途，其中底物可以是氨基酸、核苷酸、或生物聚合物，例如氨基酸聚合物、核酸聚合物、碳水化合物、或多糖。染料-聚合物共轭物可以被制备为合并被共轭至底物的多个染料分子，以增加来自染料-共轭物的荧光信号。
在一些实例中，底物是氨基酸或氨基酸聚合物，例如肽或蛋白。感兴趣的氨基酸聚合物包括但不局限于抗体(例如，如以上定义)，IgG结合蛋白(例如蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、等)，酶，凝集素，糖蛋白，组蛋白，白蛋白，脂蛋白，亲和素，链亲和素，蛋白A，蛋白G，藻胆蛋白和其他荧光蛋白，激素，毒素，趋化因子，生长因子，神经肽，细胞因子，毒素，蛋白酶底物，和蛋白激酶底物。在某些实施例中，生物聚合物底物是单克隆抗体。
在某些实施例中，底物是核酸碱基、核苷、核苷酸或核酸聚合物。感兴趣的核酸聚合物包括但不局限于被修饰为拥有另外的接头或间隔子以便附接本发明的染料的那些，这些接头例如是炔基连接(参见例如美国专利号5,047,519)、氨基烯丙基连接(参见美国专利号4,711,955)、杂原子取代的接头(参见例如美国专利号5,684,142)、或其他连接。在一些实施例中，共轭的物质是通过非环间隔子将嘌呤或嘧啶碱基连接至磷酸酯(盐)或聚磷酸酯(盐)部分的核苷或核苷酸类似物。在某些实施例中，例如通过羟基，或通过硫醇或氨基，染料被共轭至核苷酸或核苷的碳水化合物部分(例如，如在美国专利号5,659,025；5,668,268；5,679,785中描述)。在一些实例中，共轭的核苷酸是核苷三磷酸或脱氧核苷三磷酸或双脱氧核苷三磷酸。将亚甲基部分或氮或硫杂原子并入磷酸酯(盐)或聚磷酸酯(盐)部分也是有用的。也可以将非嘌呤的和非嘧啶的碱基，例如7-脱氮嘌呤(参见美国专利号6,150,510)和包含此类碱基的核酸偶联至主题染料化合物。通过脱嘌呤的核酸与胺、酰肼或羟胺衍生物的反应制备的核酸加合物提供了标记和检测核酸的另外手段，参见例如“A methodfor detecting abasic sites in living cells:age-dependent changes in baseexcision repair(用于在活细胞中检测碱性位点的方法：碱基切除修复中的年龄依赖性变化)。”Atamna(阿坦纳)等人，2000，Proc Natl Acad Sci(美国科学院院刊)97:686-691。
感兴趣的核酸聚合物共轭物包括但不局限于标记的、单链的、或多链的天然的或合成的DNA或RNA，DNA的或RNA的寡核苷酸，或DNA/RNA杂合物，或合并不常见接头(例如吗啉衍生化的磷酸酯(盐))的核酸，或肽核酸，例如N-(2-氨乙基)甘氨酸单元。当核酸是合成的寡核苷酸时，它可以包含少于50个核苷酸，例如少于25个核苷酸。肽核酸(PNA)的共轭物(参见例如Nielsen(尼尔森)等人，美国专利号5,539,082)可以用于一些应用，这是由于它们的总体上更快的杂交速度。
在一些实施例中，底物是作为多糖的碳水化合物，多糖例如是葡聚糖、肝素、糖原、支链淀粉、甘露聚糖、菊糖、淀粉、琼脂糖或纤维素。可替代地，碳水化合物是作为脂多糖的多糖。感兴趣的多糖共轭物包括但不局限于葡聚糖的和脂多糖的共轭物。
在某些实施例中，底物是脂(例如具有6-60个碳)，包括糖脂、磷脂、鞘脂、和类固醇。可替代地，共轭的物质是脂质组件，例如脂质体。亲脂性部分可以用于将共轭的物质保持在细胞中，例如，如在美国专利号5,208,148中描述。本发明的某些极性染料还可以被限制在脂质组件内。
其中底物是离子复合部分的共轭物可以用作针对钙、钠、镁、锌、钾或其他生物学上重要的金属离子的指示剂。感兴趣的离子复合部分包括但不局限于冠醚(参见美国专利号5,405,975)；1,2-二-(2-氨基苯氧基乙烷)-N,N,N',N'-四乙酸的衍生物(BAPTA螯合剂，参见例如美国专利号5,453,517、5,516,911、和5,049,673)；2-羧基甲氧基苯胺-N,N-二-乙酸的衍生物(参见例如APTRA螯合剂；Am.J.Physiol.(美国生理学杂志)256,C540(1989))；基于吡啶和菲咯啉的金属离子螯合剂(参见美国专利号5,648,270)；和次氮基三乙酸的衍生物，参见例如“Single-step synthesis and characterization of biotinylatednitrilotriacetic acid,a unique reagent for the detection of histidine-taggedproteins immobilized on nitrocellulose(生物素化的次氨基三乙酸，用于检测在硝化纤维上固定的组氨酸标记蛋白的独特试剂的但不合成和特征化)”，McMahan(麦克马汉)等人，1996，Anal Biochem(分析生物化学)236:101-106。离子复合部分可以是冠醚螯合剂、BAPTA螯合剂、APTRA螯合剂或次氮基三乙酸的衍生物。
其他感兴趣的共轭物包括非生物材料，包括但不局限于有机的或无机的聚合物的染料共轭物、聚合物膜(polymeric film)、聚合物片、聚合物质膜(polymeric membrane)、聚合物颗粒、或聚合物微粒；包括磁性的和非磁性的微球；铁、金或银颗粒；传导的和非传导的金属和非金属；以及玻璃的和塑料的表面和颗粒。任选地通过包含适当的官能度的染料的共聚制备共轭物，同时，或者通过包含具有适合的化学反应性的官能团的聚合物的化学修饰制备聚合物。对于制备聚合物的染料共轭物有用的其他类型的反应包括烯的催化聚合和共聚，和二烯与二烯亲合物的反应，转酯或转胺基作用。
在一些实施例中，进一步用任选地是本发明的另外染料的至少一种第二染料标记染料共轭物。在某些实施例中，第一和第二染料形成了能量转移对，例如荧光能量转移对(FRET)。在本发明的一些方面，标记的共轭物充当酶底物，并且酶水解中断能量转移。
在一些实例中，荧光染料共轭物，特别是在底物是生物聚合物的情况下，每个底物分子可以合并多个染料，以增加荧光信号。在一些情况下，将染料的3个或更多个分子并入染料生物聚合物共轭物。在其中生物聚合物是抗体的一些实施例中，将三个或更多个，例如4个或更多个、5个或更多个或6个或更多个染料分子共轭至该抗体。在一些实例中，1至约50个染料分子被共轭至抗体，例如每个抗体约3至约35个染料分子、约6至约35个染料分子、约10至约35个染料分子、或约15至约20个染料分子。在一些实施例中，多达约35个染料分子可以被共轭至抗体而没有显著的自淬灭。本领域普通技术人员应理解，每个共轭物底物的染料的每个陈述的范围旨在描述该范围内的所有值。例如，通过陈述本发明的荧光生物聚合物包含6-15个染料分子，包含6、7、8、…、或15个染料分子的生物聚合物也是本发明的一部分。应理解，在此描述的每个共轭物的染料的陈述的范围和值可以是平均值。
通过偶联部分，可以将底物和主题染料化合物(例如，如以上所述)彼此共轭。在一些情况下，底物和主题染料化合物可以各自结合(例如共价地结合)至偶联部分，由此间接地将底物和染料化合物结合在一起。在一些情况下，偶联部分包括染料化合物的RGM和底物的相容官能团之间的共轭反应的产物。底物可以包含这样的一个或多个官能团或可以被修饰为包含具有适合的反应性的此类官能团，导致染料至物质的化学附接。在一些情况下，反应性染料和底物上的一个或多个官能团之间的共轭反应生成反应性基团RGM的一个或多个原子，其有待并入将染料附接至该底物的新连接(例如偶联部分)。
在一些情况下，底物是氨基酸、肽、蛋白、酪胺、多糖、离子复合部分、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、半抗原、补骨脂内酯、药物、激素、脂、脂质组件、聚合物、聚合物微粒、生物细胞或病毒。在一些实例中，底物是肽、蛋白、核苷酸、寡核苷酸、或核酸。当将本发明的染料共轭至此类生物聚合物时，可能的是每个分子合并更多染料，以增加荧光信号。在某些实例中，可能的是每个抗体分子合并此类染料的三个或更多个分子，而不损失总荧光，而当每个抗体合并了大于约两种Cy5染料时，光谱上可比较的Cy5(其中n＝2)的荧光强烈淬灭。在一些实例中，在相同抗体浓度，与光谱上类似的花菁染料的共轭物，例如Alexa700相比，本发明的标记的共轭物荧光更强。
在一些实施例中，底物是氨基酸(例如被磷酸酯(盐)、碳水化合物、或C1至C25羧酸保护或取代的氨基酸)或是氨基酸的聚合物，例如肽或蛋白。在某些实施例中，肽的共轭物包含至少五个氨基酸，例如5至36个氨基酸。感兴趣的肽包括但不局限于神经肽、细胞因子、毒素、蛋白酶底物、和蛋白激酶底物。感兴趣的蛋白共轭物包括酶、抗体、凝集素、糖蛋白，组蛋白，白蛋白、脂蛋白，亲和素、链亲和素、蛋白A、蛋白G、藻胆蛋白和其他荧光蛋白、激素、毒素、趋化因子、和生长因子。
在一些实例中，共轭的蛋白是藻胆蛋白，例如别藻蓝蛋白、藻青蛋白、藻红蛋白、别藻蓝蛋白B、B-藻红蛋白、和藻红青蛋白(例如参见Roederer(勒德雷尔)的美国专利号5,714,386(1998))。在某些实例中，这些共轭物是具有用作激发态能量受体或供体的本发明的选择的染料的R-藻红蛋白的和别藻蓝蛋白(APC)的共轭物。在这些共轭物中，激发态能量转移导致当在较短波长激发时，长波长荧光发射。
在一些实施例中，染料共轭物是具有第二底物的串联共轭物的一部分。串联共轭物可以包括共轭至荧光物(例如荧光蛋白，例如藻胆蛋白)的染料，其中将染料-荧光物共轭物进一步共轭至感兴趣的底物。在一些实施例中，染料荧光物共轭物是染料-APC共轭物。在某些实施例中，染料-APC共轭物被共轭至特异性结合对的成员，例如，如在表2中描述。在一些实例中，串联共轭物是染料-APC-抗体共轭物。在某些实施例中，染料-APC共轭物包括一个或多个反应性基团部分，以便共轭至感兴趣的底物。像这样，在一些情况下，染料-APC共轭物可以称为反应性染料(例如，如在此描述)。任何方便的方法可以用于制备主题串联共轭物。在本发明的一个方面，底物是共轭的物质，该物质是抗体(包括完整的抗体、抗体片段、和抗体血清、等)，氨基酸，血管抑素或内皮抑素，亲和素或链亲和素，生物素(例如酰胺基生物素、生物胞素、脱硫生物素、等)，血液组分蛋白(例如白蛋白、纤维蛋白原、纤溶酶原、等)，葡聚糖，酶，酶抑制剂，IgG-结合蛋白(例如蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、等)，荧光蛋白(例如藻胆蛋白、水母蛋白、绿色荧光蛋白、等)，生长因子，激素，凝集素(例如麦胚凝集素、伴刀豆球蛋白A、等)，脂多糖，金属结合蛋白(例如钙调蛋白、等)，微生物或它的一部分(例如细菌、病毒、酵母、等)，神经肽和其他生物活性因子(例如皮啡肽、deltropin、内***肽、内啡肽、肿瘤坏死因子等)，非生物微粒(例如铁磁流体的、金的、聚苯乙烯的、等)，核苷酸，寡核苷酸，肽毒素(例如蜂毒明肽、银环蛇毒素、鬼笔环肽、等)，磷脂结合蛋白(例如膜联蛋白、等)，小分子药物(例如甲氨蝶呤、等)，结构蛋白(例如肌动蛋白，纤连蛋白，层粘连蛋白，微管相关蛋白，微管蛋白(tublin)、等)，或酪胺酰胺(tyramide)。
制备染料共轭物
可以将本发明的染料共轭物合成为底物和主题染料之间的反应的产物(例如，如在此描述)。多种化学反应性基团(RGM)和相容底物、和生物共轭化学品可以用于制备主题染料共轭物(参见例如Bioconjugate Techniques(生物共轭技术)，Greg T.Hermanson(格雷格T.霍曼逊)，Academic Press(学术出版社)，纽约，第三版，2013)。可以使用任何方便的方法达到使用反应性染料的染料共轭物的制备(参见例如Hermanson(霍曼逊)，同上；Haugland(豪格兰)，1995，Methods Mol.Biol(分子生物学方法)45:205-21；和Brinkley(布林克利)，1992，Bioconjugate Chemistr(生物共轭物化学)3:2)。共轭物可以生成自：在其中二者都可溶的适合溶剂中混合适当的反应性染料和待共轭的底物。容易地产生在此描述的反应性染料的溶液，协助与任何方便的底物的共轭反应。对于光活化的那些反应性染料，可以经由用来活化反应性染料的反应混合物的光照来达到共轭。
染料共轭物可以被合成为生物聚合物和反应性染料之间的反应的产物，其中反应条件导致将多个染料分子共轭至每个生物聚合物。在一些情况下，染料生物聚合物共轭物可以被合成为亚基分子的聚合反应，其中在生物聚合物的聚合之前，已经将一个或多个亚基分子共轭至反应性染料。后者方法的一个实例是，使用标准亚磷酰胺化学品的寡核苷酸的合成，其中至少一种亚磷酰胺是染料标记的。
在一些情况下，化学反应性基团是可以通过分别暴露于作为亲核体或亲电体的对应官能团而形成共价连接的亲电体或亲核体。亲电的和亲核的基团的反应性对的一些实例连同生成自它们的反应的共价连接示出于下表3中。
表3：反应性亲电的和亲核的基团，以及生成的偶联部分
*活化酯可以具有式-COW，其中W是优良的离去基团(例如琥珀酰亚胺基氧(-OC4H4O2)、磺基琥珀酰亚胺基氧(-OC4H3O2-SO3H)、-1-氧代苯并***基(-OC6H4N3)；或芳氧基或被吸电子取代基(例如硝基、氟、氯、氰基、或三氟甲基、或它们的组合)取代一次或多次的芳氧基，用于形成活化芳基酯；或用碳二亚胺活化的羧酸，以形成酸酐或混合酸酐-OCOAlk或–OCN(Alk1)NH(Alk2)，其中Alk1和Alk2(它们可以是相同的或不同的)是C1-C20烷基、C1-C20全氟烷基、或C1-C20烷氧基；或环己基、3-二甲基氨基丙基、或N-吗啉代乙基)。**酰叠氮还可以重排为异氰酸酯。
用于将染料附接至待共轭的底物的反应性基团的选择可以取决于待共轭的物质上的官能团和希望的共价连接的类型或长度。可以存在于有机的或无机的底物上的官能团的类型包括但不局限于胺、酰胺、硫醇、醇、酚、醛、酮、磷酸酯(盐)、咪唑、肼、羟胺、双取代的胺、卤化物、环氧化合物、羧酸酯、磺酸酯、嘌呤、嘧啶、羧酸、烯键、或这些基团的组合。在底物上单一类型的反应位点可以是可用的(例如，因为对于多糖可以存在)，或多种位点可以存在(例如胺、硫醇、醇、酚)，例如因为对于蛋白可以存在。可以将共轭的底物共轭至多于一种染料，这些染料可以是相同的或不同的，或共轭至用任何方便的部分(例如用半抗原，例如生物素)另外修饰的底物。在一些情况下，可以通过小心地控制反应条件来获得选择性。在一些情况下，可以通过选择方便的反应性染料来获得标记的选择性。
在一些实例中，反应性基团，RGM与胺、硫醇、醇、醛或酮反应。在某些情况下，RGM与胺或硫醇官能团反应。在某些实施例中，RGM是丙烯酰胺、反应性胺(包括尸胺或乙二胺)、羧酸的活化酯(例如羧酸的琥珀酰亚胺基酯)、酰叠氮、酰基腈、醛、卤代烷、酸酐、苯胺、芳基卤、叠氮化物、吖丙啶、硼酸盐、羧酸、重氮烷、卤代乙酰胺、卤代三嗪、肼(包括酰肼)、亚胺基酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、亚磷酰胺、反应性铂复合物、磺酰卤、或硫醇基团。“反应性铂复合物”特别是指化学反应性铂复合物，例如在美国专利号5,580,990；5,714,327；5,985,566中描述。
在RGM是羧酸的活化酯的情况下，对于制备蛋白、核苷酸、寡核苷酸、或半抗原的染料共轭物，反应性染料可以是有用的。在RGM是马来酰亚胺或卤代乙酰胺的情况下，对于共轭至含硫醇物质，反应性染料可以是有用的。在RGM是酰肼的情况下，对于共轭至高碘酸氧化的碳水化合物和糖蛋白，反应性染料可以是有用的，并且此外，反应性染料可以是用于细胞微注射的醛可固定极性示踪物。在一些实例中，RGM是羧酸、羧酸的琥珀酰亚胺基酯、卤代乙酰胺、肼、异硫氰酸酯、马来酰亚胺基团、脂肪胺、全氟苯甲酰氨基、叠氮基全氟苯甲酰胺基、或补骨脂内酯。在某些实例中，RGM是羧酸的琥珀酰亚胺基酯、马来酰亚胺、碘乙酰胺、或反应性铂复合物。可替代地，反应性基团，RGM是一个可光活化基团，其中仅在用适当波长的光照射后，染料才变为化学反应性的。在一些实例中，反应性基团是可光活化基团，例如叠氮化物、二氮杂环丙烯基、叠氮基芳基、或补骨脂内酯衍生物，并且仅在用适当波长的光照射后，染料才变为化学反应性的。
在某些实施例中，生物分子底物共轭的方法是与适合该生物分子的反应条件相容的。例如，反应条件可以包括：包括水的反应混合物。在一些情况下，反应混合物可以具有与多肽相容的pH，例如但不局限于4至11的pH、或5至10的pH、或6至9的pH、或6至8的pH。在某些实例中，反应混合物具有7的pH。在一些实施例中，在与多肽相容的温度进行这些反应条件。例如，反应条件可以是在20℃至45℃的温度，例如25℃至40℃、或30℃至40℃，或35℃至40℃。在一些情况下，反应条件是在室温(例如25℃)。在一些实例中，反应条件是在37℃的温度。普通技术人员将理解，因素，例如pH和位阻(即修饰的氨基酸残基至与感兴趣的反应性配偶子反应的可接近性)是具有重要性的。修改反应条件以提供最佳共轭条件是很好地在普通技术人员的技术内的，并且是本领域的常规。在用存在于活细胞中或上的多肽进行共轭的情况下，选择条件以便是生理学相容的。例如，可以临时下降pH持续一段时间，这段时间足以允许反应发生，而且是在细胞耐受的时期内(例如从约30min至1小时)。用于在细胞表面上进行多肽的修饰的生理条件可以类似于在承载细胞表面叠氮化物的细胞的修饰中的酮-叠氮化物反应中使用的那些条件(参见例如U.S.6,570,040)。
在某些实施例中，本披露提供了多肽共轭物，其中多肽是抗体。像这样，多个实施例包括共轭至感兴趣的部分的抗体，其中共轭至感兴趣的部分的抗体称为“抗体共轭物”。Ig多肽一般包括至少Ig重链恒定区或Ig轻链恒定区，并且可以进一步包括Ig可变区(例如VL区和/或VH区)。Ig重链恒定区包括任何重链同种型的Ig恒定区、非天然发生的Ig重链恒定区(包括一致的Ig重链恒定区)。Ig恒定区可以被修饰为共轭至感兴趣的部分，其中感兴趣的部分存在于Ig恒定区的溶剂可及环区或邻近该区。
基于上述属性，选择本发明的反应性染料用于制备希望的染料共轭物，这些染料共轭物的有利特性使得它们对于大量应用而言是有用的。
方法
本披露的方面包括检测样品中的分析物的方法。使样品与检测试剂接触可以导致标记分析物并且提供通过荧光来检测分析物。在一些实例中，经由与检测试剂复合来标记分析物。在某些实例中，经由与检测试剂共轭来标记分析物。
在一些实施例中，该方法包括使样品在其中检测试剂形成与分析物的复合物的条件下，与包含染料共轭物(例如，如在此描述)的检测试剂接触。在某些实施例中，在足以使检测试剂特异性结合分析物的条件下，发生接触步骤。
在一些情况下，检测试剂包括特异性结合分析物的特异性结合部分。在一些实施例中，该方法包括使样品在其中检测试剂共轭至分析物的条件下，与包含反应性染料(例如，如在此描述)的检测试剂接触。
如在此使用，术语“分析物”与“靶”可互换地使用，并且是指待分析、检测、测量、或标记的任何物质。感兴趣的分析物包括但不局限于蛋白、肽、激素、半抗原、抗原、抗体、受体、酶、核酸、多糖、化学品、聚合物、病原体、毒素、有机药物、无机药物、细胞、组织、微生物、病毒、细菌、真菌、藻类、寄生物、***原、污染物、和它们的组合。按照惯例，在待检测给定细胞类型的细胞的情况下，细胞组分分子或细胞自身都可以被描述为分析物。
如在此使用，术语“检测试剂”是指用于协助分析物的光学检测的任何分子。
在一些实例中，检测试剂包括能够共轭至感兴趣的分析物的反应性染料(例如，如在此描述)。
在一些情况下，检测试剂包括其中共轭物的底物组分自身是分析物特异性试剂的染料共轭物。在一些情况下，检测试剂包括共轭至荧光染料化合物(例如，如在此描述)的分析物特异性试剂。在一些实施例中，检测试剂包括共轭至荧光蛋白的染料共轭物(例如串联共轭物)的分析物特异性试剂。在某些情况下，检测试剂包括充当荧光标记的染料共轭物和结合至该共轭物的分析物特异性试剂。在此类情况下，染料共轭物和分析物特异性试剂可以经由任何方便的方法共价地或非共价地彼此结合。
如在此使用，术语“分析物特异性试剂”和“靶特异性试剂”互换地使用，用来指相对于潜在地存在于样品中的其他分析物，优先结合至感兴趣的分析物或靶的任何试剂。靶(分析物)和靶特异性(分析物特异性)试剂可以是特异性结合对(例如特异性结合部分)的成员，并且该对的任一成员可以用作靶特异性试剂，以便特异性结合至该对的其他成员。感兴趣的靶和靶特异性试剂对包括但不局限于在下表2中提供的那些试剂对。在一些实例中，靶特异性试剂是抗体，这些抗体包括特异性结合抗原(与抗原发生免疫反应)的抗原结合位点。
表2：特异性结合部分的对
抗原 抗体
生物素 亲和素、链亲和素、或抗生物素抗体
IgG(一种免疫球蛋白) 蛋白A或蛋白G
药物 药物受体
毒素 毒素受体
碳水化合物 凝集素或碳水化合物受体
肽 肽受体
核苷酸 互补核苷酸
蛋白 蛋白受体
酶底物 酶
核酸 核酸
激素 激素受体
补骨脂内酯 核酸
靶分子 RNA或DNA适体
可以采用被用于使样品与染料化合物或染料共轭物接触的任何方便的实验方案。采用的具体实验方案可以变化，例如取决于样品是在体外还是在体内，以及使用了染料化合物还是染料共轭物。对于体外实验方案，可以使用任何方便的实验方案来达到样品与染料化合物或染料共轭物的接触。在一些实例中，样品包括维持在适合的培养基中的细胞，并且染料化合物或染料共轭物被引入该培养基中。对于体内实验方案，可以采用任何方便的给予实验方案。取决于靶，给予的方式(例如静脉内、皮下、腹膜内、口服、等)，半衰期，存在的细胞数等，可以采用不同的实验方案。如在此使用，术语“样品”涉及一种材料或材料的混合物，典型地，虽然并不是必需，处于流体形式，包含感兴趣的一种或多种组分(例如分析物)。
在一些实施例中，主题方法进一步包括从样品分离或纯化标记的分析物(例如分析物检测试剂复合物、或染料标记的分析物)。任何方便的方法都可以用于此类分离或纯化步骤，包括但不局限于流式细胞术、扫描细胞计量术、凝胶电泳、毛细管电泳、离子交换色谱、尺寸排阻色谱法、疏水作用色谱法、过滤、提取、ELISA方法、等。
其中该使用分析物特异性检测试剂标记感兴趣的一种或多种分析物并且随后进行光学分析的测定是本领域熟知的，并且本发明的荧光染料共轭物作为此类测定中的检测试剂一般都是有用的。例如，可以使用检测试剂标记样品中的蛋白，这一检测试剂由标记的蛋白，典型地是抗体组成，其特异性结合分析物蛋白。可以使用多种熟知的测定程式和仪器(包括使用流式细胞术、扫描细胞计量术、成像、和凝胶分析)来进行生成的标记的分析物蛋白的检测。在本领域的广泛文献中详细描述了流式细胞术，包括例如Landy(浪迪)等人(编辑)，Clinical Flow Cytometr(临床流式细胞术)，Annals of the New York Academy ofSciences(纽约科学院年鉴)卷677(1993)；Bauer(鲍尔)等人(编辑)，Clinical FlowCytometry:Principles and Applications(临床流式细胞术：原理和应用)，Williams&Wilkins出版社(1993)；Ormerod(奥默罗德)(编辑)，Flow Cytometry:A PracticalApproach(流式细胞术：实践方法)，Oxford Univ.Press(牛津大学出版社)(1997)；Jaroszeski(乔罗谢夫斯基)等人(编辑)，Flow Cytometry Protocols(流式细胞术实验方案)，Methods in Molecular Biology(分子生物学方法)91期，Humana Press(美国胡马纳出版社)(1997)；以及Practical Shapiro(帕克提科夏皮罗)，Flow Cytometry(流式细胞术)，第4版，Wiley-Liss出版社(2003)。例如在Pawley(波利)(编辑)，Handbook ofBiological Confocal Microscopy(生物共聚焦显微术手册)，第二版，PlenumPress(纳姆出版社)(1989)中描述了荧光成像显微术。
对于激发本发明的荧光聚合物有用的照明源包括但不局限于手提式紫外灯、汞弧灯、氙灯、激光和激光二极管。将这些照明源任选地整合到激光扫描仪、荧光微板阅读仪、标准的或小型的荧光计、或色谱检测仪中。在一些实例中，在或接近633nm处，本发明的荧光聚合物是可激发的，并且可以使用相对便宜的红光激光激发源来进行激发。
本发明的方面包括分析流体***，该***包括仪器，该仪器包含样品，该样品包括例如，如在此描述的染料或染料共轭物。适合用于本发明的方法的任何方便的仪器或装置可以加载有该样品。感兴趣的仪器包括但不局限于流式细胞仪、扫描细胞计量仪、和凝胶分析仪。可以使用任何方便的方法，将例如，如在此描述的任何方便的样品加载进主题仪器中。样品可以包括一种或多种组分，例如感兴趣的分析物、染料、或染料共轭物，例如染料-抗体、染料-寡核苷酸、或涂覆有染料-蛋白共轭物的微球。在一些实例中，该仪器是加载有样品的流式细胞仪，该样品包括感兴趣的分析物和染料共轭物。
实用性
例如，如以上所述，本发明的染料化合物、它们的共轭物和方法在多个应用中发现了用途。感兴趣的应用包括但不局限于在多个领域中的研究应用和诊断应用，这些领域包括组织学、细胞学和免疫学。本发明的方法在多个不同应用中发现了用途，这些应用包括其中用荧光检测和/或量化感兴趣的分析物是感兴趣的任何方便的应用。
主题染料化合物、共轭物和方法在多个诊断的和研究的应用中发现了用途。感兴趣的诊断应用包括但不局限于其中用流式细胞术鉴定和分离细胞混合物中的细胞的亚群的诊断测定，利用荧光活化的细胞分选和显微术的诊断测定，涉及确定结合部分(例如抗原抗体结合)的浓度的诊断测定、等。此类诊断测定可以包括检测样品(例如血液、尿、脑脊液)中的分析物。
主题染料化合物、共轭物和方法在多个研究应用中发现了用途。感兴趣的研究应用包括但不局限于检测细胞表面标志，例如CD3、CD4、CD8、CD14、CD19、CD20、CD45、等。
在本发明的一个方面，反应性染料被用于直接标记样品，或直接标记样品的组分，这样使得样品可以被鉴定或量化。化学反应性染料化合物共价地附接至广泛多样的材料上的对应官能团，形成染料共轭物，如以上所述。
在一些实施例中，反应性染料化合物被直接用于染色或标记具有生物组分的样品。样品可以包括组分的异质混合物(这些组分包括完整的细胞、细胞提取物、细菌、病毒、细胞器、和它们的混合物)，或单一组分或组分的同类组(例如天然的或合成的氨基酸的、核酸的或碳水化合物的聚合物，或脂质膜复合物)。在使用的浓度内，这些染料一般对活细胞和其他生物组分是非毒性的。
为了直接标记，将染料化合物与样品按协助染料化合物和感兴趣的样品组分之间的接触的任何方式进行组合。在一些实例中，将染料化合物或包含染料化合物的溶液简单地添加至样品。某些本发明的染料，例如被一个或多个磺酸部分取代的那些，倾向于对生物细胞膜是非通透的，并且一旦在活细胞内，就典型地是被良好保留的保持。渗透质膜的处理，例如电穿孔、休克处理或高细胞外ATP，可以用于将选择的染料化合物引入细胞。可替代地，选择的染料化合物可以被物理地***细胞，例如通过压力显微注射、刮除负载、膜片钳方法、或吞噬。
合并脂肪胺或肼残基的染料可以被显微注射进细胞，在那里可以通过醛固定剂，例如甲醛或戊二醛，将它们固定在位。这一可固定性使得这类染料对于细胞内应用，例如神经元示踪而言是有用的。
拥有亲脂性取代基(例如磷脂)的染料化合物将非共价地并入脂质组件，例如供用作用于膜结构的探针；或用于并入脂质体、脂蛋白、膜、塑料、亲脂性微球或类似材料；或用于示踪。亲脂性染料作为膜结构的荧光探针是有用的。
为了直接染色生物应用中的分析物，本发明的染料化合物可以用于根据本领域一般所知的方法制备的水性的、大部分水性的或水性可混溶的溶液。染料化合物的提取浓度取决于实验条件和希望的结果，但是范围可以从一纳摩尔至一毫摩尔或更多。通过***变化确定最佳浓度，直至完成具有最小背景荧光的满意结果。
在本发明的另一方面，本发明的荧光染料共轭物作为检测试剂(例如分析物特异性检测试剂)或其一部分是有用的，用来协助光学检测和分析物的分析。在一个实施例中，染料共轭物底物自身是分析物特异性试剂，并且荧光染料共轭物被用作检测试剂，以标记感兴趣的分析物。在一个替代实施例中，荧光染料共轭物结合至分析物特异性试剂，并且组合的实体被用作检测试剂，以标记感兴趣的分析物。在这一替代实施例中，染料共轭物充当结合至分析物特异性试剂的荧光标记。
染料和共轭物的测定和检验试剂盒
本发明的方面进一步包括试剂盒，其中这些试剂盒包括用于本发明的方法的一种或多种组分。在此描述的任何组分可以被提供于这些试剂盒中，这些组分例如是染料化合物，染料共轭物，底物(例如抗体、生物聚合物多核苷酸)，分析物，细胞，支持物(例如质膜(membrane)、珠粒、颗粒、膜(film)、微球)，特异性结合部分(例如，如在表2中描述)，缓冲液，试剂，共轭物试剂，光源，例如，如在此描述。可以包括适合用于制造和使用共轭物的多种组分。试剂盒还可以包括管、缓冲液、等，和使用说明书。试剂盒的不同试剂组分可以存在于分开的容器中，或它们中的一些或全部可以被预先组合为单个容器中的试剂混合物，如所希望的。试剂盒任选地进一步包括一种或多种缓冲试剂，典型地存在为水性溶液。本发明的试剂盒任选地进一步包括另外的检测试剂，用于纯化生成的标记的物质的纯化介质，发光标准物，酶，酶抑制剂，有机溶剂，或用于进行本发明的测定的说明书。
本发明的一个方面是配制试剂盒，这些试剂盒协助使用本发明的任何染料实践不同测定，如以上所述。本发明的试剂盒可以包括本发明的荧光染料，存在为对于制备染料共轭物有用的化学反应性标记，抑或存在为染料共轭物，其中共轭的物质是特异性结合的对成员、或核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸聚合物、肽、或蛋白。在一些情况下，染料存在为串联共轭物(例如，如在此描述)。
在一些实施例中，试剂盒进一步包括具有式I、式II、式III、式IV、式V、或式VI的结构的反应性染料化合物(例如，如以上所述)；以及一种或多种选自以下项的组分：染料共轭物、底物、分析物、细胞、支持物、特异性结合部分、缓冲液、试剂、光源和反应性染料化合物的使用说明书。
在某些实施例中，试剂盒包括具有式VII、式VIII、式IX、式X、式XI、或式XII的结构的染料共轭物(例如，如以上所述)；以及一种或多种选自以下项的组分：染料化合物、底物、分析物、细胞、支持物、特异性结合部分、缓冲液、试剂、光源和染料共轭物的使用说明书。在某些实例中，染料共轭物包括染料-APC共轭物。
在某些情况下，主题试剂盒可以进一步包括用于实践主题方法的说明书。这些说明书可以按多种形式存在于这些主题试剂盒中，这些形式中的一种或多种可以存在于试剂盒中。这些说明书可以存在的一种形式是打印在适合的介质或基底上(例如，在其上打印信息的一张或多张纸)、打印在试剂盒的包装中、打印在包装***物等中的信息。这些说明书的又另外的形式是在其上已经记录有信息的计算机可读介质，例如软盘、光盘(CD)、硬盘等。这些说明书可以存在的又另外的形式是可以在远离的地方经由因特网来获取信息而使用的网址。
提出以下实例以便为本领域普通技术人员提供如何制造和使用本发明的完整披露和描述，并且不旨在限制或限定诸位发明人考虑作为他们的发明的范围，它们也不旨在表示以下实验是进行的所有或仅有的实验。已经作出努力以确保关于使用数目的准确性(例如，量，温度，等)，但一些实验误差和偏差应被考虑在内。除非另外指明，份数是重量份，分子量是重量平均分子量，温度是摄氏度，并且压力是或接近大气压。
实例
在以下实例中提供了用于感兴趣的染料的一些合成策略，连同它们的特征，合成前体，共轭物和使用方法。对于本领域普通技术人员而言，另外的修改和变换将是明显的。
实例1.制备化合物2
在室温下，向在1-丁醇中的2,5-二溴吡啶(10g，42mmol)的溶液(50mL)中添加水合肼(80％，13mL，211mmol)。6小时后，在115℃，将混合物浓缩至约15mL。形成白色固体，并且经过滤进行收集，用30mL冷水洗涤。在空气中干燥过夜，获得化合物2(8.0g)，为一种灰白色固体。
实例2.制备化合物3
在室温下，向在苯中的化合物2(20g，106mmol)的溶液(100mL)中添加3-甲基-2-丁酮(22.9mL，212mmol)。使用装备有迪安-斯达克分水器的冷凝器，将该混合物回流过夜。浓缩混合物并且在多磷酸(125g)中，在140℃加热残余物45min。在搅拌下，将该混合物倒入冰水中(500M)。添加NaOH(5N)以中和该溶液至pH＝8.0，并且用EtOAc(500mL)进行萃取。用Na2SO4干燥后，在硅胶柱上纯化残余物，以给出化合物3(7.6g)，为一种黄色固体。
实例3.制备化合物4
在-78℃，向在干THF中的化合物3(2g，8.36mmol)的溶液(40mL)中滴加在己烷中的n-BuLi(2.5M，7.4mL，18.4mmol)。1小时后，在-78℃，将CO2气体起泡穿过该反应混合物，并且在-78℃保持起泡1小时。添加HCl溶液(1N，50mL)来淬灭该反应，并且用HPLC纯化粗材料，以给出化合物4(1g)，为一种浅褐色固体。
实例4.制备化合物5
向在MeOH中的化合物4(0.5g，2.5mmol)的溶液(10mL)中，添加浓H2SO4(几滴)，并且将该混合物保持回流72小时。添加NaOAc(1g)并且搅拌30min。将浓缩物和残余物溶解在EtOAc(50mL)中，用H2O(50mL)、盐水(50mL)洗涤，用Na2SO4干燥并且浓缩。不经进一步纯化，将褐色固体5(0.61g)用于下一步骤。
实例5.制备化合物6
在65℃，将1,2-二氯苯(6mL)中的化合物5(0.61g，2.8mmol)和1,3-丙磺酸内酯(2g，16.8mmol)的混合物加热3小时。将该混合物添加至醚(50mL)，并且经过滤收集沉淀，以给出化合物6(0.8g)，为一种褐色固体。不经进一步纯化，将褐色固体化合物6用于下一步骤。
实例6.制备化合物7
在室温下，向在MeOH中的化合物6(0.8g，2.4mmol)的溶液(15mL)中滴加1N NaOH溶液(5mL)。1小时后，在室温下，添加1N HCl(6mL)，使得pH＝2.0。用HPLC纯化该混合物，以给出化合物7(0.52g)，为一种浅褐色固体。
实例7.制备化合物8
在0℃，向在DMF(8mL)和吡啶(4mL)中的化合物7(1.21g，2.75mmol)的溶液中添加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(0.633g，3.3mmol)。15min后，在0℃，添加N,O-二甲基羟胺盐酸化物(0.32g，3.3mmol)。2小时后，在室温下，将该混合物添加至二***(50mL)，并且经过滤收集沉淀。用HPLC纯化粗材料，以给出化合物8(1.12g)，为一种浅褐色固体。
实例8.制备化合物10
向在乙酸酐(10mL)和乙酸(5mL)中的化合物9(1.38g，2.32mmol，陕西真迪化学生物有限公司(Shaanxi Zhendi Chemical Biology Co.,Ltd))的溶液中，添加丙二醛二苯胺盐酸盐(0.69g，2.66mmol)。30分钟后，在115℃，将该混合物添加至EtOAc(50mL)，并且经过滤收集沉淀，用EtOAc(50mL)洗涤。不经进一步纯化，将红色固体化合物10(1.51g)用于下一步骤。
实例9.制备化合物11
向在DMF中的化合物10(1.51g，2.32mmol)和化合物8(1.12g，2.32mmol)的混合物(12mL)中添加乙酸酐(1.05mL，11.1mmol)，随后添加三乙胺(2.58mL，18.6mmol)。12小时后，在室温下，在二***(200ml)中沉淀粗化合物11，过滤并且干燥。在H2O(50mL)中溶解残余物，并且在室温下搅拌6小时。用HPLC纯化该混合物，以给出化合物11(0.95g)，为一种深红色固体。
实例10.制备化合物12
向在DMF中的化合物11(100mg，0.1mmol)的溶液(4mL)中添加O-(N-琥珀酰亚胺基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(35mg，0.12mmol)，随后添加三乙胺(0.3mL)。在室温下搅拌该混合物1小时。将该溶液倒入EtOAc(15mL)中。离心该固体，并且用EtOAc(3x10mL)、醚(1x10mL)洗涤，并且在真空下干燥，以给出化合物12，为一种浅蓝色粉末(110mg)。
实例11.制备化合物14
如在BIOCONJUGATE CHEM.(生物共轭化学)105-111(1993)和356-362(1996)中描述，从在120℃，在二氯苯中的1,1,2-三甲基苯并吲哚鎓(trimethylbenzindolenium)-6,8-二磺酸的钾盐(5.0g，0.011mol)和6-溴己酸(5.3g，0.027mol)的过夜反应随后是处理程序来制备希望的吲哚鎓14。
实例12.制备化合物15
利用如美国专利7,465,810中描述的程序，类似地，从4-磺苯基肼与7-甲基-8-氧代-壬酸的费希尔(Fisher)反应随后用1,3-丙磺酸内酯进行季铵化来合成化合物15。
实例13.制备化合物16
利用如美国专利7,465,810中描述的程序，类似地，从6-肼基萘1,3-二磺酸盐与7-甲基-8-氧代-壬酸的反应随后用1,3-丙磺酸内酯进行季铵化来合成化合物16。
实例14.制备化合物17
类似地，根据化合物8的程序，从化合物6与O-羧甲基羟胺的反应合成化合物17。
实例15.制备化合物18
类似地，根据化合物10的程序，从化合物13与丙二醛二苯胺盐酸盐的反应合成希望的亚胺18。
实例16.制备化合物19
如在BIOCONJUGATE CHEM.(生物共轭化学)105-111(1993)和356-362(1996)中描述，从1,1,2-三甲基吲哚鎓-5-磺酸的钾盐和1,3-丙磺酸内酯的反应制备希望的吲哚鎓19。
实例17.制备化合物20
类似地，根据化合物10的程序，从化合物19与丙二醛二苯胺盐酸盐的反应合成希望的亚胺20。
实例18.制备化合物21
类似地，根据化合物11的程序，从化合物20与化合物17的缩合制备花菁21。
实例19.制备化合物22
类似地，根据化合物12的程序，从化合物21制备花菁22。
实例20.制备化合物23
类似地，根据化合物11的程序，从化合物18与化合物8的缩合制备花菁23。
实例21.制备化合物24
类似地，根据化合物12的程序，从化合物23制备花菁24。
实例22.制备化合物25
在120℃，将乙酸中的化合物17(100mg，0.25mmol)和丙二醛双(苯亚胺)单盐酸盐(27mg，0.1mmol)的溶液(0.5mL)和乙酸酐(0.5mL)加热1小时，随后添加NaOAc(50mg)。通过甲醇中的吸收光谱监测反应的完成。加热反应混合物，直至右戊酯(anyl)中间体消失(通过吸收光谱监测)。冷却反应混合物，并且倒入乙酸乙酯中(50mL)。通过离心收集粗产物，并且用乙酸乙酯洗涤两次。制备型HPLC纯化给出化合物25，为一种浅蓝色粉末(90mg)。
实例23.制备化合物26
类似地，根据化合物12的程序，从化合物25制备花菁26。
实例24.制备化合物27
将1-丁醇(48mL)和苯(12mL)中的化合物8(370mg，1mmol)和2-氯代-1-甲酰基-3-(羟基亚甲基)环己-1-烯(70mg，0.4mmol)的溶液加热至回流持续2小时。向该反应混合物添加1-丁醇(7mL)和苯(3mL)。继续回流该混合物持续10小时，其中用Dean(迪恩)-Stark(斯塔克)冷凝器除去水。除去溶剂后，用制备型HPLC纯化残余物，以给出化合物27。
实例25.制备化合物28
根据N.Narayanan(纳拉亚南)和G.Patonary(帕托纳里)的程序(J.ORG.CHEM.(有机化学杂志)，60,2391(1995))，用DMF中的4-羟基苯甲酸和氢化钠将化合物27(90mg)转化为化合物28。制备型HPLC纯化给出纯的化合物28(80mg)。
实例26.制备化合物29
类似地，根据化合物12的程序，从化合物28制备花菁29。
实例27.制备化合物31
类似地，根据化合物10的程序，从化合物30(陕西真迪化学生物有限公司(ShaanxiZhendi Chemical Biology Co.,Ltd))制备亚胺31。
实例28.制备化合物32
类似地，根据化合物11的程序，通过化合物31(陕西真迪化学生物有限公司(Shaanxi Zhendi Chemical Biology Co.,Ltd))与化合物8的反应制备花菁32。
实例29.制备化合物33
类似地，根据化合物12的程序，将花菁32转化为它的活性酯33。
实例30.制备化合物34
在室温下，向在DMF(0.2ml)中的化合物33(10mg)添加4当量的三乙胺和1.2当量的N-(2-氨乙基)马来酰亚胺，三氟乙酸盐(Sigma-Aldrich(西格玛奥瑞奇集团))。在环境温度下搅拌该混合物60分钟。将DMF溶液倒入醚中，将生成的悬浮液离心，以收集风干的固体。用硅胶色谱法进一步纯化粗产物，以生成希望的化合物34。
实例31.制备化合物35
在室温下，向肼(在1ml水中100mg)添加在DMF(0.2ml)中的化合物33(50mg)。在环境温度下搅拌该混合物60分钟。将DMF溶液倒入水中，将生成的悬浮液离心，以收集风干的固体。用HPLC进一步纯化粗产物，以生成希望的化合物35。
实例32.制备蛋白-染料共轭物
可以使用任何方便的方法制备蛋白-染料共轭物，例如，在以下文献中描述的那些，例如Haugland(豪格兰)等人1995，Meth.Mol.Biol.(分子生物学方法)45:205；Haugland(豪格兰)，1995，Meth.Mol.Biol.(分子生物学方法)45:223；Haugland(豪格兰)，1995，Meth.Mol.Biol.(分子生物学方法)45:235；Haugland(豪格兰)，2000，Current Protocolsin Cell Biology(细胞生物学实验室指南)16.5.1-16.5.22。例如，如以下，可以使用主题琥珀酰亚胺基酯制备蛋白-染料共轭物。
在0.1M碳酸氢钠中，按约10mg/mL制备蛋白的溶液。在适合的溶剂，例如水，或DMF或DMSO中，按约10mg/mL溶解标记试剂。在搅拌下，将预定量的标记溶剂添加至蛋白溶液。在室温下孵育反应混合物一小时或在冰上孵育若干小时。典型地，用尺寸排阻色谱法，例如在用磷酸盐缓冲盐水(PBS)平衡的Amersham(安玛西亚)PD-10树脂(GE Healthcare Bio-Sciences Corp.(通用电气医疗生物科学有限公司)，Piscataway(皮斯卡塔韦)，新泽西州)上，将染料-蛋白共轭物与游离的未反应的试剂分离。收集初始含蛋白着色带，并且使用游离荧光团的消光系数，在每个荧光团的吸收最大值处，从吸光度确定取代度。任选地，将由此获得的染料-蛋白共轭物细分级，以生成具有更高的、更低的或更均匀的DOS的共轭物。
对于很多应用而言，例如生产染料标记的抗体，使用10至50当量的染料比1当量的蛋白的摩尔比。将理解，可以经验性地确定最适的反应条件和反应物浓度。染料-蛋白共轭的优化是本领域熟知的，并且例如描述于在此引用的参考文献中。
实例33.制备抗体-染料共轭物
IgG抗体的染料共轭物如以下指出，以小的变化，使用以下一般实验方案制备化合物12、22、26、29、40、48、49和50的染料共轭物。
步骤1制备蛋白溶液：混合50μL的1M NaHCO3与450μL的IgG蛋白溶液(4mg/mL)，以获得0.5mL蛋白样品溶液(溶液A)。生成的溶液应具有pH 8.5±0.5。
步骤2制备染料溶液：向50μL的DMSO添加1mg的染料化合物，并且搅拌直至化合物完全溶解，以获得染料溶液(溶液B)。
步骤3进行共轭反应：在有效搅拌或摇荡下，添加蛋白溶液(A)至染料溶液(B)，并且保持反应混合物搅拌或摇荡持续1-3hr，以获得蛋白-染料共轭物。
步骤4纯化共轭物：
a)就在预填柱中的液体刚流动至低于上表面时，用蛋白-染料共轭物反应混合物(来自步骤3，必要时进行过滤)或上清液装载PD-10柱(Amersham Biosciences(安玛西亚生物科学公司)，Piscataway(皮斯卡塔韦)，新泽西州)；
b)就在样品刚流动至低于树脂上表面时，添加1mL的1X PBS洗脱缓冲液；重复这一‘样品洗涤’过程两次；添加更多1X洗脱缓冲溶液以洗脱希望的样品；
c)收集通常是希望的标记的蛋白的更快流动的带。保持通常是游离的或水解的染料的更慢流动的带，直至鉴定了希望的产物。
步骤5表征希望的染料-蛋白共轭物：
a)在蛋白的最大吸收波长(它是280nm)处，并且在染料的最大吸收波长处测量OD(吸光度)。对于多数分光光度计而言，需要用去离子水稀释样品(来自柱级分)，这样使得OD值是在从0.1至0.9的范围内。化合物12酰胺的最大吸收波长是约683nm。用于与其他染料化合物一起使用，应在共轭之前测量染料的最大吸收波长。
b)使用针对化合物12的以下等式计算取代度(DOS)。
DOS＝[染料]/[蛋白]＝A683×εp/250000(A280-0.035A683)
其中[染料]是染料浓度并且[蛋白]是蛋白浓度。可以容易地从比尔-朗伯定律(Beer-Lambert Law)计算染料浓度：A＝ε染料C×L，其中A是吸光度，ε染料是摩尔消光系数，C是浓度，并且L是穿过溶液的光路的长度。如果共轭效率足够高(优选>70％)，可以用重量(添加至该反应的)估算蛋白浓度，抑或更准确地，用比尔-朗伯定律进行计算：A＝ε蛋白C×L。例如，IgG具有203,000cm-1M-1的ε值。应注意，为获得准确的DOS，共轭物应不含有非共轭的染料。
为了有效标记，对于多数抗体而言，取代度应落在3-20摩尔的化合物12比一摩尔的抗体之间。提供最适标记的DOS将取决于抗体，并且在一些情况下，更高的DOS可以提供改进的标记。通过在一个范围的DOS上制备染料共轭物并且比较测量的荧光强度，经验性地确定最适标记。在附图中示出了多个实例。
实例34.制备高碘酸氧化的糖蛋白的染料共轭物
在冰上，用2.1mg的偏高碘酸钠处理在1mL的0.1M乙酸钠、0.135M NaCl、pH 5.5中的5mg的山羊IgG抗体(该抗体具有附接至该蛋白的多糖链)的样品，持续实验地确定的一个时段，该时段足以生成希望量的糖蛋白上的醛基，然后使它与化合物35进行反应。通过添加30μL的乙二醇来停止反应。在填充了PBS pH 7.2的Sephadex G25柱上纯化抗体。添加十分之一体积的1M碳酸氢钠来升高pH，并且按50:1的染料与蛋白的摩尔比添加化合物35。在室温下，搅拌该反应，持续实验地确定的一个时段，该时段足以生成希望的染料/蛋白比。添加氰基硼氢化钠至10mM的终浓度，并且在室温下搅拌该反应4小时。如在此描述，通过透析并且在Sephadex G25柱上纯化抗体共轭物。通过改适如在Estep(埃斯特波)和Miller(米勒)，1986，Anal.Biochem.(分析生物化学)157:100-105中描述方法，在凝胶中和在印迹上的高碘酸氧化的糖蛋白也可以被标记，将该文献的披露内容通过引用结合再其次。
实例35.使用硫醇反应性染料制备蛋白-染料共轭物
在PBS中制备β-半乳糖苷酶(富含游离硫醇基团的一种蛋白)的溶液(在400μL中2.0mg)。然后用DMF中的马来酰亚胺衍生化合物34的10mg/L溶液处理蛋白溶液。在旋转柱上除去未反应的染料。如在实例33中描述，使用游离染料的消光系数估算染料的取代度。从在280nm的吸光度估算蛋白浓度，针对在该波长的化合物34的吸光度进行矫正。
实例36.制备氨基葡聚糖-染料共轭物
作为举例，使用具有平均13个氨基的衍生化的70,000MW氨基葡聚糖(50mg)，如以下描述，制备氨基葡聚糖-染料共轭物。在0.1M NaHCO3中，以10mg/mL溶解氨基葡聚糖(50mg)。添加化合物12、22、26、29、40、48、49或50，以便给出约10-15的染料/葡聚糖比。在6-12小时后，在SEPHADEX G-50上纯化生成的共轭物，并且用水进行洗脱。在一些情况下，6-10摩尔的染料被共轭至70,000MW的葡聚糖。
实例37.制备染料标记的微球
可以使用任何方便的实验方案，用主题染料标记微球。化学改性以具有多种官能团(例如氨基、羧基或醛)的微球可以通过用如在表1中列举的对应反应性染料共价地共轭表面基团而进行表面标记。例如，通过琥珀酰亚胺基酯将胺改性的微球容易地共轭至本发明的染料，例如化合物12、22、26、29、40、48、49或50。
可以使用乙基3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDAC)，通过它的胺残基，将如以上所述制备的染料标记蛋白共价偶联至微球上的羧酸基团。可替代地，染料标记蛋白可以被动地吸附到微球上。例如，将羧酸改性的微球悬浮在染料标记蛋白溶液中，该蛋白被允许被动地吸附到微球上，并且通过离心和洗涤除去过量蛋白。通过借助具有高MW截留的半透膜的透析，或通过凝胶过滤色谱法，从过量蛋白中分离具有不能被离心的大小的微粒。如以上所述，用共轭至主题染料的链亲和素、亲和素或抗生物处理生物素酰化的微球。
实例38.制备核苷酸-染料共轭物
可以使用任何方便的程序，例如在M.Nimmakayalu(尼玛卡亚鲁)等人，2000，Biotechniques(生物技术)28,518-522；Muhlegger(穆勒格尔)等人，1990，Biol ChemHoppe Seyler(霍佩-赛勒生物化学)371,953-965；和Giaid(盖德)等人，1989，Histochemistry(组织化学)93,191-196中描述的那些，容易地制备与主题染料共轭的核苷酸，以上文献的披露内容都通过引用结合在此。以下描述了具体共轭的实例。
向在100μl水中的2mg的5-(3-氨基烯丙基)-2'-脱氧尿苷5'-三磷酸盐(Sigma-Aldrich(西格玛奥瑞奇集团))中添加在100μL DMF和5μL三乙胺中的化合物12、22、26、29、40、48、49或50。3小时后，蒸发溶液并且用HPLC纯化残余物。将产物级分冻干，以给出荧光核苷酸共轭物。
可替代地，从5-(3-氨基-1-丙炔基)-2'-脱氧尿苷5'-三磷酸盐，或通过用本发明的硫醇反应性染料(例如马来酰亚胺化合物34)处理硫醇化的核苷酸或硫代磷酸核苷酸，制备脱氧尿苷5'-三磷酸盐的荧光染料共轭物。
可替代地，在用乙醇沉淀后，2'-(或3')-2-氨基乙基氨基羰基腺苷5'-三磷酸盐与略过量的化合物12、22、26、29、40、48、49或50反应，用制备型HPLC纯化核糖改性的产物。
实例39.制备寡核苷酸-染料共轭物
将5'-胺改性的18碱基M13引物序列(约100μg)溶解在4μl水中。向该溶液添加在100μl的0.1M硼酸钠，pH 8.5中的250μg的化合物12、22、26、29、40、48、49或50。16小时后，添加10μl的5M NaCl和3体积的冷乙醇。将混合物冷却至-20℃离心，轻轻滗析上清液，用乙醇清洗沉淀物，并且然后将沉淀物溶解在100μL水中。用HPLC纯化标记的寡核苷酸。收集希望的峰并且蒸发，以给出荧光寡核苷酸-染料共轭物。
实例40.使用染料-抗体共轭物，用流式细胞术进行细胞分析
对于用流式细胞术分析血液细胞(例如在全血样品中)，共轭至主题染料化合物的分析物特异性抗体(即标记的抗体)是有用的。标记的抗体可以用于标记(染色)细胞蛋白，并且使用流式细胞仪检测标记的细胞。
在黑暗中，按每0.1ml的血液1μg或更小的染料共轭物浓度，用抗体-染料共轭物染色全血的样品(100μL)(优选收集在EDTA中)。染色后，将2mL的1X FACSTM裂解溶液(BDBioscience(BD生物科学公司)，圣何塞，加利福尼亚州)添加至样品，在涡旋混合器上按中速混合样品，并且在室温孵育10min。在200-500g(优选是200-300)将样品离心5分钟，并且轻轻滗析上清液。洗涤样品(在2mL的0.5％BSA/PBS洗涤缓冲液中再悬浮，混合，并且离心)两次，在0.5mL的洗涤缓冲液抑或150μl的固定稳定缓冲液(Fixation StabilizationBuffer)中再悬浮，并且保持在4℃，直至进行流式细胞分析。
使用装备有红色(大约640nm)激光器的BD Canto II流式细胞仪器(BDBioscience(BD生物科学公司)，圣何塞，加利福尼亚州)进行染色细胞的分析。将染料化合物(例如化合物12和48)合并至APC的荧光生物聚合物显示出接近匹配红色激光器的640nm发射的激发最大值，并且在710/20nm检测通道中测量来自生物聚合物的发射。按照制造商的说明书设置流式细胞仪。根据制造商的实验方案进行染色细胞的样品的流式细胞分析，并且使用本领域熟知的标准技术分析数据，以获得针对感兴趣的细胞群的中位荧光强度。
将理解，使用的具体抗体共轭物和使用的特定反应组分和使用的具体反应条件会对所得结果产生影响。可以进行常规实验以确定优选的反应组分，例如缓冲液或裂解溶液，和反应条件，包括染色时间和温度。测定条件的此类常规优化是基于免疫染色的测定领域中的标准规程。
实例41.抗-CD8、CD19和CD20抗体的染料共轭物
使用特异性针对CD8和CD20(BD Bioscience(BD生物科学公司)，圣何塞，加利福尼亚州)的抗体制备染料共轭物，在分开的制备中，每一种都以一个范围的染料-蛋白比共轭至化合物12和48。基本上如在以上实例40中描述，制备细胞染色。基本上如在以上实例40中描述，CD8、CD19和CD20抗体的抗体共轭物被用于分析全血样品中的淋巴细胞。
数据表明了针对每个抗体-染料对的最适染料-蛋白比。对于每种抗体，针对三种染料中的每一种的最适染料-蛋白比以类似的比率出现。比较共轭至同一染料的不同抗体，最适染料-蛋白比是显著不同的。如在图8中所见(CD8)，比较使用每种染料化合物获得的最大荧光染色，与光谱上类似的Alexa700的效果相比，化合物12和48产生了更好的荧光染色。
图8.观察到用化合物12和48标记的CD8的染料-抗体共轭物提供了供用于流式细胞免疫荧光测定的淋巴细胞群的充分标记，其优于产生自光谱上等价的Alexa700的标记。
结果表明，在制备用于通过流式细胞术分析的免疫荧光测定的抗原特异性检测试剂方面，本发明的所有染料共轭物都是有用的。总的来说，针对每种待标记的抗体，经验性地确定最适染料-蛋白比。
图9.观察到用化合物12标记的CD20的染料-抗体共轭物提供了供用于流式细胞免疫荧光测定的淋巴细胞群的充分标记，其优于产生自光谱上等价的APC-H7的标记。
实例42.抗CD8和CD19抗体的染料串联共轭物
使用特异性针对CD8(来自BD Bioscience(BD生物科学公司)，圣何塞，加利福尼亚州的克隆SK1)的、特异性针对化合物12的抗体制备染料-APC串联共轭物，基本上如在以下文献中描述(Stryer(斯特莱尔)等人的美国专利5,055,556；和Clin.Chem(临床化学)2004，50:1921-1929)。基本上如在以上实例40中描述，CD8抗体的抗体共轭物被用于分析全血样品中的淋巴细胞。如在图10(CD8)和图11(CD19)中所见，比较使用每种染料化合物获得的最大荧光染色，与光谱上类似的Alexa700的效果相比，APC-化合物12串联共轭物产生了更好的荧光染色。
观察到用APC-化合物12标记的CD8的串联染料-抗体共轭物提供了供用于流式细胞免疫荧光测定的淋巴细胞群的充分标记，其优于产生自光谱上等价的APC-Alexa700和APC-Cy5.5的标记(参见图10)。
观察到用化合物12串联物标记的CD19的染料-抗体共轭物提供了供用于流式细胞免疫荧光测定的淋巴细胞群的充分标记，其优于产生自CD19抗体标记的Alexa700的标记(参见图11)。
实例43.光稳定性测试
以1μM浓度的化合物12、48和55以及可商购的Alexa Fluor 700进行光漂白实验。在PBS(H 7.0)中，用100W水银灯照射这两种化合物，其中所有染料都接受相同量的如通过光度计测量所确定的照射。如在图3中所示，与Alexa Fluor 700相比，本发明的化合物12、48和55显示出远远更高的光稳定性(远远更慢的光漂白速度)。测试它们的APC串联物(如在Stryer(斯特莱尔)等人的美国专利5,055,556；和Clin.Chem(临床化学)2004,50:1921-1929中描述而制备)的光稳定性。如在图4中所示，与光谱上类似的Alexa Fluor 700的效果相比，本发明的化合物12、48、50、53的APC串联物显示出远远更高的光稳定性(远远更慢的光漂白速度)。
虽然有附加条款，但是还通过以下条款限定了在此列出的披露内容：
1.一种5-异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁染料化合物，包括经由二价聚甲炔连接基团连接至5-元杂环的5-异羟肟酸-氮杂吲哚啉基团，其中该5-异羟肟酸-氮杂吲哚啉基团、该二价聚甲炔连接基团和该5元杂环中的一个或多个被反应性基团部分(RGM)取代。
2.根据条款1所述的化合物，其中该化合物具有为600nm或更大的吸光度最大值。
3.根据条款1所述的化合物，其中该化合物具有为700nm或更大的发射最大值。
4.根据条款1所述的化合物，其中该化合物是光稳定的。
5.根据条款1所述的化合物，其中该化合物是由式I所描述：
其中：
环B表示对于形成含氮五元杂环所必需的原子并且进一步包括零至三个稠合的芳香族环；其中该五元杂环和该零至三个稠合的芳香族环的每个原子独立地选自下组，该组由以下各项组成：C、CH、C(烷基)、C(芳基)、O、S、N、N(芳基)和N(烷基)，并且该五元杂环和该零至三个芳香族环任选地被选自下组的一个或多个取代基取代，该组由以下各项组成：氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、羰基、氨基、硫醇、磺酸盐、膦酰基、和L-RGM；
n是0至3；
R1–R3各自独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、羧烷基、膦酰基烷基、磺酰基烷基、或L-RGM；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、羧烷基、膦酰基烷基、磺烷基、或L-RGM；
R6和R7各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、膦酰基烷基、磺烷基、或L-RGM；
R8和R9各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、羰基、氨基、硫醇、磺酸盐、膦酰基、或L-RGM；
R10和R11各自独立地是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、膦酰基烷基、磺烷基、或L-RGM；
RGM是化学反应性基团；并且
L是接头。
6.根据条款5所述的化合物，其中该化合物是由式II所描述：
其中：
n是0至3；
R1–R3各自独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、羧烷基、膦酰基烷基、磺酰基烷基、或L-RGM；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、芳烷基、羧烷基、膦酰基烷基、磺烷基、或L-RGM；
R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-RGM；
R8、R9和R17–R20各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、羰基、氨基、硫醇、磺酸盐、膦酰基、或L-RGM；
R10和R11各自独立地是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、膦酰基烷基、磺烷基、或L-RGM；
RGM是化学反应性基团；
L是接头；并且
任选地，R4和R5、R6和R7、R5和R9、R15和R16、R4和R20、R4和R6/R7、或R6/R7和R15/R16中的一个或多个按组合而取，以形成5–至50–元环。
7.根据条款6所述的化合物，其中：
R1–R3各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、烷氨基、芳氨基、硫代烷基、硫代芳基、芳氧基、或L-RGM；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM；
R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-RGM；
R8、R9和R17–R20各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、卤素、磺酸盐、或L-RGM；
R10和R11各自独立地是烷基、芳基、芳烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM；
8.根据条款6所述的化合物，其中：
R1–R3各自是氢；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM；
R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-RGM；
R8、R9和R17–R20各自独立地是氢、卤素、磺酸盐、或L-RGM；并且
R10和R11各自独立地是烷基、或L-RGM。
9.根据条款6所述的化合物，其中：
R1–R3各自是氢；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM；
R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-RGM；
R8、R9、R17、R19和R20各自是氢；
R18是磺酸盐；并且
R10和R11各自独立地是烷基、或L-RGM。
10.根据条款6所述的化合物，其中L是无、烷基、烷氧基、硫代烷基、氨基酸、磺基氨基酸、多胺、聚乙二醇、芳基、芳烷基、杂芳基烷基、或杂芳基。
11.根据条款6所述的化合物，其中L是无、烷基、或聚乙二醇。
12.根据条款6所述的化合物，其中RGM是丙烯酰胺、胺、羧酸、羧酸的活化酯、酰叠氮、酰基腈、醛、卤代烷、酸酐、芳基卤、叠氮化物、吖丙啶、硼酸盐、重氮烷、卤代乙酰胺、卤代三嗪、肼、羟胺、亚胺基酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、反应性铂复合物、磺酰卤或补骨脂内酯衍生物。
13.根据条款6所述的化合物，其中RGM是琥珀酰亚胺基酯、或马来酰亚胺。
14.根据条款5所述的化合物，其中该化合物是由式III所描述：
其中：
n是0至3；
R1–R3各自独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、羧烷基、膦酰基烷基、磺酰基烷基、或L-RGM；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、羧烷基、膦酰基烷基、磺酰基烷基、或L-RGM；
R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、膦酰基烷基、磺酰基烷基、或L-RGM；
R8、R9和R17–R22各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、羰基、氨基、硫醇、磺酸盐、膦酰基、或L-RGM；R10和R11是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM；
RGM是化学反应性基团；
L是接头；并且
任选地，R4和R5、R6和R7、R5和R9、R15和R16、R4和R22、R4和R6/R7、或R6/R7和R15/R16中的一个或多个按组合而取，以形成5–至50–元环。
15.根据条款5所述的化合物，其中该化合物是由式IV所描述：
其中：
n是0至3；
R1–R3各自独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、羧烷基、膦酰基烷基、磺酰基烷基、或L-RGM；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、羧烷基、磺烷基、膦酰基烷基、或L-RGM；
R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、膦酰基烷基、磺烷基、或L-RGM；
R8、R9和R17–R22各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、羰基、氨基、硫醇、磺酸盐、膦酰基、或L-RGM；R10和R11是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、膦酰基烷基、磺烷基、或L-RGM；
RGM是化学反应性基团；
L是接头；并且
任选地，R4和R5、R6和R7、R5和R9、R15和R16、R4和R18、R4和R6/R7、或R6/R7和R15/R16中的一个或多个按组合而取，以形成5–至50–元环。
16.根据条款5所述的化合物，其中该化合物是由式V所描述：
其中：
n是0至3；
R1–R3各自独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、羧烷基、膦酰基烷基、磺酰基烷基、或L-RGM；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、羧烷基、膦酰基烷基、磺酰基烷基、或L-RGM；
R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、膦酰基烷基、磺烷基、或L-RGM；
R8、R9和R17–R22各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、羰基、氨基、硫醇、磺酸盐、膦酰基、或L-RGM；
R10和R11各自独立地是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、磺烷基、膦酰基烷基、或L-RGM；
RGM是化学反应性基团；
L是接头；并且
任选地，R6和R7、R5和R9、R15和R16、R4和R18、R4和R6/R7、或R6/R7和R15/R16中的一个或多个按组合而取，以形成5–至50–元环。
17.根据条款16所述的化合物，其中：
R1–R3各自独立地是氢、或L-RGM；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM；
R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-RGM；
R8、R9和R17–R22各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、磺酸盐、或L-RGM；并且
R10和R11各自独立地是烷基、羧烷基、或L-RGM。
18.根据条款16所述的化合物，其中：
R1–R3各自是氢；
R4和R5独立地是具有1-20个碳的烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM；
R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-RGM；
R8、R9和R17–R22各自独立地是氢或磺酸盐；并且
R10和R11各自独立地是烷基、或L-RGM。
19.根据条款16所述的化合物，其中L是无、烷基、聚乙二醇、烷氧基、硫代烷基、氨基酸、磺基氨基酸、多胺、聚乙二醇、芳基、芳烷基、杂芳基烷基、或杂芳基。
20.根据条款16所述的化合物，其中L是无、烷基、或聚乙二醇。
21.根据条款16所述的化合物，其中RGM是丙烯酰胺、胺、羧酸、羧酸的活化酯、酰叠氮、酰基腈、醛、卤代烷、酸酐、芳基卤、叠氮化物、吖丙啶、硼酸盐、重氮烷、卤代乙酰胺、卤代三嗪、肼、羟胺、亚胺基酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、反应性铂复合物、磺酰卤或补骨脂内酯衍生物。
22.根据条款16所述的化合物，其中RGM是琥珀酰亚胺基酯、或马来酰亚胺。
23.根据条款5所述的化合物，其中该化合物是由式VI所描述：
其中：
n是0至3；
R1–R3各自独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、羧烷基、或L-RGM；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM；
R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-RGM；
R8、R9、R17和R18各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、羰基、氨基、硫醇、磺酸盐、膦酰基、或L-RGM；
R10、R11、R20和R21各自独立地是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM；
RGM是化学反应性基团；
L是接头；并且
任选地，R4和R5、R6和R7、R5和R9、R15和R16、R4和R18、R4和R6/R7、或R6/R7和R15/R16中的一个或多个按组合而取，以形成5–至50–元环。
24.根据条款23所述的化合物，其中：
R1–R3各自独立地是氢、或L-RGM；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM；
R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-RGM；
R8、R9和R17–R22各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、磺酸盐、膦酰基或L-RGM；并且
R10和R11各自独立地是烷基、芳基、芳烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM。
25.根据条款23所述的化合物，其中：
R1–R3各自是氢；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM；
R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-RGM；
R8、R9、R17、和R18各自独立地是氢、或磺酸盐；并且
R10和R11各自独立地是烷基、或L-RGM。
26.根据条款23所述的化合物，其中L是无、烷基、聚乙二醇、烷氧基、硫代烷基、氨基酸、磺基氨基酸、多胺、聚乙二醇、芳基、芳烷基、杂芳基烷基、或杂芳基。
27.根据条款23所述的化合物，其中L是无、烷基、或聚乙二醇。
28.根据条款23所述的化合物，其中RGM是丙烯酰胺、胺、羧酸、羧酸的活化酯、酰叠氮、酰基腈、醛、卤代烷、酸酐、芳基卤、叠氮化物、吖丙啶、硼酸盐、重氮烷、卤代乙酰胺、卤代三嗪、肼、羟胺、亚胺基酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、反应性铂复合物、磺酰卤或补骨脂内酯衍生物。
29.根据条款23所述的化合物，其中RGM是琥珀酰亚胺基酯、或马来酰亚胺。
30.根据条款5所述的化合物，其中该化合物是由以下结构之一所描述：
31.一种5-异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁染料共轭物，包括经由二价聚甲炔连接基团连接至5-元杂环的5-异羟肟酸-氮杂吲哚啉基团，其中该5-异羟肟酸-氮杂吲哚啉基团、该二价聚甲炔连接基团和该5-元杂环中的一个或多个被共轭至底物。
32.根据条款31所述的染料共轭物，其中该染料共轭物是由式VII所描述：
其中：
环B表示对于形成含氮五元杂环所必需的原子并且进一步包括零至三个稠合的芳香族环；其中该五元杂环和该零至三个稠合的芳香族环的每个原子独立地选自下组，该组由以下各项组成：C、CH、C(烷基)、C(芳基)、O、S、N、N(芳基)和N(烷基)，并且该五元杂环和该零至三个芳香族环任选地被选自下组的一个或多个取代基取代，该组由以下各项组成：氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、磺酸盐、羰基、氨基、硫醇、膦酸盐、和L-底物；
n是0至3；
m是1至50；
R1–R3各自独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、羧烷基、或L-底物；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、羧烷基、或L-底物；
R6和R7各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、或L-底物；
R8和R9各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、磺酸盐、羰基、氨基、硫醇、膦酰基、或L-底物；
R10和R11各自独立地是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、或L-底物；
L是底物和染料之间的接头；并且
底物是生物分子。
33.根据条款32所述的染料共轭物，其中该染料共轭物是由式VIII所描述：
其中：
n是0至3；
m是1至50；
R1–R3各自独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、羧烷基、或L-底物；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、或L-底物；
R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、或L-底物；
R8、R9和R17–R20各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、磺酸盐、羰基、氨基、硫醇、膦酸盐、或L-底物；R10和R11是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、或L-底物；
L是底物和染料之间的接头；
底物是生物分子：小的生物活性配体、抑或生物聚合物；并且
任选地，R6和R7、R5和R9、R15和R16、R4和R20、R4和R6/R7、或R6/R7和R15/R16中的一个或多个按组合而取，以形成5–至50–元环。
34.根据条款33所述的染料共轭物，其中：
R1–R3各自是氢；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、羧烷基、磺烷基、或L-底物；
R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-底物；
R8、R9、R17、R19和R20各自是氢；
R18是磺基；并且
R10和R11各自独立地是烷基、或L-底物。
35.根据条款33所述的染料共轭物，其中L是无、烷基、烷氧基、硫代烷基、氨基酸、磺基氨基酸、多胺、聚乙二醇、芳基、芳烷基、杂芳基烷基、或杂芳基。
36.根据条款33所述的染料共轭物，其中L是无、烷基、或聚乙二醇。
37.根据条款33所述的染料共轭物，其中底物是一种抗体。
38.根据条款32所述的染料共轭物，其中该染料共轭物是由式IX所描述：
其中：
n是0至3；
m是1至50；
R1–R3各自独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、羧烷基、或L-底物；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、羧烷基、或L-底物；
R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、或L-底物；
R8、R9和R17–R22各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、磺酸盐、羰基、氨基、硫醇、磷酸盐、或L-底物；
R10和R11各自独立地是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、或L-底物；
L是底物和染料之间的接头；
底物是生物分子；并且
任选地，R4和R5、R6和R7、R5和R9、R15和R16、R4和R22、R4和R6/R7、或R6/R7和R15/R16中的一个或多个按组合而取，以形成5–至50–元环。
39.根据条款32所述的染料共轭物，其中该染料共轭物是由式X所描述：
其中：
n是0至3；
m是1至50；
R1–R3各自独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、羧烷基、或L-RGM；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、羧烷基、或L-底物；
R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、或L-底物；
R8、R9和R17–R22各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、磺酸盐、羰基、氨基、硫醇、磷酸盐、或L-底物；
R10和R11各自独立地是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、或L-底物；
L是底物和染料之间的接头；
底物是生物分子；并且
任选地，R4和R5、R6和R7、R5和R9、R15和R16、R4和R18、R4和R6/R7、或R6/R7和R15/R16中的一个或多个按组合而取，以形成5–至50–元环。
40.根据条款32所述的染料共轭物，其中该染料共轭物是由式XI所描述：
其中：
n是0至3；
m是1至50；
R1–R3各自独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、羧烷基、或L-底物；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、羧烷基、或L-底物；
R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、或L-底物；
R8、R9和R17–R22各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、磺酸盐、羰基、氨基、硫醇、磷酸盐、或L-底物；
R10和R11各自独立地是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、或L-底物；
L是底物和染料之间的接头；
底物是生物分子；并且
任选地，R4和R5、R6和R7、R5和R9、R15和R16、R4和R18、R4和R6/R7、或R6/R7和R15/R16中的一个或多个按组合而取，以形成5–至50–元环。
41.根据条款40所述的染料共轭物，其中：
R1–R3各自是氢；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、羧烷基、磺酰基烷基、或L-底物；
R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、羧烷基、羧基芳基、磺酰基烷基、或L-底物；
R8、R9和R17–R22各自独立地是氢、或硫酸盐；并且
R10和R11各自独立地是烷基、或L-底物。
42.根据条款40所述的染料共轭物，其中L是无、烷基、或聚乙二醇。
43.根据条款40所述的染料共轭物，其中底物是一种抗体。
44.根据条款32所述的染料共轭物，其中该染料共轭物是由式XII所描述：
其中：
n是0至3；
m是1至50；
R1–R3各自独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、羧烷基、或L-底物；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、羧烷基、或L-底物；
R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、或L-底物；
R8、R9、R17和R18各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、磺酸盐、羰基、氨基、硫醇、膦酸盐、或L-底物；
R10、R11、R20和R21各自独立地是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、或L-底物；
L是底物和染料之间的接头；
底物是生物分子；并且
任选地，R4和R5、R6和R7、R5和R9、R15和R16、R4和R18、R4和R6/R7、或R6/R7和R15/R16中的一个或多个按组合而取，以形成5–至50–元环。
45.根据条款44所述的染料共轭物，其中：
R1–R3各自是氢；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、羧烷基、磺烷基、或L-底物；
R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-底物；R8、R9、R17和R18是氢、或磺酸盐；R10和R11是烷基、或L-底物。
46.根据条款44所述的染料共轭物，其中L是无、烷基、聚乙二醇、烷氧基、硫代烷基、氨基酸、磺基氨基酸、多胺、聚乙二醇、芳基、芳烷基、杂芳基烷基、或杂芳基。
47.根据条款44所述的染料共轭物，其中L是无、烷基、或聚乙二醇。
48.根据条款44所述的染料共轭物，其中底物是一种抗体。
49.一种检测样品中的分析物的方法，该方法包括：
a)在包含由式VII所描述的染料共轭物的检测试剂与该分析物形成复合物的条件下，使该样品与该检测试剂接触；
其中：
环B表示对于形成含氮五元杂环所必需的原子并且进一步包括零至三个稠合的芳香族环；其中该五元杂环和该零至三个稠合的芳香族环的每个原子选自下组，该组由以下各项组成：C、CH、C(烷基)、C(芳基)、O、S、N、N(芳基)和N(烷基)，并且该五元杂环和该零至三个芳香族环任选地被选自下组的一个或多个取代基取代，该组由以下各项组成：氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、磺酸盐、羰基、氨基、硫醇、膦酰基、和L-底物；
n是0至3；
m是1至50；
R1–R3各自独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、羧烷基、或L-底物；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、羧烷基、或L-底物；
R6和R7各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、或L-底物；
R8和R9各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、磺酸盐、羰基、氨基、硫醇、膦酸盐、或L-底物；
R10和R11各自独立地是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、或L-底物；
L是底物和染料之间的接头；
b)通过荧光检测该复合物。
50.根据条款49所述的方法，其中该染料共轭物是由式VIII所描述：
其中：
n是0至3；
m是1至50；
R1–R3各自独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、羧烷基、或L-底物；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、或L-底物；
R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、或L-底物；
R8、R9和R17–R20各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、磺酸盐、羰基、氨基、硫醇、膦酸盐、或L-底物；
R10和R11各自独立地是烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、或L-底物；
L是底物和染料之间的接头；
底物是生物分子；并且
任选地，R4和R5、R6和R7、R5和R9、R15和R16、R4和R20、R4和R6/R7、或R6/R7和R15/R16中的一个或多个按组合而取，以形成5–至50–元环。
51.根据条款50所述的方法，其中：
R1–R3各自是氢；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、羧烷基、磺烷基、或L-底物；
R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-底物；
R8、R9、R17、R19和R20各自是氢；
R18是磺酸盐；并且
R10和R11各自独立地是烷基、或L-底物。
52.根据条款50所述的方法，其中L是无、烷基、烷氧基、硫代烷基、氨基酸、磺基氨基酸、多胺、聚乙二醇、芳基、芳烷基、杂芳基烷基、或杂芳基。
53.根据条款50所述的方法，其中L是无、烷基、或聚乙二醇。
54.根据条款50所述的方法，其中底物是一种抗体。
55.根据条款49所述的方法，其中该染料共轭物是由式IX所描述：
其中：
n是0至3；
m是1至50；
R1–R3各自独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、羧烷基、或L-底物；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、羧烷基、或L-底物；
R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、或L-底物；
R8、R9和R17–R22各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、磺酸盐、羰基、氨基、硫醇、磷酸盐、或L-底物；
R10和R11各自独立地是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、或L-底物；
L是底物和染料之间的接头；
底物是生物分子；并且
任选地，R4和R5、R6和R7、R5和R9、R15和R16、R4和R22、R4和R6/R7、或R6/R7和R15/R16中的一个或多个按组合而取，以形成5–至50–元环。
56.根据条款49所述的方法，其中该染料共轭物是由式X所描述：
其中：
n是0至3；
m是1至50；
R1–R3各自独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、羧烷基、或L-底物；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、羧烷基、或L-底物；
R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、或L-底物；
R8、R9和R17–R22各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、磺酸盐、羰基、氨基、硫醇、磷酸盐、或L-底物；
R10和R11各自是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、或L-底物；
L是底物和染料之间的接头；
底物是生物分子；并且
任选地，R4和R5、R6和R7、R5和R9、R15和R16、R4和R18、R4和R6/R7、或R6/R7和R15/R16中的一个或多个按组合而取，以形成5–至50–元环。
57.根据条款49所述的方法，其中该染料共轭物是由式XI所描述：
其中：
n是0至3；
m是1至50；
R1–R3各自独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、羧烷基、或L-底物；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、羧烷基、或L-底物；
R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、或L-底物；
R8、R9和R17–R22各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、磺酸盐、羰基、氨基、硫醇、磷酸盐、或L-底物；R10和R11是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、或L-底物；
L是底物和染料之间的接头；
底物是生物分子；并且
任选地，R4和R5、R6和R7、R5和R9、R15和R16、R4和R18、R4和R6/R7、或R6/R7和R15/R16中的一个或多个按组合而取，以形成5–至50–元环。
58.根据条款57所述的方法，其中：
R1–R3各自是氢；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、羧烷基、磺酰基烷基、或L-底物；
R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、羧烷基、羧基芳基、磺酰基烷基、或L-底物；
R8、R9和R17–R22各自独立地是氢、或磺酸盐；并且
R10和R11各自独立地是烷基、或L-底物。
59.根据条款57所述的方法，其中L是无、烷基、或聚乙二醇。
60.根据条款57所述的方法，其中底物是一种抗体。
61.根据条款49所述的方法，其中该染料共轭物是由式XII所描述：
其中：
n是0至3；
m是1至50；
R1–R3各自独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、羧烷基、或L-底物；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、羧烷基、或L-底物；
R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、或L-底物；
R8、R9、R17和R18各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、磺酸盐、羰基、氨基、硫醇、膦酸盐、或L-底物；
R10、R11、R20和R21各自独立地是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、或L-底物；
L是底物和染料之间的接头；
底物是生物分子；并且
任选地，R4和R5、R6和R7、R5和R9、R15和R16、R4和R18、R4和R6/R7、或R6/R7和R15/R16中的一个或多个按组合而取，以形成5–至50–元环。
62.根据条款61所述的方法，其中：
R1–R3各自是氢；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、羧烷基、磺烷基、或L-底物；
R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-底物；
R8、R9、R17和R18各自独立地是氢、或磺酸盐；并且
R10和R11各自独立地是烷基、或L-底物。
63.根据条款61所述的方法，其中L是无、烷基、烷氧基、硫代烷基、氨基酸、磺基氨基酸、多胺、聚乙二醇、芳基、芳烷基、杂芳基烷基、或杂芳基。
64.根据条款61所述的方法，其中L是无、烷基、或聚乙二醇。
65.根据条款61所述的方法，其中底物是一种抗体。
66.如条款49所述的方法，其中该检测试剂包括一种串联共轭物。
67.一种检测样品中的分析物的方法，该方法包括：
在足以将如条款1所述的5-异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁染料化合物共轭至该分析物并且产生标记的分析物共轭物的条件下，使该样品与该染料接触；并且
通过荧光检测该标记的分析物。
68.根据条款67所述的方法，进一步包括从该样品分离该标记的分析物。
69.一种试剂盒，包含：
根据条款1所述的5-异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁染料化合物；以及
一种或多种选自以下项的组分：染料共轭物、底物、分析物、细胞、支持物、特异性结合部分、缓冲液、试剂、光源和反应性染料化合物的使用说明书。
70.一种试剂盒，包含：
根据条款31所述的5-异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁染料共轭物；以及
一种或多种选自以下项的组分：染料化合物、底物、分析物、细胞、支持物、特异性结合部分、缓冲液、试剂、光源和染料共轭物的使用说明书。
71.根据条款70所述的试剂盒，其中该染料共轭物包括一种染料APC共轭物。
72.一种分析流体***，该***包括分析流体仪器和样品，其中该样品包括5-异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁染料。
73.根据条款72所述的分析流体***，其中该样品包括根据条款1所述的5-异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁染料。
74.根据条款72所述的分析流体***，其中该样品包括根据条款31所述的5-异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁染料共轭物。
75.根据条款72所述的分析流体***，其中该分析流体仪器包括一台流式细胞仪。
虽然上述发明已经通过说明和实例的方式出于清楚理解的目的在一些细节方面进行了描述，但是本领域技术人员根据本发明传授的内容很容易明白可以对其进行某些变化和修改而不偏离所附权利要求的精神或范围。
因此，前述内容仅说明本发明的原理。将理解的是本领域的技术人员将能够设计不同的安排，这些不同的安排虽然没有在此明确地描述或显示，但体现本发明的原理并且被包括在其精神和范围之内。另外，在此叙述的所有实例和条件性语言主要打算帮助读者理解诸位发明人所贡献的本发明的原理和概念以推动本领域发展，并且将被视为而不限于这些特别叙述的实例和条件。并且，引用本发明的原理、方面、以及实施例的所有在此的陈述连同其具体实例旨在涵盖其结构和功能等效物两者。另外，预期此类等效物包括当前已知的等效物以及有朝一日发展的等效物，即不论结构而执行相同功能的发展的任何要素。因此，本发明的范围不是旨在限制于在此显示和描述的示例性实施例。而本发明的范围和精神是通过所附权利要求书来体现。

Claims (22)

1.一种5-异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁染料化合物，包括经由二价聚甲炔连接基团连接至5-元杂环的5-异羟肟酸-氮杂吲哚啉基团，其中所述5-异羟肟酸-氮杂吲哚啉基团、所述二价聚甲炔连接基团和所述5-元杂环中的一个或多个被能够与不同化合物上的官能团化学反应以形成共价键的反应性基团部分取代。
2.根据权利要求1所述的染料化合物，其中所述染料化合物具有为600nm或更大的吸光度最大值。
3.根据权利要求1所述的染料化合物，其中所述染料化合物具有为700nm或更大的发射最大值。
4.根据权利要求1所述的染料化合物，其中所述染料化合物是光稳定的。
5.根据权利要求1所述的染料化合物，其中所述染料化合物是由式I所描述：
其中：
环B表示对于形成含氮五元杂环所必需的原子，所述五元杂环稠合至零至三个稠合的芳基的环或杂芳基的环；其中所述五元杂环的每个原子独立地选自下组，该组由以下各项组成：C、O、S和N，并且其中，所述五元杂环和所述零至三个稠合的芳基的环或杂芳基的环任选地被选自下组的一个或多个取代基取代，该组由以下各项组成：氢、具有1-20个碳的烷基、具有1-20个碳的烷氧基、和L-RGM；
n是1至3；
R1–R3各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、芳氨基、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、或L-RGM；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、或L-RGM；
R6和R7各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧基芳基、或L-RGM；
R8和R9各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、具有1-20个碳的烷氧基、或L-RGM；
R10和R11各自独立地是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、或L-RGM；
RGM选自于丙烯酰胺、胺、羧酸、羧酸的活化酯、酰基腈、醛、卤代烷、酸酐、芳基卤、叠氮化物、吖丙啶、硼酸盐、重氮烷、卤代乙酰胺、卤代三嗪、肼、羟胺、亚胺基酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、反应性铂复合物、磺酰卤或补骨脂内酯衍生物；并且
L是接头。
6.根据权利要求1所述的染料化合物，其中所述染料化合物是由式II所描述：
其中：
n是1至3；
R1–R3各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、芳氨基、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、膦酰基烷基、磺酰基烷基、或L-RGM；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、芳烷基、膦酰基烷基、磺烷基、或L-RGM；
R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-RGM；
R8、R9和R17–R20各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、甲硫基、磺酸根基团、膦酰基、或L-RGM；
R10和R11各自独立地是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、膦酰基烷基、磺烷基、或L-RGM；
RGM选自于丙烯酰胺、胺、羧酸、羧酸的活化酯、酰基腈、醛、卤代烷、酸酐、芳基卤、叠氮化物、吖丙啶、硼酸盐、重氮烷、卤代乙酰胺、卤代三嗪、肼、羟胺、亚胺基酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、反应性铂复合物、磺酰卤或补骨脂内酯衍生物；
L是接头；并且
任选地，R4和R5、R6和R7、R5和R9、R15和R16、R4和R20、R4和R6/R7、或R6/R7和R15/R16中的一个或多个按组合而取，以形成5–至50–元环。
7.根据权利要求1所述的染料化合物，其中所述染料化合物是由式III所描述：
其中：
n是1至3；
R1–R3各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、芳氨基、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、膦酰基烷基、磺酰基烷基、或L-RGM；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、膦酰基烷基、磺酰基烷基、或L-RGM；
R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧基芳基、膦酰基烷基、磺酰基烷基、或L-RGM；
R8、R9和R17–R22各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、甲硫基、磺酸根基团、膦酰基、或L-RGM；R10和R11是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、磺烷基、或L-RGM；
RGM选自于丙烯酰胺、胺、羧酸、羧酸的活化酯、酰基腈、醛、卤代烷、酸酐、芳基卤、叠氮化物、吖丙啶、硼酸盐、重氮烷、卤代乙酰胺、卤代三嗪、肼、羟胺、亚胺基酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、反应性铂复合物、磺酰卤或补骨脂内酯衍生物；
L是接头；并且
任选地，R4和R5、R6和R7、R5和R9、R15和R16、R4和R22、R4和R6/R7、或R6/R7和R15/R16中的一个或多个按组合而取，以形成5–至50–元环。
8.根据权利要求1所述的染料化合物，其中所述染料化合物是由式IV所描述：
其中：
n是1至3；
R1–R3各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、芳氨基、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、膦酰基烷基、磺酰基烷基、或L-RGM；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、磺烷基、膦酰基烷基、或L-RGM；
R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧基芳基、膦酰基烷基、磺烷基、或L-RGM；
R8、R9和R17–R22各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、甲硫基、磺酸根基团、膦酰基、或L-RGM；R10和R11是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、膦酰基烷基、磺烷基、或L-RGM；
RGM选自于丙烯酰胺、胺、羧酸、羧酸的活化酯、酰基腈、醛、卤代烷、酸酐、芳基卤、叠氮化物、吖丙啶、硼酸盐、重氮烷、卤代乙酰胺、卤代三嗪、肼、羟胺、亚胺基酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、反应性铂复合物、磺酰卤或补骨脂内酯衍生物；
L是接头；并且
任选地，R4和R5、R6和R7、R5和R9、R15和R16、R4和R18、R4和R6/R7、或R6/R7和R15/R16中的一个或多个按组合而取，以形成5–至50–元环。
9.根据权利要求1所述的染料化合物，其中所述染料化合物是由式V所描述：
其中：
n是1至3；
R1–R3各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、芳氨基、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、膦酰基烷基、磺酰基烷基、或L-RGM；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、膦酰基烷基、磺酰基烷基、或L-RGM；
R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧基芳基、膦酰基烷基、磺烷基、或L-RGM；
R8、R9和R17–R22各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、甲硫基、磺酸根基团、膦酰基、或L-RGM；
R10和R11各自独立地是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、磺烷基、膦酰基烷基、或L-RGM；
RGM选自于丙烯酰胺、胺、羧酸、羧酸的活化酯、酰基腈、醛、卤代烷、酸酐、芳基卤、叠氮化物、吖丙啶、硼酸盐、重氮烷、卤代乙酰胺、卤代三嗪、肼、羟胺、亚胺基酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、反应性铂复合物、磺酰卤或补骨脂内酯衍生物；
L是接头；并且
任选地，R6和R7、R5和R9、R15和R16、R4和R18、R4和R6/R7、或R6/R7和R15/R16中的一个或多个按组合而取，以形成5–至50–元环。
10.根据权利要求1所述的染料化合物，其中所述染料化合物是由式VI所描述：
其中：
n是1至3；
R1–R3各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、芳氨基、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、或L-RGM；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、磺烷基、或L-RGM；
R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-RGM；
R8、R9、R17和R18各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、甲硫基、磺酸根基团、膦酰基、或L-RGM；
R10、R11、R20和R21各自独立地是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、磺烷基、或L-RGM；
RGM选自于丙烯酰胺、胺、羧酸、羧酸的活化酯、酰基腈、醛、卤代烷、酸酐、芳基卤、叠氮化物、吖丙啶、硼酸盐、重氮烷、卤代乙酰胺、卤代三嗪、肼、羟胺、亚胺基酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、反应性铂复合物、磺酰卤或补骨脂内酯衍生物；
L是接头；并且
任选地，R4和R5、R6和R7、R5和R9、R15和R16、R4和R18、R4和R6/R7、或R6/R7和R15/R16中的一个或多个按组合而取，以形成5–至50–元环。
11.根据权利要求5所述的染料化合物，其中所述染料化合物是由以下结构之一所描述：
12.根据权利要求6-10中任一项所述的染料化合物，其中，所述RGM是酰叠氮。
13.一种5-异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁染料共轭物，包括
经由二价聚甲炔连接基团连接至5-元杂环的5-异羟肟酸-氮杂吲哚啉基团，以及
底物，所述底物为生物分子，
其中所述5-异羟肟酸-氮杂吲哚啉基团、所述二价聚甲炔连接基团和所述5-元杂环中的一个或多个被共轭至所述底物。
14.根据权利要求13所述的染料共轭物，其中所述染料共轭物是由式VII所描述：
其中：
环B表示对于形成含氮五元杂环所必需的原子，所述五元杂环稠合至零至三个稠合的芳基的环或杂芳基的环；其中所述五元杂环的每个原子独立地选自下组，该组由以下各项组成：C、O、S和N，并且其中，所述五元杂环和所述零至三个稠合的芳基的环或杂芳基的环任选地被选自下组的一个或多个取代基取代，该组由以下各项组成：氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、磺酸根基团、羰基、氨基、膦酸根基团、和L-底物；
n是1至3；
m是1至50；
R1–R3各自独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、羧烷基、或L-底物；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、羧烷基、或L-底物；
R6和R7各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、或L-底物；
R8和R9各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、磺酸根基团、羰基、氨基、膦酰基、或L-底物；
R10和R11各自独立地是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、或L-底物；
L是底物和染料之间的接头；并且
底物是生物分子。
15.一种检测样品中的分析物的方法，所述方法包括：
a)在包含由式VII所描述的染料共轭物的检测试剂与所述分析物形成复合物的条件下，使所述样品与所述检测试剂接触；
其中：
环B表示对于形成含氮五元杂环所必需的原子，所述五元杂环稠合至零至三个稠合的芳基的环或杂芳基的环；其中所述五元杂环的每个原子选自下组，该组由以下各项组成：C、O、S和N，并且其中，所述五元杂环和所述零至三个稠合的芳基的环或杂芳基的环任选地被选自下组的一个或多个取代基取代，该组由以下各项组成：氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、磺酸根基团、羰基、氨基、膦酸根基团、和L-底物；
n是1至3；
m是1至50；
R1–R3各自独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙二醇、烷氧基、芳氧基、羧烷基、或L-底物；
R4和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基烷基、羧烷基、或L-底物；
R6和R7各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、或L-底物；
R8和R9各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫基、磺酸根基团、羰基、氨基、膦酰基、或L-底物；
R10和R11各自独立地是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、或L-底物；
L是底物和染料之间的接头；并且
底物是生物分子；
b)通过荧光检测所述复合物。
16.一种检测样品中的分析物的方法，所述方法包括：
在足以将如权利要求1所述的5-异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁染料化合物共轭至所述分析物并且产生标记的分析物共轭物的条件下，使所述样品与所述染料化合物接触；并且
通过荧光检测所述标记的分析物。
17.根据权利要求16所述的方法，进一步包括从所述样品分离所述标记的分析物。
18.一种试剂盒，包含：
根据权利要求1所述的5-异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁染料化合物；以及
一种或多种选自以下项的组分：染料共轭物、分析物、支持物、特异性结合部分、缓冲液、光源和染料化合物的使用说明书。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中，所述分析物是细胞。
20.一种试剂盒，包含：
根据权利要求13所述的5-异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁染料共轭物；以及
一种或多种选自以下项的组分：染料化合物、分析物、支持物、特异性结合部分、缓冲液、光源和染料共轭物的使用说明书。
21.根据权利要求20所述的试剂盒，其中，所述分析物是细胞。
22.根据权利要求20或21所述的试剂盒，其中所述染料共轭物包括一种染料APC共轭物。
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