ITMI952049A1 - Coloranti fluorescenti della famiglia della solfo benz e indocianina - Google Patents
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Classifications
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Abstract
La presente invenzione riguarda coloranti fluorescenti e i loro tautomeri di valenza della formula (FORMULA I) in cui Q rappresenta una frazione coniugata atta a migliorare la resa quantica fluorescente e il comportamento di sintonizzazione di detto colorante; R1 è un gruppo funzionalizzato della formula -(CH2) JY in cui Y è scelto dal gruppo costituito da SO3H, COOH, NH2, CHO, NCS, epossido, ftalimido, e COOZ in cui Z rappresenta un gruppo residuo; R2 è un gruppo funzionalizzato avente la formula -(CH2) KY' in cui Y' è scelto dal gruppo sostituito da SO3H, COOH, NH2, CHO, NCS, epossido, ftalimido, e COOZ in cui Z rappresenta un gruppo rimovibile; M+ è un controione scelto dal gruppo costituito da ammonio, cationi di metalli alcalini e cationi di metalli alcalino terrosi; n = da 1 a 4; m = da 1 a 4; j = da 2 a 10 e k = da 2 a 10.
Description
DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo:
"COLORANTI FLUORESCENTI DELLA FAMIGLIA DELLA SOLFO BENZ[e]INDO-CIANINA"
TESTO DELLA DESCRIZIONE
La presente invenzione riguarda una nuova classe di coloranti fluorescenti, e suoi tautomeri di valenza appartenenti alla famiglia della solfo benz[e] indocianina . La presente invenzione riguarda pure la sintesi della nuova classe di coloranti fluorescenti appartenenti alla famiglia della solfo benz [e]indocianina. I nuovi coloranti fluorescenti possono essere eccitati impiegando diodi fotoemettitori e diodi laser potenti e al tempo stesso economici, essi presentano buona solubilità nell'acqua e possono essere fissati o coniugati ad un'ampia varietà di molecole o superiici per scopi di marcatura. I nuovi coloranti fluorescenti sono particolarmente utili in tecniche come immunoanalisi, sonde di DNA, cromatografia in fase liquida ad alta pressione (H.F.L.C), elettroforesi capillare, polarizzazione di fluorescenza, fluorescenza a riflessione interna totale (T.I.R.F), flusso-citometria, sequenziamento del DNA e sensori ottici.
Sfondo dell'invenzione e descrizione della tecnica nota L'impiego della tecnologia della fluorescenza si è diffuso nei campi della chimica clinica, cioè le prove in laboratorio, e nei campi diagnostici medicali. Tale tecnologia è particolarmente efficace per eseguire determinazioni di prova estremamente sensibili e specifiche, competenti efficacemente in molte aree con le radioimmunoanalisi e le immunoanalisi enzimatiche.
Il fenomeno della fluorescenza si verifica quando una molecola o un atomo sono bombardati con una luce di date lunghezze d'onda; in altre parole, la conversione di quella luce ad una emissione di luce di una lunghezza d'onda diversa. In termini macroscopici, la conversione è istantanea, ma in termini reali le differenze di tempo finite tra l'assorbimento della luce da parte della molecola e l'intervallo di tempo durante il quale la luce emessa si estingue è una misura delle caratteristiche dei corpi che vengono misurati.
Il procedimento della fluorescenza inizia con l'assorbimento di fotoni di luce da parte di atomi o molecole. La frequenza dell'assorbimento della luce varia con l'atomo o la molecola interessati .
Le molecole fluorescenti, in qualsiasi ambiente specifico, hanno due spettri caratteristici. Il primo, il cosiddetto spettro di eccitazione, è rappresentato da una serie di lunghezze d'onda della luce che sono assorbite dalla molecola con efficienze diverse. In altre parole, tra una possibile pluralità di lunghezze d'onda esistenti che possono essere assorbite dalla molecola per provocare fluorescenza, solitamente una di queste sarà assorbita ad un livello maggiore. La maggior parte degli atomi o delle molecole che assorbono luce convertono in calore tale energia luminosa, ma pochi emettono luce o emettono "fluorescenza" ad una frequenza della luce più bassa. L'assorbimento dei fotoni si verifica rapi.damente m circa 10—15 secondi. Se l'eccitazione della luce è bruscamente interrotta, come ad esempio con un impulso di luce estremamente breve, allora l'emissione della luce fotonica, nel secondo spettro, subirà rapido decadimento con una costante di tempo che dipende dall'atomo o dalla molecola interessati. L'intervallo dei tempi di decadimento è solitamente compreso fra 10<-10 >e 10<-6 >secondi (da 0,1 a 1000 nanosecondi). L’intensità dello spettro di emissione è direttamente proporzionale all'intensità della luce di eccitazione.
Capita pure che l'intensità della luce emessa è pure direttamente proporzionale alla concentrazione delle molecole fluorescenti nel campione. Si può così osservare che una tecnica estremamente sensibile per misurare la concentrazione di un corpo fluorescente può essere sviluppata controllando l'intensità della luce di eccitazione e altre costanti fisiche del sistema di misurazione .
Il valore analitico della misurazione del tempo di decadimento della fluorescenza deriva dal fatto che ciascun atomo o ciascuna molecola ha la sua propria distinta velocità di decadimento. Ciascun atomo o ciascuna molecola è eccitato ad una frequenza diversa e emette luce solamente ad una lunghezza d'onda di emissione particolare.
Sonde analitiche marcate mediante marcatura a fluorescenza sono reagenti di valore per l’analisi e la separazione di molecole e cellule. Applicazioni specifiche includono: (1) identificazione e separazione di sub-popolazione di cellule in una miscela di cellule mediante le tecniche di flusso-citometria a fluorescenza, cernita delle cellule attivata da fluorescenza, e microscopia a fluorescenza; (2) determinazione della concentrazione di una sostanza che si lega ad una seconda specie (ad esempio reazioni antigeni-anticorpi ) nella tecnica della immunoanalisi a fluorescenza; (3) localizzazione di sostanze in gel e altri supporti insolubili mediante le tecniche della macchiatura a fluorescenza. Queste tecniche sono descritte da Herzenberg ed al. in "Cellular Immunology", 3a ed. Capitolo 22, Blackwell Scientific Publications , 1978 (cernita di cellule attivata a fluorescenza) e da Goldman, in "Fluorescenze Antibody Methods", Academic Press, New York, 1968 (microscopia a fluorescenza e macchiatura a fluorescenza).
Nell ’impiegare sostanze emettitrici di fluorescenza per gli scopi precedenti, vi sono molti vincoli sulla scelta della sostanza emettitrice di fluorescenza. Un vincolo è quello delle caratteristiche di assorbimento e di emissione della sostanza emettitrice di fluorescenza, poiché molti agenti leganti, ricettori e materiali associati con questi composti nel campione in cui i composti sono presenti, ad esempio sangue, urina, fluido cerebrospinale, emetteranno fluorescenza e interferiranno con una accurata determinazione della fluorescenza dell'etichetta fluorescente. Un'altra considerazione è la capacità di coniugare la sostanza emettitrice di fluorescenza a leganti e ricettori e l'effetto di tale coniugazione sulla sostanza emettitrice di fluorescenza. In molte situazioni, coniugazione ad un'altra molecola può tradursi in una variazione sostanziale nelle caratteristiche fluorescenti della sostanza emettitrice di fluorescenza, e in taluni casi, distruggere o ridurre sostanzialmente l'efficienza quantica della sostanza emettitrice di fluorescenza. Una terza considerazione è l'efficienza quantica della sostanza emettitrice di fluorescenza. Pure da tenere in considerazione è il fatto se le molecole fluorescenti interagiranno l'una con l'altra quando in stretta vicinanza, determinando auto-spegnimento. Un aspetto addizionale è il fatto se vi sia legame non-specifico della sostanza emettitrice di fluorescenza ad altri composti o pareti di contenitori, o di per sè stessi o in coniugazione con il composto a cui la sostanza fluorescente è coniugata.
I valori dei metodi indicati precedentemente sono strettamente correlati alla disponibilità di composti fluorescenti adatti. In anni recenti, l'evoluzione di diodi emettitori allo stato solido e di rivelatori allo stato solido è progredita rapidamente analogamente alla chimica dei coloranti fluorescenti. Ciò ha schiuso varie opportunità per applicazioni nella regione rossa e infrarossa vicina (da 617 a 2500 nm). La regione rossa ed infrarossa vicina appare particolarmente adatta in analisi biologica a causa della bassa fluorescenza di sfondo generata da materiale biologico o da composti chimici. Inoltre, lo sviluppo di laser a diodi commerciali economici con le seguenti lunghezze d'onda di emissione di 670, 750, 780, 810 nm ha suggerito la ricerca di coloranti suscettibili di essere eccitati a queste lunghezze d'onda.
Sforzi precedenti in questo campo hanno prodotto molti coloranti, la maggior parte di essi appartenendo alla famiglia della cianina. Tuttavia, questi coloranti non hanno soddisfatto tutti i requisiti richiesti per applicazioni utili. Waggoner ed al. (Bioconluqate Chemistry, 4, 105-1111993), hanno studiato la composizione chimica dei coloranti di cianina al fine di sviluppare siti di coniugazione e aumentare pure la solubilità nell'acqua. Essi hanno sintetizzato coloranti di solfoindocianina con elevata idrosolubilità, e gruppi reattivi disponibili per la coniugazione con composti biologici. Tuttavia, questi coloranti non possono essere eccitati da laser a diodi e/o hanno basse rese quantiche di fluorescenza.
Durante lo sviluppo di coloranti fotosensibili, un gruppo di ricercatori della Kodak ha aggiunto un ulteriore anello alla frazione indolenina e ha reso la struttura del colorante più rigida mediante un addizionale anello nella catena della polimetina. In un tenativo di ottenere il medesimo traguardo, Patonay ed al. (J. Qrg. Chem. 57, 4578-45801992) hanno studiato strutture portanti gruppi attivati per scopi di coniugazione e un anello di clorocicloesenile nella catena della polimetina. Quest'ultima aumenta la rigidità della struttura, migliorando così la resa quantica di fluorescenza del colorante. Essa fornisce pure un sito conveniente per la sostituzione chimica in corrispondenza dell'anello centrale, utile per introdurre gruppi reattivi o radicali di estrazione di elettroni in grado di modificare la lunghezza d'onda di eccitazione. Gli inconvenienti principali dei coloranti di Kodak e Patonay sono la loro bassa idrofilicità e/o il disadattamento con laser a diodi commercialmente disponibili.
La tecnica nota non dice nulla in relazione ai coloranti fluorescenti di solfo benz [e] indocianina della presente invenzione come pure dei loro impieghi in immunoanalisi, sonde di DNA, sequenziamento di DNA, HPLC, elettroforesi capillare, polarizzazione a fluorescenza, fluorescenza a riflessione interna totale, citometria di flusso e sensori ottici. Le precedenti tecniche analitiche fruirebbero di benefici sostanziali impiegando i coloranti fluorescenti della presente invenzione che hanno un'elevata efficienza quantica, elevate caratteristiche di assorbimento ed emissione nella regione rossa e infrarossa vicina, mezzi semplici per la coniugazione e sostanzialmente privi di interferenza non specifica.
Uno scopo principale della presente invenzione è quello di fornire nuovi coloranti fluorescenti di solfo benz[e]indocianina. Un ulteriore scopo della presente invenzione è quello di fornire nuovi coloranti fluorescenti di solfo benz[e]indocianina di elevata idrofilicità aventi uno o più gruppi di acido solfonico fissati all'anello benzo.
Un ulteriore scopo della presente invenzione è quello di fornire nuovi coloranti fluorescenti di solfo benz[e]indocianina aventi elevate efficienze quantiche.
Ancora un altro scopo della presente invenzione è quello di fornire coloranti fluorescenti di solfo benz[e]indocianina aventi siti reattivi per la coniugazione.
Un altro scopo della presente invenzione è quello di fornire coloranti fluorescenti di solfo benz[e]indocianina aventi un anello centrale di aumento della rigidità nella molecola.
Ancora un altro scopo della presente invenzione è quello di fornire coloranti fluorescenti di solfo benz[e] aventi catene di polimetina variabili per la sintonizzazione del comportamento fluorescente dei coloranti.
Un altro scopo principale della presente invenzione è quello di fornire molecole biologicamente attive aventi fissati su esse coloranti fluorescenti di solfo benz[e]indocianina.
Un ulteriore scopo della presente invenzione è quello di fornire coloranti fluorescenti di solfo benz[e]indocianina utili nella regine rossa e infrarossa vicina.
Un addizionale scopo della presente invenzione è l'impiego di coloranti fluorescenti di solfo benz[e] indocianina in analisi biologiche.
La presente invenzione riguarda coloranti fluorescenti e i loro tautomeri di valenza aventi la formaula:
in cui Q rappresenta una frazione coniugata atta a migliorare la resa quantica fluorescente e il comportamento di sintonizzazione di detto colorante; R1 è un gruppo funzionaiizzato avente la formula -(CH2)jY in cui Y è scelto dal gruppo costituito da SO3H, COOH, NH2, CHO, NCS, epossido, ftalimido, e COOZ in cui Z rappresenta un gruppo rimovibile; R2 è un gruppo funzionalizzato avente la formula -(ΟΗ2)kΥ' in cui Y' è scelto dal gruppo costituito da SO3H, COOH, NH2, CHO, NCS, epossido, ftalimido, e COOZ in cui Z rappresenta un gruppo rimovibile; M<+ >è un controione scelto dal gruppo costituito da ammonio, cationi di metalli alcalini e cationi di metalli alcalino terrosi;
n=da 1 a 4; m= da 1 a 4; j= da 2 a 10 e k= da 2 a 10.
La frazione coniugata Q è tipicamente scelta dal gruppo costituito da:
in cui X è scelto dal gruppo costituito da idrogeno, F, Cl, Br, I e arile sostituito in cui detto sostituente arilico è scelto dal gruppo costituito da SO3H, COOH, NH2, CHO, NCS, epossido e COOZ, in cui Z rappresenta un gruppo rimovibile e i=0 o 1.
La presente invenzione è pure diretta all'impiego dei precedenti coloranti fluorescenti per la marcatura di molecole biologiche che sono utili in analisi biologiche.
Nei disegni:
La figura 1 illustra gli spettri di assorbimento ed emissione del colorante (7).
La figura 2 illustra gli spettri di assorbimento ed emissione del colorante (8).
La f igura 3 i llustra gl i spettri di assorbimento ed emissione dei coloranti (9 ) o ( 11 ) .
La f igura 4 i l lustra gl i spettri di assorbimento ed emissione del colorante (10) .
La f igura 5 il lustra la curva di ca libraz ione per la determinazione di AFP.
La presente invenzione riguarda un colorante fluorescente e i suoi tautomeri di valenza della formula:
in cui Q rappresenta una frazione coniugata atta a migliorare la resa quantica fluorescente ed il comportamento di sintonizzazione di detto colorante; R1 è un gruppo funzionalizzato della formula -(CH2)jY in cui Y è scelto dal gruppo costituito da SO3H, COOH, NH2, CHO, NCS, epossido, ftalimido, e COOZ in cui Z rappresenta un gruppo rimovibile; R2 è un gruppo funzionalizzato avente la formula -(CH2)kY' in cui Y' è scelto dal gruppo costituito da SO3H, COOH, NH2, CHO, NCS, epossido, ftalimido e COOZ in cui Z rappresenta un gruppo rimovibile; M<+ >è un controione scelto dal gruppo costituito da ammonio, cationi di metalli alcalini e cationi di metalli alcalino terrosi;
n=da 1 a 4; m=da 1 a 4; j= da 2 a 10 e k=da 2 a 10.
La frazione coniugata Q è scelta dal gruppo costituito da:
in cui X è scelto dal gruppo costituito da idrogeno, F, Cl, Br, I e arile sostituito in cui detto sostituente arilico è scelto dal gruppo costituito da SO3H, COOH, NH2, CHO, NCS, epossido e COOZ in cui Z rappresenta un gruppo rimovibile e i=0 o 1.
Più specificatamente, i coloranti di etichettatura fluorescenti della presente invenzione possono essere rappresentati dalle seguenti formule generali:
in cui è un gruppo funzionalizzato avente la formula
in cui Y è scelto dal gruppo costituito da SO3H, COOH, NH2, CHO, NCS, epossido, ftalimido, e COOZ in cui Z rappresenta un gruppo rimovibile; R2 è un gruppo funzionalizzato avente la formula -(CHz)^ ', in cui Y' è scelto dal gruppo costituito da SO3H, COOH, NH2, CHO, NCS, epossido, ftalimido, e COOZ in cui Ζ rappresenta un gruppo rimovibile; M<+ >è un controione scelto dal gruppo costituito da ammonio, cationi di metalli alcalini e cationi di metalli alcalino terrosi; n=da 1 a 4; m=da 1 a 4; j= da 2 a 10, k=da 2 a 10; i=0 o 1 e in cui X è scelto dal gruppo costituito da idrogeno, F, Cl, Br, I e arile sostituito, in cui detto sostituente arilico è scelto dal gruppo costituito da SO3H, COOH, ΝΗ2, CHO, NCS, epossido e COOZ in cui Z rappresenta un gruppo rimovibile.
Il gruppo residuo Z è fondamentalmente qualsiasi gruppo organico rimovibile, che può essere facilmente spostato quando i coloranti fluorescenti della presente invenzione sono fissati o coniugati ad una molecola specifica, ad esempio un anticorpo. Un tipico gruppo residuo è n-idrossisuccinimide. I coloranti fluorescenti della presente invenzione possono essere simmetrici, cioè R1 e R2 sono identici oppure asimmetrici, cioè e R2 non sono identici.
Per tautometrismo di valenza, la richiedente intende lo spostamento dei legami coniugati come è mostrato qui sotto per un colorante fluorescente asimmetrico:
I coloranti fluorescenti della presente invenzione hanno le importanti seguenti caratteristiche:
1. Uno o più gruppi solfonici fissati all'anello benzo per fornire elevata idrofilicità al composto e sopprimere legame non specifico a proteine e superfici, fra cui la pelle, consentendo così il suo impiego come una marcatura biochimica. In aggiunta, la carica negativa portata dai gruppi solfonici favorisce nel ridurre l'impi lamento tra molecole di colorante mediante repulsione elettrostatica. Come è noto questo impilamento riduce la resa quantica fluorescente del colorante.
2. La presenza dell'anello aumenta la rigidità della struttura, aumentando perciò la resa quantica della fluorescenza.
3. I gruppi legati in corrispondenza di N in 1 o 1' (generalmente catene carbos sia lchiliche , solfoalchile o alchilamminiche) hanno siti reattivi per scopi di coniugazione o al fine di aumentare la solubilità in mezzi acquosi.
4. L'anello centrale aumenta la rigidità del colorante migliorando così la sua resa quantica di fluorescenza e ciò ostacola pure l'attacco da parte dell'ossigeno, aumentando così la stabilità del colorante rispetto alla ossidazione. Esso può essere impiegato per introdurre sostituenti con siti reattivi per scopi di coniugazione o al fine di aumentare la solubilità in mezzi acquosi.
5. La lunghezza della catena di polimetina presente nel colorante costituisce lo strumento principale per sintonizzare il comportamento fluorescente di questa classe di coloranti.
I composti della presente invenzione sono sintetizzati partendo con il nuovo composto acido 2,3,3-trimetil benz[e] indolenina-7-solf onico (4). La sintesi del composto (4) è delineata nel seguente Schema I.
Partendo con il composto (4) una pluralità di prodotti intermedi come i composti (5) e (6) possono essere sintetizzati come mostrato nel seguente Schema II.
Schema II
I coloranti simmetrici o asimmetrici sono sintetizzati partendo con prodotti intermedi come i composti (5) e (6) mediante condensazione con trietil ortoformiato di varie dialdeide diamilidi come mostrato nel seguente Schema III:
Schema III
Come si è osservato precedentemente, i coloranti di cianina sono stati sintetizzati partendo da un nuovo prodotto intermedio, l'acido 2,3,3-trimetil benz[e]indolenina-7-solfonico. Da questa molecola sono stati ottenuti sali quaternari di ciclammonio diversi, e questi ultimi sono stati condensati con composti come trietil ortoformiato o varie dialdeidi dianilidi. Le catene laterali fissate agli atomi di azoto 1- e 1'- della benz[e] indolenina possono essere le medesime o diverse, portando a coloranti simmetrici o asimmetrici. Tutti questi composti sono solitamente in forma salina e il controione (M<+>) dipende dalle condizioni di reazione e purificazione. Si deve notare che come altri coloranti di cianina, i coloranti della presente invenzione possono esistere come monomeri, aggregati-H e aggregati-J in dipendenza dell'equilibrio chimico interessato. Naturalmente, il pKa e il pH avranno un effetto sostanziale relativamente alla forma che il colorante assume quando sciolto in un dato solvente. Inoltre, un equilibrio esiste pure tra monomeri ed aggregati costituiti da dimeri, trimeri o polimeri superiori. Fattori come la forza ionica, la concentrazione del colorante, la temperatura ed il solvente influenzano l'equilibrio.
I coloranti fluorescenti della presente invenzione combinano tutte le proprietà ottimali che sono desiderabili in detti coloranti. Dette proprietà sono massimi di assorbimento adattantisi a diodi fotoemettitori e diodi laser (si veda la Tabella I e le figure 1-4), massimi di emissione nella regione spettrale rossa e infrarossa vicina a basso sfondo; proprietà chimiche soddisfacenti requisiti di marcatura (presenza di siti reattivi, idrosolubilità, mancanza di legame non specifico a proteine e superfici, tra cui la pelle, e stabilità.
Tabella I
Come si è menzionato nella parte introduttiva della presente invenzione, i coloranti fluorescenti della presente invenzione sono particolarmente utili nella chimica clinica, immunochimica e nella chimica analitica. I composti possono essere impiegati in immunoanalisi fluorometriche, sonde di DNA, cromatografia di liquidi ad alta pressione (H.P.L.C.), elettroforesi capillare, polarizzazione a fluorescenza, fluorescenza a riflessione interna totale (T.I.R.F.), flusso citometria, sequenziamento di DNA e sensori ottici. Quando i composti fluorescenti della presente invenzione sono impiegati in determinazioni immunochimiche, è tipicamente necessario coniugare l'etichetta fluorescente con uno dei partner leganti, cioè un anticorpo o un antigene o una molecola di proteina biologicamente attiva.
In dipendenza dalla molecola che viene marcata, un'ampia varietà di gruppi di legame possono essere impiegati per coniugare la proteina all'altra molecola. In massima parte, con piccole molecole, il gruppo funzionale di interesse per il legame sarà carbonile, o un'aldeide per fornire amminazione riduttiva o un carbonile che, in unione con carbodiimide, o come un estere attivato, ad esempio N-idrossi succinimmide, formerà un legame covalente con i gruppi ammino presenti nella proteina; un tioetere o disolfuro, in cui la proteina può essere modificata con una olefina attivata e un gruppo mercapto aggiunto o gruppi mercapto attivati uniti, ad esempio reagente di Ellmann; isotiocianato, diazonio; nitrene o carbene. Vi è abbondante letteratura tecnica relativa alla coniugazione di un'ampia varietà di composti a proteine. Si veda, ad esempio, A.N. Glazer, The Proteins, Voi. H A, 3a Ed. N. Neurath e R.L. Hill, Eds., Academic Press, pp 1-103 (19760; A.N. Glazer ed al., "Chemical Modification of Proteins", Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Voi. 4, PRT I, T.S. Work ed E. Work, eds., North-Holland Publishing Co. (1975); e K. Peters ed al., Ann. Rev. Biochem., 46, 423-51 (1977), le cui descrizioni sono qui incluse a titolo di riferimento. Esempi di reagenti di reticolazione commercialmente disponibili sono descritti nel Pierce 1981-82 Handbook and General Catalog. pp. 161-166, Pierce Chemical Co. Rockford, III.
Come è stato indicato precedentemente, antigeni o anticorpi sono marcati con coloranti fluorescenti dell’invenzione mediante reazione chimica ordinaria. Così, un colorante fluorescente può essere fatto reagire con un antigene o anticorpo per formare un prodotto di reazione marcato mediante legame covalente; specificatamente, la reazione si verifica tra il gruppo funzionale (cioè mercapto, ammino, idrossi o carbossi) del colorante e un gruppo (o gruppi) ammino, immino, mercapto, carbossi, ammidi di acido carbossilico o idrossi di un antigene o anticorpo. La reazione tra i due può essere condotta mediante una qualsiasi delle procedure seguenti:
(1) Coloranti fluorescenti sono direttamente fatti reagire con i summenzionati gruppi funzionali;
(2) Coloranti fluorescenti e i summenzionati gruppi funzionali sono fatti reagire impiegando un agente di attivazione, e
(3) Coloranti fluorescenti e i summenzionati gruppi funzionali sono fatti reagire attraverso almeno un composto avente un gruppo bifunzionale.
Gruppi che sono reattivi con i summenzionati gruppi funzionali di antigeni o anticorpi e procedimenti per la reazione dei medesimi sono descritti dettagliatamente ad esempio in Lectures on Experimental Biochemistry, Voi. 1, avente come subtitolo "Chemistry of Proteins", ibid. Voi. 2, avente come subtitolo "Chemistry of Nucleic Acids", ibid. Voi. 3, avente come subtitolo "Chemistry of Lipids" e ibid. Voi. 4 avente come subtitolo "Chemistry of Sugars", tutti editi dalla Biochemical Associatio, Japan, pubblicati da Tokyo Kagaku Dojin (1977); Izumiya, PEPTIDE GOSEI (Peptide Synthesis), e Greenstein ed al., CHEMISTRY OF THE AMINO ACIDS, Voi. I-III (1961); John-Wiley & Sons Ine., New York. L'esperto del ramo può facilmente attuare queste reazioni per formare il legame da conoscenza nel campo e da queste pubblicazioni.
Esempi di composti contenenti gruppi che reagiscono con i summenzionati gruppi funzionali includono inoltre, ad esempio, esteri attivati, alogeni attivati, aldeidi, vinilesteri attivati, alogeni attivati, aldeidi, composti vinilici attivati, anidridi di acidi, alogenuri acidi, tioisocianati, isocianati, acidi carbossilici, ammidi, alchilalogenuri, nitrofenilalogenuri, ecc. Perciò, questi gruppi funzionali possono essere originariamente presenti nei coloranti fluorescenti oppure possono essere introdotti in conseguenza della reazione di un composto avente un gruppo bifunzionale e il colorante fluorescente.
Le condizioni di reazione per la marcatura variano in dipendenza dal tipo dell'antigene o dell'anticorpo, dal tipo di colorante fluorescente, ecc., e le condizioni sono scelte in modo da non danneggiare l'attività biologica dell 'antigene o dell 'anticorpo da marcare. Perciò, la temperatura di reazione è generalmente scelta dall'intervallo da 40°C a 60°c, preferibilmente da -20°C a 40°C, e il tempo di reazione dall'intervallo da 10 minuti a 16 ore. La pressione di reazione è preferibilmente la pressione atmosferica, ma può essere opportunamente scelta dall'intervallo da 1 a 20 atomi. E' vantaggioso che acqua o soluzione tampone del pH sia impiegata in qualità di un solvente per la marcatura. Solventi organici come DMF (dimetilformammide), cloruro di metilene, ecc., possono pure essere impiegati. Queste condizioni di reazione sono comuni a condizioni di reazione che sono generalmente applicabili alla modificazione di protene o enzimi e i dettagli sono descritti nelle pubblicazioni precedentemente menzionate.
La quantità di coloranti fluorescenti impiegati per la marcatura varia in dipendenza dal tipo delle sostanze summenzionate da marcare, ma è generalmente compresa in un rapporto molare di da 1/100 a 100 moli per 1 mole dell'antigene o dell 'anticorpo , preferibilmente da 1/20 a 20 moli, più preferibilmente da 1/2 a 2 volte, sulla medesima base.
In qualità di procedimenti per confermare il completamento della etichettatura, sono rappresentativi procedimenti o metodi per misurare spettri come UV, raggi visibili, IR, spettri di massa e NMR, ecc., ed un metodo confermante l'etichettatura tramite scomparsa del gruppo terminale in corrispondenza del quale la sostanza etichettante deve essere introdotta. Prove semplici saranno sufficienti a confermare il completamento della etichettatura. Ove la conferma sia attuata utilizzando lo spettro di assorbimento, dopo il completamento della reazione di etichettatura, è misurato uno spettro di assorbimento di un prodotto separato e purificato; se lo spettro di assorbimento risultante è coerente con lo spettro di assorbimento intrinseco che un colorante fluorescente possiede, allora risulta confermato che la reazione di etichettatura è stata effettuata. Un ulteriore procedimento per confermare il fatto che l'etichettatura è effettuata è quello di analizzare la presenza o l'assenza dei gruppi terminali specifici, ad esempio uno o più gruppi ammino o carbossi .
Il gruppo o i gruppi carbossi terminali sono analizzati per controllare il completamento della reazione di marcatura, particolari della quale sono forniti, ad esempio, da S. Akabori, K. Ohno e K. Narita, in Bull . Chem. Soc. Japan, 25, 214 (1952) (questo essendo nella tecnica generalmente chiamato un metodo di decomposizione di idrazina), H. Matuo, U. Fujimoto e T. Tatuno, in Biochem. Biophys . Res. Communi cation, 22, 69 (1966) (un metodo di marcatura di trizio) ecc. Ulteriori particolari di questi metodi di determinazione di terminali sono pure forniti come una recensione da S. B. Needleman, in PROTEIN SEQUENZE DETERMINATION, pubblicato da Springer Editore (Berlino), 1975.
Le molecole di proteina come gli anticorpi o antigeni possono essere impiegate in una determinazione immunochimica in conformità con uno degli aspetti preferiti dell'invenzione. Una tipica immunoanalisi fluorometrica di un antigene in un campione liquido comprende l'incubare una miscela di:
(a) il campione liquido;
(b) anticorpi marcati all'antigene sotto analisi;
(c) un reagente comprendente anticorpi all'antigene sotto analisi ;
(d) un reagente atto a legarsi al componente (c) mediante legame non covalente, ma che non è legabile direttamente nè al componente (a) nè al componente (b), detto reagente (d) essendo legato ad un supporto in fase solida, almeno uno dei componenti (b), (c) e (d) comprendendo anticorpi monoclonali;
separando la frazione solida dalla frazione liquida, determinando la quantità di agenti di marcatura in una di dette frazioni, e, da questa, la quantità di antigene presente nel campione. I reagenti degli anticorpi possono pure essere impiegati sotto forma di frammenti.
Un altro aspetto dell'invenzione è un'analisi competitiva per determinare la quantità di un antigene in un campione che si sospetta contenga l'antigene comprendente: (a) incubare il campione con una soluzione di un antigene etichettatofluorescente , anticorpo anti-antigene , e un anticorpo contro l'anticorpo anti-antigene ; (b) aggiungere un agente immuno precipitante, non dispersivo della luce non fluorescente alla miscela di incubazione, per formare un immuno-precipitato; (c) separare l'immuno-precipitato e sciogliere l'immuno-precipitato in un solvente non fluorescente avente una bassa forza ionica e mantenente sostanzialmente costante il pH della soluzione risultante; e (d) misurare l'intensità di fluorescenza della soluzione per la fase (c) e comparare l'intensità di fluorescenza con una curva standard.
Tipicamente, il campione che è analizzato è un fluido corporeo come sangue, siero sanguigno, plasma sanguigno, urina, fluido linfatico, bile, fluido spinale o simili. Il particolare fluido corporeo analizzato può variare con l'antigene che viene testato. Nella maggior parte dei casi sarà impiegato siero sanguigno. Tra circa 0,1 e circa 500 pi di fluido saranno impiegati per ogni analisi.
Sostanze che possono essere analizzate mediante l'impiego dei reagenti di marcatura fluorescenti della presente invenzione includono antigeni (molecole che eccitano una risposta immunologica quando introdotte nel flusso sanguigno di un soggetto vertebrato) e apteni che non sono di per sè immunogeni, ma che possono essere coniugati ad un supporto di proteina o proteico per formare un coniugato che è immunogeno e in grado di generare anticorpi contro l'aptene. Il termine "antigene" è qui impiegato per indicare genericamente composizioni sia antigeniche che apteniche. Queste sostanze includono farmaci, ormoni, pesticidi, tossine, vitamine, proteine batteriche e virali umane, e simili. Esempi di antigeni che possono essere analizzati mediante l'invenzione includono tirossina (T4) triodotironina (T3), digossina, gentamicina, amicacina, tobramicina, canamicina, cortisolo, luteinizzante , gonadotropina corionica umana, teof illina, angiotensina, ormone della crescita umana, infezione da HIV, a fetoproteina e simili.
I reagenti che sono incubati con il campione sospetto di contenere antigene per formare immunocomplessi sono (1) antigene marcato-f luorescente, (2) anticorpo anti-antigene, (3) anticorpo contro l'anticerpo ant i-ant igene e (4) un agente immunoprecipi tante non dispersivo della luce non fluorescente (cioè glicole di polietilene). Come si è indicato precedentemente, l'antigene etichettato-fluorescente può essere realizzato mediante accoppiamento dell'antigene con un derivato reattivo del colorante fluorescente impiegando agenti di accoppiamento multifunzionali come aldeidi, carbodi immidi , dimaleimidi, imidati e succinimidi.
I coloranti della presente invenzione trovano pure utilità in qualsiasi applicazione corrente per la rivelazione di acidi nucleici che richieda un reagente di rivelazione sensibile. In particolare i coloranti sono utili per la rivelazione di acidi nucleici isolati a cellule libere, acidi nucleici in soluzione e bande di acidi nucleici in gel. Addizionalmente, i presenti coloranti fanno grandemente aumentare la sensibilità di rivelazione degli acidi nucleici in una varietà di cellule e tessuti, sia vitali che morti, piante e animali, di tipo eucarlotico e procariotico. Questa famiglia di coloranti presenta fotostabilità insolitamente buona e sembra essere relativamente non tossica per le cellule. Inoltre, molti dei coloranti penetrano rapidamente nelle membrane delle cellule di una varietà di cellule. Le superiori proprietà presentate da questi coloranti non sono state nè anticipate nè risultano ovvie in vista dei noti coloranti di cianina.
L'impiego dei coloranti fluorescenti della presente invenzione nella rivelazione di acidi nucleici comprende il combinare un colorante secondo la presente invenzione con un campione che contiene un acido nucleico, incubare il campione per un periodo di tempo sufficiente ad ottenere una risposta fluorescente rivelabile, ed osservare la risposta fluorescente.
Tipicamente, il colorante è presente come una soluzione di macchiatura, che è preparata mediante l'aggiunta del colorante ad una soluzione acquosa che è biologicamente compatibile con il campione. La soluzione di macchiatura è preparata sciogliendo il colorante direttamente in un solvente acquoso come acqua, una soluzione tampone, come una soluzione salina tamponata con fosfato, od un solvente miscibile in acqua organico come dimetilsolfossido (DMSO), dimetilformammide (DMF), o un alcol inferiore come metanolo o etanolo, o acetonitrile. Tipicamente, il colorante è preliminarmente sciolto in un solvente organico (preferibilmente DMSO) ad una concentrazione superiore di circa 100 volte a quella impiegata nella soluzione di macchiatura, quindi diluito per una o più volte con un solvente acquoso come acqua o un tampone. Preferibilmente, il colorante è sciolto in circa 100% DMSO e quindi diluito per una o più volte in acqua o in un tampone in modo tale che il colorante è presente in una quantità efficace. Una quantità efficace di colorante è la quantità sufficiente per fornire una risposta fluorescente rivelabile quando in presenza di acidi nucleici. Tipicamente, le soluzioni di macchiatura per campioni cellulari hanno una concentrazione di colorante superiore a circa 0,1 nM e inferiore a circa 100 μΜ, più tipicamente superiore a circa 1 nM. Soluzioni di macchiatura per gel elettroforetici hanno tipicamente una concentrazione di colorante superiore a circa 1 pM e inferiore a circa 10 pM, più tipicamente di circa 4-5 pM. E' generalmente chiaro nella tecnica che la concentrazione specifica della soluzione di macchiatura è determinata dalla natura fisica del campione, e dalla natura dell'analisi che viene eseguita.
Il colorante è combinato con un campione che contiene un acido nucleico. L'acido nucleico nel campione può essere RNA o DNA o una miscela di questi. Quando l'acido nucleico è presente in DNA, il DNA può essere opzionalmente DNA a singolo, doppio, triplo o quadruplo ceppo. L'acido nucleico può essere naturale (di origine biologica) o sintetico (preparato artificialmente). L'acido nucleico può essere presente come frammenti di acido nucleico, oligonucleotidi o polimeri di acido nucleico. L'acido nucleico può essere presente in una fase condensata, come un cromosoma. La presenza dell'acido nucleico nel campione può essere dovuta ad una metodologia sperimentale di successo o non di successo, a indesiderabile contaminazione o a uno stato di malattia. L'acido nucleico può essere presente in tutto il campione o solamente in una parte di un campione, e la presenza di acidi nucleici può essere impiegata per attuare distinzione tra campioni individuali o per differenziare una porzione o una regione entro un campione singolo.
I coloranti fluorescenti della presente invenzione possono pure essere impiegati per metodi di sequenziamento del DNA.
I metodo è basato sul metodo di sequenziamento di terminazione di catena di Sangers come descritto in Sanger ed al., Proc. Nati. Acad. Sci., 74, 5464 (1977) il cui contenuto è qui incluso a titolo di riferimento. Tipicamente, una sonda marcata con fluoroforo specifica per la sequenza è ibridizzata con il DNA desiderato o target, e le scale della sequenza sono identificate mediante fluorescenza indotta da laser o altri mezzi appropriati per rivelare DNA marcato a fluorescenza.
I coloranti fluorescenti dell'invenzione sono pure utili in metodologie di analisi che impiegano sonde di DNA per la determinazione della presenza e/o della quantità di analiti. Più particolarmente, un metodo di analisi per un analita in un campione utilizzante una sonda di DNA etichettata con un colorante secondo l'invenzione comprende il porre a contatto la sonda di DNA cosi marcata in condizioni adatte per il legame con l'analita, in cui il legame è rappresentativo della presenza o quantità dell'analita nel campione, e determinare l'estensione del legame misurando la fluorescenza della sonda di DNA marcata in modo fluorescente. In qualità di una forma di realizzazione di questo procedimento, l'analita che deve essere terminato può essere separato dal campione in cui esso è presente prima di essere legato alla sonda di DNA. E' pure possibile impiegare una prima e seconda sonda di DNA in un'analisi singola, in cui la prima di queste sonde è legata con un colorante fluorescente secondo l'invenzione, e la seconda sonda non è etichettata ed è legata ad una fase solida. In questo modo, l'analita può essere separato dal campione ponendo a contatto il campione con la seconda sonda di DNA in condizioni adatte per legare l'analita con esso, il campione rimanente rimosso prima di contattare l'analita con la prima sonda di DNA (marcata).
Rientra pure nell'ambito protettivo dei procedimenti di analisi utilizzanti i coloranti fluorescenti della presente invenzione che la fase di separare dell'analita dal campione nel modo appena descritto può pure essere praticata con reagenti di legame marcati diversi da sonde di DNA. Ad esempio, invece di utilizzare una prima (etichettata) ed una seconda (non etichettata e legata ad una fase solida) sonde di DNA, possono essere impiegati una pluralità di reagenti immunologicamente leganti specifici per un dato analita.
Addizionalmente, i coloranti fluorescenti secondo la presente invenzione possono essere impiegati nella flussocitometria . Tale procedimento è caratterizzato dall'impiego di un flussocitometro che comprende una sorgente di luce, una cella di flusso che consente ai globuli sanguigni in un campione di scorrere uno per uno attraverso un canale strozzato, un’unità fotometrica che rivela luce uscente da ciascun globulo sanguigno, e un analizzatore per analizzare il segnale rivelato. In tale procedimento, corpuscoli nel campione che sono macchiati sono illuminati sotto luce e la fluorescenza emessa dei corpuscoli irradiati è rivelata, opzionalmente assieme a luce dispersa, classificazione dei leucociti essendo realizzata conformemente all'intensità del segnale rivelato. Gli esempi seguenti sono forniti per illustrare l’attuazione pratica della presente invenzione. Essi non vogliono limitare o definire l'intero ambito protettivo della presente invenzione.
ESEMPI
Per la sintesi del prodotto intermedio comune acido 2,3,3-trimetil benz[e]indolenina-7-solfonico, siamo partiti dall'acido di Dahl, cioè acido 6-ammino-1-naftalensolf onico , e tramite diazotizzazione e riduzione lo abbiamo convertito in acido 6-idrazino-1-naf talensolfonico; quindi, mediante classica sintesi degli indoli di Fischer con 3-metil-2-butanone abbiamo ottenuto acido 2,3,3-trimetil benz[e]indolenina-7-solfonico . E' notevole il fatto che la ciclizzazione ha luogo fornendo proprio l'isomero desiderato.
ESEMPIO 1
Diazotizzazione dell'acido di Dahl. Una sospensione di 13,34 g (64,2 mmoli) di acido di Dahl in 45 mi di acido cloridrico concentrato è raffreddata -5°C mediante un bagno di ghiaccio-sale in un pallone a tre colli da 500 ml dotato di un agitatore meccanico, termometro e condensatore a riflusso. Alla sospensione è aggiunta goccia a goccia, a 0°C o temperatura più bassa, una soluzione di nitrito di sodio raffreddata con ghiaccio (4,43 g, o 64,2 mmoli, in 30 ml di acqua) e la miscela è agitata per 40 minuti alla medesima temperatura e quindi impiegata senza ritardo nella fase seguente.
ESEMPIO 2
Riduzione dell'acido di Dahl diazotizzato ad acido 6-idrazino-1-naf talensolfonico (3). Una soluzione di diidrato di cloruro stannoso (43,6 g - 193,2 mmoli) in 46 mi di acido cloridrico concentrato freddo è aggiunta goccia a goccia a circa 0°C con agitazione alla sospensione ottenuta aggiungendo 50 g di ghiaccio sminuzzato all'acido di Dahl diazotizzato. L'aggiunta richiede pressocchè 1 ora. La miscela è agitata per ulteriori 15 minuti. La sospensione è refrigerata per tutta la notte, filtrata e lavata con salamoia. Il prodotto finale è ricristallizzato da acqua calda per fornire 9,9 g (- 64%). Lo spettro <1>H-NMR del prodotto corrisponde alla struttura dell'acido 6-idrazino-1-naftalensolfonico .
ESEMPIO 3
Sintesi di Fischer di acido 2,3,3-trimetil benz[e]indolenina -7-solfonico (4). Ad un pallone con fondo tondo da 250 ml, dotato di condensatore a riflusso e agitatore magnetico sono aggiunti acido acetico (25 mi), 3-metil-2-butanone (13,4 ml-124 mmoli) e acido 6-idrazino-1-naf talensolfonico (9,9 g - 41,6 mmoli). La miscela è sciolta e riscaldata a riflusso per 3 ore. Quindi la soluzione è evaporata ed il residuo è lavato con tre porzioni di n-esano. Il residuo solido è essiccato, ridisciolto in metanolo e fatto precipitare in etere per fornire acido 2,3,3-trimetil benz [e]indolenina-7-solfonico (80%). Come confermato mediante lo spettro H -NMR, la ciclizzazione si verifica solamente in corrispondenza della posizione-5 dell'anello naftalenico.
Per la guaternar izzaz ione abbiamo impiegato i metodi descritti precedentemente nella letteratura del ramo per composti similari. Tutte le strutture sono state confermate mediante H-NMR.
ESEMPIO 4
Sintesi di 1-(5'-carbossipentil)-2,3,3-trimetil benz[e]indoleninio-7-solf onato (5). In un pallone a fondo tondo da 100 ml, 21 g (7,26 mmoli) di 2,3,3-trimetil benz[e]indolenina-7-solfonato sono sciolti in 27 mi di solfonato caldo sotto argo. A questa soluzione è aggiunto acido 6-bromoesanoico (1,76 g - 9,0 mmoli). La miscela risultante è quindi riscaldata a 130 "C per 12 ore. Dopo raffreddamento, la soluzione marrone viene miscelata con toluente (~50 ml) e si separa un solido scuro; il solido viene filtrato e lavato con due ulteriori porzioni di toluente. Toluene in eccesso è distillato via sotto forma di una miscela azeotropica con etanolo. Il prodotto, sciolto in pochi millilitri di metanolo, è precipitato mediante aggiunta goccia a goccia ad un grande eccesso di etere (resa -35%).
ESEMPIO 5
Sintesi di l-[3'-(N-ftalimidopropil)]-2,3,3-trinietil benz[e] indoleninio-7-solfonato (6). In un pallone a fondo tondo sono stati sciolti 2,3,3-trimetil benz[e]indolenina-7-solfonato (3 g -10,4 mmoli) e N-(3-bromopropil)ftalimide (2,78 g - 10,4 mmoli) in solfolano (-20 ml) e sono stati sospesi 0,58 g (10,4 mmoli) di KOH . La miscela è stata riscaldata a 120°C per 6 ore. Un materiale solido è quindi fatto precipitare dalla soluzione aggiungendo 50 ml di toluene. Il materiale solido è raccolto su un filtro di vetro sinterizzato e lavato con toluene. Il residuo gommoso è sciolto in etanolo e fatto precipitare in etere per ottenere un materiale solido che è stato completamente triturato con etanolo. Per ottenere il gruppo amminico libero, è possibile seguire modi di clivaggio convenzionali come ad esempio il trattamento in etanolo con idrazina a 25°C per 12 ore o idrolisi in acido cloridrico concentrato.
Infine, i coloranti di cianina possono essere ottenuti condensando i prodotti intermedi di benz[e]indoleninio-7-solfonato con trietil ortoformiato o varie dialdeidi dianilidi.
Nuovamente, le strutture erano confinate mediante spettroscopia H-NMR.
ESEMPIO 6
Sintesi di 2-{3'-[l"-(∈-carbossipentil)-3'',3''-dimetil-7"-solf o benz[e]indolin-2 "-ilidene]-1-propen'-1'-il}-1-(∈-carbossipentil)-3, 3-dimetil benz[e] indoleninio-7-solfonato (7). In un pallone a fondo tondo dotato di un condensatore a riflusso, 306 mg (0,76 mmoli) di 1-(5’-carbossipentil)-2,3,3-trimetil benz[e] indoleninio-7-solfonato sono sciolti in 1 mi di piridina. La soluzione è quindi riscaldata a riflusso. Un eccesso di trietil ortoformiato (225 mg - 1,52 mmoli) è aggiunto e la soluzione è lasciata a riflusso per 2 ore. La miscela è raffreddata ed il prodotto è separato mediante l'aggiunta di etere. Il materiale solido è sciolto in metano e fatto riprecipitare con etere (resa 56%) .
ESEMPIO 7
Sintesi di 2-{5'-[1''-{∈-carbossipentil)-3'', 3''-dilnetil-7''-solfo benz[e]indolin-2"-iliden] -1' , 3"-pentadien-1' -il }-1- (∈-carbossipentil) -3, 3-dimetil benz[e]indoleninio-7-solfonato (8) .
Malonaldeide dianil idrocloruro (160 mg-0, 620 mmoli) è sciolto in una miscela calda di 5 mi di anidride acetica, 1 , 2 mi e piridina in un pallone a fondo tondo da 50 ml dotato di un condensatore a rif lusso . Al la misce la è aggiunto 1- ( 5 ' -carbossipentil ) -2 , 3 , 3-tr imeti 1 benz [e] indoleninio-7-solfonato 0, 5 g (1 , 24 mmoli ) . Dopo 15 minuti, la soluzione raffreddata è diluita con etere, si separa un materiale solido ed è ridisciolto in un volume minimo di metanolo e fatto precipitare con una miscela di 2-propanolo/etere 2 : 1 ( resa 46%) .
ESEMPIO 8
Sintesi di 2-{5'-cloro-7' ∈-carbossipentil )-3",3"-dimetil-7"-solfo benz[e]indolin-2"-ilidene]-3 ',5 (propano-1'" , 3'''-diil}-1',3',5'-eptatrien-1 '-il}-1-(∈-carbossipentil)-3,3-dimetìl benz[e]indoleninio-7-solfonato (9). Una soluzione di (5-fenilammino-2 ,4-trimetilene-2,4-pentadienilidene) fenilammonio cloruro (0,29 g - 0,80 mmoli),1-(5 '-carbossipentil)-2,3,3-trimetil benz[e]indoleninio-7-solfonato (0,65 g - 1,61 mmoli) e sodio acetato (0,16 g - 1,93 mmoli) in etanolo (30 ml) è riscaldata a riflusso per un'ora. Il solvente è evaporato ed il residuo è sciolto nel volume minimo di metanolo e precipitato con etere (resa 83%).
Da questa molecole è possibile sintetizzare coloranti di cianina con sostituenti diversi in corrispondenza della posizione del cloro. Questi sostituenti possono introdurre nuovi siti di coniugazione e/o spostare le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione ad un'area più utile dello spettro. Ad esempio, il colorante seguente può essere eccitato mediante diodi laser a 670 e 780 nm.
ESEMPIO 9
Sintesi di 2-{7'-[1"-(∈-carbossipentil)-3" , 3"~dimetil-7"-solfo benz[e]indolin-2"-ilidene]-3 ' , 5 ’-propano-1" ' , 3" ' -diil)-1' , 3',5'-eptatrien-1'-il]-1-(∈-carbossipentil)-3,3-dimetil benz[e] indoleninio-7-solfonato (10). Ad un pallone con fondo tondo sotto argon sono aggiunti 15 mi di Ν,Ν-dimetilformammide anidra, 300 mg (0,31 mmoli) di colorante di cianina (9) e 0,5 g (6,1 mmoli) di sodio etantiolato. La miscela è trattata a riflusso per un'ora e, dopo raffreddamento, viene fatto precipitare con etere un materiale solido (resa 70%).
ESEMPIO 10
Sintesi di 2-{5'-cloro-7’-[1''-(γ -{N-ftaliraidopropil))-3",3" -dimetil-7"-solfo benz[e]indolin-2"-ilidene]-3 ',5'-(propano-1"', 3"'-diilj-1' ,3',S'-eptatrien-1'il)l-i -(N-ftalimidopropil )-3,3-dimetilbenz[e]indoleninio-7-solfonato (11). 1- [3'-(N-ftalimidopropil ))-2,3,3-trimetil benz[e]indoleninio-7-solfonato (330 mg -773 mmoli), (5-fenilammino-2,4-trimetilene-2 ,4-pentadienilidenefenilammonio cloruro (139 mg - 0,39 mmoli) e sodio acetato (76 mg - 0,93 mmoli) sono sciolti in etanolo (10 ml). Dopo trattamento a riflusso per 20 ore, la soluzione è evaporata ed il residuo è ridisciolto in metanolo e fatto precipitare con etere (resa 67%).
La purificazione dei coloranti è stata eseguita su una unità Millipore Waters Delta Prep 400 HPLC dotata di una colonna Vydac C18 RP impiegando una eluizione a gradiente (per esempio: H2O/CH3CN- da 80:20 a 5:95. A causa dei numerosi siti ionici presenti in questi coloranti, per ottenere una composizione ben definita è necessario eseguire una fase di scambio ionico facendo passare una soluzione acquosa del colorante attraverso uno scambiatore di cationi fortemente acido, come ad esempio Dowex 50W in forma di idrogeno.
ESEMPIO 11
Procedura generale per la preparazione di succinimidil esteri di coloranti di carbossialchil solfo benz[e]indocianina. La procedura seguente descrive la preparazione di succinimidil esteri di coloranti di carbossialchil solfo benz[e]indocianina. I succinimidil esteri risultanti sono impiegati come prodotti intermedi per la marcatura di biomolecole come anticorpi ed antigeni .
In una miscela solvente contenente di N,N-dimetilformammide anidra (1 mi) e piridina anidra (50 pi) sono stati sciolti 50 mg di colorante contenente gruppi carbossialchiliti (cioè i coloranti 7, 8 o 9). Disuccinimidil carbonato (1,5 equivalenti per gruppo carbossi) è stato aggiunto e la miscela è stata riscaldata a 55-60°C per 90 minuti sotto un'atmosfera di argo. Il prodotto era isolato aggiungendo etiul acetato (anidro), facendo passare la miscela attraverso un filtro di vetro sinterizzato e lavando il prodotto raccolto con etil acetato. Il prodotto grezzo era sciolto in dimetilformammide anidra ed era precipitato con etil acetato anidro o etere. La resa era praticamente quantitativa .
ESEMPIO 12
Procedura generale per la marcatura di proteina . Una soluzione iniziale dei succinimidil esteri di un colorante di carbossialchil solfo[e]indocianina è stata preparata sciogliendo 1 mg di estere attivo in 100 μΐ di DMF anidro. Queste soluzioni erano stabili per pochi giorni quando mantenute in un essiccatore a 4°C. Le soluzioni acquose degli esteri attivi erano stabili per qualche ora ad un pH ≤7. E' possibile impiegare soluzioni acquose dei coloranti contenenti esteri attivi nel caso in cui non è possibile impiegare DMF come solvente nella marcatura della proteina. Si determina la concentrazione del colorante reattivo nella soluzione di partenza misurando i fattori di assorbimento o assorbanza di una aliquota di soluzione di partenza appropriatamente diluita in una soluzione salina a tampone fosfatico impiegando il coefficiente di estinzione dei colori. In generale, la marcatura della proteina è stata condotta in un tampone di carbonato-bicarbonato (0,1 M, pH 9,4) per 15 minuti a temperatura ambiente.
ESEMPIO 13
Marcatura di anticorpo anti-a-fetoproteina monoclonale. Ad un milligrammo di anticorpo anti-a-fetoproteina monoclonale (MAbanti-AFP) sciolto in 1 mi di tampone di carbonato-bicarbonato (0,1 M, pH 9,4) sono aggiunti con miscelazione a vortice 20 mldi colorante di estere attivo (estratto dalla soluzione di partenza contenente 1 mg/100 pi di colorante di estere attivo). La miscela è stata incubata per 15 minuti a temperatura ambiente. Colorante che non si coniugava con la proteina era separato dall'anticorpo etichetatto impiegando cromatografia a permeazione su gel su una colonna di Sephadex G-25 (0,7 x 70 cm) ed eluito con tampone fosfatico a pH 7. Sono formate due bande colorate, e la prima ad eluirsi conteneva l'anticorpo etichettato.
ESEMPIO 14
Applicazione: Immunoanalisi fluorescente (EIA). In qualità di un esempio di F.I.A. in fase eterogenea del tipo sandwich, fra l'analita da determinare e due anticorpi monoclonali specifici rispetto a due epitopi diversi dall'analita, è possibile eseguire la determinazione di α-fetopro teina nel siero. Lo schema analitico per l'analisi è il seguente: il primo anticorpo MAb, anti-AFP è usato come anticorpo di cattura ed è coniugato con biotina. Il secondo anticorpo Mab2 anti-AFP è coniugato con l'indicatore (ad esempio Colorante 8 con deassorbimento massimo a 670 nm). La reazione immunochimica tra l’analita e gli anticorpi monoclonali ha luogo nella fase omogenea, in presenza di una fase solida, ad esempio piastre con pozzetti, sensibilizzate con streptavidina , che costituisce metà della separazione non legata/legato .
Schema dell'analisi
i- StAV STET-Mab1anti-AFP AFP Mab2anti-AFP -colorante
→
i- StAV STET-Mab1anti-AFP-AFP-Mab2anti-AFP-colorante
4 incubazione (loraR.T.)
i- StAV STET-Mab1anti-AFP-AFP-Mab2anti-AFP -colorante
in cui 1- StAV è la fase solida sensibilizzata con streptavidina;
[STET-Mab1 anti-AFP è l'anticorpo di cattura coniugato con biotina;
AFP èα-fetoproteina;
M ab2anti-AFP-colorante è l'anticorpo coniugato con l'indicatore.
Dopo aver lavato la piastra con un tampone di lavaggio appropriato, un numero di molecole di Mab2anti-AFP-colorante, uguale a quelle dell'analita rimangono ancorate alla fase solida. Mediante la costruzione di una curva di calibrazione (come è mostrato in figura 5) è possibile terminare la concentrazione di analita AFP in campione di siero prelevato estratto. Il risultato può essere calcolato dall'intensità della luce fluorescente da un volumr costante per ogni campione o campione di riferimento di una soluzione di guanidina, mediante la quale l'immunocomplesso rimane nella fase solida. Una tipica procedura per questo tipo di determinazione è la seguente:
• porre in ciascun pozzetto 50 pL di campione o campione di riferimento;
100 pL di soluzione del coniugato STET-Mab1anti-AFP; 100 pL della solzuione di coniugato di Mab2anti-AFP-colorante;
• Incubare per un'ora a temperatura ambiente.
• Una serie di 5 lavaggi con tampone appropriato è condotta automaticamente impiegando apparecchiatura nota nel campo immunochimico.
• Introdurre in ciascun pozzetto 300 pL di una soluzione (6 M) di dicloruro di guanidina;
• Trasferire 300 pL di soluzione ad una provetta;
• Sottoporre il campione a eccitazione a 670 nm e integrare l'emissione spettrale risultante dopo correzione e normalizzazione.
Si comprenderà che le forme di realizzazione dell'invenzione qui illustrate devono essere considerate come esempi preferiti della medesima e che vari cambiamenti possono essere apportati senza allontanarsi dallo spirito dell'invenzione o dall'ambito protettivo delle seguenti rivendicazioni.
Claims (8)
- RIVENDICAZIONI 1. Composto fluorescente e suoi tautomeri di valenza della formula in cui Q rappresenta una frazione coniugata atta a migliorare la resa quantica fluorescente ed il comportamento di sintonizzazione di detto colorante; è un gruppo funzionalizzato della formula -(CH2)jY in cui Y è scelto dal gruppo costituito da SO3H, COOH, NH2, CHO, NCS, epossido, ftalimido, e COOZ in cui Z rappresenta un gruppo rimovibile; R2 è un gruppo funzionalizzato della formula -(CH2)kY ' in cui Y’ è scelto dal gruppo costituito da SO3H, COOH, NH2, CHO, NCS, epossido, ftalimido, e COOZ in cui Z rappresenta un gruppo rimovibile; M<+ >è un controione scelto dal gruppo costituito da ammonio, cationi di metalli alcalini e cationi di metalli alcalino-terrosi; n= da 1 a 4; m= da 1 a 4, j= da 2 a 10 e k= da 2 a 10.
- 2. Composto fluorescente secondo la rivendicazione 1, in cui Q è scelto dal gruppo costituito da: in cui X è scelto dal gruppo costituito da idrogeno, F, Cl, Br, I e arile sostituito, in cui detto sostituente arilico è scelto dal gruppo costituito da SO3H, COOH, NH2, CHO, NCS, epossido e COOZ in cui Z rappresenta un gruppo residuo e i= 0 o 1.
- 3. Composto fluorescente secondo la rivendicazione 2, in cui Q è ; R1 e R2 sono entrambi carbossipentile e M<+ >è Na<+>.
- 4. Composto fluorescente secondo la rivendicazione 2, in cui Q è \ ; R1 e R2 sono entrambi carbossipentile e M<+ >è Na<+>.
- 5. Composto fluorescente secondo la rivendicazione 2, in cui Q è . f R1 e R2 sono entrambi carbossipentile e M<+ >è Na<+>.
- 6. Composto fluorescente secondo la rivendicazione 2, in cui Q è R1 e R2 sono entrambi carbossipentile e M<+ >è Na<+>.
- 7. Composto fluorescente secondo la rivendicazione 2, in cui Q è CI R1 e R2 sono entrambi ftalimidopropil e M<+ >è Na<+>.
- 8. Composto fluorescente avente la formula: CH3- CH3 <CH3 >CH -O3S O3-Na (CH2)5 COOH COQH 9. Composto fluorescente avente la formula: 10. Composto fluorescente avente la formula: 11. Composto fluorescente avente la formula: 12. Composto fluorescente della formula: 13. Sonda di DNA marcata con un composto fluorescente secondo le rivendicazioni 1-12. 14. Procedimento di analisi di un analita in un campione comprendente il porre a contatto una sonda di DNA secondo la rivendicazione 13 in condizioni adatte per il legame con l'analita in cui il legame è rappresentativo della presenza o quantità dell'analita nel campione e determinare l'estensione di detto legame misurando la fluorescenza della sonda di DNA legata marcata con detto composto fluorescente. 15. Procedimento di analisi secondo la rivendicazione 14, in cui l'analita è separato dal campione prima del contatto con la sonda di DNA. 16. Procedimento di analisi secondo la rivendicazione 15, in cui una seconda sonda di DNA, che non è marcata, è fissata ad una fase solida e l'analita è separato dal campione mediante contatto con detta seconda sonda di DNA in condizioni adatte per il legame e il cui campione rimanente è rimosso prima del contatto dell 'analita con la sonda marcata. 17. Reagente di legame immunologico etichettato con un composto fluorescente secondo le rivendicazioni 1-12. 16. Reagente di legame secondo la rivendicazione 17, in cui detto reagente è un anticorpo. 19. Reagente di legame secondo la rivendicazione 17, in cui detto reagente è un antigene. 20. Reagente secondo la rivendicazione 18, in cui detto anticorpo è un anticorpo monoclonale. 21. procedimento di analisi di un analita in un campione comprendente il porre a contatto un reagente immunologicamente legante etichettato con un composto fluorescente secondo le rivendicazioni 1-12, in condizioni adatte per il legame con l'analita in cui il legame è rappresentativo della presenza o quantità dell'analita nel campione e determinare l'estensione di detto legame misurando la fluorescenza dell'agente immunologicamente legante etichettato con detto composto fluorescente . 22. Procedimento di analisi secondo la rivendicazione 21, in cui l'analita è separato dal campione prima del contatto con il reagente immunologicamente legante. 23. Procedimento di analisi secondo la rivendicazione 22, in cui un secondo reagente immunologicamente legante, che non è marcato, è fissato ad una fase solida e l'analita è separato dal campione mediante contatto con detto secondo reagente immunologicamente legante in condizioni adatte per il legame e in cui il campione rimanente è rimosso prima del contatto dell'analita con il reagente immunologicamente legante marcato.
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