CN108776121A - 一种基于荧光猝灭原理对药材中抗氧剂的高通量筛选方法 - Google Patents

一种基于荧光猝灭原理对药材中抗氧剂的高通量筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于荧光猝灭原理对药材中抗氧剂的高通量筛选方法，其包括如下步骤：(1)溶液配制：包括样品溶液的配制、阳性对照品溶液配制、阴性对照溶液的配制、荧光生成反应液的配制；(2)微阵列芯片的制备：将对照品溶液和样品溶液点于薄层预制硅胶板上；(3)荧光猝灭图像的获取：取微阵列芯片，荧光生成反应液雾化，置于薄层图像观察仪中，曝光，采集图像；(4)数据处理：采集的图像导入TLC分析软件中进行像素分析；该方法具有样品前处理简单、通量高、成本低廉的优点；反应体系为荧光自发光***，不会受样品本身颜色和外界光源的干扰，具有良好的专属性。

Description

一种基于荧光猝灭原理对药材中抗氧剂的高通量筛选方法
技术领域
本发明属于药物技术领域，公开了一种基于荧光猝灭原理的抗氧剂高通量筛选方法，用于抗氧剂的筛选、追踪及总抗氧化活性评价。
背景技术
关于人类的生老病死，自由基衰老理论是较为被人们接受的理论之一。该理论认为，衰老过程中的退行性变化是由于细胞正常代谢过程中产生的自由基的有害作用造成的。生物体系中的自由基主要以活性氧的形态存在，包括超氧阴离子(O2 .-)，羟基自由基(OH.-)，双氧水(H2O2)等，它们是线粒体在有氧代谢过程中产生的副产物。活性氧具有高反应活性，对机体的组织、蛋白、DNA造成氧化损伤。损伤的累积会造成细胞和组织功能损伤或丧失，从而引起衰老和疾病。在生理情况下，机体内部的抗氧化***能够清除过量的自由基从而使机体免受其伤害，达到一种氧化还原平衡状态。但在病理状况下，过量自由基的产生或抗氧化***的失职将令机体处于一种氧化应激的状态，进而引起老化和一些退行性疾病。研究发现，外源性的抗氧剂可以阻止自由基链式反应而改变机体的氧化应激状态。绝大多数疾病与过量自由基的产生息息相关，除了少数遗传性疾病。外源性抗氧剂的补充可以大大改善患者的健康状况。最新有研究显示，甚至在出生之前补充抗氧剂也可延缓衰老。目前以“antioxidant supplement”为关键词在ClinicalTrials.gov网站上搜索到的抗氧化补充剂的临床试验多达1000多项。目前常用的抗氧剂有维生素类(C和E)，微量元素，黄酮类和酚酸类等，诸多临床试验的效果并不尽如人意，原因可能与部分抗氧剂可能会引起炎症反应有关，因此，筛选出即具有强抗氧化活性又具有较好抗氧活性的抗氧剂显得尤为迫切。
目前为止，高通量筛选抗氧剂的方法主要有96孔板法和流动注射法。复杂的样品处理过程和昂贵的精密仪器使得这些方法不仅效率低下，而且难以普及。因此，需要寻找一种简便经济的快速筛选抗氧剂的方法，并同时追踪及评价抗氧剂活性的方法。
发明内容
发明人在研发过程中发现鲁米诺作为一种荧光底物被广泛应用于刑事侦查，即使用水冲洗过犯罪现场，残留的血迹中微量的铁离子仍然可以催化鲁米诺的氧化还原反应，发出425nm的荧光用于辨认血迹。受此启示，如若有抗氧剂的存在，将与鲁米诺竞争性的抢夺氧化剂，从而降低荧光的强度。为此，我们以预制硅胶G板作为芯片载体，将样品以微阵列的形式加载于芯片上。然后依次以双氧水和鲁米诺半定量地雾化。理论上来讲，整个芯片表面应产生蓝色荧光，而具有抗氧化能力的样品点样处则会产生荧光强度的减弱。然而这样产生的荧光强度太弱，不足以被普通的图像采集设备捕获到。我们利用一种高效催化剂-铁***，大大提高了荧光效率，使得反应产生的荧光肉眼可见，且持续20～30s的时间，可以进行图像捕获进行进一步的像素分析。
本发明建立的一种基于荧光猝灭原理的抗氧剂高通量筛选方法，具有样品前处理简单、通量高、成本低廉的优点。本发明的方法中反应体系为荧光自发光***，不会受样品本身颜色和外界光源的干扰，具有良好的专属性。
本发明是通过下述技术方案实现的：
一种基于荧光猝灭原理的对药材中抗氧剂高通量筛选方法，其包括如下步骤：
步骤1，溶液配制：
步骤2、微阵列芯片的制备：
步骤3、荧光猝灭图像的获取：
步骤4、数据处理。
进一步，本发明基于荧光猝灭原理的对药材中抗氧剂高通量筛选方法，还包括步骤5HPLC-DAD-CL/MS分析追踪活性成分的方法。该步骤能够进一步识别和指认被筛选出抗氧化活性成分。
上述步骤(1)所述溶液配制包括样品溶液的配制、阳性对照品溶液配制、阴性对照溶液的配制、荧光生成反应液的配制。
所述样品为药材粉末，药材为常用生药材或饮片，包括但不限于石菖蒲、贝母、枳壳、巴戟天、菊花、甘草、柴胡、三七、黄柏、党参、灵芝、西洋参、茯苓、山茱萸、桂枝、赤芍、大黄、当归、枳实、酸枣仁、白芍、青皮、黄连、天麻、桃仁、白芷、白术、人参、川赤芍、陈皮、无柄灵芝、北五味子、黄芪、红花、南五味子、升麻、川芎、紫芝、肉桂、野木瓜中一种或多种。
所述样品溶液的制备：取药材粉末，加入10-30倍量(g/ml)的30～95％乙醇，超声或回流提取15～60min，即得样品溶液。
优选上述样品溶液的制备中，所述乙醇浓度40-60％，最佳所述乙醇浓度为50％。所述超声提取为30min。
上述步骤(1)中所述阳性对照品溶液：取Vitamin C对照品，加入30～95％乙醇定容并制成终浓度为10～30mg/mL溶液。进一步优选所述乙醇浓度40-60％，最佳乙醇浓度为50％。
上述步骤(1)中所述阴性对照品溶液：非还原性低聚糖类加水溶解即可。
所述非还原性低聚糖类包括但不限于D-葡萄糖、果糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-蔗果五糖。
具体，称取D-葡萄糖、果糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-蔗果五糖适量加水溶解并制成终浓度为10-30mg/mL溶液。
优选，阴性对照品溶液：称取D-葡萄糖、果糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-蔗果五糖适量加水溶解并制成终浓度为20mg/mL溶液。
上述步骤(1)中所述荧光生成反应液包括荧光底物溶液、荧光激发液。所述荧光底物溶液是由鲁米诺用氢氧化钠溶液溶解成终浓度为(1.5～3)×10-2M的混合液。所述氢氧化钠浓度为(5～10)×10-1M。
进一步优选，所述荧光底物溶液是由鲁米诺用7.50×10-1M氢氧化钠溶液溶解成终浓度为(1.5～3)×10-2M的混合液(优选2.26×10-2M)。
所述荧光激发液是由铁***溶液和双氧水溶液配制成(1～2.5)×10-1M的混合溶液。所述铁***溶液浓度为(1～2)×10-1M；所述双氧水浓度为20-40％。所述荧光激发液需要临用前配制。进一步优选，用水溶解适量铁***制成终浓度为1.52×10-1M的储备液，临用前加30％的双氧水使其终浓度为1.94×10-1M作为荧光激发液。
本发明步骤(2)中所述微阵列芯片的制备：将薄层预制硅胶板，对照品溶液和样品溶液以10×10矩阵方式点样于小板上，斑点中心距离3.5mm，用冷空气吹干板面残留溶剂，制备好的芯片置于真空干燥器内存放。
本发明步骤(3)所述图像捕获：取微阵列芯片，首先以双氧水铁***荧光激发液雾化，然后以鲁米诺荧光底物液进行雾化，迅速置于薄层图像观察仪中，曝光，采集图像。
进一步优选，图像捕获：首先以双氧水铁***荧光激发液雾化，锯齿式均匀地雾化两个“之”字形，横向纵向各一个，然后以鲁米诺荧光底物液进行雾化，五个“之”字。迅速置于薄层图像观察仪中，曝光时间8000～12,000ms，(优选102,000ms)增益1.0，进行图像采集。本发明采用计数交叉“之”字形雾化可以更均匀，而且达到半定量的效果。
本发明步骤(4)数据处理：将步骤(3)采集的图像导入TLC Image Analyzer5.0(公开号：CN 104792915A公开的全部内容)进行像素分析，选取强度高和噪音低的蓝色通道进行峰面积积分，线性回归、精密度考察、热图分析等均由R(RGui 64-bit,version 3.2.3,Win 864-bit system)处理生成，筛选出抗氧活性。
本发明步骤(5)所述的HPLC-DAD-CL/MS分析追踪活性成分的方法，化学发光抗氧化图谱中较强峰对应的高效液相色谱峰具有较强抗氧活性，具有较强抗氧化活性的色谱峰信息由质谱进一步确认，包括如下步骤：
步骤A，高效液相色谱联合流动注射化学发光法(HPLC-DAD-CL)测定抗氧剂，超微弱化学发光检测器串联于高效液相色谱仪的DAD检测器；
高效液相色谱条件中色谱柱、流动相、流速、进样量、柱温、检测波长根据步骤(1)被测样品溶液活性成分设定；
超微弱化学发光检测器条件：流通池体积：50～500μL；高压：200～1200V；增益：1～16；
质谱MS分析条件：模式：负离子；扫描范围：100～1600m/z；喷雾电压：-1.0～-4.2kV；雾化器压力：20～50psi；脱溶剂气体温度：100～500℃，流速：3～9L/min；碰撞电压设置：50～120；碰撞能量：10～80；载气：高纯氮气。
本发明优选技术方案，样品药材为大黄，按照步骤(1)～(4)获得的大黄抗氧剂，按照步骤(5)追踪大黄抗氧剂中成分及含量。
步骤A，高效液相色谱联合流动注射化学发光法(HPLC-DAD-CL)测定抗氧剂，超微弱化学发光检测器串联于高效液相色谱仪的DAD检测器；
高效液相色谱法：
色谱柱：C18
流动相如下表
时间(min) 乙腈％ 水％
0-20 12 88
20-46 18 82
46-57 29 71
57-60 34 66
60 40 .60
流速：0.8～1.5mL/min，优选1.0mL/min；
进样量：1.0μL；柱温：30℃；检测波长：269nm；
超微弱化学发光检测法：
流通池体积：50～500μL；高压：200～1200V；增益：1～16；
优选
超微弱化学发光检测器条件：流通池体积：200μL；高压：1000V；增益：1.0；
步骤B质谱分析MS模式：负离子；扫描范围：100～1000m/z；喷雾电压：-1.0～-4.2kV；雾化器压力：20～50psi；脱溶剂气体温度：100～500℃，流速：3～9L/min；碰撞电压设置：50～120；碰撞能量：10～80；载气：高纯氮气。
步骤B质谱分析(MS)
工作站：Q-TOF B.05.01(B5125.3)；模式：负离子；扫描范围：100-1000m/z；喷雾电压：-3.5kV；雾化器压力：45psi；脱溶剂气体温度：300℃，流速：8L/min；碰撞电压设置：100；碰撞能量：20；载气：高纯氮气。
本发明有益效果
1、我们以预制硅胶G板作为芯片载体，将样品以微阵列的形式加载于芯片上。然后依次以双氧水和鲁米诺半定量地雾化。理论上来讲，整个芯片表面应产生蓝色荧光，而具有抗氧化能力的样品点样处则会产生荧光强度的减弱。然而这样产生的荧光强度太弱，不足以被普通的图像采集设备捕获到。我们利用一种高效催化剂-铁***，大大提高了荧光效率，使得反应产生的荧光肉眼可见，且持续20～30s的时间，可以进行图像捕获进行进一步的像素分析。
2、本发明建立的一种基于荧光猝灭原理的抗氧剂高通量筛选方法，具有样品前处理简单、通量高、成本低廉的优点。本发明的方法中反应体系为荧光自发光***，不会受样品本身颜色和外界光源的干扰，具有良好的专属性。
3、本发明建立的一种基于荧光猝灭原理的抗氧剂高通量筛选方法，经过方法学验证，该方法安全可靠。
4、采用荧光猝灭微阵列方法建立抗氧剂的高通量筛选和活性评价模型，筛选出具有较强抗氧化活性的化合物，对已知抗氧剂的活性进行了评价。
附图说明
图1：专属性试验和高通量筛选结果：(a)可见光；(b)366nm；(c)暗室自发光；(d)基于(c)生成的热图。图(d)中，1A-1J:Vitamin C不同点样量(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1μL),2A:空白,2B:水,2C:乙醇,2D:50％乙醇,2E:葡萄糖,2F:果糖,2G:蔗糖,2H:1-蔗果三糖,2I:耐斯糖,2J:1F-蔗果五糖,3A-10J:两个点样量的40个常用中药样品(0.1μL-1μL)，样品名称及顺序见图3。
图2：线性和精密度试验：(a)Vitamin C的线性关系；(b)芯片内精密度；(c)芯片间精密度。
图3：常用40种中药的高通量筛选结果：1.石菖蒲；2.贝母(未经硫熏)；3.贝母(硫熏)；4.枳壳；5.巴戟天；6.菊花；7.甘草；8.柴胡；9.三七；10.黄柏；11.党参；12.灵芝；13.西洋参；14.茯苓；15.山茱萸；16.桂枝；17.赤芍；18.大黄；19.当归；20.枳实；21.酸枣仁；22.白芍；23.青皮；24.黄连；25.天麻；26.桃仁；27.白芷；28.白术；29.人参；30.川赤芍；31.陈皮；32.无柄灵芝；33.北五味子；34.黄芪；35.红花；36.南五味子；37.升麻；38.川芎；39.紫芝；40.肉桂。
图4：大黄化学和抗氧化活性镜像图：上图-269nm HPLC-DAD指纹图谱；下图-基于双氧水清除的化学发光指纹图谱。
图5：野木瓜化学和抗氧化活性镜像图：上图-203nm HPLC-DAD指纹图谱；下图-基于双氧水清除的化学发光指纹图谱。
具体实施方式
以下结合附图说明本发明的具体实施方式，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的组成部分，而并未排除其它组成部分。
实施例1
1.材料、试剂与仪器
1.1.样品与对照品所有中药材样品均收集自广西玉林中药材市场，经具有50多年药检经验的谢培山教授鉴定为药典收录品种。D-无水葡萄糖(批号110833-200904，纯度100％，中检院)；果糖(批号100231-201305，纯度99.4％，中检院)；蔗糖(批号111507-201303，纯度99.8％，中检院)；1-蔗果三糖(批号AWG0714，纯度99.0％，日本和光纯药工业株式会社)；耐斯糖(批号AWG0714，纯度99.0％，日本和光纯药工业株式会社)；1F-蔗果五糖(批号AWG0714，纯度80.0％，日本和光纯药工业株式会社)；Vitamin C(批号100425-201504，纯度100％，中检院)；表儿茶素(批号110878-200102，纯度100％，中检院)；儿茶素(批号110877-201604，纯度99.2％，中检院)，其它对照品包括染料木素，柚皮素，柚皮苷，鸢尾苷元为自制，HPLC归一化法显示纯度均大于95％。
1.2.其它材料预制硅胶G60薄层板(批号HX69481826,Merck)，液体喷雾器(CAMAG)。
1.3.试剂试药无水乙醇(批号20160901-2，广州化学试剂厂)；实验用水为三重蒸馏水；色谱纯乙腈(批号JA048130，Merck，德国)；铁***(批号20150901-1，广州化学试剂厂)；鲁米诺(批号MKBJ0761V，Sigma)；双氧水(批号20161102-1，广州化学试剂厂)；碳酸氢钠(批号20130401-1，广州化学试剂厂)；碳酸钠(批号20131101-1，广州化学试剂厂)；EDTA-2Na(批号20130901-1，广州化学试剂厂)；氢氧化钠(批号20140901-1，广州化学试剂厂)。
1.4.仪器SmartCut薄层板切割器(CAMAG，瑞士)；ATS 4薄层自动点样***(CAMAG，瑞士)；薄层图像观察仪(CAMAG，瑞士)；KQ-500TDE型高频数控超声仪(昆山市超声仪器有限公司)；BT25S型电子天平(Sartorious，德国)；SZ-97A型三重纯水蒸馏***(上海亚荣生化仪器厂)；TLC观察仪(CAMAG，瑞士)；Agilent1260系列液相色谱仪(Agilent，美国)配备C18色谱柱(250×4.6mm,5μm,Kromasil，瑞典)；IFFM-E型超微弱化学发光检测仪(Remex，西安)；Agilent 6540B Q-ToF液质联用仪(Agilent，美国)。
2.实验方法
步骤(1)
2.1.溶液的制备
样品溶液
取0.5g药材粉末(打粉前50℃过夜烘干)，精密称定，精密加入10mL 50％乙醇，超声提取30min，摇匀，通过0.25μm微孔滤膜，取续滤液作为样品溶液。
所述药品为1.石菖蒲；2.贝母(未经硫熏)；3.贝母(硫熏)；4.枳壳；5.巴戟天；6.菊花；7.甘草；8.柴胡；9.三七；10.黄柏；11.党参；12.灵芝；13.西洋参；14.茯苓；15.山茱萸；16.桂枝；17.赤芍；18.大黄；19.当归；20.枳实；21.酸枣仁；22.白芍；23.青皮；24.黄连；25.天麻；26.桃仁；27.白芷；28.白术；29.人参；30.川赤芍；31.陈皮；32.无柄灵芝；33.北五味子；34.黄芪；35.红花；36.南五味子；37.升麻；38.川芎；39.紫芝；40.肉桂。
阳性对照品溶液
精密称取Vitamin C对照品约50mg，加50％乙醇溶解定容2mL，溶液通过0.25μm微孔滤膜，制得阳性对照品溶液。
阴性对照溶液
称取D-葡萄糖、果糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-蔗果五糖适量加水溶解并制成终浓度为20mg/mL溶液，通过0.25μm微孔滤膜得阴性对照溶液。荧光生成反应液
称取鲁米诺适量，用7.50×10-1M NaOH溶液溶解制成终浓度为2.26×10-2M的混合溶液，作为荧光底物溶液；用水溶解适量铁***制成终浓度为1.52×10-1M的储备液，临用前加30％的双氧水使其终浓度为1.94×10-1M作为荧光激发液。
步骤(2)
2.2.微阵列芯片的制备
将薄层预制硅胶G 60板切成5cm见方的小板，对照品溶液和样品溶液以10×10矩阵方式点样于小板上，斑点中心距离3.5mm，用冷空气吹干板面残留溶剂，制备好的芯片置于真空干燥器内存放。
步骤(3)-(4)
2.3.图像捕获及数据处理
首先以双氧水铁***荧光激发液雾化，锯齿式均匀地雾化两个“之”字形，横向纵向各一个，然后以鲁米诺荧光底物液进行雾化，五个“之”字。迅速置于薄层图像观察仪中，曝光时间10,000ms，增益1.0，进行图像采集。随后将分辨率为343×343的bmp格式图像导入TLC Image Analyzer 5.0(已申请专利，公开号：CN 104792915A)进行像素分析，选取强度高和噪音低的蓝色通道进行峰面积积分，线性回归、精密度考察、热图分析等均由R(RGui 64-bit,version3.2.3,Win 864-bit system)处理生成。
步骤(5)
2.4.流动注射化学发光法(HPLC-DAD-CL)
超微弱化学发光检测器串联于DAD检测器后，流动相梯度如下：乙腈(A)和水(B),0min-12％A；20min-18％A；46min-29％A；57min-34％A；60min-40％A；流速：1.0mL/min；进样量：1.0μL；柱温：30℃；检测波长：269nm；流通池体积：200μL；高压：1000V；增益：1.0；黄酮类化合物抗氧化活性评价时将色谱柱卸载；具体检测方法参考文献报道[14]。
2.5.质谱分析(MS)
工作站：Q-TOF B.05.01(B5125.3)；模式：负离子；扫描范围：100-1000m/z；喷雾电压：-3.5kV；雾化器压力：45psi；脱溶剂气体温度：300℃，流速：8L/min；碰撞电压设置：100；碰撞能量：20；载气：高纯氮气。
3.实验结果
3.1方法学考察(专属性、线性、精密度、检测限)
非还原性低聚糖类未见有体外抗氧活性的报道，因此选取该类物质作为阴性对照；Vitamin C作为阳性对照；结果如附图1所示。溶剂、D-葡萄糖、果糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-蔗果五糖均未见有荧光强度的削弱，而阳性对照Vitamin C斑点则有明显的暗斑出现。另外，该方法属于自发光体系，不受外界光源的干扰，具有良好的专属性。分别点样0.1-1.0μL的Vitamin C(23.1mg/mL)阳性对照溶液10个斑点于芯片上，结果显示荧光猝灭峰面积与Vitamin C的点样量呈良好的线性关系，回归方程为：y＝4618.2x-1150.4，(R2＝0.9978,n＝10)，y为荧光猝灭斑点的峰面积，x为Vitamin C的点样量(μg)。分别以上述10个点样量点于同一芯片(n＝10)和不同芯片(n＝6)上考察方法的精密度，同一芯片内以峰面积为指标，芯片间以相对峰面积为指标考察RSD(％)值，结果显示芯片内精密度随着点样量上升至0.5μL，RSD迅速下降至5％以内，芯片间精密度也有这种趋势，当点样量>0.5μL时，RSD均在10％范围内。因此，该方法的精密度良好，结果见附图2。点样量为1μL时，Vitamin C的检测限为622ng/mL。
3.2.高通量筛选结果
40个供试品溶液分别以0.1μL和1.0μL两个点样量点样于芯片上，总抗氧化活性如附图3所示。抗氧化活性排名前三位的是：大黄(18号)、桂枝(16号)和肉桂(40号)；贝母硫熏后抗氧化活性大幅下降(2号和3号)；枳实(20号)的抗氧化活性强于枳壳(4号)；青皮(23号)的抗氧化活性显著强于陈皮(31号)；两个种子类药材酸枣仁(21号)和桃仁(26号)抗氧化活性微弱；南五味子(36号)的抗氧化活性显著强于北五味子(33号)。
3.3.HPLC-DAD-CL/MS分析追踪活性成分
为了进一步追踪抗氧化活性成分，HPLC-DAD-CL/MS技术用于进一步识别和指认抗氧化活性成分。以排名第一大黄药材(18号)为例，实验结果如附图4所示，上图为269nm下化学信息图谱，下图为化学发光抗氧化图谱，在下图中对应有较强倒峰的成分具有较强的抗氧化活性。具有较强抗氧化活性的色谱峰信息由质谱进一步确认，色谱峰信息如下表所示：
表1：大黄主要抗氧化成分的色谱峰信息
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实施例2 HPLC-DAD-CL/MS追踪野木瓜中抗氧化活性成分
供试品溶液制备
野木瓜药材40℃干燥过夜，粉碎过80目筛，取1.0g加60mL乙醇超声提取30min，过滤，滤液减压干燥至干，残渣加适量甲醇溶解，定容止2.0mL，通过0.45μm微孔滤膜，取续滤液制得。
步骤(1)-(4)溶液配制、微阵列芯片的制备、荧光猝灭图像的获取、数据处理同实施例1。
步骤(5)HPLC-DAD-CL/MS追踪野木瓜中抗氧化活性成分
HPLC色谱条件：
色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱，4.6mm×150mm，粒径5μm。
流动相：0.1％磷酸乙腈(A)和0.1％磷酸水(B),0min-5％A；120min-30％
A；流速：1.0mL/min；进样量：1.0μL；柱温：35℃；检测波长：203nm；
流通池体积：450μL；高压：1000V；增益：1.0。
质谱条件：
仪器：AB Sciex 3200串联四级杆离子阱质谱；工作站：1.4.2
Software；模式：负离子；扫描范围：100-1600m/z；喷雾电压：-4.2kV；
去簇电压：-20V；入口电压：-10V；碰撞能：-100V(质量依赖最大值)；
帘气：20psi；碰撞气：high；离子源温度：600℃，气压1和2:50psi。实验结果：利用对照品、质谱数据和参考文献对色谱峰指认结果如图5、表2所示：野木瓜中主要的抗氧化活性成分为大极性物质，大部分皂苷类成分没有直接的自由基清除作用。
表2野木瓜主要抗氧化成分的色谱峰信息
试验例1
方法可靠性验证
实施例1中筛选出具有较强抗氧化活性的物质6个(表1)用流动注射化学发光法进行了结果确认。对于高通量筛选方法，以与实施例1中相同的点样量的Vitamin C构建标准曲线，荧光猝灭斑点面积与Vitamin C浓度(0.661-5.29mg/mL)的对数呈较好的线性关系，线性方程为：y＝21592*ln(x)+24753(r2＝0.9744),其中y为荧光猝灭斑点的面积，x为Vitamin C的浓度。抗氧化活性以相对抗坏血酸当量(RAAE，抗坏血酸当量与其实际浓度的比值)表示，如果RAAE大于1，则表明抗氧化活性强于Vitamin C。对于流动注射化学发光法，鲁米诺与双氧水浓度分别为4.68×10-5M和2.42×10-1M，发光抑制率与Vitamin C浓度的自然对数呈良好的线性关系，线性方程为：y＝0.224*ln(x)+0.9312(r2＝0.9916),其中y为发光抑制率，x为Vitamin C的浓度。两种方法的结果见下表3。
表3：本发明芯片分析与流动注射法测定相对抗坏血酸当量的比较
单侧Wilcoxon检测的P值为0.016(<0.05),两种方法的结果存在显著性差异，本发明荧光芯片法的结果显著大于流动注射化学发光法的结果。Pearson相关性分析则显示，两种方法的结果存在极好的相关性，相关系数高达0.98，关系如下：RAAE荧光芯片＝21.95×RAAE化学发光+1.51。结果的差异应该由体系的pH值不同引起，黄酮类物质的抗氧化活性随着pH值的增加而上升。流动注射化学发光法反应体系的pH约为10，而荧光芯片体系的pH约为13.5。儿茶素与表儿茶素的抗氧化活性相近，均高于柚皮素。柚皮素糖基化成苷后，抗氧化活性明显降低。儿茶素与其衍生物也是茶叶的主要抗氧化活性成分。说明新方法较为可靠。
试验例2实验条件优化
本发明的难点在于所激发的荧光的寿命较短，较难捕捉到稳定的荧光图片。为了延长荧光寿命，采用单因素试验对实验条件进行了优化。将鲁米诺浓度设置为2.26×10-2M，考察双氧水的四个浓度3.92×10-2,1.96×10-1,3.92×10-1,9.79×10-1M，结果显示1.96×10-1M的双氧水产生的荧光强度最强；荧光强度随着曝光时间的延长而逐渐增强，受限于薄层观察仪的参数上限，选择10,000ms作为最佳曝光时间；铁***的浓度也是影响荧光寿命的一个关键因素，四个浓度0.1％,1％,5％,10％的筛选结果显示，5％的铁***所产生的荧光寿命最长。

Claims (10)

1.一种基于荧光猝灭原理对药材中抗氧剂的高通量筛选方法，其包括如下步骤：
(1)溶液配制：包括样品溶液的配制、阳性对照品溶液配制、阴性对照溶液的配制、荧光生成反应液的配制；
(2)微阵列芯片的制备：将对照品溶液和样品溶液点于薄层预制硅胶板上；
(3)荧光猝灭图像的获取：用荧光生成反应液雾化微阵列芯片，置于薄层图像观察仪中，曝光，采集图像；
(4)数据处理：采集的图像导入TLC分析软件中进行像素分析，筛选出抗氧活性。
2.如权利要求1所述的一种基于荧光猝灭原理对药材中抗氧剂的高通量筛选方法，其特征在于，还包括步骤(5)用HPLC-DAD-CL/MS分析追踪抗氧活性成分的方法。
3.如权利要求1所述的一种基于荧光猝灭原理对药材中抗氧剂的高通量筛选方法，其特征在于：所述样品溶液的制备，取药材粉末，加入含水乙醇，超声或回流提取，即得样品溶液；所述阳性对照品溶液：取Vitamin C对照品，加入含水乙醇定容即可；所述阴性对照品溶液：取非还原性低聚糖类加水溶解即可；所述荧光生成反应液包括荧光底物溶液、荧光激发液，所述荧光底物溶液是由鲁米诺用氢氧化钠溶液溶解成的混合溶液，所述荧光激发液是由铁***溶液和双氧水溶液配制成的混合溶液。
4.如权利要求1所述的一种基于荧光猝灭原理对药材中抗氧剂的高通量筛选方法，其特征在于：所述样品溶液的制备，取药材粉末，加入10～30倍量的30～95％乙醇，超声或回流提取15～60min，即得样品溶液；所述阳性对照品溶液：取Vitamin C对照品，加入30～95％乙醇定容成终浓度为10～30mg/mL溶液即可；所述阴性对照品溶液：取非还原性低聚糖类加水溶解成终浓度为10～30mg/mL溶液即可；所述荧光生成反应液包括荧光底物溶液、荧光激发液，所述荧光底物溶液是由鲁米诺用氢氧化钠溶液溶解成终浓度为(1.5～3)×10-2M的混合溶液，所述荧光激发液是由铁***溶液和双氧水溶液配制成(1～2.5)×10-1M的混合溶液。
5.如权利要求4所述的一种基于荧光猝灭原理对药材中抗氧剂的高通量筛选方法，其特征在于：所述氢氧化钠浓度为(5～10)×10-1M；所述铁***溶液浓度为(1～2)×10-1M；所述双氧水浓度为20～40％。
6.如权利要求1所述的一种基于荧光猝灭原理对药材中抗氧剂的高通量筛选方法，其特征在于：步骤(2)中所述微阵列芯片的制备：将薄层预制硅胶板，对照品溶液和样品溶液以10×10矩阵方式点样于小板上，斑点中心距离3.5mm，用冷空气吹干板面残留溶剂，制备好的芯片置于真空干燥器内存放。
7.如权利要求1所述的一种基于荧光猝灭原理对药材中抗氧剂的高通量筛选方法，其特征在于：步骤(3)所述图像捕获：取微阵列芯片，首先以双氧水铁***荧光激发液雾化，然后以鲁米诺荧光底物液进行雾化，迅速置于薄层图像观察仪中，曝光，采集图像。
8.如权利要求7所述的一种基于荧光猝灭原理对药材中抗氧剂的高通量筛选方法，其特征在于：步骤(3)所述图像捕获：首先以双氧水铁***荧光激发液雾化，锯齿式均匀地雾化两个“之”字形，横向纵向各一个，然后以鲁米诺荧光底物液进行雾化，五个“之”字，迅速置于薄层图像观察仪中，曝光时间8000～12,000ms，增益1.0，进行图像采集。
9.如权利要求2所述的一种基于荧光猝灭原理对药材中抗氧剂的高通量筛选方法，其特征在于：步骤(5)HPLC-DAD-CL/MS分析追踪活性成分的方法包括对筛选出抗氧化活性成分用高效液相色谱联合流动注射化学发光法HPLC-DAD-CL测定抗氧剂和质谱MS分析及评价，化学发光抗氧化图谱中较强峰对应的高效液相色谱峰具有较强抗氧活性，具有较强抗氧化活性的色谱峰信息由质谱进一步确认，所述高效液相色谱条件、超微弱化学发光检测条件、质谱条件根据药材成分进行设定。
10.如权利要求2所述的一种基于荧光猝灭原理对药材中抗氧剂的高通量筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)溶液的制备
样品溶液：
取0.5份药材粉末，打粉前50℃过夜烘干，精密称定，精密加入15-25倍量40-60％乙醇，超声提取20-40min，摇匀，通过0.25μm微孔滤膜，取续滤液作为样品溶液；所述药品为石菖蒲、未经硫熏贝母、硫熏贝母、枳壳、巴戟天、菊花、甘草、柴胡、三七、黄柏、党参、灵芝、西洋参、茯苓、山茱萸、桂枝、赤芍、大黄、当归、枳实、酸枣仁、白芍、青皮、黄连、天麻、桃仁、白芷、白术、人参、川赤芍、陈皮、无柄灵芝、北五味子、黄芪、红花、南五味子、升麻、川芎、紫芝、肉桂、野木瓜中一种或以上；
阳性对照品溶液：
精密称取Vitamin C对照品，加40～60％乙醇溶解成浓度为25mg/ml，溶液通过0.25μm微孔滤膜，制得阳性对照品溶液；
阴性对照溶液：
称取D-葡萄糖、果糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-蔗果五糖适量加水溶解并制成终浓度为20mg/mL溶液，通过0.25μm微孔滤膜得阴性对照溶液；
荧光生成反应液：
称取鲁米诺适量，用7.50×10-1M NaOH溶液溶解制成终浓度为2.26×10-2M的混合溶液，作为荧光底物溶液；用水溶解适量铁***制成终浓度为1.52×10-1M的储备液，临用前加30％的双氧水使其终浓度为1.94×10-1M作为荧光激发液；
(2)微阵列芯片的制备：
将薄层预制硅胶G 60板切成5cm见方的小板，对照品溶液和样品溶液以10×10矩阵方式点样于小板上，斑点中心距离3.5mm，用冷空气吹干板面残留溶剂，制备好的芯片置于真空干燥器内存放；
(3)图像捕获：
首先以双氧水铁***荧光激发液雾化，锯齿式均匀地雾化两个“之”字形，横向纵向各一个，然后以鲁米诺荧光底物液进行雾化，五个“之”字，迅速置于薄层图像观察仪中，曝光时间10,000ms，增益1.0，进行图像采集；
(4)数据处理：
将分辨率为343×343的bmp格式图像导入TLC Image Analyzer 5.0进行像素分析，选取强度高和噪音低的蓝色通道进行峰面积积分，线性回归、精密度考察、热图分析处理生成，筛选抗氧活性；
(5)HPLC-DAD-CL/MS分析追踪活性成分的方法：
化学发光抗氧化图谱中较强峰对应的高效液相色谱峰具有较强抗氧活性，具有较强抗氧化活性的色谱峰信息由质谱进一步确认，超微弱化学发光检测器串联于DAD检测器后，高效液相色谱条件中色谱柱、流动相、流速、进样量、柱温、检测波长根据步骤(1)被测样品溶液抗氧活性成分设定；
超微弱化学发光检测器条件：流通池体积：50～500μL；高压：200～1200V；增益：1～16；
质谱MS分析条件：模式：负离子；扫描范围：100～1600m/z；喷雾电压：-1.0～-4.2kV；雾化器压力：20～50psi；脱溶剂气体温度：100～500℃，流速：3～9L/min；碰撞电压设置：50～120；碰撞能量：10～80；载气：高纯氮气。
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