CN106132934A - 治疗炎性病症的苯并咪唑衍生物及其医药组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了式(I)化合物，其中Cy、R1、L1、R3、R4、R5、La和Ra如本文所定义。公开了能够抑制JAK的新的式(I)的苯并咪唑，这些化合物可以制备成医药组合物，可用于预防和治疗哺乳动物、包括人的多种病症，包括作为非限制性实例的过敏性疾病、炎性疾病、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨转换受损的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6分泌过多或干扰素分泌过多相关的疾病。

Description

治疗炎性病症的苯并咪唑衍生物及其医药组合物
技术领域
本发明涉及作为JAK抑制剂的化合物，JAK是在过敏性疾病、炎性疾病、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨转换受损的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6分泌过多或干扰素分泌过多相关的疾病中牵涉的酪氨酸激酶家族。具体而言，本发明的化合物抑制JAK1和/或TYK2。本发明还提供了生产本发明的化合物的方法、包含本发明的化合物的医药组合物、通过施用本发明的化合物来预防和/或治疗包括如下的疾病的方法：过敏性疾病、炎性疾病、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨转换受损的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6分泌过多或干扰素分泌过多相关的疾病。
发明背景
杰纳斯(Janus)激酶(JAKs)是将细胞因子信号从膜受体转导至STAT转录因子的胞质酪氨酸激酶。记载了四种JAK家族成员，JAK1、JAK2、JAK3和TYK2。在细胞因子与其受体结合后，JAK家族成员自磷酸化和/或彼此转磷酸化，然后是STAT磷酸化，其随后迁移至细胞核以调节转录。JAK-STAT胞内信号转导服务于干扰素、大部分白介素以及多种细胞因子和内分泌因子如EPO、TPO、GH、OSM、LIF、CNTF、GM-CSF和PRL(Vainchenker等人,2008)。
遗传模型和小分子JAK抑制剂研究的联合揭示了数种JAK的治疗潜能。JAK3经小鼠和人类遗传学验证为免疫抑制靶标(O'Shea等人,2004)。JAK3抑制剂被成功地引入临床开发，最初用于器官移植排斥，但后来还用于其它免疫-炎性适应证如类风湿性关节炎(RA)、银屑病和节段性回肠炎(http://clinicaltrials.gov/)。
TYK2是免疫炎性疾病的潜在靶标，经人类遗传学及小鼠基因敲除研究得以验证(Levy和Loomis,2007)。
JAK1是免疫炎性疾病区域中的靶标。JAK1与其它JAK异二聚化以转导细胞因子驱动的促炎信号传导。因此，JAK1的抑制是具有使用JAK1信号传导的病理学相关细胞因子如IL-6、IL-4、IL-5、IL-13或IFNγ的免疫炎性疾病以及由JAK介导的信号转导所驱动的其它疾病所关注的。
软骨退化是多种疾病的标志，其中类风湿性关节炎和骨关节炎为最显著的。类风湿性关节炎(RA)是一种以关节结构发炎和遭破坏为特征的慢性关节退化疾病。当该疾病未被检查出时，其由于关节功能丧失而导致实质性失能和疼痛和甚至导致过早死亡。因此，RA疗法的目标不仅是减缓疾病，而且还有实现减轻以终止关节破坏。除疾病后果的严重性外，RA的高发病率(全世界约0.8％的成年人患病)意味着巨大的社会经济影响。(Choy和Panayi,2001；Firestein,2003；Lee和Weinblatt,2001；O'Dell,2004；Smolen和Steiner,2003)。
JAK1和JAK2在多种细胞因子和激素的细胞内信号转导中有牵涉。与任意这些细胞因子和激素相关联的病状可通过JAK1和JAK2抑制剂得以改善。因此，多种过敏性或炎性病症以及自身免疫疾病可得益于用本发明所述的化合物进行的治疗，包括类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、幼年型特发性关节炎、骨关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺病COPD、组织纤维化、嗜酸细胞性炎症、食管炎(eosophagitis)、炎性肠病(例如节段性回肠炎、溃疡性结肠炎)、移植、移植物抗宿主病、银屑病、肌炎、多发性硬化症。(Kopf等人,2010)
骨关节炎(还称为OA或磨损性关节炎)是关节炎的最常见形式，其特征为关节软骨丧失，常常伴有骨肥大和疼痛。(Wieland等人,2005)
骨关节炎是难以治疗的。目前，无治愈措施可供使用，并且治疗集中于缓解疼痛和预防患病关节变形。常见治疗包括使用非类固醇抗炎药(NSAID)。尽管已经提倡诸如软骨素和硫酸葡糖胺的膳食补充剂作为治疗骨关节炎的安全有效选项，但是最新临床试验揭示这两种治疗未减少与骨关节炎相关的疼痛。(Clegg等人,2006)
刺激合成代谢过程、阻断分解代谢过程或此两者的组合可使软骨稳定，甚至可能使损害逆转，因此阻止了疾病的进一步发展。已经开发了用于矫正在骨关节炎疾病期间出现的关节软骨病损的治疗方法，但是迄今为止它们中无一者能够介导关节软骨原位和活体内再生。总之，尚无调节疾病的骨关节炎药物可供使用。
Vandeghinste等人(Vandeghinste等人,2005)发现JAK1作为靶标，它的抑制可具有对多种疾病、包括OA的治疗相关性。在小鼠中敲除JAK1基因证明JAK1在发育期间发挥基础且非冗余的作用：JAK1-/-小鼠在出生后24小时内死亡且淋巴细胞发育被严重损害。而且，JAK1-/-细胞对使用II类细胞因子受体、使用γ-c亚单位用于信号传导的细胞因子受体和使用gp130亚单位用于信号传导的细胞因子受体家族的细胞因子无反应性或反应性较小。(Rodig等人,1998)
多个群组已经在软骨细胞生物学中牵涉了JAK-STAT信号传导。Li等人(Li等人,2001)证明，制瘤素M通过激活JAK/STAT和MAPK信号传导路径诱导初级软骨细胞中的MMP和TIMP3基因表达。Osaki等人(Osaki等人,2003)证明，干扰素γ介导的软骨细胞中胶原蛋白II的抑制涉及JAK-STAT信号传导。IL1-β通过减少基质组分的表达和通过诱导胶原酶和诱生型一氧化氮合酶(NOS2)(其介导一氧化氮(NO)的产生)的表达来引起软骨分解代谢。Otero等人(Otero等人,2005)证明，瘦蛋白和IL1-β协同诱导软骨细胞中的NO产生或NOS2mRNA表达，并且其被JAK抑制剂所阻断。Legendre等人(Legendre等人,2003)证明，IL6/IL6受体诱导牛关节软骨细胞中的软骨特异性基质基因胶原蛋白II、聚集蛋白聚糖核心和连接蛋白的下调，并且其通过JAK/STAT信号传导所介导。因此，这些观测结果表明了JAK激酶活性在软骨内稳态中的作用和JAK激酶抑制剂的治疗机会。
JAK家族成员已经牵涉在另外的病症、包括骨髓增殖性病症中(O'Sullivan等人,2007)，其中已鉴别出JAK2中的突变。这指示JAK抑制剂、特别是JAK2抑制剂也可用于治疗骨髓增殖性病症。另外，JAK家族、特别是JAK1、JAK2和JAK3已经与癌症、特别是白血病、例如急性髓性白血病(O'Sullivan等人,2007；Xiang等人,2008)和急性淋巴母细胞白血病(Mullighan等人,2009)或实体肿瘤、例如子宫平滑肌肉瘤(Constantinescu等人,2008)、***癌(Tam等人,2007)相关联。这些结果指示，JAK抑制剂、特别是JAK1和/或JAK2抑制剂在治疗癌症(白血病和实体肿瘤，例如子宫平滑肌肉瘤、***癌)中具有效用。
另外，卡斯尔曼病(Castleman's disease)、多发性骨髓瘤、肾小球膜增生性肾小球肾炎、银屑病和卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)也可能归因于细胞因子IL-6分泌过多，细胞因子IL-6的生物学作用通过细胞内JAK-STAT信号传导所介导(Naka等人,2002)。该结果证明，JAK抑制剂还可以在所述疾病的治疗中具有效用。
现有疗法不是令人满意的，因此仍然需要鉴别出可用于治疗过敏性疾病、炎性疾病、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨转换受损的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6分泌过多或干扰素分泌过多相关的疾病的其它化合物。因此，本发明提供了化合物、它们的制备方法和包含本发明的化合物连同适宜的药用载体的医药组合物。本发明还提供了本发明的化合物在制备用于治疗过敏性疾病、炎性疾病、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨转换受损的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6分泌过多或干扰素分泌过多相关的疾病的药剂中的用途。
发明简述
本发明基于以下发现：本发明的化合物能够充当JAK抑制剂，它们可用于治疗过敏性疾病、炎性疾病、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨转换受损的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6分泌过多或干扰素分泌过多相关的疾病。在一个特定方面，本发明的化合物为JAK1和/或TYK2抑制剂。本发明还提供了这些化合物的生产方法、包含这些化合物的医药组合物和通过施用本发明的化合物来治疗过敏性疾病、炎性疾病、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨转换受损的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6分泌过多或干扰素分泌过多相关的疾病的方法。
因此，在本发明的第一方面，根据式(I)提供了本发明的化合物：
其中
R1为H或Me；
L1为-NR2-；-O-；或-CH2-；
Cy为苯基或包含1至4个独立地选自N、O和S的杂原子的5-9元单环或稠合双环杂芳基；
R2为H或C1-4烷基；
R3为H、卤素、任选被一个或多个卤素取代的C1-4烷基或任选被一个或多个卤素取代的C1-4烷氧基；
R4为H或卤素；
R5为-CN、卤素或为-L2-R6
-L2不存在或为-C(＝O)-、-C(＝O)NR7-、-NR7C(＝O)-、-SO2-、-SO2NR7-或-NR7SO2-；
R6为H或任选被一个或多个独立选择的R8基团取代的C1-6烷基；
R7为H或C1-4烷基；
R8为OH、CN、卤素或C1-4烷氧基，
La不存在或为-C(＝O)-、-C(＝O)O-或-C(＝O)NH-；
Ra为：
-H，
-任选被一个或多个独立选择的Rb取代的C1-4烷基，
-任选被一个或多个独立选择的Rc取代的C3-7单环环烷基，或
-包含一个或多个独立地选自O、N和S的杂原子的4-7元单环杂环烷基，或
-包含一个或多个独立地选自O、N和S的杂原子的5-6元单环杂芳基；
Rb为
-卤素，
-CN，
-OH，
-C1-4烷氧基，
-C3-7环烷基，
-包含一个或多个独立地选自O、N和S的杂原子的4-7元单环杂环烷基(该杂环烷基任选被一个或多个独立选择的卤素或氧代基取代)，
--SO2-C1-4烷基，或
--C(＝O)NRb1Rb2
Rc为
-卤素，
-CN，
-OH，
-C1-4烷基，
--C(＝O)OH，或
--C(＝O)NRc1Rc2；且
Rb1、Rb2、Rc1和Rc2各自独立地选自H和C1-4烷基。
在一个具体实施方案中，本发明的化合物为JAK1和/或TYK2抑制剂。
现在已经出人意料地发现，本发明的化合物当与密切相关的类似物相比时可呈现出改善的体外活性。
而且，在具体的方面，本发明的化合物当与密切相关的类似物相比时可呈现出改善的体外稳定性。这种改善在体内可导致所需要的药物剂量较低，由此可导致毒性和/或药物-药物相互作用降低。
在另一方面，本发明提供了包含本发明的化合物和药用载体、赋形剂或稀释剂的医药组合物。而且，可用于本文公开的医药组合物和治疗方法的本发明的化合物在制备和使用时是医药学上可接受的。在本发明的该方面，医药组合物可另外包含适用于与本发明的化合物组合的其它活性成分。
在另一方面，本发明提供了本发明的化合物或包含本发明的化合物的医药组合物用作药剂。在特定实施方案中，所述医药组合物另外包含其它活性成分。
在本发明的另一方面，本发明提供了治疗易罹患或罹患来自本文所列出的那些病症的病症的哺乳动物的方法，特别地，这些病症可与异常JAK活性相关，例如过敏性疾病、炎性疾病、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨转换受损的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6分泌过多或干扰素分泌过多相关的疾病，该方法包括施用有效量的如本文所述的医药组合物或本发明的化合物。在特定实施方案中，该病症与异常JAK1和/或TYK2活性相关。
在另一方面，本发明提供了用于治疗或预防选自本文所列那些的病症的本发明的化合物，特别是可以与异常JAK活性相关的这类病症，例如过敏性疾病、炎性疾病、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨转换受损的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6分泌过多或干扰素分泌过多相关的疾病。
在治疗方面的另一方法中，本发明提供了用于治疗易罹患或罹患如本文所述的与异常JAK活性因果相关的病症的哺乳动物的方法，其包括施用有效治疗病症或预防病症的量的本文所述的医药组合物或本发明的化合物。在一个特定方面，该病症与异常JAK1和/或TYK2活性因果相关。
在另一方面，本发明提供了本发明的化合物或包含本发明的化合物的医药组合物用作药剂。
在另一方面，本发明提供了用于治疗或预防与异常JAK活性因果相关的病症的本发明的化合物。
在另外方面，本发明提供了采用本文随后公开的代表性合成方案和途径合成本发明的化合物的方法。
因此，本发明的主要目标是提供新的化合物，其可改变JAK活性，因此可预防或治疗可与之因果相关的任意病症。在一个特定方面，本发明的化合物调节JAK1和/或TYK2活性。
本发明的另一目标是提供可治疗或缓解可与JAK活性、特别是JAK1和/或TYK2活性因果相关的病症或其症状的化合物，所述病症例如为过敏性疾病、炎性疾病、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨转换受损的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6分泌过多或干扰素分泌过多相关的疾病。
本发明的另一目标是提供可用于治疗或预防多种病症的医药组合物，所述病症包括与JAK活性相关的疾病，例如过敏性疾病、炎性疾病、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨转换受损的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6分泌过多或干扰素分泌过多相关的疾病。在特定实施方案中，该疾病与JAK1和/或TYK2活性相关。
其它目标和优点对于本领域技术人员而言考虑随后的实施方式将变得显而易见。
发明详述
定义
以下术语意欲具有下文与此有关所呈现的含义，并且可用于理解本发明的描述和意欲范畴。
当描述可包括化合物、含有该化合物的医药组合物和使用该化合物和组合物的方法的本发明时，以下术语如果存在的话具有以下含义，另有指示除外。还应理解：当在本文中描述时，下文定义的任意部分可以被各种取代基取代，并且各定义意欲包括下文在其范围内的这类被取代的部分。除非另有说明，否则术语“被取代”应如下文所述进行定义。还应当理解，术语“基团”和“基”在本文中使用时可视为可互换。
冠词“该”和类似术语以及实体名词在本文中可用于指一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)该冠词的语法对象和实体。例如，“类似物”指一种类似物或多于一种类似物。
“烷基”指具有指定碳原子数的直链或支链脂族烃。特定的烷基具有1至8个碳原子。更特定为具有1至6个碳原子的低级烷基。更特定的基团具有1至4个碳原子。示例性直链基团包括甲基、乙基、正丙基和正丁基。支链指一个或多个低级烷基如甲基、乙基、丙基或丁基与直链烷基链连接，示例性支链基团包括异丙基、异丁基、叔丁基和异戊基。
“烷氧基”指基团-OR26，其中R26为具有指定碳原子数的烷基。特定的烷氧基有甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、正己氧基和1,2-二甲基丁氧基。特定的烷氧基基团有低级烷氧基，即具有1至6个碳原子。更特定的烷氧基基团具有1至4个碳原子。
“链烯基”指具有指定碳原子数的单价烯烃(不饱和)烃基。特定的链烯基具有2至8个碳原子，更特别是2至6个碳原子，其可以是直链或支链的，具有至少1个、特别是1至2个烯烃不饱和位点。特定的链烯基基团包括乙烯基(-CH＝CH2)、正丙烯基(-CH2CH＝CH2)、异丙烯基(-C(CH3)＝CH2)等。
“氨基”指基团-NH2。
“芳基”指通过从母体芳环***的单个碳原子除去一个氢原子而得到的单价芳族烃基。具体而言，芳基指具有指定环原子数的单环或稠合多环芳环结构。具体而言，该术语包括包含6至10个环成员的基团。当芳基是单环***时，其优选含有6个碳原子。特别地，芳基包括苯基和萘基。
“环烷基”指具有指定环原子数的单环、稠合多环、桥联多环或螺环非芳族烃基环结构。环烷基可具有3至12个碳原子、特别是3至10个、更特别是3至7个碳原子。这类环烷基包括例如单环结构，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。
“氰基”指基团-CN。
“卤代”或“卤素”指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)和碘(I)。特定的卤素为氟或氯。
“杂”当用于描述化合物或化合物上存在的基团时指化合物或基团中的一个或多个碳原子已经被氮、氧或硫杂原子所代替。杂可应用于具有1至4个、特别是1至3个杂原子、更典型地是1或2个杂原子、例如单个杂原子的任意上述烃基基团如烷基(例如杂烷基)、环烷基(例如杂环烷基)、芳基(例如杂芳基)等。
“杂芳基”指包括一个或多个独立地选自O、N和S的杂原子和指定环原子数的单环或稠合多环芳环结构。特别地，芳环结构可具有5至9个环成员。杂芳基可以例如是5元或6元单环或由稠合5元和6元环或两个稠合6元环或(作为另一实例)两个稠合5元环形成的稠合双环结构。各环可含有至多四个通常选自氮、硫和氧的杂原子。杂芳环通常将含有至多4个杂原子、更通常至多3个杂原子、更常见至多2个杂原子、例如单个杂原子。在一个实施方案中，杂芳基环含有至少一个环氮原子。杂芳基环中的氮原子可为碱性的，例如在咪唑或吡啶的情况中，或基本上为非碱性的，例如在吲哚或吡咯氮的情况中。通常，存在于杂芳基基团、包括环的任意氨基取代基中的碱性氮原子的数目将少于5个。
五元单环杂芳基的实例包括但不限于吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、呋咱基、噁唑基、噁二唑基、噁***基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、吡唑基、***基和四唑基基团。
六元单环杂芳基的实例包括但不限于吡啶基、吡嗪基、哒嗪基、嘧啶基和三嗪基。含有五元环与另一五元环稠合的双环杂芳基的特定实例包括但不限于咪唑并噻唑基和咪唑并咪唑基。含有六元环与五元环稠合的双环杂芳基的特定实例包括但不限于苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、异苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、异苯并呋喃基、吲哚基、异吲哚基、吲嗪基、嘌呤基(例如腺嘌呤、鸟嘌呤)、吲唑基、吡唑并嘧啶基、***并嘧啶基和吡唑并吡啶基。含有两个稠合的六元环的双环杂芳基的特定实例包括但不限于喹啉基、异喹啉基、吡啶并吡啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、酞嗪基、萘啶基和喋啶基基团。特定的杂芳基基团为来自噻吩基、吡咯基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、吲哚基、吡啶基、喹啉基、咪唑基、噁唑基和吡嗪基的那些。代表性杂芳基的实例包括以下：
其中Y各自选自>C(＝O)、NH、O和S。
“杂环烷基”指包括一个或多个独立地选自O、N和S的杂原子和指定环原子数的单环、稠合多环、螺环或桥联多环非芳族完全饱和环结构。杂环烷基环结构可具有4至12个环成员、特别是4至10个环成员、更特别是4至7个环成员。各环可含有至多四个通常选自氮、硫和氧的杂原子。通常，杂环烷基环将含有至多4个杂原子、更通常为至多3个杂原子、更常见为至多2个杂原子、例如单个杂原子。杂环的实例包括但不限于氮杂环丁基、氧杂环丁基、硫杂环丁基、吡咯烷基(例如1-吡咯烷基、2-吡咯烷基和3-吡咯烷基)、吗啉基、硫吗啉基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、咪唑啉基、噁唑啉基、噻唑啉基、哌啶基(例如1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基和4-哌啶基)、吡喃基、二噁烷基、四氢吡喃基(例如4-四氢吡喃基)、2-吡唑啉基、吡唑烷基或哌嗪基。
单环杂环烷基的特定实例显示在以下说明性实例中：
其中W和Y各自独立地选自CH2、NH、O和S。
稠合双环杂环烷基基团的特定实例显示于以下说明性实例中：
其中W和Y各自独立地选自CH2、NH、O和S。
桥联双环杂环烷基的特定实例显示在以下说明性实例中：
其中W和Y各自独立地选自CH2、NH、O和S，且Z为N或CH。
螺环杂环烷基的特定实例显示在以下说明性实例中：
其中Y各自选自NH、O和S。
“羟基”指基团-OH。
“氧代基”指基团＝O。
“取代”指其中一个或多个氢原子各自独立地被相同或不同取代基替换的基团。
“磺基”或“磺酸”指例如-SO3H的基团。
“硫羟”指基团-SH。
如本文所用的术语“被一个或多个……取代”指一至四个取代基。在一个实施方案中，其指一至三个取代基。在进一步的实施方案中，其指一或两个取代基。在更进一步的实施方案中，其指一个取代基。
“烷硫基”指基团-SR26，其中R26具有指定碳原子数、特别是C1-C8烷基。特定的烷硫基基团有甲硫基、乙硫基、正丙硫基、异丙硫基、正丁硫基、叔丁硫基、仲丁硫基、正戊硫基、正己硫基和1,2-二甲基丁硫基。特定的烷硫基为低级烷硫基，即具有1至6个碳原子。更特定的烷氧基具有1至4个碳原子。
有机合成领域的普通技术人员将认识到，稳定的、化学上可行的杂环(无论是芳族还是非芳族)中的杂原子的最大数目由该环的尺寸、不饱和度和杂原子价数来决定。通常，杂环可具有一至四个杂原子，只要该杂芳环在化学上可行且稳定即可。
“可药用”或“医药学上可接受”指美国联邦或州政府的管理机构或美国以外的其它国家的相应机构所批准或可批准的，或者在美国药典或其它公认的药典中被列出用于动物、更特别是人。
“可药用盐”指在医药学上可接受的并且具有母体化合物的预期药理学活性的本发明的化合物的盐。特别地，这类盐是无毒的，可以是无机或有机酸加成盐和碱加成盐。具体而言，这类盐包括：(1)酸加成盐，与无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等形成；或与有机酸形成，所述有机酸例如有乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙烷-二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基双环[2.2.2]-辛-2-烯-1-甲酸、葡庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、十二烷基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等；或(2)当存在于母体化合物中的酸性质子被金属离子(例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子)替换所形成的盐；或与有机碱(例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、N-甲基葡糖胺等配位时所形成的盐。盐还包括(仅作为举例)钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铵盐、四烷基铵盐等；当化合物含有碱性官能团时，还有无毒有机酸或无机酸的盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、草酸盐等。术语“可药用阳离子”指酸性官能基团的可接受的阳离子抗衡离子。这类阳离子例如有钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵阳离子等。
“可药用媒介物”指与本发明的化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。
“前药”指具有可裂解的基团并且通过溶剂解或在生理条件下变成在体内具有药学活性的本发明的化合物的化合物、包括本发明的化合物的衍生物。这类实例包括但不限于胆碱酯衍生物和其类似物、N-烷基吗啉酯和其类似物。
“溶剂合物”指与溶剂缔合、通常通过溶剂解反应与溶剂缔合的化合物形式。这种物理缔合包括氢键合。常规溶剂包括水、EtOH、乙酸等。本发明的化合物可以例如以结晶形式制备，并且可以是被溶剂化或水化。适宜的溶剂合物包括可药用溶剂合物如水合物，并且进一步包括化学计量溶剂合物与非化学计量溶剂合物两者。在一些情况下，溶剂合物将能够分离，例如当一个或多个溶剂分子并入到结晶固体的晶格中时。“溶剂合物”涵盖溶液相和可分离的溶剂合物。代表性溶剂合物包括水合物、乙醇合物和甲醇合物。
“个体”包括人。术语“人”、“患者”和“个体”在本文中可互换使用。
“有效量”指当施用于个体治疗疾病时足以实现对该疾病的这类治疗的本发明的化合物的量。“有效量”可根据化合物、疾病及其严重性和待治疗个体的年龄、体重等而变化。
“预防”或“阻止”指患得或发展出疾病或病症的风险降低(即，在可暴露于引起疾病的介质或在疾病发作前易感染疾病的个体中引起疾病的至少一个临床症状不出现)。
术语“防预”与“预防”相关，指旨在预防疾病而非治疗或治愈疾病的措施或操作。防预措施的非限制性实例可包括施用疫苗；给由于例如固定术而处于血栓形成风险中的住院患者施用低分子量肝素；和在前往疟疾为地方流行病或感染疟疾的风险较高的地理区域之前施用抗疟疾剂如氯奎。
“治疗”任意疾病或病症在一个实施方案中指改善该疾病或病症(即，阻止疾病或降低其至少一个临床症状的表现、程度或严重性)。在另一个实施方案中，“治疗”指改善至少一个身体参数，所述身体参数可能不可被个体辨别。在另一个实施方案中，“治疗”指在身体上(例如稳定可辨别的症状)、生理学上(例如稳定身体参数)或在两者上调节疾病或病症。在另一个实施方案中，“治疗”涉及减缓疾病进展。
如本文所用的术语“过敏性疾病”指以免疫***的过敏病症为特征的病症集合，包括过敏性气道疾病(例如哮喘、鼻炎)、窦炎、湿疹和荨麻疹以及食物过敏或昆虫毒液过敏。
如本文所用的术语“哮喘”如本文所用指以与任意病因(内源性、外源性或两者；过敏性或非过敏性)的气道收缩相关的肺气流变化为特征的任意肺病症。术语哮喘可以与一个或多个形容词一起使用以指示病因。
如本文所用的术语“炎性疾病”指包括如下的病症集合：类风湿性关节炎、骨关节炎、幼年型特发性关节炎、银屑病、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎、过敏性气道疾病(例如哮喘、鼻炎)、慢性阻塞性肺病(COPD)、炎性肠病(例如节段性回肠炎、溃疡性结肠炎)、内毒素驱动的疾病状态(例如在心脏搭桥手术后的并发症或导致例如慢性心力衰竭的慢性内毒素状态)和涉及软骨如关节软骨的相关疾病。特别地，该术语指类风湿性关节炎、骨关节炎、过敏性气道疾病(例如哮喘)、慢性阻塞性肺病(COPD)和炎性肠病。更特别地，该术语指类风湿性关节炎、慢性阻塞性肺病(COPD)和炎性肠病。
如本文所用的术语“自身免疫疾病”指包括如下的疾病集合：阻塞性气道疾病，包括诸如COPD、哮喘(例如内源性哮喘、外源性哮喘、粉尘性哮喘、小儿哮喘)且特别是慢性或顽固性哮喘(例如迟发型哮喘和气道过度反应)的病症；支气管炎，包括支气管哮喘；全身性红斑狼疮(SLE)、皮肤型红斑狼疮、狼疮性肾炎、皮肌炎、舍格伦(Sjogren)综合征、多发性硬化症、银屑病、干眼病、I型糖尿病和与其相关的并发症、特应性湿疹(特应性皮炎)、甲状腺炎(桥本(Hashimoto's)甲状腺炎和自体免疫性甲状腺炎)、接触性皮炎和其它湿疹性皮炎、炎性肠病(例如节段性回肠炎和溃疡性结肠炎)、动脉粥样硬化和肌萎缩性侧索硬化症。特别地，该术语指COPD、哮喘、全身性红斑狼疮、I型糖尿病和炎性肠病。如本文所用的术语“增殖性疾病”指诸如以下的病症：癌症(例如子宫平滑肌肉瘤或***癌)、骨髓增殖性病症(例如真性红细胞增多症、原发性血小板增多和骨髓纤维化)、白血病(例如急性髓性白血病、急性和慢性淋巴母细胞白血病)、多发性骨髓瘤、银屑病、再狭窄、硬皮病或纤维化。特别地，该术语指癌症、白血病、多发性骨髓瘤和银屑病。
如本文所用的术语“癌症”指皮肤或身体器官中的细胞的恶性或良性生长，所述器官例如是但不限于***、***、肺、肾脏、胰脏、胃或肠。癌症倾向于浸润至相邻组织中并扩散(转移)至远处器官如骨骼、肝脏、肺或脑。如本文所用的术语癌症包括转移性肿瘤细胞类型(例如但不限于黑素瘤、淋巴瘤、白血病、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和肥大细胞瘤)和组织癌类型(例如但不限于结肠直肠癌、***癌、小细胞肺癌和非小细胞肺癌、乳癌、胰癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、成胶质细胞瘤、原发性肝癌、卵巢癌、***癌和子宫平滑肌肉瘤)。特别地，术语“癌症”指急性淋巴母细胞白血病、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、***癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎样/杆状瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌(骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤)、脑干神经胶质瘤、脑瘤、脑和脊髓肿瘤、乳癌、支气管肿瘤、Burkitt淋巴瘤、子***、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性粒细胞白血病、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、胚胎瘤、子宫内膜癌、室管膜母细胞瘤、室管膜瘤、食道癌、肿瘤的尤因肉瘤家族、眼癌、视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、胃肠道基质细胞瘤、胚细胞瘤、神经胶质瘤、多毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞瘤(内分泌胰腺)、卡波西(Kaposi)肉瘤、肾癌、朗氏细胞组织细胞增多病(Langerhans cell histiocytosis)、喉癌、白血病、急性淋巴母细胞白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性粒细胞白血病、多毛细胞白血病、肝癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、Burkitt淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、成神经管细胞瘤、髓上皮瘤、黑素瘤、间皮瘤、口腔癌、慢性骨髓性粒细胞白血病、髓性白血病、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口癌、口咽癌、骨肉瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低度潜在恶性肿瘤、胰癌、***状瘤病、甲状旁腺癌、***癌、咽癌、中等分化的松果体实质肿瘤、松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤、垂体瘤、浆细胞瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺胚细胞瘤、原发性中枢神经***淋巴瘤、***癌、直肠癌、肾细胞(肾)癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、肿瘤的尤因肉瘤家族、肉瘤、卡波西肉瘤、赛泽里综合征、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、***癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和维尔姆斯瘤。在另一个特定实施方案中，术语癌症指胰癌、肝癌、肝细胞癌(HCC)、乳癌或结肠癌。
如本文所用的术语“白血病”指血液和血液形成器官的赘生性疾病。该疾病可造成骨髓和免疫***功能障碍，导致主体极易感染和出血。特别地，术语白血病指急性髓性白血病(AML)和急性淋巴母细胞白血病(ALL)和慢性淋巴母细胞白血病(CLL)。在另一个特定实施方案中，术语白血病指T细胞急性淋巴母细胞白血病(T-ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)或弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。
如本文所用的术语“移植排斥”指细胞、组织或实体器官同种异体移植物或异种移植物(例如胰岛、干细胞、骨髓、皮肤、肌肉、角膜组织、神经元组织、心脏、肺、心肺联合、肾脏、肝脏、肠、胰脏、气管或食管的那些)的急性或慢性排斥，或者移植物抗宿主疾病。
如本文所用的术语“涉及软骨转换受损的疾病”包括诸如以下的病症：骨关节炎、银屑病性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、痛风性关节炎、败血性或感染性关节炎、反应性关节炎、反射交感性营养不良、痛性营养不良、提策(Tietze)综合征或肋软骨炎、纤维肌痛、骨软骨炎、神经性或神经病性关节炎、关节病、地方性形式的关节炎如地方性变形性骨关节炎、毛瑟来尼病(Mseleni disease)和汉迪勾度病(Handigodu disease)；由纤维肌痛、全身性红斑狼疮、硬皮病和强直性脊柱炎引起的退化。
如本文所用的术语“先天性软骨畸形”包括诸如以下的病症：遗传性软骨溶解、软骨发育不全和假性软骨发育不全，特别是但不限于小耳畸形、无耳畸形、干骺端软骨发育不全和相关病症。
如本文所用的术语“与IL6分泌过多相关的疾病”包括诸如以下的病症：卡斯尔曼(Castleman)病、多发性骨髓瘤、银屑病、卡波西肉瘤和/或肾小球膜增生性肾小球肾炎。
如本文所用的术语“与干扰素分泌过多相关的疾病”包括诸如以下的病症：全身性和皮肤型红斑狼疮、狼疮性肾炎、皮肌炎、舍格伦综合征、银屑病、类风湿性关节炎。
“本发明的化合物”和等同表述表示涵盖如本文所述的通式化合物，该表述当上下文允许时包括可药用的盐和溶剂合物如水合物和可药用盐的溶剂合物。类似地，对中间体的称谓(无论是否要求保护它们自身)在上下文允许时表示包括它们的盐和溶剂合物。
当本文提及范围、例如但不限于C1-8烷基时，范围的引用应视为表示该范围的各个成员。
本发明的化合物的其它衍生物的酸和酸衍生物形式均具有活性，但是酸敏感形式在哺乳动物生物体中通常提供了溶解度、组织兼容性或延缓释放的优势(Bundgaard,1985)。前药包括本领域技术人员熟知的酸衍生物，例如通过母体酸与适宜的醇反应而制备的酯或通过母体酸化合物与取代或未取代的胺反应而制备的酰胺或酸酐或混合酸酐。由本发明的化合物上伸出的酸性基团衍生的简单脂族或芳族酯、酰胺和酸酐是特别有用的前药。在一些情况中，期望制备双酯型前药，例如(酰氧基)烷基酯或((烷氧基羰基)氧基)烷基酯。具体的这类前药有本发明的化合物的C1-8烷基、C2-8链烯基、任选取代的C6-10芳基和(C6-10芳基)-(C1-4烷基)酯。
如本文所用的术语“同位素变体”指化合物在构成该化合物的一个或多个原子处含有非天然比例的同位素。例如，化合物的“同位素变体”可含有一个或多个非放射性同位素，例如氘(2H或D)、碳-13(13C)、氮(15N)等。应当理解，在进行这类同位素取代的化合物中，以下原子(若存在)可以改变，从而例如任意氢可以是2H/D，任意碳可以是13C，或任意氮可以是15N，并且这类原子的存在和位置可以在本领域技术范围内确定。同样，在例如所得化合物可用于药物和/或底物组织分布研究的情形中，本发明可以包括具有放射性同位素的同位素变体的制备。放射性同位素氚(即3H)和碳-14(即14C)由于它们易于掺入和现成的检测手段而尤其可用于此目的。此外，可以制备被正电子发射同位素如11C、18F、15O和13N取代的化合物，它们将适用于正电子发射断层扫描(PET)研究以检查底物受体占有率。
本文提供的化合物的所有同位素变体不论是否具有放射性，均意欲被涵盖在本发明的范畴内。
还应理解，具有相同分子式但在原子键合性质或顺序或原子空间排列方面存在不同的化合物称为“异构体”。在原子空间排列方面存在不同的异构体称为“立体异构体”。
彼此不为镜像的立体异构体称为“非对映异构体”，彼此为不可重叠的镜像的异构体称为“对映异构体”。当化合物具有不对称中心时，例如，当其与四个不同基团键合时，可能存在一对对映异构体。对映异构体可以通过不对称中心的绝对组构型表征，通过Cahn和Prelog的R-和S-顺序规则来描述，或通过分子旋转偏振光平面的方式来描述，指定为右旋或左旋(即分别为(+)-或(-)-异构体)。手性化合物可以作为单个对映异构体或其混合物存在。含有相等比例的对映异构体的混合物称为“外消旋混合物”。
“互变异构体”指作为特定化合物结构的可互换形式并且氢原子和电子的移位变化的化合物。因此，两个结构可经由π电子和原子(通常为H)的移动保持平衡。例如，烯醇与酮为互变异构体，因为它们可通过用酸或碱处理而快速互变。互变异构的另一实例为苯基硝基甲烷的酸形式和硝基形式，它们同样可通过用酸或碱处理来形成。
互变异构形式可与所关注化合物的最佳化学反应性和生物活性的达成相关。
本发明的化合物可具有一个或多个不对称中心；这类化合物因此可以作为单个(R)-或(S)-立体异构体或作为其混合物进行制备。
除非另有指示，否则本说明书和权利要求书中的特定化合物的描述或命名意欲包括单独对映异构体及其混合物(外消旋或其它)。用于确定立体化学和分离立体异构体的方法是本领域熟知的。
应理解，本发明的化合物可代谢产生生物活性代谢物。
发明
本发明基于以下鉴别：本发明的化合物为JAK抑制剂，它们可用于治疗过敏性疾病、炎性疾病、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨转换受损的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6分泌过多或干扰素分泌过多相关的疾病。在特定实施方案中，本发明的化合物为JAK1和/或TYK2抑制剂。
本发明还提供了本发明的化合物的生产方法、包含本发明的化合物的医药组合物和通过施用本发明的化合物来治疗过敏性疾病、炎性疾病、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨转换受损的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6分泌过多或干扰素分泌过多相关的疾病的方法。在特定实施方案中，本发明的化合物为JAK1和/或TYK2抑制剂。
因此，在本发明的第一方面，根据式(I)提供了本发明的化合物：
其中
R1为H或Me；
L1为-NR2-；-O-或-CH2-；
Cy为苯基或包含1至4个独立地选自N、O和S的杂原子的5-9元单环或稠合双环杂芳基；
R2为H或C1-4烷基；
R3为H、卤素、任选被一个或多个独立选择的卤素取代的C1-4烷基或任选被一个或多个独立选择的卤素取代的C1-4烷氧基；
R4为H或卤素；
R5为-CN、卤素或为-L2-R6；
-L2不存在或为-C(＝O)-、-C(＝O)NR7-、-NR7C(＝O)-、-SO2-、-SO2NR7-或-NR7SO2-；
R6为H或任选被一个或多个独立选择的R8基团取代的C1-6烷基；
R7为H或C1-4烷基；
R8为OH、CN、卤素或C1-4烷氧基；
La不存在或为-C(＝O)-、-C(＝O)O-或-C(＝O)NH-；
Ra为：
-H，
-任选被一个或多个独立选择的Rb取代的C1-4烷基，
-任选被一个或多个独立选择的Rc取代的C3-7单环环烷基，
-包含一个或多个独立地选自O、N和S的杂原子的4-7元单环杂环烷基，或
-包含一个或多个独立地选自O、N和S的杂原子的5-6元单环杂芳基；
Rb为
-卤素，
-CN，
-OH，
-C1-4烷氧基，
-C3-7环烷基，
-包含一个或多个独立地选自O、N和S的杂原子的4-7元单环杂环烷基(该杂环烷基任选被一个或多个独立选择的卤素或氧代基取代)，
--SO2-C1-4烷基，或
--C(＝O)NRb1Rb2；
Rc为
-卤素，
-CN，
-OH，
-C1-4烷基，
--C(＝O)OH，或
--C(＝O)NRc1Rc2；和
Rb1、Rb2、Rc1和Rc2各自独立地选自H和C1-4烷基。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I，其中R1为Me。
在另一个实施方案中，本发明的化合物符合式I，其中Cy为苯基。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I，其中Cy为包含1至4个独立地选自N、O和S的杂原子的5-9元单环或稠合双环杂芳基。在另一个实施方案中，本发明的化合物符合式I，其中Cy为包含1或2个独立地选自N、O和S的杂原子的5-9元单环或稠合双环杂芳基。在特定实施方案中，Cy为吡唑基、吡咯基、咪唑基、***基、噻吩基、噻唑基、呋喃基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并噁唑基、吲哚基或吲唑基。
在另一个实施方案中，本发明的化合物符合式I，其中Cy为包含1至4个独立地选自N、O和S的杂原子的5-6元单环杂芳基。在另一个实施方案中，本发明的化合物符合式I，其中Cy为包含1或2个独立地选自N、O和S的杂原子的5-6元单环杂芳基。在特定实施方案中，Cy为吡唑基、吡咯基、咪唑基、呋喃基、噻吩基、***基、四唑基、噻唑基、噁唑基、噻二唑基或噁二唑基。在另一个特定实施方案中，Cy为吡啶基、吡嗪基、嘧啶基或pyridazolyl。在更特定实施方案中，Cy为吡啶基。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式IIa、IIb或IIc：
其中L1、R3、R4、La、Ra和R5如以上实施方案任一者中所述。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式IIIa、IIIb或IIIc：
其中L1、R3、R4、La、Ra和R5如以上实施方案任一者中所述。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-IIIc中的任一者，其中L1为-CH2-。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-IIIc中的任一者，其中L1为-O-。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-IIIc中的任一者，其中L1为-NR2-且R2如以上实施方案任一者中所述。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-IIIc中的任一者，其中L1为-NR2-，其中R2为H。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-IIIc中的任一者，其中L1为-NR2-，其中R2为C1-4烷基。在特定实施方案中，R2为Me、Et或iPr。在更特定实施方案中，R2为Me。在另一个更特定实施方案中，R2为Et。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式IVa、IVb、IVc、IVd、IVe或IVf：
其中R3、R4、R5、La和Ra如以上实施方案任一者中所述。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-IVf中的任一者，其中La不存在。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-IVf中的任一者，其中La为-C(＝O)-、-C(＝O)O-或-C(＝O)NH-。在特定实施方案中，La为-C(＝O)-。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式Va、Vb、Vc、Vd、Ve或Vf：
其中R3、R4、R5和Ra如以上实施方案任一者中所述。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-Vf中的任一者，其中R4为H或卤素。在特定实施方案中，R4为F或Cl。在另一个特定实施方案中，R4为H。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-Vf中的任一者，其中R3为H。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-Vf中的任一者，其中R3为卤素。在特定实施方案中，R3为F或Cl。在更特定实施方案中，R3为Cl。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-Vf中的任一者，其中R3为C1-4烷基。在特定实施方案中，R3为Me、Et或n-Pr。在更特定实施方案中，R3为Me或Et。在最特定实施方案中，R3为Et。在另一个最特定实施方案中，R3为Me。
在另一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-Vf中的任一者，其中R3为被一个或多个独立选择的卤素取代的C1-4烷基。在特定实施方案中，R3为-CHF2、-CF3、-CH2-CHF2或-CH2-CF3。在更特定实施方案中，R3为-CF3或-CH2-CF3。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-Vf中的任一者，其中R3为C1-4烷氧基。在特定实施方案中，R3为-OMe、-OEt或-On-Pr。在更特定实施方案中，R3为-OMe或-OEt。
在另一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-Vf中的任一者，其中R3为被一个或多个独立选择的卤素取代的C1-4烷氧基。在特定实施方案中，R3为-OCHF2、-OCF3或-OCH2-CHF2。在更特定实施方案中，R3为-OCHF2。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-Vf中的任一者，其中R5为CN。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-Vf中的任一者，其中R5为卤素。在特定实施方案中，R5为F或Cl。在更特定实施方案中，R5为F。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-Vf中的任一者，其中R5为-L2-R6，R6如上所述，L2为-C(＝O)NR7-、-NR7C(＝O)-、-SO2NR7-或-NR7SO2-，且R7如前述实施方案任一者中所定义。在特定实施方案中，R7为H。在另一个特定实施方案中，R7为C1-4烷基。在更特定实施方案中，R7为Me或Et。在最特定实施方案中，R7为Me。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-Vf中的任一者，其中R5为-L2-R6，L2如上所述，且R6为H。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-Vf中的任一者，其中R5为-L2-R6，L2如上所述，且R6为C1-6烷基。在特定实施方案中，R6为Me、Et、iPr或tBu。在更特定实施方案中，R6为Me或Et。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-Vf中的任一者，其中R5为-L2-R6，L2如上所述，且R6为被一个或多个独立选择的R8基团取代的C1-6烷基。在另一个实施方案中，R6为Me、Et、iPr或tBu，其各自被一个或多个独立选择的R8基团取代。在特定实施方案中，R6为被一个、两个或三个独立选择的R8基团取代的C1-6烷基。在另一个特定实施方案中，R6为Me、Et、iPr或tBu，其各自被一个、两个或三个独立选择的R8基团取代。在更特定实施方案中，R6为被一个R8基团取代的C1-6烷基。在另一个特定实施方案中，R6为Me、Et、iPr或tBu，其各自被一个R8基团取代。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-Vf中的任一者，其中R8为OH、CN、卤素或C1-4烷氧基。在特定实施方案中，R8为OH、CN、F、Cl、-OMe或-OEt。
在特定实施方案中，R5为-L2-R6，L2为-C(＝O)-或-SO2-，且R6为C1-6烷基。在更特定实施方案中，R5为-L2-R6，L2为-C(＝O)-或-SO2，且R6为Me、Et、iPr或tBu。在最特定实施方案中，R5为-C(＝O)Me、-C(＝O)Et、-SO2Me或-SO2Et。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-Vf中的任一者，其中R5为-L2-R6，L2为-C(＝O)NR7-、-NR7C(＝O)-、-SO2NR7-或-NR7SO2-，R6和R7如前述实施方案任一者中所定义。在特定实施方案中，R7为H、Me或Et，且R6如前述实施方案任一者中所定义。在另一个特定实施方案中，R7如前述实施方案任一者中所定义，且R6为H。在另一个特定实施方案中，R7如前述实施方案任一者中所定义，且R6为任选被一个或多个独立选择的OH、CN、卤素或C1-4烷氧基取代的C1-6烷基。在更特定实施方案中，R7为H、Me或Et，且R6为H。在另一个更特定实施方案中，R7为H、Me或Et，且R6为Me、Et、iPr或tBu，其各自任选被一个或多个独立选择的OH、CN、卤素或C1-4烷氧基取代。在另一个更特定实施方案中，R7为H、Me或Et，且R6为Me、Et、iPr或tBu，其各自任选被一个或多个独立选择的OH、CN、F、Cl、OMe或OEt取代。在最特定实施方案中，R5为-C(＝O)NH2或-SO2NH2。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-Vf中的任一者，其中Ra为H。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-Vf中的任一者，其中Ra为C1-4烷基。在特定实施方案中，Ra为Me、Et、iPr或tBu。在更特定实施方案中，Ra为Me或Et。在最特定实施方案中，Ra为Me。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-Vf中的任一者，其中Ra为被一个或多个独立选择的Rb取代的C1-4烷基。在另一个实施方案中，Ra为Me、Et、iPr或tBu，其各自被一个或多个独立选择的Rb取代。在特定实施方案中，Ra为被一个、两个或三个独立选择的Rb取代的C1-4烷基。在另一个特定实施方案中，Ra为Me、Et、iPr或tBu，其各自被一个、两个或三个独立选择的Rb取代。在更特定实施方案中，Ra为被一个Rb取代的C1-4烷基。在另一个更特定实施方案中，Ra为Me、Et、iPr或tBu，其各自被一个Rb取代。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-Vf中的任一者，其中Rb为卤素、CN或OH。在特定实施方案中，Rb为F、Cl、CN或OH。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-Vf中的任一者，其中Rb为C1-4烷氧基。在特定实施方案中，Rb为OMe、OEt或OiPr。在更特定实施方案中，Rb为OMe。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-Vf中的任一者，其中Rb为C3-7环烷基。在特定实施方案中，Rb为环丙基、环丁基、环戊基或环己基。在更特定实施方案中，Rb为环丙基。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-Vf中的任一者，其中Rb为包含一个或多个独立地选自O、N和S的杂原子的4-7元单环杂环烷基。在特定实施方案中，Rb为氧杂环丁基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、氮杂环丁基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基或硫吗啉基。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-Vf中的任一者，其中Rb为被一个或多个独立选择的卤素或氧代基取代的包含一个或多个独立地选自O、N和S的杂原子的4-7元单环杂环烷基。在特定实施方案中，Rb为氧杂环丁基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、氮杂环丁基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基或硫吗啉基，其各自被一个或多个独立选择的卤素或氧代基取代。在另一个特定实施方案中，Rb为被一个或多个独立选择的F、Cl或氧代基取代的包含一个或多个独立地选自O、N和S的杂原子的4-7元单环杂环烷基。在更特定实施方案中，Rb为氧杂环丁基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、氮杂环丁基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基或硫吗啉基，其各自被一个或多个独立选择的F、Cl或氧代基取代。在最特定实施方案中，Rb为被一个、两个或三个独立选择的F、Cl或氧代基取代的包含一个或多个独立地选自O、N和S的杂原子的4-7元单环杂环烷基。在另一个最特定实施方案中，Rb为氧杂环丁基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、氮杂环丁基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基或硫吗啉基，其各自被一个、两个或三个独立选择的F、Cl或氧代基取代。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-Vf中的任一者，其中Rb为-SO2-C1-4烷基。在特定实施方案中，Rb为-SO2CH3或-SO2CH2CH3。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-Vf中的任一者，其中Rb为-C(＝O)NRb1Rb2，其中Rb1或Rb2各自独立地选自H和C1-4烷基。在特定实施方案中，Rb1或Rb2各自独立地选自H、-CH3和-CH2CH3。在更特定实施方案中，Rb为-C(＝O)NH2、-C(＝O)NMeH或-C(＝O)NMe2。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-Vf中的任一者，其中Ra为C3-7单环环烷基。在特定实施方案中，Ra为环丙基、环丁基或环戊基。在更特定实施方案中，Ra为环丙基。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-Vf中的任一者，其中Ra为被一个或多个独立选择的Rc基团取代的C3-7单环环烷基。在另一个实施方案中，Ra为环丙基、环丁基或环戊基，其各自被一个或多个独立选择的Rc基团取代。在特定实施方案中，Ra为被一个、两个或三个独立选择的Rc基团取代的C3-7单环环烷基。在另一个特定实施方案中，Ra为环丙基、环丁基或环戊基，其各自被一个、两个或三个独立选择的Rc基团取代。在更特定实施方案中，Ra为被一个Rc基团取代的C3-7单环环烷基。在另一个特定实施方案中，Ra为环丙基、环丁基或环戊基，其各自被一个Rc基团取代。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-Vf中的任一者，其中Rc为卤素、CN或OH。在特定实施方案中，Rc为F、Cl、CN或OH。在更特定实施方案中，Rc为F。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-Vf中的任一者，其中Rc为C1-4烷基。在特定实施方案中，Rc为-Me、-Et或-iPr。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-Vf中的任一者，其中Rc为-C(＝O)OH。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-Vf中的任一者，其中Rc为-C(＝O)NRc1Rc2，其中Rc1或Rc2各自独立地选自H和C1-4烷基。在特定实施方案中，Rc1或Rc2各自独立地选自H、-CH3和-CH2CH3。在更特定实施方案中，Rc为-C(＝O)NH2、-C(＝O)NMeH或-C(＝O)NMe2。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-Vf中的任一者，其中Ra为：
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-Vf中的任一者，其中Ra为：
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-Vf中的任一者，其中Ra为包含一个或多个独立地选自O、N和S的杂原子的4-7元单环杂环烷基。在特定实施方案中，Ra为氧杂环丁基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、氮杂环丁基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基或硫吗啉基。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I-Vf中的任一者，其中Ra为包含一个或多个独立地选自O、N和S的杂原子的5-6元单环杂芳基。在特定实施方案中，Ra为呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、***基、噁二唑基、四唑、吡啶基、吡嗪基或嘧啶基。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I，其中所述化合物选自：
N-(6-((6-氰基-4-乙基吡啶-3-基)(甲基)氨基)-1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-4-基)环丙烷甲酰胺，
N-(6-(4-氰基-2-乙基-6-氟苯基氨基)-1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-4-基)环丙烷甲酰胺，
N-(6-((4-氰基-2-乙基-6-氟苯基)(甲基)氨基)-1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-4-基)环丙烷甲酰胺，
6-((6-氰基-4-乙基吡啶-3-基)(甲基)氨基)-1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-4-基氨甲酸甲酯，
6-((4-氰基-2-乙基-6-氟苯基)(甲基)氨基)-1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-4-基氨甲酸甲酯，
(1R,2R)-N-[6-[(6-氰基-4-乙基-3-吡啶基)氧基]-1-甲基-苯并咪唑-4-基]-2-氟-环丙烷甲酰胺，
N-(6-((4-氰基-2-乙基-6-氟苯基)(甲基)氨基)-1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-4-基)-2-氟环丙烷甲酰胺(1S,2S)/(1R,2R)外消旋混合物，
(1R,2R)-N-(6-((6-氰基-4-乙基吡啶-3-基)(甲基)氨基)-1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-4-基)-2-氟环丙烷甲酰胺，
(1R,2R)-N-(6-((6-氰基-4-甲基吡啶-3-基)(甲基)氨基)-1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-4-基)-2-氟环丙烷甲酰胺，
(1R,2R)-N-[6-(4-氰基-2-乙基-苯氧基)-1-甲基-苯并咪唑-4-基]-2-氟-环丙烷甲酰胺，
(1R,2R)-N-[6-(2-氯-4-氰基-6-氟-N-甲基-苯胺基)-1-甲基-苯并咪唑-4-基]-2-氟-环丙烷甲酰胺，
(1R,2R)-2-氟-N-[6-[(6-氟-4-甲基-3-吡啶基)-甲基-氨基]-1-甲基-苯并咪唑-4-基]环丙烷甲酰胺，
(1R,2R)-N-[6-[(2,6-二氟-3-吡啶基)-甲基-氨基]-1-甲基-苯并咪唑-4-基]-2-氟-环丙烷甲酰胺，
(1R,2R)-N-[6-[(6-氰基-2-氟-3-吡啶基)-甲基-氨基]-1-甲基-苯并咪唑-4-基]-2-氟-环丙烷甲酰胺，
(1R,2R)-N-[6-(4-氰基-2-氟-N-甲基-苯胺基)-1-甲基-苯并咪唑-4-基]-2-氟-环丙烷甲酰胺，
(1R,2R)-2-氟-N-[6-(2-氟-N,6-二甲基-4-甲基磺酰基-苯胺基)-1-甲基-苯并咪唑-4-基]环丙烷甲酰胺，
(1R,2R)-2-氟-N-[6-(2-氟-N-甲基-4-甲基磺酰基-苯胺基)-1-甲基-苯并咪唑-4-基]环丙烷甲酰胺，
N-[6-[(4-乙基-6-甲基磺酰基-3-吡啶基)-甲基-氨基]-1-甲基-苯并咪唑-4-基]环丙烷甲酰胺，
N-[6-(2-氟-N,6-二甲基-4-甲基磺酰基-苯胺基)-1-甲基-苯并咪唑-4-基]环丙烷甲酰胺，
(1R,2R)-N-[6-[(6-氰基-4-甲基-3-吡啶基)氧基]-1-甲基-苯并咪唑-4-基]-2-氟-环丙烷甲酰胺，
(1R,2R)-N-[6-[(6-氰基-2-氟-4-甲基-3-吡啶基)-甲基-氨基]-1-甲基-苯并咪唑-4-基]-2-氟-环丙烷甲酰胺，
(1R,2R)-N-[6-[(2-氰基-3-氟-5-甲基-4-吡啶基)-甲基-氨基]-1-甲基-苯并咪唑-4-基]-2-氟-环丙烷甲酰胺，
N-[6-[(6-氰基-4-甲基-3-吡啶基)氧基]-1-甲基-苯并咪唑-4-基]环丙烷甲酰胺，
5-((4-(环丙烷甲酰氨基)-1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)(甲基)氨基)-4-乙基吡啶酰胺，
4-乙基-5-((4-((1R,2R)-2-氟环丙烷甲酰氨基)-1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)(甲基)氨基)吡啶酰胺，
(1R,2R)-N-[6-(N,2-二甲基-4-甲基磺酰基-苯胺基)-1-甲基-苯并咪唑-4-基]-2-氟-环丙烷甲酰胺，
(1R,2R)-N-[6-(4-乙磺酰基-N,2-二甲基-苯胺基)-1-甲基-苯并咪唑-4-基]-2-氟-环丙烷甲酰胺，
5-(7-氨基-3-甲基-苯并咪唑-5-基)氧基-4-甲基-吡啶-2-甲腈，
N-[6-[(4-乙基-6-甲基磺酰基-3-吡啶基)氧基]-1-甲基-苯并咪唑-4-基]环丙烷甲酰胺，
N-[6-[4-(氰基甲基)苯胺基]-1-甲基-苯并咪唑-4-基]环丙烷甲酰胺，
N-[6-(2,3-二氢-1,4-苯并二噁烯-6-基氨基)-1-甲基-苯并咪唑-4-基]环丙烷甲酰胺，和
5-[7-[[(1R,2R)-2-氟环丙烷甲酰基]氨基]-3-甲基-苯并咪唑-5-基]氧基-4-甲基-吡啶-2-甲酰胺。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I，其中所述化合物选自：
1-[6-[(6-氰基-4-甲基-3-吡啶基)氧基]-1-甲基-苯并咪唑-4-基]-3-异丙基-脲，
4-甲基-5-[3-甲基-7-(甲基氨基)苯并咪唑-5-基]氧基-吡啶-2-甲腈，
5-[7-(二甲基氨基)-3-甲基-苯并咪唑-5-基]氧基-4-甲基-吡啶-2-甲腈，
N-[6-[(6-氰基-4-甲基-3-吡啶基)氧基]-1-甲基-苯并咪唑-4-基]-3-羟基-氮杂环丁烷-1-甲酰胺，
N-[6-[(6-氰基-4-甲基-3-吡啶基)氧基]-1-甲基-苯并咪唑-4-基]吗啉-4-甲酰胺，和
1-[6-[(6-氰基-4-甲基-3-吡啶基)氧基]-1-甲基-苯并咪唑-4-基]-3-异丙基-脲。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I，其中所述化合物为N-[6-[(6-氰基-4-甲基-3-吡啶基)氧基]-1-甲基-苯并咪唑-4-基]-2-氟-环丙烷甲酰胺。在更特定实施方案中，本发明的化合物符合式I，其中所述化合物为(1R,2R)-N-[6-[(6-氰基-4-甲基-3-吡啶基)氧基]-1-甲基-苯并咪唑-4-基]-2-氟-环丙烷甲酰胺。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I，其中所述化合物不为N-[6-[(6-氰基-4-甲基-3-吡啶基)氧基]-1-甲基-苯并咪唑-4-基]-2-氟-环丙烷甲酰胺。在更特定实施方案中，本发明的化合物符合式I，其中所述化合物不为(1R,2R)-N-[6-[(6-氰基-4-甲基-3-吡啶基)氧基]-1-甲基-苯并咪唑-4-基]-2-氟-环丙烷甲酰胺。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I，其中所述化合物为N-(6-((6-氰基-4-甲基吡啶-3-基)(甲基)氨基)-1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-4-基)-2-氟环丙烷甲酰胺。在更特定实施方案中，本发明的化合物符合式I，其中所述化合物为(1R,2R)-N-(6-((6-氰基-4-甲基吡啶-3-基)(甲基)氨基)-1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-4-基)-2-氟环丙烷甲酰胺。
在一个实施方案中，本发明的化合物符合式I，其中所述化合物不为N-(6-((6-氰基-4-甲基吡啶-3-基)(甲基)氨基)-1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-4-基)-2-氟环丙烷甲酰胺。在更特定实施方案中，本发明的化合物符合式I，其中所述化合物不为(1R,2R)-N-(6-((6-氰基-4-甲基吡啶-3-基)(甲基)氨基)-1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-4-基)-2-氟环丙烷甲酰胺。
在一个实施方案中，本发明的化合物不为同位素变体。
在一个方面，根据本文所述的实施方案任一者的本发明的化合物以游离碱形式存在。
在一个方面，根据本文所述的实施方案任一者的本发明的化合物为可药用盐。
在一个方面，根据本文所述的实施方案任一者的本发明的化合物为化合物的溶剂合物。
在一个方面，根据本文所述的实施方案任一者的本发明的化合物为化合物的可药用盐的溶剂合物。
虽然在上文已经单独地大体列出了各实施方案的特定基团，但是本发明的化合物包括其中上述式以及本文给出的其它式中的多个或每个实施方案选自针对每个变量分别指定的特定成员或基团中的一者或多者的化合物。因此，本发明在其范围内意欲包括这类实施方案的所有组合。
虽然在上文已经单独地大体列出了各实施方案的特定基团，但是本发明的化合物可以是其中一个或多个变量(例如R基团)选自上文列出的任意式的一个或多个实施方案的化合物。因此，本发明在其范围内意欲包括来自任一个所公开实施方案的变量的所有组合。
或者，本发明还涵盖了从集合或实施方案中排除一个或多个指定变量或其组合。
在某些方面，本发明提供了上述式的化合物的前药和衍生物。前药为如下的本发明的化合物的衍生物：其具有可代谢裂解的基团，并且通过溶剂解或在生理条件下变成在体内具有药学活性的本发明的化合物。这类实例包括但不限于胆碱酯衍生物及其类似物、N-烷基吗啉酯及其类似物。
本发明的化合物的其它衍生物的酸和酸衍生物形式均具有活性，但是酸敏感形式在哺乳动物生物体中通常提供了溶解度、组织兼容性或延缓释放的优势(Bundgard,H,1985)。前药包括本领域技术人员熟知的酸衍生物，例如通过母体酸与适宜的醇反应而制备的酯或通过母体酸化合物与取代或未取代的胺反应而制备的酰胺或酸酐或混合酸酐。由本发明的化合物上伸出的酸性基团衍生的简单脂族或芳族酯、酰胺和酸酐是优选的前药。在一些情况中，期望制备双酯型前药，例如(酰氧基)烷基酯或((烷氧基羰基)氧基)烷基酯。特别有用的有本发明的化合物的C1-8烷基、C2-8链烯基、芳基、取代的C7-C12芳基和C7-C12芳基烷基酯。
条款
1)式I化合物：
其中
R1为H或Me；
L1为-NR2-；-O-；或-CH2-；
Cy为苯基或包含1至4个独立地选自N、O和S的杂原子的5-9元单环或稠合双环杂芳基；
R2为H或C1-4烷基；
R3为H、卤素、任选被一个或多个独立选择的卤素取代的C1-4烷基或任选被一个或多个独立选择的卤素取代的C1-4烷氧基；
R4为H或卤素；
R5为-CN、卤素或为-L2-R6；
-L2不存在或为-C(＝O)-、-C(＝O)NR7-、-NR7C(＝O)-、-SO2-、-SO2NR7-或-NR7SO2-；
R6为H或任选被一个或多个独立选择的R8基团取代的C1-6烷基；
R7为H或C1-4烷基；
R8为OH、CN、卤素或C1-4烷氧基；
La不存在或为-C(＝O)-、-C(＝O)O-或-C(＝O)NH-；
Ra为：
-H，
-任选被一个或多个独立选择的Rb取代的C1-4烷基，
-任选被一个或多个独立选择的Rc取代的C3-7单环环烷基，
-包含一个或多个独立地选自O、N和S的杂原子的4-7元单环杂环烷基，或
-包含一个或多个独立地选自O、N和S的杂原子的5-6元单环杂芳基；
Rb为
-卤素，
-CN，
-OH，
-C1-4烷氧基，
-C3-7环烷基，
-包含一个或多个独立地选自O、N和S的杂原子的4-7元单环杂环烷基(该杂环烷基任选被一个或多个独立选择的卤素或氧代基取代)，
--SO2-C1-4烷基，或
--C(＝O)NRb1Rb2；
Rc为
-卤素，
-CN，
-OH，
-C1-4烷基，
--C(＝O)OH，或
--C(＝O)NRc1Rc2；和
Rb1、Rb2、Rc1和Rc2各自独立地选自H和C1-4烷基；
或可药用盐或溶剂合物或可药用盐的溶剂合物。
2)如条款1的化合物或可药用盐，其中R1为Me。
3)如条款1-2中任一项的化合物或可药用盐，其中Cy为苯基。
4)如条款1-2中任一项的化合物或其可药用盐，其中Cy为包含1至4个独立地选自N、O和S的杂原子的5-9元单环或稠合双环杂芳基。
5)如条款1-2中任一项的化合物或其可药用盐，其中5-6元单环杂芳基包含1至4个独立地选自N、O和S的杂原子。
6)如条款1-2中任一项的化合物或可药用盐，其中Cy为吡啶基。
7)如条款1中任一项的化合物或可药用盐，其中所述化合物符合式IIa、IIb或IIc：
其中L1、R3、R4、La、Ra和R5如条款1中所述。
8)如条款1中任一项的化合物或可药用盐，其中所述化合物符合式IIIa、IIIb或IIIc：
其中L1、R3、R4、La、Ra和R5如条款1中所述。
9)如条款1-8中任一项的化合物或可药用盐，其中L1为-CH2-。
10)如条款1-8中任一项的化合物或可药用盐，其中L1为O。
11)如条款1-8中任一项的化合物或可药用盐，其中L1为-NR2-。
12)如条款11的化合物或可药用盐，其中R2为H。
13)如条款11的化合物或可药用盐，其中R2为C1-4烷基。
14)如条款11的化合物或可药用盐，其中R2为Me。
15)如条款1中任一项的化合物或可药用盐，其中所述化合物符合式IVa、IVb、IVc、IVd、IVe或IVf：
其中R3、R4、R5、La和Ra如条款1中所述。
16)如条款1-15中任一项的化合物或可药用盐，其中La不存在。
17)如条款1-15中任一项的化合物或可药用盐，其中La为-C(＝O)-。
18)如条款1中任一项的化合物或可药用盐，其中所述化合物符合式Va、Vb、Vc、Vd、Ve或Vf：
其中R3、R4、R5、La和Ra如条款1中所述。
19)如条款1-18中任一项的化合物或可药用盐，其中R4为H。
20)如条款1-18中任一项的化合物或可药用盐，其中R4为F或Cl。
21)如条款1-18中任一项的化合物或可药用盐，其中R3为H。
22)如条款1-18中任一项的化合物或可药用盐，其中R3为C1-4烷基。
23)如条款22的化合物或可药用盐，其中R3为Me或Et。
24)如条款1-23中任一项的化合物或可药用盐，其中R5为CN。
25)如条款1-23中任一项的化合物或可药用盐，其中R5为卤素。
26)如条款25的化合物或可药用盐，其中R5为F或Cl。
27)如条款1-23中任一项的化合物或可药用盐，其中R5为-L2-R6，R6如条款1中所述，且L2为-C(＝O)NR7-、-NR7C(＝O)-、-SO2NR7-或-NR7SO2-。
28)如条款27的化合物或可药用盐，其中R7为H。
29)如条款1-23中任一项的化合物或可药用盐，其中R5为-L2-R6，L2如条款1中所述，且R6为H。
30)如条款1-26中任一项的化合物或可药用盐，其中R5为-L2-R6，L2如条款1中所述，且R6为C1-6烷基。
31)如条款30的化合物或可药用盐，其中R6为Me。
32)如条款1-23中任一项的化合物或可药用盐，其中R5为-L2-R6，L2如条款1中所述，且R6为被一个或多个独立选择的R8基团取代的C1-6烷基。
33)如条款32的化合物或可药用盐，其中R6为Me、Et、iPr或tBu，其各自被一个或多个独立选择的R8基团取代。
34)如条款33的化合物或可药用盐，其中R8为OH、CN、F、Cl、-OMe或-OEt。
35)如条款1-23中任一项的化合物或可药用盐，其中R5为-L2-R6，其中L2为-C(＝O)-或-SO2-，且R6为C1-6烷基。
36)如条款35的化合物或可药用盐，其中R5为-C(＝O)Me、-C(＝O)Et、-SO2Me或-SO2Et。
37)如条款1-23中任一项的化合物或可药用盐，其中R5为-L2-R6，其中L2为-C(＝O)NR7-、-NR7C(＝O)-、-SO2NR7-或-NR7SO2-，其中R7为H、Me或Et，且R6为Me、Et、iPr或tBu，其各自任选被一个或多个独立选择的OH、CN、卤素或C1-4烷氧基取代。
38)如条款37的化合物或可药用盐，其中R5为-C(＝O)NH2或-SO2NH2。
39)如条款1-38中任一项的化合物或可药用盐，其中Ra为C1-4烷基。
40)如条款39的化合物或可药用盐，其中Ra为Me或Et。
41)如条款1-38中任一项的化合物或可药用盐，其中Ra为被一个或多个独立选择的Rb取代的C1-4烷基。
42)如条款41的化合物或可药用盐，其中Ra为Me、Et、iPr或tBu。
43)如条款41或42的化合物或可药用盐，其中Rb为F、Cl、CN或OH。
44)如条款41或42的化合物或可药用盐，其中Rb为OMe、OEt或OiPr。
45)如条款41或42的化合物或可药用盐，其中Rb为环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
46)如条款41或42的化合物或可药用盐，其中Rb为氧杂环丁基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、氮杂环丁基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基或硫吗啉基。
47)如条款41或42的化合物或可药用盐，其中Rb为氧杂环丁基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、氮杂环丁基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基或硫吗啉基，其各自被一个或多个独立选择的卤素或氧代基取代。
48)如条款41或42的化合物或可药用盐，其中Rb为-SO2CH3或-SO2CH2CH3。
49)如条款41或42的化合物或可药用盐，其中Rb为-C(＝O)NH2、-C(＝O)NMeH或-C(＝O)NMe2。
50)如条款1-38中任一项的化合物或可药用盐，其中Ra为C3-7单环环烷基。
51)如条款1-38中任一项的化合物或可药用盐，其中Ra为被一个或多个独立选择的Rc基团取代的C3-7单环环烷基。
52)如条款50或51的化合物或可药用盐，其中Ra为环丙基、环丁基或环戊基。
53)如条款51的化合物或可药用盐，其中Rc为F、Cl、CN或OH。
54)如条款51的化合物或可药用盐，其中Rc为-Me、-Et或-iPr。
55)如条款51的化合物或可药用盐，其中Rc为-C(＝O)OH。
56)如条款51的化合物或可药用盐，其中Rc为-C(＝O)NH2、-C(＝O)NMeH或-C(＝O)NMe2。
57)如条款1-38中任一项的化合物或可药用盐，其中Ra为：
58)如条款1-38中任一项的化合物或可药用盐，其中Ra为：
59)如条款1-38中任一项的化合物或可药用盐，其中Ra为包含一个或多个独立地选自O、N和S的杂原子的4-7元单环杂环烷基。
60)如条款59的化合物或可药用盐，其中Ra为氧杂环丁基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、氮杂环丁基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基或硫吗啉基。
61)如条款1-38中任一项的化合物或可药用盐，其中Ra为包含一个或多个独立地选自O、N和S的杂原子的5-6元单环杂芳基。
62)如条款61的化合物或可药用盐，其中Ra为呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、***基、噁二唑基、四唑、吡啶基、吡嗪基或嘧啶基。
63)如条款1的化合物或其可药用盐，其中所述化合物选自表I。
64)如条款1的化合物或其可药用盐，其中所述化合物为(1R,2R)-N-[6-[(6-氰基-4-甲基-3-吡啶基)氧基]-1-甲基-苯并咪唑-4-基]-2-氟-环丙烷甲酰胺。
65)如条款1的化合物或其可药用盐，其中所述化合物不为(1R,2R)-N-[6-[(6-氰基-4-甲基-3-吡啶基)氧基]-1-甲基-苯并咪唑-4-基]-2-氟-环丙烷甲酰胺。
66)如条款1的化合物或其可药用盐，其中所述化合物为(1R,2R)-N-(6-((6-氰基-4-甲基吡啶-3-基)(甲基)氨基)-1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-4-基)-2-氟环丙烷甲酰胺。
67)如条款1的化合物或其可药用盐，其中所述化合物不为(1R,2R)-N-(6-((6-氰基-4-甲基吡啶-3-基)(甲基)氨基)-1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-4-基)-2-氟环丙烷甲酰胺。
68)医药组合物，包含可药用载体和药物有效量的如条款1-67中任一项的化合物。
69)如条款68的医药组合物，包含另外的治疗剂。
70)如条款1-67中任一项的化合物或其可药用盐或如条款68-69中任一项的医药组合物，用于药剂中。
71)如条款1-67中任一项的化合物或如条款68-69中任一项的医药组合物，其用于治疗或预防过敏性疾病、炎性疾病、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨转换受损的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6分泌过多或干扰素分泌过多相关的疾病。
72)如条款1-67中任一项的化合物或如条款68-69中任一项的医药组合物，其用于治疗或预防增殖性疾病。
73)如条款72的化合物，其中所述增殖性疾病选自骨髓纤维化、T细胞急性淋巴母细胞白血病(T-ALL)、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、胰癌、肝癌、肝细胞癌(HCC)、肺癌、乳癌和结肠癌。
74)过敏性疾病、炎性疾病、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨转换受损的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6分泌过多或干扰素分泌过多相关的疾病的治疗或预防方法，该方法包括施用足以实现所述治疗或预防的量的如条款1-67中任一项的化合物或如条款68-69中任一项的医药组合物。
75)增殖性疾病的治疗或预防方法，该方法包括施用足以实现所述治疗或预防的量的如条款1-67中任一项的化合物或如条款68-69中任一项的医药组合物。
76)如条款76的治疗方法，其中所述增殖性疾病选自骨髓纤维化、T细胞急性淋巴母细胞白血病(T-ALL)、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、胰癌、肝癌、肝细胞癌(HCC)、肺癌、乳癌和结肠癌。
77)如条款75-77中任一项的方法，其中如条款1-67中任一项的化合物或如条款68-69中任一项的医药组合物是与其它治疗剂组合施用的。
78)如条款69的医药组合物或如条款78的方法，其中所述其它治疗剂是用于治疗或预防过敏性疾病、炎性疾病、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨转换受损的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6分泌过多或干扰素分泌过多相关的疾病的物质。
79)如条款69的医药组合物或如条款78的方法，其中所述其它治疗剂是用于治疗或预防骨髓纤维化、T细胞急性淋巴母细胞白血病(T-ALL)、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、胰癌、肝癌、肝细胞癌(HCC)、肺癌、乳癌和结肠癌的物质。
医药组合物
当用作药物时，本发明的化合物通常以医药组合物的形式施用。这类组合物可以以医药领域熟知的方式进行制备，其包含至少一种式I的本发明的活性化合物。通常，本发明的化合物以药物有效量进行施用。本发明的化合物的实际施用量通常将由医师根据相关情况、包括待治疗病症、所选的施用途径、所施用的实际的本发明的化合物、个体患者的年龄、体重和响应以及患者症状的严重性等来确定。
本发明的医药组合物可通过多种途径来施用，包括口服、经直肠、经皮、皮下、关节内、静脉内、肌内和鼻内。根据预期的递送途径，本发明的化合物优选配制成可注射或口服组合物，或配制成均用于经皮施用的药膏、乳液或贴剂。
口服施用的组合物可采取散装液体溶液或混悬液或散装散剂的形式。然而，更通常地，所述组合物以单位剂量形式呈现以便于精确给药。术语“单位剂量形式”指适宜作为用于人个体和其它哺乳动物的单位剂量的物理离散单位，各单位含有经计算产生预期治疗作用的预定量的活性物质以及适宜的药用赋形剂、媒介物或载体。典型单位剂量形式包括液体组合物的预填充、预测量安瓿剂或注射器或者在固体组合物的情况中的丸剂、片剂、胶囊剂等。在这类组合物中，式I的本发明的化合物通常是较少的组分(约0.1至约50重量％或优选约1至约40重量％)，其余为各种媒介物或载体和有助于形成预期给药形式的加工助剂。
适于口服施用的液体形式可以包括适宜的水性或非水性媒介物以及缓冲剂、助悬剂和分散剂、着色剂、矫味剂等。固体形式可以包括例如以下成分中的任一者或具有类似性质的本发明的化合物：粘合剂，例如微晶纤维素、西黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如海藻酸、Primogel)或玉米淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁；助流剂，例如胶体二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或矫味剂，例如薄荷或柑橘矫味剂。
可注射组合物通常基于可注射无菌生理盐水或磷酸盐缓冲生理盐水或本领域已知的其它可注射载体。如前所述，这类组合物中的式I的本发明的活性化合物通常为较少的组分，通常为约0.05至10重量％，其余为可注射载体等。
经皮组合物通常配制成含有活性成分的局部用软膏或乳膏，所述活性成分的量通常为约0.01至约20重量％、优选约0.1至约20重量％、优选约0.1至约10重量％、更优选约0.5至约15重量％。当配制成软膏时，通常将活性成分与石蜡或水可混溶性软膏基质合并。或者，可以将活性成分与例如水包油型乳膏基质一起配制成乳膏。这类经皮制剂是本领域熟知的，通常包括增强活性成分或制剂的稳定性的经皮穿透的另外成分。所有这类已知的经皮制剂和成分包括在本发明的范围内。
本发明的化合物还可以通过经皮装置施用。因此，经皮施用可以采用贮库或多孔膜型或固体骨架类贴剂来实现。
上述用于可口服施用、可注射或可局部施用的组合物的组分仅仅是代表性的。其它物质以及加工技术等在Remington's Pharmaceutical Sciences,第17版,1985,Mack出版公司,伊斯顿,宾夕法尼亚州的第8部分中给出，该文献引入本文作为参考。
本发明的化合物还可以以持续释放形式或从持续释放药物递送***中进行施用。代表性持续释放材料的描述可见于Remington's Pharmaceutical Sciences。
以下制剂实施例说明了可以按照本发明制备的代表性医药组合物。然而，本发明不限于以下的医药组合物。
制剂1-片剂
可以将式I的本发明的化合物与干明胶粘合剂以约1:2重量比混合成干燥粉末。可添加少量硬脂酸镁作为润滑剂。可以在压片机中使混合物形成240-270mg片剂(每片片剂含有80-90mg式I的本发明的活性化合物)。
制剂2-胶囊剂
可以将式I的本发明的化合物与淀粉稀释剂以约1:1重量比混合成干燥粉末。可以将混合物填充至250mg胶囊中(每粒胶囊剂含有125mg式I的本发明活性化合物)。
制剂3-液体
可以将式I的本发明的化合物(125mg)与蔗糖(1.75g)和西黄耆胶(4mg)混合，将所得混合物掺合，通过10号网眼U.S.筛过筛，随后与先前制备的微晶纤维素和羧甲基纤维素钠(11:89，50mg)在水中的溶液混合。可以将苯甲酸钠(10mg)、矫味剂和着色剂用水稀释并在搅拌下添加。然后可以在搅拌下添加足够的水。然后可以添加更多足够的水以产生5mL的总体积。
制剂4-片剂
可以将式I的本发明的化合物与干明胶粘合剂以约1:2重量比混合成干燥粉末。可以添加少量硬脂酸镁作为润滑剂。可以在压片机中使混合物形成450-900mg片剂(每片片剂含有150-300mg式I的本发明的活性化合物)
制剂5-注射剂
可以将式I的本发明的化合物溶于或混悬于缓冲无菌生理盐水可注射水性介质中，达到约5mg/mL的浓度。
制剂6-局部用
可以将硬脂醇(250g)和白凡士林(250g)在约75℃熔融，然后可以添加式I的本发明的化合物(50g)、尼泊金甲酯(0.25g)、尼泊金丙酯(0.15g)、月桂硫酸钠(10g)和丙二醇(120g)溶于水(约370g)中的混合物，可以将所得混合物搅拌直至其凝结。
治疗方法
本发明的化合物可用作用于治疗哺乳动物的与JAK异常活性因果相关或可归因于JAK异常活性的病症的治疗剂。具体而言，病症与JAK1和/或TYK2的异常活性相关。因此，本发明的化合物和医药组合物可用作预防和/或治疗哺乳动物、包括人的过敏性疾病、炎性疾病、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨转换受损的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6分泌过多或干扰素分泌过多相关的疾病的治疗剂。
在一个方面，本发明提供了本发明的化合物或包含本发明的化合物的医药组合物用作药剂。
在另一方面，本发明提供了本发明的化合物或包含本发明的化合物的医药组合物用于制备药剂。
在另一方面，本发明提供了治疗患有本文公开的疾病或处于患有本文公开的疾病的风险中的哺乳动物的方法，所述方法包括施用有效治疗病症或预防病症的量的一种或多种本文所述的本发明的医药组合物或化合物。在特定方面，本发明提供了治疗患有以下疾病或处于患有以下疾病的风险中的哺乳动物的方法：过敏性疾病、炎性疾病、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨转换受损的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6分泌过多或干扰素分泌过多相关的疾病。
在治疗方法方面，本发明提供了易罹患或罹患过敏性反应的哺乳动物的治疗和/或预防方法，所述方法包括施用有效治疗病症或预防病症的量的一种或多种如本文所述的本发明的医药组合物或化合物。在特定实施方案中，过敏性反应选自过敏性气道疾病、窦炎、湿疹和荨麻疹、食物过敏和昆虫毒液过敏。
在另一方面，本发明提供了本发明的化合物用于治疗和/或预防过敏性反应。在特定实施方案中，过敏性反应选自过敏性气道疾病、窦炎、湿疹和荨麻疹、食物过敏和昆虫毒液过敏。
在另一方面，本发明提供了本发明的化合物或包含本发明的化合物的医药组合物用于制备治疗或预防过敏性反应的药剂。在特定实施方案中，过敏性反应选自过敏性气道疾病、窦炎、湿疹和荨麻疹、食物过敏和昆虫毒液过敏。
在另外的治疗方法方面，本发明提供了易罹患或罹患炎性病症的哺乳动物的治疗和/或预防方法。所述方法包括施用有效治疗病症或预防病症的量的一种或多种如本文所述的本发明的医药组合物或化合物。在特定实施方案中，炎性病症选自类风湿性关节炎、骨关节炎、过敏性气道疾病(例如哮喘)和炎性肠病。
在另一方面，本发明提供了本发明的化合物用于治疗和/或预防炎性病症。在特定实施方案中，炎性病症选自类风湿性关节炎、骨关节炎、过敏性气道疾病(例如哮喘)和炎性肠病。
在另一方面，本发明提供了本发明的化合物或包含本发明的化合物的医药组合物用于制备治疗和/或预防炎性病症的药剂。在特定实施方案中，炎性病症选自类风湿性关节炎、骨关节炎、过敏性气道疾病(例如哮喘)和炎性肠病。
在另外的治疗方法方面，本发明提供了易罹患或罹患自身免疫疾病的哺乳动物的治疗和/或预防方法。所述方法包括施用有效治疗病症或预防病症的量的一种或多种本文所述的本发明的医药组合物或化合物。在特定实施方案中，自身免疫疾病选自COPD、哮喘、全身性红斑狼疮、I型糖尿病和炎性肠病。
在另一方面，本发明提供了本发明的化合物用于治疗和/或预防自身免疫疾病。在特定实施方案中，自身免疫疾病选自COPD、哮喘、全身性红斑狼疮、I型糖尿病和炎性肠病。在更特定实施方案中，自身免疫疾病为全身性红斑狼疮。
在另一方面，本发明提供了本发明的化合物或包含本发明的化合物的医药组合物用于制备治疗和/或预防自身免疫疾病的药剂。在特定实施方案中，自身免疫疾病选自COPD、哮喘、全身性红斑狼疮、I型糖尿病和炎性肠病。
在其它治疗方法方面，本发明提供了易罹患或罹患增殖性疾病的哺乳动物的治疗和/或预防方法，所述方法包括施用有效治疗病症或预防病症的量的一种或多种本文所述的本发明的医药组合物或化合物。在特定实施方案中，增殖性疾病选自癌症(例如实体肿瘤，例如子宫平滑肌肉瘤或***癌)、白血病(例如AML、ALL或CLL)、多发性骨髓瘤和银屑病。在更特定实施方案中，增殖性疾病选自骨髓纤维化、T细胞急性淋巴母细胞白血病(T-ALL)、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、胰癌、肝癌、肝细胞癌(HCC)、肺癌、乳癌和结肠癌。
在另一方面，本发明提供了本发明的化合物用于治疗和/或预防增殖性疾病。在特定实施方案中，增殖性疾病选自癌症(例如实体肿瘤，例如子宫平滑肌肉瘤或***癌)、白血病(例如AML、ALL或CLL)、多发性骨髓瘤和银屑病。在更特定实施方案中，增殖性疾病选自骨髓纤维化、T细胞急性淋巴母细胞白血病(T-ALL)、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、胰癌、肝癌、肝细胞癌(HCC)、肺癌、乳癌和结肠癌。
在另一方面，本发明提供了本发明的化合物或包含本发明的化合物的医药组合物用于制备治疗和/或预防增殖性疾病的药剂。在特定实施方案中，增殖性疾病选自癌症(例如实体肿瘤，例如子宫平滑肌肉瘤或***癌)、白血病(例如AML、ALL或CLL)、多发性骨髓瘤和银屑病。在更特定实施方案中，增殖性疾病选自骨髓纤维化、T细胞急性淋巴母细胞白血病(T-ALL)、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、胰癌、肝癌、肝细胞癌(HCC)、肺癌、乳癌和结肠癌。
在其它治疗方法方面，本发明提供了易罹患或罹患移植排斥的哺乳动物的治疗和/或预防方法，所述方法包括施用有效治疗病症或预防病症的量的一种或多种本文所述的本发明的医药组合物或化合物。在特定实施方案中，移植排斥为器官移植排斥。
在另一方面，本发明提供了本发明的化合物用于治疗和/或预防移植排斥。在特定实施方案中，移植排斥为器官移植排斥。
在另一方面，本发明提供了本发明的化合物或包含本发明的化合物的医药组合物用于制备治疗和/或预防移植排斥的药剂。在特定实施方案中，移植排斥为器官移植排斥。
在治疗方法方面，本发明提供了易罹患或罹患涉及软骨转换受损的疾病的哺乳动物的治疗和/或预防方法，所述方法包括施用治疗有效量的本文所述的本发明的化合物或一种或多种医药组合物。
在另一方面，本发明提供了本发明的化合物用于治疗和/或预防涉及软骨转换受损的疾病。
在另一方面，本发明提供了本发明的化合物或包含本发明的化合物的医药组合物用于制备治疗和/或预防涉及软骨转换受损的疾病的药剂。
本发明还提供了治疗和/或预防先天性软骨畸形的方法，所述方法包括施用有效量的一种或多种本文所述的本发明的医药组合物或化合物。
在另一方面，本发明提供了本发明的化合物用于治疗和/或预防先天性软骨畸形。
在另一方面，本发明提供了本发明的化合物或包含本发明的化合物的医药组合物用于制备治疗和/或预防先天性软骨畸形的药剂。
在其它治疗方法方面，本发明提供了易罹患或罹患与IL6分泌过多相关的疾病的哺乳动物的治疗和/或预防方法，所述方法包括施用有效治疗病症或预防病症的量的一种或多种本文所述的本发明的医药组合物或化合物。在特定实施方案中，与IL6分泌过多相关的疾病选自卡斯尔曼病和肾小球膜增生性肾小球肾炎。
在另一方面，本发明提供了本发明的化合物用于治疗和/或预防与IL6分泌过多相关的疾病。在特定实施方案中，与IL6分泌过多相关的疾病选自卡斯尔曼病和肾小球膜增生性肾小球肾炎。
在另一方面，本发明提供了本发明的化合物或包含本发明的化合物的医药组合物用于制备治疗和/或预防与IL6分泌过多相关的疾病的药剂。在特定实施方案中，与IL6分泌过多相关的疾病选自卡斯尔曼病和肾小球膜增生性肾小球肾炎。
在其它治疗方法方面，本发明提供了易罹患或罹患与干扰素分泌过多相关的疾病的哺乳动物的治疗和/或预防方法，所述方法包括施用有效治疗病症或预防病症的量的一种或多种本文所述的本发明的医药组合物或化合物。在特定实施方案中，与干扰素分泌过多相关的疾病选自全身性和皮肤型红斑狼疮、狼疮性肾炎、皮肌炎、舍格伦综合征、银屑病和类风湿性关节炎。
在另一方面，本发明提供了本发明的化合物用于治疗和/或预防与干扰素分泌过多相关的疾病。在特定实施方案中，与干扰素分泌过多相关的疾病选自全身性和皮肤型红斑狼疮、狼疮性肾炎、皮肌炎、舍格伦综合征、银屑病和类风湿性关节炎。
在另一方面，本发明提供了本发明的化合物或包含本发明的化合物的医药组合物用于制备治疗和/或预防与干扰素分泌过多相关的疾病的药剂。在特定实施方案中，与干扰素分泌过多相关的疾病选自全身性和皮肤型红斑狼疮、狼疮性肾炎、皮肌炎、舍格伦综合征、银屑病和类风湿性关节炎。
作为本发明的另一方面，提供了用作药物、尤其是用于治疗和/或预防上述病症和疾病的本发明的化合物。本文还提供了本发明的化合物在制备治疗和/或预防上述病症和疾病之一的药剂中的用途。
本发明的方法的特定方案包括向罹患涉及炎症的疾病的个体施用有效量的本发明的化合物达到足以降低该个体的炎症水平、优选终止引起所述炎症的过程的时间期。所述方法的特定实施方案包括向罹患或易罹患发生类风湿性关节炎的个体患者施用有效量的本发明的化合物达到足以分别降低或预防所述患者的关节炎症、优选终止引起所述炎症的过程的时间期。
本发明的方法的其它特定方案包括向罹患以软骨或关节退化为特征的疾病病症(例如类风湿性关节炎和/或骨关节炎)的个体施用有效量的本发明的化合物达到足以降低、优选终止引起所述退化的自身延续过程的时间期。该方法的特定实施方案包括向罹患或易罹患发生骨关节炎的个体患者施用有效量的本发明的化合物达到足以分别降低或阻止所述患者的关节软骨退化、优选终止引起所述退化的自身延续过程的时间期。在特定实施方案中，所述化合物可呈现出软骨合成代谢和/或抗分解代谢性质。
注射剂量水平介于约0.1mg/kg/h至至少10mg/kg/h，均持续约1至约120小时、尤其是24至96小时。还可以施用约0.1mg/kg至约10mg/kg或更多的预装快速浓注以达到充分稳态水平。对于40至80kg人患者，最大总剂量预期不超过约2g/天。
对于长期病症如退化性病症的预防和/或治疗，治疗方案通常延续历经多个月或多年，因此口服给药就患者便利性和耐受性而言是优选的。在口服给药时，每天一至五次、尤其是二至四次、通常是三次口服给药是代表性方案。采用这种给药模式，各剂量提供了约0.01至约20mg/kg本发明的化合物，其中特定剂量各自提供了约0.1至约10mg/kg、尤其是约1至约5mg/kg。
通常选择经皮剂量以提供与采用注射剂量所实现的血液水平相比类似或较低的血液含量。
当用于预防病症发作时，本发明的化合物将以上述剂量水平施用于处于发生该病症的风险中的患者，通常是在医师的建议和监督下进行。处于发生特定病症的风险中的患者通常包括具有该病症的家族史的患者或已经通过遗传测试或筛查被鉴别为特别易罹患该病症的患者。
本发明的化合物可以作为唯一活性剂施用，或者其可以与其它治疗剂、包括展示出相同或相似治疗活性并且被确定对于这种组合施用而言安全有效的其它化合物组合施用。在特定实施方案中，两种(或更多种)物质的共同施用允许显著降低各物质的使用剂量，由此减少观察到的副作用。
在一个实施方案中，本发明的化合物或包含本发明的化合物的医药组合物作为药剂施用。在特定实施方案中，所述医药组合物另外包含其它活性成分。
在一个实施方案中，本发明的化合物与其它治疗剂共同施用以用于治疗和/或预防涉及炎症的疾病；特定的治疗剂包括但不限于免疫调节剂(例如硫唑嘌呤(azathioprine))、皮质类固醇(例如***龙(prednisolone)或***(dexamethasone))、环磷酰胺(cyclophosphamide)、环孢素A(cyclosporin A)、他克莫司(tacrolimus)、麦考酚酸吗乙酯(Mycophenolate Mofetil)、莫罗单抗-CD3(muromonab-CD3)(OKT3，例如)、ATG、阿司匹林(aspirin)、对乙酰氨基酚(acetaminophen)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)和吡罗昔康(piroxicam)。
在一个实施方案中，本发明的化合物与其它治疗剂共同施用以用于治疗和/或预防关节炎(例如类风湿性关节炎)；特定的治疗剂包括但不限于镇痛剂、非类固醇抗炎药(NSAIDS)、类固醇、合成DMARDS(例如但不限于甲氨喋呤(methotrexate)、来氟米特(leflunomide)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、金诺芬(auranofin)、金硫丁二钠(sodiumaurothiomalate)、青霉胺(penicillamine)、氯喹、羟基氯喹、硫唑嘌呤和环孢素(ciclosporin))和生物DMARDS(例如但不限于英夫利昔单抗(Infliximab)、依那西普(Etanercept)、阿达木单抗(Adalimumab)、利妥昔单抗(Rituximab)和阿巴西普(Abatacept))。
在一个实施方案中，本发明的化合物与其它治疗剂共同施用以用于治疗和/或预防增殖性病症；特定的治疗剂包括但不限于：甲氨喋呤、亚叶酸(leukovorin)、亚德利亚霉素(adriamycin)、***(prenisone)、博来霉素(bleomycin)、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)、长春花新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、长春瑞滨(vinorelbine)、多柔比星(doxorubicin)、他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、阿那曲唑(anastrozole)、戈舍瑞林(goserelin)、抗HER2单克隆抗体(例如HerceptinTM)、卡培他滨(capecitabine)、雷诺昔酚盐酸盐(raloxifene hydrochloride)、EGFR抑制剂(例如TarcevaTM、ErbituxTM)、VEGF抑制剂(例如AvastinTM)、蛋白酶体抑制剂(例如VelcadeTM)、和hsp90抑制剂(例如17-AAG)。另外，本发明的化合物可以与其它疗法、包括但不限于放射疗法或手术组合施用。在特定实施方案中，增殖性病症选自癌症、骨髓增殖性疾病和白血病。
在一个实施方案中，本发明的化合物与其它治疗剂共同施用以用于治疗和/或预防自身免疫疾病，特定的治疗剂包括但不限于：糖皮质激素、细胞生长抑制剂(例如嘌呤类似物)、烷化剂(例如氮芥(环磷酰胺)、亚硝基脲、铂化合物等)、抗代谢物(例如甲氨喋呤、硫唑嘌呤和巯基嘌呤)、细胞毒性抗生素(例如放线菌素D蒽环霉素(dactinomycinanthracycline)、丝裂霉素C(mitomycin C)、博来霉素和光神霉素(mithramycin))、抗体(例如抗CD20、抗CD25或抗CD3(OTK3)单克隆抗体、和)、环孢素、他克莫司、雷帕霉素(rapamycin)(西罗莫司(sirolimus))、干扰素(例如IFN-β)、TNF结合蛋白(例如英夫利昔单抗(RemicadeTM)、依那西普(EnbrelTM)或阿达木单抗(HumiraTM))、麦考酚酯、芬戈莫德(Fingolimod)和多球壳菌素(Myriocin)。
在一个实施方案中，本发明的化合物与其它治疗剂共同施用以用于治疗和/或预防移植排斥，特定的治疗剂包括但不限于：钙调磷酸酶抑制剂(例如环孢素或他克莫司(FK506))、mTOR抑制剂(例如西罗莫司、依维莫司(everolimus))、抗增殖剂(例如硫唑嘌呤、麦考酚酸(mycophenolic acid))、皮质类固醇(例如***龙、氢化可的松(hydrocortisone))、抗体(例如单克隆抗IL-2Rα受体抗体、巴利昔单抗(basiliximab)、达珠单抗(daclizumab))、多克隆抗T细胞抗体(例如抗胸腺细胞球蛋白(ATG)、抗淋巴细胞球蛋白(ALG))。
在一个实施方案中，本发明的化合物与其它治疗剂共同施用以用于治疗和/或预防哮喘和/或鼻炎和/或COPD，特定的治疗剂包括但不限于：β2肾上腺素受体激动剂(例如沙丁胺醇(salbutamol)、左沙丁胺醇(levalbuterol)、特布他林(terbutaline)和比托特罗(bitolterol))、肾上腺素(吸入或片剂)、抗胆碱能药(例如异丙托溴铵(ipratropiumbromide))、糖皮质激素(口服或吸入)长效β2激动剂(例如沙美特罗(salmeterol)、福莫特罗(formoterol)、班布特罗(bambuterol)和持续释放口服阿布叔醇)、吸入类固醇和长效支气管扩张剂的组合(例如氟替卡松(fluticasone)/沙美特罗、布***(budesonide)/福莫特罗)、白三烯拮抗剂和合成抑制剂(例如孟鲁司特(montelukast)、扎鲁司特(zafirlukast)和齐留通(zileuton))、介体释放抑制剂(例如色甘酸盐(cromoglycate)和酮替芬(ketotifen))、IgE反应生物调节剂(例如奥马珠单抗(omalizumab))、抗组胺药(例如西替利嗪(ceterizine)、桂利嗪(cinnarizine)、非索非那定(fexofenadine))和血管收缩剂(例如羟甲唑啉(oxymethazoline)、赛洛唑啉(xylomethazoline)、萘甲唑林(nafazoline)和曲马唑啉(tramazoline))。
另外，本发明的化合物可以与用于哮喘和/或COPD的紧急疗法组合施用，这类疗法包括氧气或氦氧混合气施用、雾化沙丁胺醇或特布他林(任选与抗胆碱能药(例如异丙托铵)组合)、全身性类固醇(口服或静脉内，例如***、***龙、甲泼尼龙、***或氢化可的松)、静脉内沙丁胺醇、非特异性β激动剂、注射或吸入剂(例如肾上腺素、异他林(isoetharine)、异丙肾上腺素、奥西那林)、抗胆碱能药(IV或雾化，例如格隆铵(glycopyrrolate)、阿托品(atropine)、异丙托铵)、甲基黄嘌呤(茶碱、氨茶碱、苄胺茶碱(bamiphylline))、具有支气管扩张作用的吸入麻醉剂(例如异氟烷(isoflurane)、氟烷(halothane)、恩氟醚(enflurane))、***(ketamine)和静脉内硫酸镁。
在一个实施方案中，本发明的化合物与其它治疗剂共同施用以用于治疗和/或预防炎性肠病(IBD)，特定的治疗剂包括但不限于：糖皮质激素(例如***、布***)；改善疾病的合成免疫调节剂(例如甲氨喋呤、来氟米特、柳氮磺吡啶、美沙拉嗪(mesalazine)、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤和环孢素)和改善疾病的生物免疫调节剂(英夫利昔单抗、阿达木单抗、利妥昔单抗和阿巴西普)。
在一个实施方案中，本发明的化合物与其它治疗剂共同施用以用于治疗和/或预防SLE，特定的治疗剂包括但不限于：改善疾病的抗风湿药物(DMARD)，例如抗疟疾药(例如plaquenil、羟基氯喹)、免疫抑制剂(例如甲氨喋呤和硫唑嘌呤)、环磷酰胺和麦考酚酸；免疫抑制药物和镇痛剂，例如非类固醇抗炎药、***制剂(例如右丙氧芬(dextropropoxyphene)和co-codamol)、阿片样物质(例如氢可酮(hydrocodone)、羟考酮(oxycodone)、美施康定(MS Contin)或***(methadone))和芬太尼多瑞吉(fentanylduragesic)经皮贴剂。
在一个实施方案中，本发明的化合物与其它治疗剂共同施用以用于治疗和/或预防银屑病，特定的治疗剂包括但不限于：局部治疗，例如浴液、增湿剂、含煤焦油的含药乳膏和软膏、地蒽酚(dithranol)(蒽三酚(anthralin))；类皮质类固醇，如去羟米松(desoximetasone)(TopicortTM)、醋酸氟轻松(fluocinonide)、维生素D3类似物(例如钙泊三醇(calcipotriol))、摩洛哥坚果油(argan oil)和类视色素(retinoid)(依曲替酯(etretinate)、阿维A(acitretin)、他扎罗汀(tazarotene))；全身性治疗，例如甲氨喋呤、环胞菌素、类视色素、硫鸟嘌呤、羟基脲(hydroxyurea)、柳氮磺吡啶、麦考酚酸吗乙酯、硫唑嘌呤、他克莫司、富马酸酯或生物制剂如AmeviveTM、EnbrelTM、HumiraTM、RemicadeTM、RaptivaTM和优西努单抗(ustekinumab)(一种IL-12和IL-23阻断剂)。另外，本发明的化合物可以与其它疗法、包括但不限于光疗法或光化学疗法(例如补骨脂素(psoralen)和紫外线A光疗法(PUVA))组合施用。
在一个实施方案中，本发明的化合物与其它治疗剂共同施用以用于治疗和/或预防过敏性反应，特定的治疗剂包括但不限于：抗组胺药(例如西替利嗪、苯海拉明(diphenhydramine)、非索非那定、左西替利嗪(levocetirizine))、糖皮质激素(例如***、倍他米松(betamethasone)、倍氯米松(beclomethasone)、***)、肾上腺素、茶碱或抗白三烯剂(例如孟鲁司特或扎鲁司特)、抗胆碱能药和减充血剂。
如对于本领域技术人员显而易见的是，共同施用包括将两种或更多种治疗剂作为相同治疗方案的一部分递送给患者的任意手段。虽然两种或更多种治疗剂可以在单一制剂中同时施用，但这不是必需的。治疗剂可以在不同的制剂中在不同时间施用。
化学合成操作
通用
本发明的化合物可采用以下通用方法和操作由容易获得的起始物质来制备。应理解，在给出典型或优选方法条件(即反应温度、时间、反应物的摩尔比、溶剂、压力等)的情况中，其它方法条件也是可以使用的，另有指出除外。最佳的反应条件可以根据所用的具体反应物或溶剂而变，但是这类条件可由本领域技术人员通过常规优化操作来确定。
另外，如本领域技术人员显而易见的那样，常规保护基可以是阻止某些官能基发生不期望的反应所必需的。针对特定官能团选择适宜的保护基以及是的保护和脱保护条件是本领域熟知的(Greene,T W；Wuts,P G M；,1991)。
关于制备如上文定义的本发明的化合物和比较实施例，详细给出了下述方法。本发明的化合物可以由有机合成领域的技术人员由已知或市售起始物质和试剂来制备。
所有试剂均为商品级，并且未经进一步纯化原样使用，另有指示除外。将市售无水溶剂用于在惰性氛围下进行的反应。在所有其它情况中使用试剂级溶剂，另有指示除外。在硅胶60(35-70μm)上进行柱色谱法。采用预涂布硅胶F-254板(厚度为0.25mm)进行薄层色谱法。在Bruker DPX 400NMR光谱仪(400MHz)或Bruker Advance 300NMR光谱仪(300MHz)上记录1H NMR光谱。1H NMR光谱的化学位移(δ)以相对于四甲基硅烷(δ0.00)或适当残余溶剂峰(即CHCl3,δ7.27)(作为内标)的百万分率(ppm)报导。峰裂数以单峰(s)、二重峰(d)、三重峰(t)、四重峰(q)、五重峰(quin)、多重峰(m)和宽峰(br)给出。电喷雾MS谱在Waters平台LC/MS光谱仪上或采用与Waters质量检测仪3100光谱仪偶联的Waters Acquity H-Class UPLC获得。所用柱子：Waters Acquity UPLC BEH C18 1.7μm,2.1mm ID×50mM L、WatersAcquity UPLC BEH C18 1.7μm,2.1mm ID×30mm L或Waters Xterra MS 5μm C18,100×4.6mm。所述方法采用MeCN/H2O梯度(含0.1％TFA或0.1％NH3的H2O)或MeOH/H2O梯度(含0.05％TFA的H2O)。使用Biotage Initiator进行微波加热。
使用与ZQ单四极质谱仪偶联的质量指向的自动纯化***进行制备型HPLC纯化。使用H2O(不同pH)/MeCN梯度进行所有的HPLC纯化。通常使用BEH XBrigde C18(5μm，19×5mm)前置柱和BEH XBrigde C18(5μm，19×100mm)进行碱性条件下的制备型HPLC分离。通常使用CSH Select C18(5μm，19×5mm)前置柱和CSH Select C18(5μm，19×100mm)进行酸性条件下的分离。集中梯度为在5分钟内由x％至x+25％的乙腈水溶液，循环时间为10分钟。柱流速为20mL/min。进样体积介于200至750μL。毛细管分流器用于在柱分离后分流至质谱仪，经1mL/min补充流稀释。补充流为含0.1％甲酸的甲醇。所有样品通过Waters质量指向级分收集进行纯化。
表I.实验部分中所用的缩略语名单：
本发明的化合物的合成制备
实施例1.本发明的中间化合物的合成
1.1.双-(4-甲氧基-苄基)-胺(Int.1)的合成
将茴香醛(411mmol)、4-甲氧基苄基胺(411mmol)和甲苯(500mL)在装备有冷凝器和Dean-Stark分离器的圆底烧瓶中合并。使反应物回流1小时，在此期间水从反应混合物中除去。冷却反应物并浓缩。将残余物溶于MeOH(120mL)中。将混合物冷却至5℃，历经45分钟分批添加NaBH4(205mmol)。将反应物缓慢加热至回流。回流2小时后，将反应物冷却至室温并浓缩。将残余物溶于EtOAc中。洗涤(3×H2O和盐水)有机层，干燥(Na2SO4)并浓缩，得到预期产物。
1.2.(6-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-4-基)-双-(4-甲氧基-苄基)-胺(Int.2)的合成
1.2.1.步骤i：5-溴-1,3-二氟-2-硝基-苯
于70℃历经30分钟向NaBO3.4H2O(325mmol)在AcOH(450mL)中的混悬液中滴加4-溴-2,6-二氟苯胺(240mmol)在AcOH(150mL)中的溶液。历经5小时向混合物中添加另外2080mmol NaBO3.4H2O。在此期间将混合物于70℃搅拌。将混合物倒入水中，用Et2O萃取。使用与上文所述相同的条件，将有机层与获自另一反应的其它Et2O溶液合并。浓缩混合物。形成沉淀，通过过滤分离。将滤液浓缩，进行快速柱色谱法(SiO2，石油醚)后得到预期产物。
1.2.2.步骤ii：(5-溴-3-氟-2-硝基-苯基)-甲基-胺
向5-溴-1,3-二氟-2-硝基苯(164mmol)和Cs2CO3(197mmol)在THF(1L)中的溶液中滴加2M MeNH2的THF溶液(82mL)。反应混合物于0℃搅拌1小时，随后于室温搅拌1小时。减压除去溶剂。将残余物分配于EtOAc与H2O之间。分离两相，干燥(Na2SO4)有机层，浓缩，得到预期产物。
1.2.3.步骤iii：5-溴-N,N-双-(4-甲氧基-苄基)-N'-甲基-2-硝基-苯-1,3-二胺
于120℃搅拌双-(4-甲氧基-苄基)-胺(346mmol)、5-溴-3-氟-N-甲基-2-硝基苯胺(297mmol)和Et3N(891mmol)的混合物16小时。接着冷却混合物。将粗物质与按照与上文所述相同的操作程序获得的其它粗物质合并。将所得混合物稀释于EtOAc中，洗涤(2×0.2MHCl、H2O和饱和NaHCO3)。干燥(Na2SO4)有机相，浓缩，得到预期产物。
1.2.4.步骤iv：5-溴-N,N-双-(4-甲氧基-苄基)-N”-甲基-苯-1,2,3-三胺
于室温搅拌5-溴-N,N-双-(4-甲氧基-苄基)-N'-甲基-2-硝基-苯-1,3-二胺(170mmol)、NH4Cl(2038mmol)和Zn(2034mmol)在1:1MeOH/THF(1L)中的混合物1小时。将混合物冷却至0℃，缓慢添加HCOOH(20mL)。使混合物达至室温并搅拌1小时。过滤混合物，与按照上文所述的程序获得的其它混合物合并。浓缩所得混合物。将残余物溶于DCM中。洗涤(饱和NH4Cl)有机混合物，干燥(Na2SO4)，浓缩，得到预期产物。
1.2.5.步骤v：(6-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-4-基)-双-(4-甲氧基-苄基)-胺
将5-溴-N,N-双-(4-甲氧基-苄基)-N”-甲基-苯-1,2,3-三胺(170mmol)溶于HC(OEt)3(100mol)与MeCN(500mL)的混合物中。混合物于85℃搅拌0.5小时，随后于室温搅拌约16小时。将混合物与按照与上文所述相同的程序获得的其它混合物合并。浓缩所得混合物，通过快速柱色谱法(SiO2，15:85至60:40EtOAc/石油醚)纯化残余物，获得预期产物。
1.3. 5-{7-[双-(4-甲氧基-苄基)-氨基]-3-甲基-3H-苯并咪唑-5-基氧基}-4-甲基-吡啶-2-甲腈(Int.3)的合成.
1.3.1.步骤i：双-(4-甲氧基-苄基)-[1-甲基-6-(4,4,5,5-四甲基-[1,3,2]二氧硼杂环戊烷-2-基)-1H-苯并咪唑-4-基]-胺
(6-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-4-基)-双-(4-甲氧基-苄基)-胺(54mmol)、联硼酸频那醇酯(81mmol)、PdCl2(dppf).DCM(2.71mmol)和KOAc(162.5mmol)在DMF(150mL)中的混合物在氮气流下超声处理5分钟。混合物然后于110℃在配备有冷凝器的圆底烧瓶中搅拌1小时。经由硅藻土垫过滤混合物，浓缩滤液。将残余物溶于EtOAc中，洗涤(H2O)有机层，干燥(Na2SO4)，浓缩，得到预期产物。
1.3.2.步骤ii：5-{7-[双-(4-甲氧基-苄基)-氨基]-3-甲基-3H-苯并咪唑-5-基氧基}-4-甲基-吡啶-2-甲腈
将30重量％H2O2的H2O溶液(20mL)添加至N,N-双(4-甲氧基苄基)-1-甲基-6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-胺(58.5mmol)在DMF(600mL)中的溶液中，于室温搅拌混合物约16小时。用5％Na2SO3水溶液淬灭反应。用EtOAc萃取混合物。洗涤(H2O)有机层，干燥(Na2SO4)，浓缩，得到预期产物。
1.4.通用方法：邻位定向的碘化
其中W可为：-N＝、-CH＝、-C(Cl)＝；Y可为：-N＝、-C(CN)＝
1.4.1.方法A1
将氨基芳族或杂芳族起始物质(1当量)、Ag2SO4(1当量)和I2(1当量)在EtOH中的混合物在室温至50℃的温度下搅拌一段时间，该时间可以在1小时至约16小时内变化。过滤混合物，浓缩，稀释于有机溶剂中。对有机混合物进行水性后处理。减压除去溶剂，通过快速柱色谱法纯化残余物，得到预期产物。
1.4.2.方法A1的说明性实施例：4-氨基-3-氟-5-碘-苄腈(Int.4)的合成.
于室温搅拌4-氨基-3-氟苄腈(147mmol)、I2(147mmol)和Ag2SO4(147mmol)在EtOH(700mL)中的混合物1.5小时。过滤混合物，浓缩。将残余物溶于EtOAc中，洗涤(饱和Na2S2O3×3)。干燥(Na2SO4)有机层，浓缩。通过快速柱色谱法(SiO2，95:5至70:30环己烷/EtOAc)纯化残余物，得到预期产物。
1.4.3.方法A2
于70℃搅拌氨基芳族或杂芳族起始物质(1当量)、Ag2SO4(3至4当量)和I2(3至4当量)在EtOH中的混合物16小时。可添加更多当量的I2和Ag2SO4以增加转化。过滤混合物，浓缩。通过快速柱色谱法纯化残余物，得到预期产物。
1.5.方法A2的说明性实施例：5-氨基-6-氟-4-碘-吡啶-2-甲腈(Int.5)的合成.
于70℃搅拌Int.11(3.62mmol)、I2(14.5mmol)和Ag2SO4(14.5mmol)在EtOH(200mL)中的混合物16小时。再添加5当量的I2和Ag2SO4，将反应物于70℃搅拌另外72小时。过滤混合物，浓缩，通过快速柱色谱法(SiO2，20:80至40:60EtOAc/环己烷)纯化，得到预期产物。
1.6.通用方法：通过根岸(Negishi)反应引入腈基
其中RA可为芳基或杂芳基；且X可为Cl、Br或I。
1.6.1.方法B
将芳基/杂芳基卤化物(1当量)、氰化锌(1至3当量)、Pd(PPh3)4(0.1至0.2当量)在DMF中的混合物于微波设备中在150℃加热5分钟至0.5小时。过滤混合物，浓缩。用有机溶剂稀释残余物。对有机混合物进行后处理，减压除去溶剂。将残余物研磨或通过快速柱色谱法纯化，得到预期产物。
1.6.2.方法B的说明性实施例：5-氟-4-甲基-吡啶-2-甲腈(Int.7)的合成.
向微波管中加入在DMF(20mL)中的2-氯-5-氟-4-甲基吡啶(5.5mmol)、Zn(CN)2(16.6mmol)、Pd(PPh3)4(1.1mmol)。在微波反应器中，在150℃搅拌混合物5分钟。混合物与按照上文所述的程序获得的其它粗物质合并。过滤所得混合物。减压浓缩滤液。用EtOAc稀释残余物，洗涤(饱和NH4Cl)，干燥(Na2SO4)，浓缩。通过快速柱色谱法(SiO2，5:95至15:85EtOAc/石油醚)纯化残余物，得到预期产物。
1.7.通用方法：使用甲基硼酸进行的铃木(Suzuki)反应
其中W可为：-N＝、-CH＝、-C(Cl)＝；且Y可为：-N＝、-C(CN)＝；且X可为-I或-Br
1.7.1.方法C
在100℃搅拌芳族/杂芳族卤化物(1当量)、甲基硼酸(1.3至3当量)、Pd(dppf)Cl2.DCM(0.11至0.2当量)和Cs2CO3(3至5当量)在1,4-二噁烷中的混合物。用有机溶剂稀释混合物。对有机混合物进行水性后处理，减压除去溶剂。通过快速柱色谱法纯化残余物，得到预期产物。
1.7.2.方法C的说明性实施例：5-氨基-6-氟-4-甲基-吡啶-2-甲腈(Int.12)的合成.
在105℃搅拌Int.5(3mmol)、甲基硼酸(9.1mmol)、Pd(dppf)Cl2.DCM(0.32mmol)和Cs2CO3(15.2mmol)在1,4-二噁烷(8mL)中的混合物5小时。稀释(EtOAc)混合物，洗涤(饱和NaHCO3)，干燥(Na2SO4)，浓缩。通过快速柱色谱法(SiO2，10:90至50:50EtOAc/石油醚)纯化残余物，得到预期产物。
1.8. 6-溴-2-氟-吡啶-3-基胺(Int.15)的合成
于室温搅拌2-氟吡啶-3-胺(44.6mmol)和KOAc(44.6mmol)在AcOH中的混合物1小时。将混合物冷却至0℃，滴加Br2(44.6mmol)。于0℃搅拌混合物15分钟。浓缩混合物，将残余物溶于EtOAc/MeOH中。洗涤(饱和NaHCO3、饱和Na2S2O3)有机溶液，干燥(Na2SO4)，浓缩。通过快速柱色谱法(SiO2，100:0至80:20石油醚/EtOAc)纯化残余物，得到预期产物。
1.9. 2-溴-6-氟-4-甲磺酰基-苯基胺(Int.16)的合成.
于室温搅拌2-氟-4-甲基磺酰基-苯胺(22.76mmol)和KOAc(22.7mmol)在AcOH中的混合物。将混合物冷却至0℃，滴加Br2(22.7mmol)。于0℃搅拌混合物30分钟。浓缩混合物，将残余物溶于EtOAc中。洗涤(饱和NaHCO3、饱和Na2S2O3)有机混合物，干燥(Na2SO4)，浓缩，得到预期产物。
1.10. 4-氨基-3-乙基-5-氟-苄腈(Int.17)的合成.
将Cs2CO3(46mmol)和Pd(dppf)Cl2.DCM(0.76mmol)的混合物混悬于DMF(35mL)中，用氮气脱气。向混合物中添加H2O(400μL)、1M Et3B的THF溶液(11.5mL)和Int.4(7.63mmol)在DMF(5mL)中的溶液，在60℃搅拌反应物30分钟。浓缩混合物，将残余物溶于EtOAc中，洗涤(饱和NaHCO3、H2O)，干燥(Na2SO4)，浓缩。通过快速柱色谱法(SiO2，100:0至95:5石油醚/EtOAc)纯化残余物，得到预期产物。
1.11.通用方法：NH2转化成碘
其中R10可为Me或Et。
1.11.1.方法D
于0℃向氨基芳族/杂芳族化合物(1当量)在H2O中的混合物中滴加浓HCl(6当量)。滴加NaNO2(1.05当量)在H2O中的溶液。于0℃搅拌所得混合物15分钟。滴加KI(1.05当量)在H2O中的溶液。混合物于0℃搅拌15分钟，于室温搅拌1小时。用有机溶剂萃取混合物。在水性处理和减压除去溶剂后，可对残余物进行研磨或色谱法，得到预期产物。
1.11.2.方法D的说明性实施例：5-碘-4-甲基-吡啶-2-甲腈(Int.18)的合成.
于0℃向Int.8(1.88mmol)在H2O(10mL)中的混合物中滴加浓HCl(0.9mL)，随后滴加NaNO2(1.97mmol)在H2O(0.5mL)中的溶液。于0℃搅拌所得混合物15分钟。滴加KI(1.97mmol)在H2O(1mL)中的溶液。所得混合物于0℃搅拌15分钟，于室温搅拌1小时。用EtOAc萃取混合物。洗涤(H2O)有机层，干燥，浓缩。通过快速柱色谱法(SiO2，100:0至75:25环己烷/EtOAc)纯化残余物，得到预期产物。
1.12. 6-溴-4-甲基-吡啶-3-基胺(Int.20)的合成
在90℃搅拌NH4Cl(14.9mmol)和铁粉(18.4mmol)在H2O(5mL)中的混合物。分批添加2-溴-4-甲基-5-硝基吡啶(2.3mmol)。在90℃搅拌混合物1小时15分钟。停止反应，用EtOAc萃取。干燥(Na2SO4)有机层，浓缩，得到预期产物。
1.13. 4-氨基-3-氯-5-氟-苄腈(Int.21)的合成
于70℃搅拌4-氨基-3-氟苄腈(184mmol)和NCS(276mmol)在AcOH(300mL)中的混合物约16小时。浓缩混合物。向残余物中添加H2O，过滤出固体产物并洗涤(饱和NaHCO3和H2O)。为除去H2O，添加THF并减压除去，得到预期产物。
1.14. 3-乙基-4-羟基-苄腈(Int.22)的合成
于0℃向4-氨基-3-乙基苄腈(6.84mmol)在H2O(12mL)中的溶液中滴加浓H2SO4(3.4mL)。于0℃向所得混合物中滴加NaNO2(7.52mmol)在H2O(5mL)中的溶液。反应物于0℃搅拌30分钟且在100℃搅拌2小时。将混合物冷却至室温，用EtOAc萃取。洗涤(H2O)有机层，干燥，浓缩，得到预期产物。
1.15. 2-氯-3-氟-吡啶-4-基胺(Int.23)的合成
1.15.1.步骤i：N-(2-氯-3-氟-4-吡啶基)氨甲酸叔丁酯
将二苯基磷酰基叠氮化物(DPPA)(129mmol)添加至2-氯-3-氟-吡啶-4-甲酸(85.7mmol)、Et3N(257mmol)在1:1t-BuOH/甲苯(200mL)中的混合物中。在110℃加热混合物4小时。用H2O稀释混合物，用DCM萃取。干燥(Na2SO4)有机层，浓缩。通过快速柱色谱法(SiO2，100:0至80:20DCM/EtOAc)纯化残余物，得到预期产物N-(2-氯-3-氟-4-吡啶基)氨甲酸叔丁酯。
1.15.2.步骤ii：2-氯-3-氟-吡啶-4-基胺
于室温搅拌N-(2-氯-3-氟-4-吡啶基)氨甲酸叔丁酯(20.2mmol)在1:2TFA/DCM(45mL)中的溶液6小时。浓缩反应混合物，通过快速柱色谱法(SiO2，100:0至90:10DCM/7NNH3的MeOH溶液)纯化残余物，得到预期产物。
1.16.通用方法：与(6-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-4-基)-双-(4-甲氧基-苄基)-胺(Int.2)的布赫瓦尔德(Buchwald)偶联.
其中RA可为任选取代的芳基或杂芳基。
1.16.1.方法E1
用惰性气体净化Int.2(1当量)、相应的苯胺(1.1当量)、Cs2CO3(2当量)和XPhos(0.3当量)在无水甲苯中的混合物，随后添加Pd(OAc)2(0.1至0.15当量)。在110℃搅拌混合物约16小时。混合物可分配于有机溶剂与水相之间。分离两层，干燥有机层，浓缩。或者，可过滤反应混合物，浓缩。残余物可保持原样或通过色谱法纯化，得到预期产物。
1.16.2.方法E1的说明性实施例：5-{7-[双-(4-甲氧基-苄基)-氨基]-3-甲基-3H-苯并咪唑-5-基氨基}-4-乙基-吡啶-2-甲腈(Int.24)的合成.
用氩气净化Int.2(0.75mmol)、Int.10(0.79mmol)、Cs2CO3(1.5mmol)和XPhos(0.225mmol)在无水甲苯(6.3mL)中的混合物，随后添加Pd(OAc)2(0.075mmol)。在110℃搅拌混合物约16小时。用H2O稀释混合物，用DCM萃取。洗涤(盐水)有机层，干燥(Na2SO4)，浓缩。通过快速柱色谱法(SiO2，100:0至50:50环己烷/EtOAc)纯化残余物，得到预期产物。
1.16.3.方法E2
用惰性气体净化Int.2(1当量)、相应的苯胺(1.1当量)、Cs2CO3(4至5当量)和XPhos(0.4当量)在无水甲苯中的混合物，随后添加Pd(OAc)2(0.2至0.3当量)。在110℃搅拌混合物1小时至24小时。混合物可分配于有机溶剂与水相之间。分离两层，干燥有机层，浓缩。或者，可过滤反应混合物，浓缩。残余物可保持原样或通过色谱法纯化，得到预期产物。
1.16.4.方法E2的说明性实施例：5-{7-[双-(4-甲氧基-苄基)-氨基]-3-甲基-3H-苯并咪唑-5-基氨基}-4-甲基-吡啶-2-甲腈(Int.27)的合成.
用氩气净化Int.2(4mmol)、Int.8(4.3mmol)、Cs2CO3(20mmol)和XPhos(1.6mmol)在无水甲苯(35mL)中的混合物10分钟，随后添加Pd(OAc)2(1.2mmol)。在110℃搅拌混合物约16小时。经由硅藻土垫过滤混合物，浓缩。通过快速柱色谱法(SiO2，98:2至25:75环己烷/EtOAc)纯化残余物，得到预期产物。
1.16.5.方法E3
Int.2(1当量)、苯胺(1.1当量)、BINAP(0.3当量)、Cs2CO3(4当量)和Pd(OAc)2(0.2当量)在无水1,4-二噁烷中的混合物用惰性气体脱气。在100-110℃搅拌反应物4小时至约16小时。混合物可分配于有机溶剂与水相之间。分离两层，干燥有机层，浓缩。或者，可过滤反应混合物，浓缩。残余物可保持原样或通过色谱法纯化，得到预期产物。
1.16.6.方法E3的说明性实施例：N6-(2-氟-4-甲磺酰基-苯基)-N4,N4-双-(4-甲氧基-苄基)-1-甲基-1H-苯并咪唑-4,6-二胺(Int.34)的合成.
Int.2(1.48mmol)、2-氟-4-甲基磺酰基-苯胺(1.58mmol)、BINAP(0.47mmol)、Cs2CO3(6.32mmol)和Pd(OAc)2(0.32mmol)在无水1,4-二噁烷(15mL)中的混合物用氮气脱气。在100℃搅拌反应物约16小时。用EtOAc稀释混合物，洗涤(H2O)有机层，干燥(Na2SO4)，浓缩，得到预期产物。
1.16.7.方法E4
Int.2(1当量)、苯胺(1.1当量)、Brettphos(0.1当量)、Cs2CO3(5当量)和Pd(OAc)2(0.05当量)在无水1,4-二噁烷中的混合物用惰性气体脱气。在85-95℃搅拌反应物2小时至约8小时。混合物可分配于有机溶剂与水相之间。分离两层，干燥有机层，浓缩。或者，可过滤反应混合物，浓缩。残余物可保持原样或通过色谱法纯化，得到预期产物。
1.16.8.方法E4的说明性实施例：N6-(2,3-二氢-1,4-苯并二噁烯-6-基)-N4,N4-双[(4-甲氧基苯基)甲基]-1-甲基-苯并咪唑-4,6-二胺(Int.78)的合成.
Int.2(1.17mmol)、2,3-二氢-1,4-苯并二噁烯-6-胺(1.29mmol)、Brettphos(0.117mmol)、Cs2CO3(6.32mmol)和Pd(OAc)2(0.058mmol)在无水1,4-二噁烷(15mL)中的混合物用氮气脱气。在90℃搅拌反应物约5小时。用EtOAc稀释混合物，洗涤(H2O)有机层，干燥(Na2SO4)，浓缩，得到预期产物。
1.17.通用方法：布赫瓦尔德(Buchwald)产物的甲基化
其中RA可为任选取代的芳基或杂芳基。
1.17.1.方法F
于0℃将NaH(60％于矿物油中，1.1至3当量)添加至获自布赫瓦尔德偶联的中间体(1当量)在THF或DMF中的溶液中。于0℃搅拌混合物30分钟。添加MeI(1.1至3当量)，于室温搅拌混合物1小时至约16小时。混合物分配于有机溶剂与水相之间。分离两层，干燥有机层，浓缩。残余物通过二氧化硅色谱法纯化或未经进一步纯化按原样使用。
1.17.2.方法F的说明性实施例：N6-(2-氟-4-甲磺酰基-6-甲基-苯基)-N4,N4-双-(4-甲氧基-苄基)-1,N6-二甲基-1H-苯并咪唑-4,6-二胺(Int.37)的合成.
于0℃将NaH(60％于矿物油中，6.76mmol)添加至Int.35(2.25mmol)在THF(10mL)中的溶液中。于0℃搅拌混合物30分钟。添加MeI(6.76mmol)，于室温搅拌混合物约16小时。用EtOAc稀释混合物，用H2O洗涤。干燥(Na2SO4)有机层，浓缩。通过快速柱色谱法(SiO2，20:80至80:20EtOAc/石油醚)纯化残余物，得到预期产物。
1.17.3.方法F的说明性实施例：N4,N4-双[(4-甲氧基苯基)甲基]-N6,1-二甲基-N6-(2-甲基-4-甲磺酰基-苯基)苯并咪唑-4,6-二胺(Int.49A)和N6-(4-乙磺酰基-2-甲基-苯基)-N4,N4-双[(4-甲氧基苯基)甲基]-N6,1-二甲基-苯并咪唑-4,6-二胺(Int.49B)的合成.
于0℃将NaH(60％于矿物油中，4.86mmol)添加至Int.36(1.62mmol)在THF(10mL)中的溶液中。于0℃搅拌混合物30分钟。添加MeI(4.86mmol)，于室温搅拌混合物1小时。用EtOAc稀释混合物，用H2O洗涤。干燥(Na2SO4)有机层，浓缩。快速柱色谱法(SiO2，20:80至80:20EtOAc/石油醚)产生预期产物(Int.49A，主要产物)连同副产物(Int.49B，次要产物)的混合物。
1.18. 4-{7-[双-(4-甲氧基-苄基)-氨基]-3-甲基-3H-苯并咪唑-5-基氧基}-3-乙基-苄腈(Int.50)的合成.
用氩气冲洗Int.2(0.4mmol)、Int.22(0.4mmol)、CuI(0.06mmol)和Cs2CO3(1mmol)在吡啶(2mL)中的混合物，密封，在微波反应器中在200℃加热3小时。用H2O稀释混合物，用EtOAc萃取。干燥有机层，浓缩，得到预期产物。
1.19.通用方法：5-{7-[双-(4-甲氧基-苄基)-氨基]-3-甲基-3H-苯并咪唑-5-基氧基}-4-甲基-吡啶-2-甲腈(Int.3)与芳族或杂芳族卤化物之间的乌尔曼偶联(Ullmanncoupling)
其中RA可为任选取代的芳基或杂芳基。
1.19.1.方法G
用惰性气体冲洗Int.3(1当量)、芳基卤化物(1.2至1.3当量)、CuI(0.1至0.2当量)、N,N-二甲基甘氨酸(0.3至0.5当量)和Cs2CO3(3当量)在1:1DMF/1,4-二噁烷中的混合物，在110℃搅拌4.5小时至16小时。过滤混合物，分配于有机溶剂与水相之间。分离两层，干燥有机层，浓缩。通过二氧化硅色谱法纯化残余物。
1.19.2.方法G的说明性实施例：5-{7-[双-(4-甲氧基-苄基)-氨基]-3-甲基-3H-苯并咪唑-5-基氧基}-4-甲基-吡啶-2-甲腈(Int.51)的合成.
用氩气冲洗Int.3(0.39mmol)、Int.18(0.47mmol)、CuI(0.08mmol)、N,N-二甲基甘氨酸(0.2mmol)和Cs2CO3(1.17mmol)在1:1DMF/1,4-二噁烷(4mL)中的混合物，在110℃于密封管中搅拌约16小时。将反应混合物冷却至室温，经硅藻土垫过滤。浓缩滤液。添加水，用EtOAc萃取混合物。用水洗涤有机层，干燥，浓缩。通过快速柱色谱法(SiO2，100:0至40:60环己烷/EtOAc)纯化残余物，得到预期产物。
1.20.通用方法：5-{7-[双-(4-甲氧基-苄基)-氨基]-3-甲基-3H-苯并咪唑-5-基氧基}-4-甲基-吡啶-2-甲腈(Int.3)与芳族或杂芳族卤化物之间的SNAr偶联
其中RA可为任选取代的芳基或杂芳基。
1.20.1.方法H
在100℃搅拌Int.3(1当量)、芳基/杂芳基卤化物(1.2至1.5当量)和K2CO3(2当量)在DMF中的混合物3小时至约16小时。用EtOAc稀释混合物，用H2O洗涤若干次，干燥，浓缩。通过快速柱色谱法纯化残余物。
1.20.2.方法H的说明性实施例：5-{7-[双-(4-甲氧基-苄基)-氨基]-3-甲基-3H-苯并咪唑-5-基氧基}-4-甲基-吡啶-2-甲腈(Int.51)的合成.
在100℃搅拌Int.3(58mmol)、Int.7(70mmol)和K2CO3(116mmol)在DMF(160mL)中的混合物。在3小时后，再添加7.35mMol Int.7至反应物中，再在100℃搅拌混合物1小时。用EtOAc稀释所得混合物，用H2O洗涤若干次，干燥(Na2SO4)，浓缩。通过快速柱色谱法(SiO2，15:85至35:75EtOAc/石油醚)纯化残余物，得到预期产物。
1.21.通用方法：双-PMB脱保护
其中RA可为任选取代的芳基或杂芳基；且-L-可为：-NH-、-NMe-或-O-。
1.21.1.方法I1
于室温搅拌受保护的双-PMB胺(1当量)在TFA中的混合物30分钟至约16小时。使温度升高至50或60℃，进一步搅拌混合物0.5至3小时。使用碱性水溶液和有机溶剂对混合物进行后处理。分离两相，干燥有机层，浓缩。或者，可首先浓缩反应混合物，随后对残余物进行上述后处理。获自后处理的残余物可通过二氧化硅色谱法或通过SCX-3(Biotage)离子交换树脂纯化或保持原样。
1.21.2.方法I1的说明性实施例：N6-(2-氟-4-甲磺酰基-6-甲基-苯基)-1,N6-二甲基-1H-苯并咪唑-4,6-二胺(Int.53)的合成.
Int.37(0.33mmol)在TFA(5mL)中的混合物于室温搅拌1小时，在50℃搅拌0.5小时。浓缩混合物。残余物分配于饱和NaHCO3与DCM之间。分离两相，干燥(Na2SO4)有机层，浓缩。通过快速柱色谱法(SiO2，20:80至100:0EtOAc/石油醚)纯化残余物，得到预期产物。
1.21.3.方法I1的说明性实施例：N6,1-二甲基-N6-(2-甲基-4-甲磺酰基-苯基)苯并咪唑-4,6-二胺(Int.56A)和N6-(4-乙磺酰基-2-甲基-苯基)-N6,1-二甲基-苯并咪唑-4,6-二胺(Int.56B)的合成.
Int.49A和49B(总计约0.61mmol)在TFA(5mL)中的混合物于室温搅拌约16小时，在50℃搅拌3小时。浓缩混合物。残余物分配于饱和NaHCO3与DCM之间。分离两相，干燥(Na2SO4)有机层，浓缩。快速柱色谱法(SiO2，20:80至100:0EtOAc/石油醚)产生预期产物(Int.56A，主要产物)连同衍生自Int.49B脱保护的副产物(Int.56B，次要产物)的混合物。
1.21.4.方法I2
于室温搅拌受保护的双-PMB胺(1当量)在DCM/TFA(3:1至1:1比率)中的混合物20分钟至3小时。使用碱性水溶液和有机溶剂对混合物进行后处理。分离两相，干燥有机层，浓缩。或者，可首先浓缩反应混合物且随后对残余物进行上述后处理。获自后处理的残余物可通过二氧化硅色谱法或通过SCX-3(Biotage)离子交换树脂纯化或保持原样。
1.21.5.方法I2的说明性实施例：5-(7-氨基-3-甲基-苯并咪唑-5-基)氧基-4-甲基-吡啶-2-甲腈(Cpd 28)的合成.
于0℃将TFA(55mL)添加至Int.51(23.1mmol)在DCM(55mL)中的溶液中。于室温搅拌混合物20分钟。添加甲苯，浓缩混合物。残余物分配于DCM与饱和NaHCO3之间。分离两相，干燥(Na2SO4)有机层，浓缩。通过快速柱色谱法(SiO2，100:0至95:5EtOAc/MeOH)纯化残余物。用THF洗涤从柱子获得的产物，得到预期产物(Int 79)。
1.21.6.方法I3
于室温搅拌受保护的双-PMB胺(1当量)在TFA中的混合物30分钟至约16小时。将混合物稀释于有机溶剂中，用碱性水溶液洗涤。分离两相，干燥有机层，浓缩。或者，在洗涤之前，可首先浓缩反应混合物。然后浓缩有机层，残余物可通过二氧化硅色谱法或通过SCX-3(Biotage)离子交换树脂纯化或未经任何进一步纯化原样使用。
1.21.7.方法I3的说明性实施例：5-[(7-氨基-3-甲基-3H-苯并咪唑-5-基)-甲基-氨基]-4-甲基-吡啶-2-甲腈(Int.62)的合成.
于室温搅拌Int.41(2.4mmol)在TFA(10mL)中的溶液3小时。稀释(DCM)混合物，用饱和NaHCO3且随后用5N NaOH洗涤。分离两层，进一步用DCM萃取水层。合并有机层，干燥(经由相分离器过滤)，浓缩。通过快速柱色谱法(SiO2，100:0至90:10EtOAc/MeOH)纯化残余物，得到预期产物。
1.22. 4-乙基-6-甲磺酰基-吡啶-3-基胺(Int.70)的合成.
1.22.1.步骤i：4-乙基-2-甲磺酰基-5-硝基-吡啶
于室温搅拌2-溴-4-乙基-5-硝基-吡啶(4.35mmol)和甲烷亚磺酸钠(4.35mmol)在DMSO(10mL)中的混合物1.5小时。将混合物倒入冰-水中，搅拌直至冰已融化。过滤混合物，收集固体(预期产物)。
1.22.2.步骤ii：4-乙基-6-甲磺酰基-吡啶-3-胺
在90℃搅拌4-乙基-2-甲基磺酰基-5-硝基-吡啶(4.1mmol)、NH4Cl(26.65mmol)和铁粉(33mmol)在H2O(10mL)中的混合物1小时。停止反应，过滤，用EtOAc萃取。干燥(Na2SO4)有机层，浓缩，得到预期产物。
1.23. 4-乙基-5-碘-2-甲基磺酰基-吡啶(Int.74)的合成.
将KI(15mmol)和NaNO2(12mmol)在H2O(1.8mL)中的溶液滴加至Int.70(6mmol)和p-TsOH·H2O(18mmol)在MeCN(12mL)中的混合物中，保持温度在10至15℃。混合物在10至15℃搅拌10分钟，随后于室温搅拌1小时。将混合物冷却至0℃，中和(饱和NaHCO3)并萃取(DCM)。干燥(Na2SO4)有机层，浓缩。通过快速柱色谱法(SiO2，70:30石油醚/EtOAc)纯化残余物，得到预期产物。
实施例2.本发明的化合物的合成
2.1.通用方法：用碳酰氯衍生物酰化胺中间体以获得最终化合物
其中RA可为任选取代的芳基或杂芳基；L可为NH、NMe或O；且RB可为环烷基、OMe。
2.1.1.方法J1
于0℃将RBCOCl(1当量)添加至中间体胺(1当量)在DCM/吡啶(2:1至5:1比率)中的溶液中。搅拌混合物40分钟至2小时。混合物分配于有机溶剂与水溶液之间。分离两相，干燥有机层，浓缩。或者，反应混合物可未进行后处理而浓缩。残余物可通过二氧化硅色谱法或通过制备型HPLC或通过使用适当溶剂混合物进行沉淀来纯化。
2.1.2.方法J1的说明性实施例：N-(6-((6-氰基-4-乙基吡啶-3-基)(甲基)氨基)-1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-4-基)环丙烷甲酰胺(Cpd 1)的合成.
于0℃将环丙烷碳酰氯(0.39mmol)添加至Int.63(0.39mmol)在1:2吡啶/DCM(2.55mL)中的溶液中。于室温搅拌混合物40分钟。浓缩反应混合物，通过快速柱色谱法(SiO2，100:0至97:3DCM/MeOH)纯化残余物，得到预期产物。
2.1.3.方法J2
将RBC(＝O)Cl(1.5至3当量)添加至中间体胺(1当量)在DCM中的溶液中，随后添加吡啶(1.5至3当量)。搅拌混合物2小时至约16小时。混合物分配于有机溶剂与水溶液之间。分离两相，干燥有机层，浓缩。残余物可通过二氧化硅色谱法、通过制备型HPLC或通过使用适当溶剂混合物进行沉淀来纯化。
2.1.4.方法J2的说明性实施例：6-((6-氰基-4-乙基吡啶-3-基)(甲基)氨基)-1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-4-基氨甲酸甲酯(Cpd 4)的合成.
将氯甲酸甲酯(0.33mmol)添加至Int.63(0.22mmol)在无水DCM(2.2mL)中的溶液中，随后添加吡啶(0.33mmol)。于室温搅拌混合物2小时。混合物分配于H2O与DCM之间。分离两相，洗涤(饱和NaHCO3)有机层，干燥(Na2SO4)，浓缩。通过快速柱色谱法(SiO2，100:0至95:5DCM/MeOH)纯化残余物，得到预期产物。
2.2.通用方法：用羧酸衍生物酰化胺中间体以获得最终化合物
其中RA可为任选取代的芳基或杂芳基；L可为：NH、NMe或O；且RC可为：环烷基、取代的环烷基。
2.2.1.方法K1
于0℃将(COCl)2(1.4至2当量)添加至羧酸(1.5至2当量)在DCM中的溶液中。添加催化性量的DMF，于0℃搅拌反应物30分钟至1小时。将中间体胺(1当量)和吡啶(2至4当量)在DCM中的溶液添加至混合物中。于室温搅拌所得混合物30分钟至2小时。混合物分配于有机溶剂与水溶液之间。分离两相，干燥有机层，浓缩。残余物可通过二氧化硅色谱法、通过制备型HPLC或通过使用适当溶剂混合物进行沉淀来纯化。
2.2.2.方法K1的说明性实施例：(1R,2R)-N-[6-[(6-氰基-4-乙基-3-吡啶基)氧基]-1-甲基-苯并咪唑-4-基]-2-氟-环丙烷甲酰胺(Cpd 6)的合成.
将(COCl)2(0.186mmol)添加至((1R,2R)-(-)-顺-2-氟-环丙烷甲酸(ChemCollect，批次号1241399，0.186mmol)在DCM(1mL)中的溶液中，随后添加DMF(2滴)。使反应混合物于0℃搅拌1小时。将Int.65(0.093mmol)和吡啶(0.186mmol)在DCM(1mL)中的溶液添加至混合物，于室温搅拌反应物2小时。添加饱和NaHCO3，分离两相。浓缩有机层。通过快速柱色谱法(SiO2，100:0至95:5DCM/MeOH)纯化残余物，得到预期产物。
2.2.3.方法K1的说明性实施例：(1R,2R)-N-[6-(N,2-二甲基-4-甲基磺酰基-苯胺基)-1-甲基-苯并咪唑-4-基]-2-氟-环丙烷甲酰胺(Cpd 26)和(1R,2R)-N-[6-(4-乙基磺酰基-N,2-二甲基-苯胺基)-1-甲基-苯并咪唑-4-基]-2-氟-环丙烷甲酰胺(Cpd 27)的合成.
将(COCl)2(0.82mmol)添加至((1R,2R)-(-)-顺-2-氟-环丙烷甲酸(ABCR，批次号1242863，0.92mmol)在DCM(1mL)中的溶液中，随后添加DMF(1滴)。使反应混合物于0℃搅拌45分钟。将Int.56A和Int.56B(总计约0.46mmol)与吡啶(1.85mmol)的混合物在DCM(1mL)中的溶液添加至混合物中，于室温搅拌反应物2小时。用DCM稀释混合物，洗涤(H2O)，分离两相。干燥(Na2SO4)有机层，浓缩。快速柱色谱法(SiO2，20:80EtOAc/石油醚至90:10EtOAc/MeOH)产生化合物26和化合物27的混合物。通过制备型HPLC分离两个组分。
2.2.4.方法K2
于0℃将(COCl)2(1.35至2.5当量)添加至羧酸(1.4至3当量)在DCM中的溶液中。添加催化性量的DMF，于0℃搅拌反应物30分钟至1小时。单独制备中间体胺(1当量)和吡啶(1.7至4当量)在NMP或NMP/DCM中的溶液，确保中间体胺充分溶解。为有助于溶解，可加热(温度至多70℃)。于0℃将后一溶液滴加至含有新形成的酰基氯化物的溶液中。使所得混合物于室温搅拌1至2小时。混合物分配于有机溶剂与水溶液之间。分离两相，干燥有机层，浓缩。残余物可通过二氧化硅色谱法、通过制备型HPLC或通过使用适当溶剂混合物进行沉淀来纯化。
2.2.5.方法K2的说明性实施例：(1R,2R)-N-[6-[(6-氰基-4-甲基-3-吡啶基)氧基]-1-甲基-苯并咪唑-4-基]-2-氟-环丙烷甲酰胺(Cpd 20)的合成.
将(COCl)2(16.6mmol)添加至((1R,2R)-(-)-顺-2-氟-环丙烷甲酸(ABCR，批次号1242863，17.5mmol)在DCM(70mL)中的溶液中，随后添加DMF(200μL)。使反应混合物于0℃搅拌45分钟。为有助于溶解，在65℃加热化合物28(12.5mmol)和吡啶(21.3mmol)在NMP(15mL)中的溶液，使其冷却至室温。于0℃将含有化合物28和吡啶的溶液添加至含有活化羧基衍生物的混合物中，于室温搅拌反应物45分钟。混合物分配于EtOAc与饱和NaHCO3之间。分离两相，进一步洗涤(饱和NaHCO3、NH4Cl、H2O)有机层，干燥(Na2SO4)，浓缩。通过从DCM/iPrOH中沉淀来纯化粗物质，所得固体用Et2O洗涤并真空干燥，得到预期产物。
2.3.通用方法：水解腈基团以获得最终化合物
其中L为NH、NMe或O；RC为环烷基、取代的环烷基；Z为N或CH；且R10为Me或Et。
2.3.1.方法L
将腈起始物质的溶液(1当量)溶于4:1EtOH/DMSO混合物中。所得有机溶液以如下比例10:2:1有机溶液/H2O2/1N NaOH与30％H2O2/H2O和1N NaOH混合。在50℃搅拌混合物1小时。混合物分配于有机溶剂与水溶液之间。分离两相，干燥有机层，浓缩。残余物可通过二氧化硅色谱法、通过制备型HPLC或通过使用适当溶剂混合物进行沉淀来纯化。
2.3.2.方法L的说明性实施例：5-((4-(环丙烷甲酰氨基)-1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)(甲基)氨基)-4-乙基吡啶酰胺(Cpd 24)的合成.
将化合物1的溶液(0.19mmol)溶于4:1EtOH/DMSO混合物(2.3mL)中。所得有机溶液与30％H2O2/H2O(0.4mL)和1N NaOH(0.23mL)混合。在50℃搅拌混合物1小时。反应混合物分配于二氯甲烷与水之间。分离各层，经由相分离器过滤有机层，浓缩。通过制备型HPLC纯化残余物，得到预期产物。
2.3.3.方法M：脲合成的通用方法
将羰基二(***)(1.5当量)添加至Cpd 28(1.0当量)和吡啶(5当量)在DCM中的混合物中。然后在50℃搅拌混合物1小时。未经任何其它处理，在50℃将所需胺RaNH2添加至溶液中，使其再搅拌1小时。通过UPLC确认反应完成后，将反应混合物冷却至室温，用DCM稀释，然后将混合物分配于水中。分离两相，用0.25M HCl溶液、碳酸氢钠溶液洗涤有机层，干燥，浓缩。残余物可通过二氧化硅色谱法、通过制备型HPLC或通过使用适当溶剂混合物进行沉淀来纯化。
2.3.4.方法M的说明性实施例：1-[6-[(6-氰基-4-甲基-3-吡啶基)氧基]-1-甲基-苯并咪唑-4-基]-3-异丙基-脲(Cpd 33)的合成
将羰基(***)(1.07mmol)添加至Cpd 28(0.71mmol)和吡啶(3.55mmol)在DCM(3mL)中的混合物中，在50℃搅拌所得混合物。2分钟后形成沉淀,再搅拌混合物1小时。然后在50℃将甲胺(于THF中的2M溶液)(2.84mmol)添加至溶液中，使其再搅拌1小时。通过UPLC确认反应完成后，将反应混合物冷却至室温，用DCM稀释，分配于水中。分离两相，用0.25MHCl溶液、碳酸氢钠溶液洗涤有机层，干燥，浓缩。残余物不经任何进一步纯化进行使用。
2.4. 5-[7-[[(1R,2R)-2-氟环丙烷甲酰基]氨基]-3-甲基-苯并咪唑-5-基]氧基-4-甲基-吡啶-2-甲酰胺(Cpd 32)的合成.
在50℃搅拌化合物20(0.27mmol)和DMSO(0.5mL)在H2O(pH 13，10mL)中的混合物72小时。过滤混合物。收集固体，通过制备型HPLC纯化，得到预期产物。
2.5. 4-甲基-5-[3-甲基-7-(甲基氨基)苯并咪唑-5-基]氧基-吡啶-2-甲腈(Cpd34)和5-[7-(二甲基氨基)-3-甲基-苯并咪唑-5-基]氧基-4-甲基-吡啶-2-甲腈(Cpd 35)的合成
于0℃将NaH添加至Cpd 28(0.36mmol)在THF(10mL)中的混合物中。30分钟后添加MeI(0.36mmol)，使反应混合物温至室温并搅拌直至完成。通过UPLC监测完成后，将反应物稀释于乙酸乙酯中，用水洗涤。有机层经Na2SO4干燥，过滤并蒸发。通过制备型HPLC分离Cpd34和Cpd 35。
已经按照本文所述的合成方法、采用表II中列出的中间体制备了下表III中列出的说明性的本发明的化合物和比较实施例。表IV中给出了本发明的化合物和一些比较实施例的NMR光谱数据。
表II.本发明的化合物的说明性中间体
表III.说明性的本发明的化合物
表IV.说明性的本发明的化合物的NMR数据
实施例3.比较化合物
3.1.化合物A 2-[4-[(3-甲基苯并咪唑-5-基)氨基]苯基]乙腈
将Pd2(dba)3(0.01mmol)和Xantphos(0.01mmol)在1,4-二噁烷(1mL)中的混合物超声处理，在氮气下添加至6-溴-1-甲基-苯并咪唑(0.45mmol)、2-(4-氨基苯基)乙腈(0.58mmol)和Cs2CO3(0.62mmol)在1,4-二噁烷(2mL)中的混合物中。在110℃搅拌混合物12小时。稀释(DCM)混合物，洗涤(H2O)，干燥(相分离器，浓缩。通过制备型HPLC纯化残余物，得到预期产物(化合物A)。
MW：262.3。MS Ms'd：263.2。
NMR:1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝8.13(1H,s),7.68(1H,dd),7.60(1H,dd),7.54(1H,d),7.32(1H,d),7.24(1H,t),6.91(1H,dd),3.77(3H,s),3.39(3H,s)。
3.2.化合物B
将Pd2(dba)3(0.01mmol)和Xantphos(0.01mmol)在1,4-二噁烷(1mL)中的混合物超声处理，在氮气下添加至6-溴-1-甲基-苯并咪唑(0.45mmol)、2,3-二氢-1,4-苯并二噁烯-6-胺(0.58mmol)和Cs2CO3(0.62mmol)在1,4-二噁烷(2mL)中的混合物中。在110℃搅拌混合物12小时。稀释(DCM)混合物，洗涤(H2O)，干燥(相分离器，浓缩。通过制备型HPLC纯化残余物，得到预期产物(化合物B)。
MW：281.3。MS Ms'd：282.1。
NMR:1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝7.94(1H,s),7.80(1H,br s),7.45(1H,d),7.05(1H,d),6.86(1H,dd),6.73(1H,dd),6.61-6.57(2H,m),4.22-4.16(4H,m),3.71(3H,s)。
3.3.化合物C 3-氟-4-[甲基-(3-甲基苯并咪唑-5-基)氨基]苄腈
3.3.1.步骤i：3-氟-4-[(3-甲基苯并咪唑-5-基)氨基]苄腈
于110℃搅拌含有6-溴-1-甲基-苯并咪唑(2.38mmol)、4-氨基-3-氟-苄腈(3.57mmol)、XPhos(0.95mmol)、Cs2CO3(7.14mmol)和Pd(OAc)2(0.71mmol)在无水甲苯(8mL)中的混合物约16小时。稀释(EtOAc)混合物，洗涤(H2O)，干燥(Na2SO4)，浓缩，得到预期产物3-氟-4-[(3-甲基苯并咪唑-5-基)氨基]苄腈。
3.3.2.步骤ii：3-氟-4-[甲基-(3-甲基苯并咪唑-5-基)氨基]苄腈(化合物C)
于0℃将NaH(7.14mmol)添加至3-氟-4-[(3-甲基苯并咪唑-5-基)氨基]苄腈(2.38mmol)在THF(10mL)中的溶液中。搅拌混合物30分钟。添加MeI(4.76mmol)，在3小时期间于室温搅拌混合物。稀释(DCM)混合物，洗涤(H2O)，浓缩。通过制备型HPLC纯化残余物，得到预期产物(化合物C)。
MW：280.1。MS Ms'd：281.0。
NMR:1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝8.13(1H,s),7.68(1H,dd),7.60(1H,dd),7.54(1H,d),7.32(1H,d),7.24(1H,t),6.91(1H,dd),3.77(3H,s),3.39(3H,s)。
3.4.化合物D
该化合物的合成描述于PCT国际申请(2013)WO 2013117645中。(Menet等人,2013)
生物学实施例
实施例4.体外分析
4.1.JAK1抑制分析
4.1.1.JAK1分析聚GT底物
重组人JAK1催化结构域(氨基酸850-1154；目录号08-144)购自CarnaBiosciences。将10ng JAK1与12.5μg聚GT底物(Sigma目录号P0275)一起在聚丙烯96孔板(Greiner，V型底)中在总体积为25μL的含或不含5μL测试化合物或媒介物(DMSO，1％终浓度)的激酶反应缓冲液(15mM Tris-HCl pH 7.5、1mM DTT、0.01％Tween-20、10mM MgCl2、2μM非放射性ATP、0.25μCi 33P-γ-ATP(GE Healthcare，目录号AH9968)终浓度)中培养。于30℃45分钟后，通过添加25μL/孔的150mM磷酸停止反应。使用细胞收集器(Perkin Elmer)将终止的激酶反应物全部转移至预洗涤(75mM磷酸)的96孔过滤板(Perkin Elmer目录号6005177)。板用300μL/孔的75mM磷酸溶液洗涤6次，密封板底部。添加40μL/孔Microscint-20，密封板顶部，使用Topcount(Perkin Elmer)进行读数。通过从在媒介物存在下获得的每分钟计数(cpm)中减去在阳性对照抑制剂(10μM星孢素)存在下获得的cpm计算了激酶活性。测试化合物抑制该活性的能力如下确定：
RFU测试化合物＝在测试化合物存在下的样品所测定的RFU
RFU对照＝具有阳性对照抑制剂的样品所测定的RFU
RFU媒介物＝在媒介物存在下所测定的RFU
制备化合物的剂量稀释系列，其能够在JAK1分析中测试剂量-响应作用和计算各化合物的IC50。各化合物常规地在20μM浓度下、随后1/3系列稀释、8个点(20μM-6.67μM-2.22μM-740nM-247nM-82nM-27nM-9nM)进行测试，DMSO终浓度为1％。当化合物系列的效能增加时，制备更多的稀释液和/或降低最高浓度(例如5μM、1μM)。
4.1.2.JAK1 Ulight-JAK1肽分析
重组人JAK1(催化结构域，氨基酸866-1154；目录号PV4774)购自Invitrogen。将1ng JAK1与20nM Ulight-JAK1(tyr1023)肽(Perkin Elmer目录号TRF0121)一起在白色384Opti板(Perkin Elmer，目录号6007290)中以20μL的总体积在含或不含4μL测试化合物或媒介物(DMSO，1％终浓度)的激酶反应缓冲液(25mM MOPS pH6.8、0.01％Brij-35、5mMMgCl2、2mM DTT、7μM ATP)中培养。于室温60分钟后，通过添加20μL/孔检测混合物(1×检测缓冲液(Perkin Elmer，目录号CR97-100C)、0.5nM铕抗磷酸酪氨酸(PT66)(Perkin Elmer，目录号AD0068)、10mM EDTA)停止反应。使用Envision进行读数，激发波长为320nm，在615nm处测量发射(Perkin Elmer)。通过从在媒介物存在下获得的相对荧光单位(RFU)中减去在阳性对照抑制剂(10μM星孢素)存在下获得的RFU计算了激酶活性。测试化合物抑制该活性的能力如下确定：
抑制百分数＝((在测试化合物存在下的样品所测定的RFU-具有阳性对照抑制剂的样品所测定的RFU)除以(在媒介物存在下所测定的RFU-具有阳性对照抑制剂的样品所测定的RFU))×100。
制备化合物的剂量稀释系列，其能够在JAK1分析中测试剂量-响应作用和计算化合物的IC50。各化合物常规地在20μM浓度下、随后1/5系列稀释、10个点进行测试，DMSO终浓度为1％。当化合物系列的效能增加时，制备更多的稀释液和/或降低最高浓度(例如5μM、1μM)。数据表示为来自分析的平均IC50值±平均值的标准误差。
表V.说明性的本发明的化合物的JAK1 IC50值
* ＞500nM
** ＞100-500nM
*** ＞50-100nM
**** 0.1-50nM
表VI.比较化合物的JAK1 IC50值
Cpd# JAK1 IC50
A *
B *
C *
D *
4.1.3.JAK1 Ki测定分析
对于测定Ki，将不同量的化合物与酶混合，随ATP浓度变化追踪酶促反应。通过Km相对于化合物浓度的双倒数绘图(Lineweaver-Burk绘图)测得Ki。将1ng JAK1(Invitrogen，PV4774)用于该分析。底物为50nM Ulight-JAK-1(Tyr1023)肽(PerkinElmer，TRF0121)。反应在25mM MOPS(pH 6.8，0.01％)、2mM DTT、5mM MgCl2Brij-35与不同浓度的ATP和化合物中进行。如1.1.2中所述，使用Eu标记的抗磷酸酪氨酸抗体PT66(PerkinElmer，AD0068)测量磷酸化底物。在envision(Perkin Elmer)上进行读数，激发波长为320nm，随后在615nm和665nm处发射。
4.2.JAK2抑制分析
4.2.1.JAK2分析聚GT底物
重组人JAK2催化结构域(氨基酸808-1132；目录号PV4210)购自Invitrogen。将0.025mU JAK2与2.5μg聚GT底物(Sigma目录号P0275)一起在聚丙烯96孔板(Greiner，V型底)中在总体积为25μL的含或不含5μL测试化合物或媒介物(DMSO，1％终浓度)的激酶反应缓冲液(5mM MOPS pH 7.5、9mM MgAc、0.3mM EDTA、0.06％Brij和0.6mM DTT、1μM非放射性ATP、0.25μCi 33P-γ-ATP(GE Healthcare，目录号AH9968)终浓度)中培养。于30℃90分钟后，通过添加25μL/孔的150mM磷酸停止反应。使用细胞收集器(Perkin Elmer)将终止的激酶反应物全部转移至预洗涤(75mM磷酸)的96孔过滤板(Perkin Elmer目录号6005177)。板用300μL/孔的75mM磷酸溶液洗涤6次，密封板底部。添加40μL/孔Microscint-20，密封板顶部，使用Topcount(Perkin Elmer)进行读数。通过从在媒介物存在下获得的每分钟计数(cpm)中减去在阳性对照抑制剂(10μM星孢素)存在下获得的cpm计算了激酶活性。测试化合物抑制该活性的能力如下确定：
RFU测试化合物＝在测试化合物存在下的样品所测定的RFU
RFU对照＝具有阳性对照抑制剂的样品所测定的RFU
RFU媒介物＝在媒介物存在下所测定的RFU
制备化合物的剂量稀释系列，其能够在JAK2分析中测试剂量-响应作用和计算各化合物的IC50。各化合物常规地在20μM浓度下、随后1/3系列稀释、8个点(20μM-6.67μM-2.22μM-740nM-247nM-82nM-27nM-9nM)进行测试，DMSO终浓度为1％。当化合物系列的效能增加时，制备更多的稀释液和/或降低最高浓度(例如5μM、1μM)。
4.2.2.JAK2 Ulight-JAK1肽分析
重组人JAK2(催化结构域，氨基酸866-1154；目录号PV4210)购自Invitrogen。将0.0125mU JAK2与25nM Ulight-JAK1(tyr1023)肽(Perkin Elmer目录号TRF0121)一起在白色384Opti板(Perkin Elmer，目录号6007290)中以20μL的总体积在含或不含4μL测试化合物或媒介物(DMSO，1％终浓度)的激酶反应缓冲液(25mM HEPES pH7.0、0.01％Triton X-100、7.5mM MgCl2、2mM DTT、7.5μM ATP)中培养。于室温60分钟后，通过添加20μL/孔检测混合物(1×检测缓冲液(Perkin Elmer，目录号CR97-100C)、0.5nM铕抗磷酸酪氨酸(PT66)(Perkin Elmer，目录号AD0068)、10mM EDTA)停止反应。使用Envision进行读数，激发波长为320nm，在615nm处测量发射(Perkin Elmer)。通过从在媒介物存在下获得的相对荧光单位(RFU)中减去在阳性对照抑制剂(10μM星孢素)存在下获得的RFU计算了激酶活性。测试化合物抑制该活性的能力如下确定：
抑制百分数＝((在测试化合物存在下的样品所测定的RFU–具有阳性对照抑制剂的样品所测定的RFU)除以(在媒介物存在下所测定的RFU–具有阳性对照抑制剂的样品所测定的RFU))×100。
制备化合物的剂量稀释系列，其能够在JAK2分析中测试剂量-响应作用和计算化合物的IC50。各化合物常规地在20μM浓度下、随后1/5系列稀释、10个点进行测试，DMSO终浓度为1％。当化合物系列的效能增加时，制备更多的稀释液和/或降低最高浓度(例如5μM、1μM)。数据表示为来自分析的平均IC50值±平均值的标准误差。
已经测试了如下化合物对抗JAK2的活性，如采用本文所述的分析测定的IC50值在下表VII中给出。
表VII.说明性的本发明的化合物的JAK2 IC50值
* ＞500nM
** ＞100-500nM
*** ＞50-100nM
**** 0.1-50nM
表VIII.比较化合物的JAK2 IC50值
Cpd# JAK2 IC50
A ＊
B ＊
C ＊
D ＊
4.2.3.JAK2 Kd测定分析
JAK2(Invitrogen，PV4210)以5nM的终浓度进行使用。在50mMHepes pH 7.5、0.01％Brij-35、10mM MgCl2、1mM EGTA中采用25nM激酶示踪剂236(Invitrogen，PV5592)和2nM Eu-抗-GST(Invitrogen，PV5594)在不同化合物浓度下进行结合实验。根据制造商的操作进行示踪剂检测。
4.3.JAK3抑制分析
4.3.1.JAK3 Ulight-JAK1肽分析
重组人JAK3催化结构域(氨基酸781-1124；目录号PV3855)购自Invitrogen。将0.5ng JAK3蛋白质与2.5μg聚GT底物(Sigma目录号P0275)一起在聚丙烯96孔板(Greiner，V型底)中以25μL的总体积在含或不含5μL测试化合物或媒介物(DMSO，1％终浓度)的激酶反应缓冲液(25mM Tris pH 7.5、0.5mM EGTA、10mM MgCl2、2.5mM DTT、0.5mM Na3VO4、5mM b-甘油磷酸、0.01％Triton X-100、1μM非放射性ATP、0.25μCi 33P-γ-ATP(GE Healthcare，目录号AH9968)终浓度)中培养。于30℃45分钟后，通过添加25μL/孔的150mM磷酸停止反应。使用细胞收集器(Perkin Elmer)将终止的激酶反应物全部转移至预洗涤(75mM磷酸)的96孔过滤板(Perkin Elmer目录号6005177)。板用300μL/孔的75mM磷酸溶液洗涤6次，密封板底部。添加40μL/孔Microscint-20，密封板顶部，使用Topcount(Perkin Elmer)进行读数。通过从在媒介物存在下获得的每分钟计数(cpm)中减去在阳性对照抑制剂(10μM星孢素)存在下获得的cpm计算了激酶活性。测试化合物抑制该活性的能力如下确定：
RFU测试化合物＝在测试化合物存在下的样品所测定的RFU
RFU对照＝具有阳性对照抑制剂的样品所测定的RFU
RFU媒介物＝在媒介物存在下所测定的RFU
制备化合物的剂量稀释系列，其能够在JAK3分析中测试剂量-响应作用和计算各化合物的IC50。各化合物常规地在20μM浓度下、随后1/5系列稀释、10个点进行测试，DMSO终浓度为1％。当化合物系列的效能增加时，制备更多的稀释液和/或降低最高浓度(例如5μM、1μM)。
已经测试了如下化合物对抗JAK3的活性，如采用本文所述的分析测定的IC50值在下表IX中给出。
表IX.说明性的本发明的化合物的JAK3 IC50值
* ＞500nM
** ＞100-500nM
*** ＞50-100nM
**** 0.1-50nM
表X.比较化合物的JAK3 IC50值
Cpd# JAK3 IC50
C *
D *
4.3.2.JAK3 Ki测定分析
对于测定Ki，将不同量的化合物与酶混合，随ATP浓度变化追踪酶促反应。通过Km相对于化合物浓度的双倒数绘图(Lineweaver-Burk绘图)测得Ki。将JAK3(CarnaBiosciences，09CBS-0625B)以10ng/mL的终浓度进行使用。底物为聚(Glu,Tyr)钠盐(4:1),MW 20 000-50 000(Sigma，P0275)。反应在25mM Tris pH 7.5、0.01％Triton X-100、0.5mMEGTA、2.5mM DTT、0.5mM Na3VO4、5mM b-甘油磷酸、10mM MgCl2与不同浓度的ATP和化合物中进行，通过添加150mM磷酸停止。通过将样品装载到过滤板(使用收集器，Perkin Elmer)上和随后洗涤测定掺入到底物聚GT中的磷酸盐。在添加闪烁液至过滤板(Perkin Elmer)后，在Topcount闪烁计数器中测量聚GT中掺入的33P。
4.4.TYK2抑制分析
4.4.1.TYK2 Ulight-JAK1肽分析
重组人TYK2催化结构域(氨基酸871-1187；目录号08-147)购自Carnabiosciences。将5ng TYK2与12.5μg聚GT底物(Sigma目录号P0275)一起在聚丙烯96孔板(Greiner，V型底)中以25μL的总体积在含或不含5μL测试化合物或媒介物(DMSO，1％终浓度)的激酶反应缓冲液(25mM Hepes pH 7.2、50mM NaCl、0.5mM EDTA、1mM DTT、5mM MnCl2、10mM MgCl2、0.1％Brij-35、0.1μM非放射性ATP、0.125μCi 33P-γ-ATP(GE Healthcare，目录号AH9968)终浓度)中培养。于30℃90分钟后，通过添加25μL/孔的150mM磷酸停止反应。使用细胞收集器(Perkin Elmer)将终止的激酶反应物全部转移至预洗涤(75mM磷酸)的96孔过滤板(Perkin Elmer目录号6005177)。板用300μL/孔的75mM磷酸溶液洗涤6次，密封板底部。添加40μL/孔Microscint-20，密封板顶部，使用Topcount(Perkin Elmer)进行读数。通过从在媒介物存在下获得的每分钟计数(cpm)中减去在阳性对照抑制剂(10μM星孢素)存在下获得的cpm计算了激酶活性。测试化合物抑制该活性的能力如下确定：
抑制百分数＝((在测试化合物存在下的样品所测定的cpm–具有阳性对照抑制剂的样品所测定的cpm)除以(在媒介物存在下所测定的cpm–具有阳性对照抑制剂的样品所测定的cpm))×100。
制备化合物的剂量稀释系列，其能够在TYK2分析中测试剂量-响应作用和计算各化合物的IC50。各化合物常规地在20μM浓度下、随后1/3系列稀释、8个点(20μM-6.67μM-2.22μM-740nM-247nM-82nM-27nM-9nM)进行测试，DMSO终浓度为1％。当化合物系列的效能增加时，制备更多的稀释液和/或降低最高浓度(例如5μM、1μM)。
已经测试了如下化合物对抗TYK2的活性；如采用本文所述的分析测定的IC50值在下表XI中给出。
表XI.说明性的本发明的化合物的TYK2 IC50值
* ＞500nM
** ＞100-500nM
*** ＞50-100nM
**** 0.1-50nM
表XII.比较化合物的TYK2 IC50值
Cpd# TYK2 IC50
C ＊
D ＊
4.4.2.TYK2 Kd测定分析
TYK2(Carna Biosciences，09CBS-0983D)以5nM的终浓度进行使用。在50mM HepespH 7.5、0.01％Brij-35、10mM MgCl2、1mM EGTA中采用50nM激酶示踪剂236(Invitrogen，PV5592)和2nM Eu-抗-GST(Invitrogen，PV5594)在不同化合物浓度下进行结合实验。根据制造商的操作进行示踪剂检测。
实施例5.细胞分析：
5.1.JAK1、JAK2和TYK2选择性细胞分析
5.1.1.选择性JAK1细胞分析，通过PMBC中的IFNα激活STAT1
在无菌条件下通过采用LymphoPrepTM培养基(Axis-Shield)的密度梯度离心从血沉棕黄层中分离出外周血单核细胞(PBMC)，然后在不含Ca++Mg++的PBS中进行3个后续洗涤步骤。将PBMC再混悬于含10％(v/v)热灭活FBS、1％Pen-Strep(100U/mL青霉素(Penicilium)和100μg/mL链霉素)的普通RPMI 1640培养基中，在增湿培育箱中于37℃5％CO2下另外培养。
在24孔板中，将PBMC以5.0 1006个细胞/孔接种于200μL体积的含10％(v/v)FBS和1％Pen-Strep(Invitrogen)的RPMI 1640(Invitrogen)中。
将PBMC于37℃5％CO2下用测试化合物处理30分钟。将25μL 10x浓缩化合物稀释液添加至培养基。在测试化合物/媒介物预处理30分钟后，通过添加25μL(10x浓缩)细胞因子触发剂将PBMC于37℃5％CO2用终浓度为100ng/mL的重组人IFNα(PeproTech)刺激30分钟，获得250μL/孔的终体积。
所有化合物从20μM开始、随后1/3连续稀释、总计8个剂量(20μM、6.6μM、2.2μM、0.74μM、0.25μM、0.082μM、0.027μM和0.009μM)单个进行测试，DMSO的终浓度为0.2％。
在细胞因子刺激30分钟后，将250μL细胞混悬液转移至96孔V型底板，在1000rpm离心5分钟以使细胞沉淀，随后移除上清液。细胞沉淀物在补充有不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合液(Roche Applied Sciences，产品号11836170001)的100μL 1×裂解缓冲液中重构，随后冻结样品并在-80℃储存。1×裂解缓冲液配备有磷酸基-STAT1Elisa试剂盒并含有磷酸酶抑制剂。使用96孔磷酸基-STAT1(Tyr701)夹心ELISA试剂盒(CellSignaling，产品号#7234)根据制造商说明书对磷酸化STAT1的内源性水平进行定量。
HRP活性(HRP与二级抗体结合)通过添加100μL新鲜制备的鲁米诺底物(BM化学发光ELISA底物(POD)，Roche，产品号11582950001)、于室温在暗处培育5分钟来测量，在Thermo Scientific Luminoskan Ascent微量板发光计(200msec整合时间)中进行测量。
5.1.2.选择性JAK2细胞分析，通过PMBC中的GM-CSF激活STAT5
在无菌条件下通过采用LymphoPrepTM培养基(Axis-Shield)的密度梯度离心从血沉棕黄层中分离出外周血单核细胞(PBMC)，然后在不含Ca++Mg++的PBS中进行3个后续洗涤步骤。将PBMC再混悬于含10％(v/v)热灭活FBS、1％Pen-Strep(100U/mL青霉素(Penicilium)和100μg/mL链霉素)的普通RPMI 1640培养基中，在增湿培育箱中于37℃5％CO2下另外培养。
在24孔板中，将PBMC以5.0E06个细胞/孔接种于200μL体积的含10％(v/v)FBS和1％Pen-Strep(Invitrogen)的RPMI 1640(Invitrogen)中。
将PBMC于37℃5％CO2下用测试化合物通过向培养基添加25μL10x浓缩化合物稀释液和于37℃5％CO2培养30分钟进行处理。随后，通过添加25μL/孔(10x浓缩)细胞因子触发剂将PBMC用终浓度为0.5ng/mL的重组人GM-CSF(PeproTech)进行刺激，获得250μL的终体积。细胞于37℃5％CO2下触发30分钟。
所有化合物从20μM开始、随后1/3连续稀释、总计8个剂量(20μM、6.6μM、2.2μM、0.74μM、0.25μM、0.082μM、0.027μM和0.009μM)单个进行测试，DMSO的终浓度为0.2％。
在细胞因子刺激30分钟后，将250μL细胞混悬液转移至96孔V型底板，在1000rpm离心5分钟以使细胞沉淀。移除上清液。细胞沉淀物在补充有不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合液(Roche Applied Sciences，产品号11836170001)的100μL 1×裂解缓冲液中重构，随后冻结样品并在-80℃储存。1×裂解缓冲液配备有磷酸基-STAT1Elisa试剂盒并含有磷酸酶抑制剂。使用96孔磷酸基-STAT5(Tyr694)夹心ELISA试剂盒(Cell Signaling，产品号#7113)根据制造商说明书对磷酸化STAT5的内源性水平进行定量。
HRP活性(HRP与二级抗体结合)通过添加100μL新鲜制备的鲁米诺底物(BM化学发光ELISA底物(POD)，Roche，产品号11582950001)、于室温在暗处培育5分钟来测量，在Thermo Scientific Luminoskan Ascent微量板发光计(200msec整合时间)中进行测量。
5.1.3.选择性TYK2细胞分析，通过NK-92细胞中的IL-12激活STAT4
NK-92细胞(人恶性非霍奇金淋巴瘤，白介素-2(IL-2)依赖性天然杀伤细胞系，ATCC#CRL-2407)。
NK-92细胞维持于最低必需培养基(MEM)α培养基w/o核糖核苷和脱氧核糖核苷、2mM L-谷氨酰胺、2.2g/L碳酸氢钠(Invitrogen，产品号22561-021)，其含有0.2mM肌醇、0.1mM 2-巯基-EtOH、0.1mM叶酸、12.5％热灭活马血清(Invitrogen，产品号26050-088)、12.5％热灭活FBS、1％Pen-Strep(100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)和10ng/mL重组人IL-2(R&D Systems)。IL-2在各培养基更新步骤中新鲜添加至培养基中。细胞于增湿培育箱中于37℃5％CO2下培养。
NK-92细胞的传代培养部分在不含rhIL-2的普通培养基中洗涤一次，在24孔板中以0.5E06个细胞/孔接种于400μL体积的普通αMEM培养基w/o rhIL-2，其含有0.2mM肌醇、0.1mM 2-巯基乙醇、0.1mM叶酸、12.5％热灭活马血清(Invitrogen，产品号26050-088)、12.5％热灭活FBS、1％Pen-Strep(Invitrogen)。
NK-92细胞用测试化合物处理30分钟，随后通过添加50μL 10x浓缩化合物稀释液刺激rhIL-12和于37℃5％CO2下培育。在化合物/媒介物预处理30分钟后，通过添加50μL(10x浓缩)细胞因子触发剂将细胞于用终浓度为25ng/mL的重组人IL-12(R&D Systems，产品号219-IL)进行刺激，获得500μL/孔的终体积。NK-92细胞于37℃5％CO2下用rhIL-12触发30分钟。
所有化合物从20μM开始、随后1/3连续稀释、总计8个剂量(20μM、6.6μM、2.2μM、0.74μM、0.25μM、0.082μM、0.027μM和0.009μM)单个进行测试，DMSO的终浓度为0.2％。
在GalliosTM流式细胞仪(Beckman Coulter)上用流式细胞分析对rhIL-12刺激的NK-92细胞中的磷酸基-STAT4水平进行定量。在细胞因子刺激30分钟后，通过立即向孔中添加500μL预温热的BD Cytofix固定缓冲液(BD PhosflowTM，产品号554655)将细胞进行固定(立即固定细胞是为了维持磷酸化状态，而不是使细胞离心出，推荐通过向细胞混悬液添加相同体积的预温热BD Cytofix缓冲液来固定细胞)。细胞于37℃培育10分钟。将固定细胞部分再混悬(1mL)，转移至FACS管，随后进行离心步骤(300×g，10分钟)和移除上清液。将细胞沉淀物混合(涡旋)，通过添加1mL BD Phosflow Perm缓冲液III(BD PhosflowTM，产品号558050)、随后在冰上培育30分钟来渗透细胞。在渗透步骤后，细胞用BD PharmingenTM染色缓冲液(BD Pharmingen，产品号554656)洗涤两次，于300×g中间离心10分钟和移除上清液。将沉淀物(0.5E06个细胞)再混悬于100μL BD PharmingenTM染色缓冲液中，通过将20μLPE小鼠抗STAT4(pY693)混合至细胞(BD PhosflowTM，PE小鼠抗STAT4(pY693)，产品号558249)进行染色，然后于室温在暗处培育30分钟。染色细胞用2mL BD PharmingenTM染色缓冲液洗涤一次，再混悬于500μL BD PharmingenTM染色缓冲液中，在GalliosTM流式细胞仪(Beckman Coulter)上分析。
对于所有分析，死细胞和碎片通过前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)排除。细胞因子刺激后STAT4蛋白质磷酸化的变化通过对全部细胞因子刺激的、测试化合物和未仅刺激的样品的100％门控部分计算X-中位或X-平均荧光强度(MFI)/孔来粗略估计。
5.1.4.结果JAK1、JAK2和TYK2分析：
未仅刺激样品(无触发剂/媒介物(0.2％DMSO)用作阳性对照(100％抑制)。仅刺激样品(触发剂/媒介物(0.2％DMSO))用作阴性对照(0％抑制)。使用阳性和阴性对照计算Z'和'抑制百分数(PIN)'值。
抑制百分数以下计算得出：
其中
RCLU(触发剂/媒介物)：在媒介物和触发剂存在下测定的相对化学发光信号
RCLU(测试化合物)：在测试化合物存在下测定的相对化学发光信号)
RCLU(无触发剂/媒介物)：在媒介物存在下不具有触发剂所测定的相对化学发光信号。
当读数信号表示为X-平均值(细胞因子刺激的NK-92细胞中pSTAT4水平的流式细胞分析)时，则RCLU由X-平均值替换。
在剂量-响应中针对测试的化合物对PIN值绘图，使用GraphPad Prism软件、应用非线形回归(S形)曲线拟合推导出EC50值。
5.2.肺癌和肝细胞癌细胞系分析中的JAK1突变.
5.2.1.JAK1突变诱发的组成性信号传导
将有和无JAK1突变的癌细胞系(表I-肺癌细胞系)在存在或不存在血清的情况下培养4-6小时，用或不用细胞因子混合液(INFγ、IL2、IL4和IL6)刺激5、10、30和45分钟。通过免疫印迹(细胞信号传导抗体)评估JAK1、STAT1、STAT3和STAT5的磷酸化。
5.2.2.使用JAK抑制剂靶向于JAK1突变体
5.2.2.1.JAK-STAT路径磷酸化：
将有和无JAK1突变的癌细胞系在有或无不同浓度的JAK抑制剂的存在下进行培养。通过免疫印迹法在24和48小时分析细胞的有效JAK-STAT路径抑制。
表XIII.表I：说明性的肺癌细胞系
*：截断
5.2.2.2.细胞存活
2D分析：将有和无JAK1突变的癌细胞系在存在或不存在增加浓度的JAK抑制剂的情况下培养。48-72小时后，使用Cell Titer-Glo发光细胞存活分析(Promega)或MTT分析测量细胞存活。或者，使用Cell Titer-Glo发光细胞存活分析(Promega)或MTT分析对在不同培养时间点和在固定浓度的JAK抑制剂下的癌细胞系的细胞存活进行分析。
3D分析：将有和无JAK1突变的癌细胞系接种于半固体琼脂培养基中。通过使用荧光染料在不同培养时间点测定细胞存活来测定多细胞集落的形成。在细胞接种后添加潜在抑制剂以分析抗致瘤作用。
5.2.3.在鼠Ba/F3细胞中研究人JAK1突变
(如Kan等人,2013；Staerk等人,2005；Zenatti等人,2011中所述)
JAK1表达载体的构筑：将野生型和突变体人JAK1序列定植于逆转录病毒载体中，通过定序验证克隆。
Ba/F3细胞的逆转录病毒感染：Ba/F3细胞用293T细胞中产生的逆转录病毒上清液感染。
将表达人WT或突变JAK1的Ba/F3细胞在有或无IL-3的情况下培养4小时，通过免疫印迹评估JAK-STAT路径的磷酸化。
JAK1突变的转化潜能通过测定当在细胞因子依赖性Ba/F3细胞中表达时各突变诱导自主生长的能力来评估。细胞生长在不存在细胞因子IL-3的情况下进行评估。
突变体JAK1转导的Ba/F3细胞系通过将它们在有或无增加浓度的JAK抑制剂的情况下培养来评估它们对JAK抑制剂的敏感性。48-72小时后，使用Cell Titer-Glo发光细胞存活分析(Promega)或MTT分析测量细胞存活。或者，使用Cell Titer-Glo发光细胞存活分析(Promega)或MTT分析在不同培养时间点、在固定浓度的JAK抑制剂下分析癌细胞系的细胞存活。
5.2.4.JAK1突变的体内致瘤潜能
5.2.4.1.异种移植物模型：
将突变体JAK1表达细胞皮下注射于CD1nu/nu小鼠或Rag1-/-小鼠中，评估肿瘤发展。建立皮下肿瘤体积生长曲线。测定原发性肿瘤向继发性受体动物中的可移植性。
5.2.4.2.PDX模型.
来源于患者的异种移植物(PDX)基于直接来自患者的原发性肿瘤(含JAK1突变)向免疫缺陷小鼠中的转移。为实现此举，患者肿瘤必须从手术中新鲜获得，此时它们被机械或化学消化，将其中小部分作为原始储备液保存和建立于NOD-SCID小鼠中。一旦肿瘤负担变得过高，则通过使细胞直接从小鼠继代至小鼠来维持PDX模型。肿瘤可异位(将肿瘤植入小鼠皮下侧腹)或正位(直接植入所选小鼠器官)移植。
原发性和继发性肿瘤中JAK1、STAT1、STAT3和STAT5的磷酸化通过免疫印迹进行评估。
5.3.PBL增殖分析
用IL-2刺激人外周血淋巴细胞(PBL)，使用BrdU并入分析测量增殖。PBL首先用PHA刺激72小时以诱发IL-2受体，随后禁食24小时以停止细胞增殖，随后再进行IL-2刺激72小时(包括24小时BrdU标记)。在IL-2添加之前用测试化合物预培育细胞1小时。细胞在含有10％(v/v)FBS的RPMI1640中培养。
5.4.人全血分析(hWBA)
5.4.1.方案1
5.4.1.1.IL-6刺激方案
使用人全血进行流式细胞术分析以离体确定JAK1相对于JAK2的化合物选择性。因此，从签署了知情同意书的人志愿者取血。血液然后于37℃在温和摇荡下平衡30分钟，然后等分在Eppendorf管中。添加不同浓度的化合物，于37℃在温和摇荡下培育30分钟，随后于37℃在温和摇荡下用白介素6(IL-6)(对于JAK1依赖性路径刺激)或GM-CSF(对于JAK2依赖性路径刺激)刺激20分钟。然后使用FACS分析评估磷酸基-STAT1和磷酸基-STAT5。
5.4.1.2.磷酸基-STAT1分析
5.4.1.2.1.试剂制备
将5×裂解/固定缓冲液(BD PhosFlow，目录号558049)用蒸馏水稀释5倍，于37℃预温热。弃去剩余的经稀释的裂解/固定缓冲液。
将10μg rhIL-6(R&D Systems，目录号206-IL)溶于1mL PBS 0.1％BSA中以获得10μg/mL储备液。将储备液等分，于-80℃储存。
在DMSO中制备化合物的3倍稀释系列(10mM储备液)。经对照处理的样品接受DMSO而非化合物。所有样品用1％DMSO终浓度进行培育。
5.4.1.2.2.用化合物培育血液和用IL-6刺激
将人血液收集于肝素化管中。将血液分成148.5μL的等分试样。然后，向各血液等分试样中添加1.5μL测试化合物稀释液，于37℃在温和摇荡下培育血液样品30分钟。向血液样品中添加1.5微升10倍稀释的IL-6储备液(终浓度10ng/mL)，于37℃在温和摇荡下培育样品20分钟。
5.4.1.2.3.白血球制备
在刺激期结束时，立即向血液样品中添加3mL 1×预温热裂解/固定缓冲液，简单涡旋，于37℃于水浴中培育15分钟以裂解红血球和固定白血球。
将管在400×g于4℃离心5分钟。将细胞沉淀物用3mL冷的1×PBS洗涤，离心后，将细胞沉淀物再混悬于100μL冰冷的1×PBS中，添加900μL冰冷的100％MeOH。细胞然后在4℃培育30分钟以便渗透。
然后将经渗透的细胞用含3％BSA的1×PBS洗涤，最后再混悬于80μL含3％BSA的1×PBX中。
5.4.1.2.4.用抗磷酸基-STAT1和抗CD4抗体标记细胞
添加20μL PE小鼠抗STAT1(pY701)或PE小鼠IgG2aκ同型对照抗体(BDBiosciences，目录号分别为612564和559319)和FITC结合的抗CD4抗体或对照FITC结合的同型抗体并混合，然后在4℃在暗处培育30分钟。
细胞然后用1×PBS洗涤一次，在FACSCanto II流式细胞仪(BD Biosciences)上进行分析。
5.4.1.2.5.FACSCanto II上的荧光分析
计数总共50,000个事件，在淋巴细胞门控中门控CD4+细胞后测量磷酸基-STAT1阳性细胞。使用FACSDiva软件分析数据，由CD4+细胞上的磷酸基-STAT1阳性细胞的百分数计算IL-6刺激的抑制百分数。
5.4.1.3.磷酸基-STAT5分析
试剂制备
将5×裂解/固定缓冲液(BD PhosFlow，目录号558049)用蒸馏水稀释5倍，于37℃预温热。弃去剩余的经稀释的裂解/固定缓冲液。
将10μg rhGM-CSF(AbCys S.A.，目录号P300-03)溶于100μL PBS 0.1％BSA中以获得100μg/mL储备液。将储备液等分储存在-80℃。
在DMSO中制备化合物的3倍稀释系列(10mM储备液)。经对照处理的样品接受DMSO而非化合物。所有样品用1％DMSO终浓度进行培育。
5.4.1.3.1.用化合物培育血液和用GM-CSF刺激
将人血液收集于肝素化管中。将血液分成148.5μL的等分试样。然后，向各等分试样中添加1.5μL化合物稀释液，于37℃在温和摇荡下培育血液样品30分钟。向血液样品中添加5000倍稀释的GM-CSF储备液(1.5μL)(终浓度20pg/mL)，于37℃在温和摇荡下培育样品20分钟。
5.4.1.3.2.白血球制备
在刺激期结束时，立即向血液样品中添加3mL 1×预温热裂解/固定缓冲液，简单涡旋，于37℃于水浴中培育15分钟以裂解红血球和固定白血球。
将管在400×g于4℃离心5分钟。将细胞沉淀物用3mL冷的1×PBS洗涤，离心后，将细胞沉淀物再混悬于100μL冰冷的1×PBS中，添加900μL冰冷的100％MeOH。细胞然后在4℃培育30分钟以便渗透。
5.4.1.3.3.用抗磷酸基-STAT5和抗CD33抗体标记细胞
添加20μL PE小鼠抗STAT5(pY694)或PE小鼠IgG1κ同型对照抗体(BDBiosciences，目录号分别为612567和554680)和APC小鼠抗CD33抗体(BD Biosciences#345800)或对照APC小鼠IgG1同型抗体(BD Biosciences#345818)，混合，然后在4℃在暗处培育30分钟。
细胞然后用1×PBS洗涤一次，在FACSCanto II流式细胞仪(BD Biosciences)上进行分析。
5.4.1.3.4.FACSCanto II上的荧光分析
计数总共50,000个事件，在CD33+细胞上门控后测量磷酸基-STAT5阳性细胞。使用FACSDiva软件分析数据，其对应于由CD33+细胞上的磷酸基-STAT5阳性细胞百分数计算的GM-CSF刺激的抑制百分数。
5.5.方案2
5.5.1.刺激方案
使用人全血进行流式细胞术分析以离体确定JAK1相对于JAK2的化合物选择性。因此，从签署了知情同意书的人志愿者取血。血液然后于37℃在温和摇荡下平衡30分钟，然后等分在Eppendorf管中。添加不同浓度的化合物，于37℃在温和摇荡下培育30分钟，随后于37℃在温和摇荡下用白介素6(IL-6)(对于JAK1依赖性路径刺激)、干扰素α(IFNα)(对于JAK1/TYK2路径刺激)、白介素2(IL-2)(对于JAK1/JAK3路径刺激)或GM-CSF(对于JAK2依赖性路径刺激)刺激20分钟。然后使用FACS分析评估磷酸基-STAT1(对于IL-6和IFNα刺激的细胞)和磷酸基-STAT5(对于IL-2和GM-CSF刺激的细胞)水平。
5.5.2.磷酸基-STAT分析
5.5.2.1.试剂制备
将5×裂解/固定缓冲液(BD PhosFlow，目录号558049)用蒸馏水稀释5倍，于37℃预温热。弃去剩余的经稀释的裂解/固定缓冲液。
将10μg rhIL-6(R&D Systems，目录号206-IL)溶于1mL PBS+0.1％BSA中以获得10μg/mL储备液。将储备液等分，于-80℃储存。
将10μg rhIL-2(R&D Systems，目录号202-IL)溶于1mL PBS+0.1％BSA中以获得10μg/mL储备液。将储备液等分，于-80℃储存。
将5μg rhGM-CSF(AbCys S.A.，目录号P300-03)溶于12.5mL PBS+0.1％BSA中以获得40ng/mL储备液。将储备液等分，于-80℃储存。
在DMSO中制备化合物的3倍稀释系列(10mM储备液)。经对照处理的样品接受DMSO而非化合物。所有样品用1％DMSO终浓度进行培育。
5.5.2.2.用化合物培育血液和用触发剂刺激
将人血液收集于肝素化管中。将血液分成148.5μL的等分试样。然后，向各血液等分试样中添加1.5μL测试化合物稀释液，于37℃在温和摇荡下培育血液样品30分钟。向血液样品中添加1.5微升10倍稀释的IL-6储备液、1.5μL uIFNα(PBL Biomedical，目录号11200-1)储备液、1.5μL 25倍稀释的IL-2储备液或1.5μL 200倍稀释的GM-CSF储备液，于37℃在温和摇荡下培育样品20分钟。
5.5.2.3.白血球制备
在刺激期结束时，立即向血液样品中添加3mL 1×预温热裂解/固定缓冲液，简单涡旋，于37℃于水浴中培育15分钟以裂解红血球和固定白血球。
将管在400×g于4℃离心5分钟。将细胞沉淀物用3mL冷的1×PBS洗涤，离心后，将细胞沉淀物再混悬于100μL冰冷的1×PBS中，添加900μL冰冷的100％MeOH。细胞然后在4℃培育30分钟以便渗透。
然后将经渗透的细胞用含3％BSA的1×PBS洗涤，最后再混悬于80μL含3％BSA的1×PBX中。
5.5.2.4.细胞标记
向IL-6和IFNα刺激管中添加20μL PE小鼠抗STAT1(pY701)或PE小鼠IgG2aκ同型对照抗体(BD Biosciences，目录号分别为612564和559319)和APC结合的抗CD4抗体或对照APC结合的同型抗体(BD Biosciences，目录号分别为555349和555751)并混合，然后在4℃在暗处培育20分钟。
向IL-2刺激管中添加20μL PE小鼠抗STAT5(pY694)或PE小鼠IgG1κ同型对照抗体(BD Biosciences，目录号分别为612567和554680)和APC结合的抗CD4抗体或对照APC结合的同型抗体(BD Biosciences，目录号分别为555349和555751)，混合，然后在4℃在暗处培育20分钟。
向GM-CSF刺激管中添加20μL PE小鼠抗STAT5(pY694)或PE小鼠IgG1κ同型对照抗体(BD Biosciences，目录号分别为612567和554680)和APC小鼠抗CD33抗体(BDBiosciences#345800)或对照APC小鼠IgG1同型抗体(BD Biosciences目录号345818)，混合，然后在4℃在暗处培育20分钟。
细胞然后用1×PBS洗涤一次，在FACSCanto II流式细胞仪(BD Biosciences)上进行分析。
5.5.2.5.FACSCanto II上的荧光分析
计数总共50,000个事件，在用于IL-6和IFNα刺激的细胞的淋巴细胞门控中，在CD4+细胞上门控后测量磷酸基-STAT1阳性细胞。在用于IL-2刺激的细胞的淋巴细胞门控中，在CD4+细胞上门控后测量磷酸基-STAT5阳性细胞。在CD33+细胞上门控后测量磷酸基-STAT5阳性细胞。使用FACSDiva软件分析数据，由CD4+细胞上的磷酸基-STAT1阳性细胞的百分数计算IL-6或IFNα刺激的抑制百分数。对于IL-2刺激的细胞，使用FACSDiva软件分析数据，由CD4+细胞上的磷酸基-STAT1阳性细胞的百分数计算IL-2刺激的抑制百分数。对于GM-CSF刺激的细胞，由CD33+细胞上的磷酸基-STAT5阳性细胞的百分数计算GM-CSF刺激的抑制百分数。
实施例6.体内模型
6.1.CIA模型
6.1.1.材料
完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)购自Difco。牛II型胶原蛋白(CII)、脂多醣(LPS)和Enbrel分别获自Chondrex(Isle d'Abeau,法国)；Sigma(P4252,L'Isle d'Abeau,法国)、Whyett(25mg可注射注射器，法国)Acros Organics(Palo Alto,CA)。所用其它全部试剂为试剂级，全部溶剂为分析级。
6.1.2.动物
深刺豚大鼠(dark Agouti rats,雄性，7-8周龄)获自Harlan实验室(Maison-Alfort,法国)。大鼠保持在12小时光/暗循环(0700-1900)中。温度维持在22℃，自由取食和饮水。
6.1.3.胶原蛋白诱发的关节炎(CIA)
在实验前一天，用0.05M乙酸制备CII溶液(2mg/mL)，于4℃储存。临免疫前，在冰水浴中在预先冷却的玻璃瓶中通过均质机混合相同体积的佐剂(IFA)和CII。若未形成乳液，可能需要额外佐剂和延长均质化。在第1天给每只大鼠的尾根部皮内注射0.2mL乳液，在第9天进行第二次加强皮内注射(2mg/mL CII溶液在CFA 0.1mL生理盐水中)。该免疫方法由已公开的方法(Jou等人,2005；Sims等人,2004)修改而得。
6.1.4.研究设计
在大鼠CIA模型中测试化合物的治疗作用。将大鼠随机分成相同组，每组含有10只大鼠。所有大鼠在第1天免疫和在第9天加强。治疗剂量从第16天持续至第30天。阴性对照组用媒介物(MC 0.5％)处理，阳性对照组用Enbrel(10mg/kg，3×周,皮下)处理。所关注的化合物通常在3个口服剂量(例如3、10、30mg/kg)下进行测试。
6.1.5.关节炎的临床评估
根据(Khachigian,2006；Lin等人,2007；Nishida等人,2004)的方法对关节炎进行评分。四个脚爪中每只的肿胀用如下的关节炎评分进行分级：0-无症状；1-一种类型的关节如踝或腕轻微、但明确地发红和肿胀，或限于个体足趾的明显发红和肿胀，与受累足趾的数目无关；2-两种或更多种类型的关节中度发红和肿胀；3-整个脚爪、包括足趾重度发红和肿胀；4-涉及多个关节的最大限度的发炎肢体(每只动物最大累积临床关节炎评分为16)(Nishida等人,2004)。
为允许对多个研究进行荟萃分析，临床评分值如下进行标准化：
临床评分的AUC(AUC评分)：计算每只个体大鼠从第1天至第14天的曲线下面积(AUC)。各动物的AUC除以对于在获得该动物数据的研究中的媒介物获得的平均AUC再乘以100(即AUC表示为每个研究的平均媒介物AUC的百分数)。
第1天至第14天的临床评分增加(端点评分)：各动物的临床评分差除以对于在获得该动物数据的研究中的媒介物获得的平均临床评分差再乘以100(即差表示为每个研究的媒介物的平均临床评分差的百分数)。
6.1.6.关节炎发作后的体重变化(％)
临床上，体重丧失与关节炎相关(Rall和Roubenoff,2004；Shelton等人,2005；Walsmith等人,2004)。因此，关节炎发作后的体重变化可用作非特异性端点以评估治疗剂在大鼠模型中的作用。关节炎发作后的体重变化(％)计算如下：
6.1.7.放射学
从每个个体动物的后脚爪获取X射线像片。将随机致盲标识号分配给每张照片，骨侵蚀的严重性由两个独立的评分者使用如下放射学拉尔森评分***(Larsen's scoresystem)进行分级：0-正常，具有完整骨轮廓和正常关节空间；1-略微异常，其中任意一个或两个外跖骨展示出略微骨侵蚀；2-明确的早期异常，其中任意3至5个外跖骨展示出骨侵蚀；3-中度破坏性异常，其中全部外跖骨以及任意一个或两个内跖骨展示出确定的骨侵蚀；4-重度破坏性异常，其中全部跖骨展示出确定的骨侵蚀，并且至少一个内跖骨关节完全侵蚀，留下一些部分被保留的骨关节轮廓；5-残肢性异常，无骨轮廓。该评分***是对(Bush等人,2002；Jou等人,2005；Salvemini等人,2001；Sims等人,2004)的修改。
6.1.8.组织学
在放射学分析后，将小鼠后脚爪固定于10％磷酸盐缓冲的***(pH 7.4)中，采用用于精细组织学的快速骨脱钙剂(Laboratories Eurobio)脱钙并包埋于石蜡中。为确保关节炎关节的评估全面，切割至少四个连续切片(5μm厚)，每个连续切片之间间隔100μm。切片用苏木精(hematoxylin)和伊红(H&E)染色。对滑液炎症以及骨骼与软骨损伤进行双盲组织学检查。在每只脚爪中，采用四点标尺评估四个参数。参数为细胞浸润、关节翳严重性、软骨侵蚀和骨骼侵蚀。如下进行评分：1-正常、2-轻度、3-中度、4-显著。这四个评分合计在一起，表示为另一评分，即“RA总评分”。
6.1.9.跟骨的微电脑断层扫描(μCT)分析：
RA中观察到的骨退化尤其出现在皮质骨，可通过μCT分析揭示(Oste等人,2007；Sims等人,2004)。在跟骨扫描和3D容积重构后，骨退化测定为每次滑动时存在的离散物体的数目，在垂直于骨骼纵轴上电脑模拟分离。越多的骨骼退化，就测量到越多的离散物体。分析了沿跟骨均匀分布(间隔约10.8μm)的1000片切片。
6.1.10.稳态PK
在第7或11天，使用肝素锂作为抗凝剂在如下时间点在眶后窦处取血样：给药前、1、3和6小时。离心全血样品，所得血浆样品储存在-20℃以待分析。各测试化合物的血浆浓度通过LC-MS/MS方法进行测定，其中质谱仪以正电喷射模式运行。使用(美国)计算药物动力学参数，假定给药前血浆水平等于24小时血浆水平。
6.2.肿瘤学模型
描述了验证小分子对JAK2驱动的脊髓增生病的功效的体内模型(Geron等人,2008；Wernig等人,2008)。
6.3.小鼠IBD模型
描述了验证小分子对IBD的功效的体外和体内模型(Wirtz和Neurath,2007)。
6.4.小鼠哮喘模型
描述了验证小分子对哮喘的功效的体外和体内模型(Ip等人,2006；Kudlacz等人,2008；Nials和Uddin,2008；Pernis和Rothman,2002)。
6.5.通过皮内注射IL22或IL23诱发的银屑病样表皮增生的鼠类模型
6.5.1.材料
由R&D systems提供了不含载体的小鼠重组IL22(582-ML-CF)。由e-Bioscience提供了不含载体的小鼠重组IL23(14-8231,CF)。
6.5.2.动物
Balb/c小鼠(雌性，18-20g体重)获自CERJ(法国)。小鼠保持在12小时光/暗循环(07:00-19:00)。温度维持在22℃，随意取食和饮水。
6.5.3.研究设计
研究设计改编自Rizzo等人,2011。
在第一天(D1)，将小鼠在两个耳朵周围刮毛。
对于连续四天(D1至D4)，小鼠在通过吸入异氟烷诱发的麻醉下在右耳廓接受每日皮内剂量的小鼠重组IL22或IL23(1μg/20μL于PBS中/0.1％BSA)，在左耳廓接受20μL PBS/0.1％BSA。
从D1至D5，在IL23/IL22注射前1小时给小鼠施用测试化合物(10、30或100mg/kg，口服，qd，于MC 0.5％中)或媒介物。
6.5.4.疾病评估
使用自动卡钳每日测量两只耳朵的厚度。在开始和处死时评估体重。在第五天最后给药后2小时，处死小鼠。切下耳廓，排除软骨。将耳廓称重，随后置放于含有1mLRNAlater溶液的小瓶中或甲醛中。
在D4，同样在临给药(T0)前和给药后1小时、3小时、6小时，从眶后窦处采集血液样品用于PK性质。
每组有8只小鼠。结果表示为平均值±标准误差，使用单向方差分析、随后相较于IL22或IL23媒介物组的Dunnett's post-hoc检验进行统计学分析。
6.5.5.组织学
处死后，收集耳朵并固定于3.7％甲醛中，随后包埋于石蜡中。进行2μm厚的切片，用苏木精和伊红染色。通过成像分析(Sis'Ncom软件)测量耳表皮厚度，其中在放大率×20下每只耳取6个影像。数据表示为平均值±标准误差，使用单向方差分析、随后相较于IL22或IL23媒介物组的Dunnett's post-hoc检验进行统计学分析。
6.5.6.RNA提取、RT-PCR和实时PCR
使用实时定量PCR测定耳组织中IL-17a、IL-22、IL-1β、LCN2和S100A9转录物水平。
实施例7.药物动力学、ADME和毒性分析
7.1.热力学溶解性
将测试化合物以1mg/mL的浓度添加至玻璃瓶中的0.2M磷酸盐缓冲液pH 7.4或0.1M柠檬酸盐缓冲液pH 3.0。
于室温在Rotator drive STR 4(Stuart Scientific,Bibby)中在速度3.0下旋转样品24小时。
在24小时后，将800μL样品转移至eppendorf管，在14000rpm下离心5分钟。然后将200μL样品上清液转移至MultiscreenR溶解度板(Millipore,MSSLBPC50)，藉助真空歧管将上清液过滤(10-12"Hg)至干净的Greiner聚丙烯V型底96孔板(目录号651201)中。将5μL滤液稀释至95μL(F20)相同缓冲液中，用于在含有标准曲线的板(Greiner，目录号651201)中培育。
从在DMSO中以因子2稀释的10mM DMSO储备液开始(5000μM)，然后进一步在DMSO中稀释直至19.5μM，在DMSO中新鲜制备化合物的标准曲线。然后将自5000μM开始的3μL稀释液系列转移至97μL乙腈-缓冲液混合物(50/50)。终浓度范围为2.5至150μM。
板用密封垫(MA96RD-04S,www.kinesis.co.uk)密封，样品于室温在LC-MS(ZQ1525，来自Waters)上最佳条件下采用Quanoptimize进行测定，以测定适当的分子质量。
样品在LC-MS上以1mL/min的流速进行分析。溶剂A为15mM氨，溶剂B为乙腈。样品在正离子喷雾下、在来自Waters的XBridge C18 3.5μM(2.1×30mM)柱上运行。溶剂梯度的总运行时间为2分钟，范围为5％B至95％B。
藉助Masslynx软件包分析峰面积，针对标准曲线绘制样品的峰面积以获得化合物的溶解度。
溶解度值以μM或μg/mL报道。
7.2.水溶解度
以DMSO中的10mM储备液开始，在DMSO中制备化合物的连续稀释液。将稀释液系列转移至F-底的96NUNC Maxisorb板(目录号442404)，于室温添加0.1M磷酸盐缓冲液pH 7.4或0.1M柠檬酸盐缓冲液pH 3.0。
在5个相同稀释步骤中，终浓度范围为300μM至18.75μM。DMSO终浓度不超过3％。向各96孔板的角落点添加200μM芘，在显微镜上用作参照点来校正Z轴。
将分析板密封，于37℃培育1小时，同时于230rpm震荡。然后在白光显微镜下对板进行扫描，产生每种浓度的沉淀物的个体图像。使用软件工具分析沉淀物并转化成可标绘在图上的数字。化合物显示完全溶解的第一个浓度为所报道的浓度；然而，真实浓度位于该浓度与较高的一个稀释步骤之间的某处。
根据此方案测量的溶解度值以μg/mL报道。
7.3.血浆蛋白质结合(平衡透析)
化合物于DMSO中的10mM储备液在DMSO中以因子5稀释。此溶液在新鲜解冻的人、大鼠、小鼠或犬血浆(BioReclamation INC)中进一步稀释，终浓度为5μM，DMSO终浓度为0.5％(PP-Masterblock 96孔(Greiner，目录号780285)中，5.5μL于1094.5μL血浆中)。
制备具有***物的Pierce Red Device板(ThermoScientific，目录号89809)，缓冲液室填充750μL PBS，血浆室填充500μL加标血浆。板于37℃培育4小时，同时在230rpm震荡。在培育后，从两室取120μL转移至96孔圆底PP深孔板(Nunc，目录号278743)中的360μL乙腈中，用铝箔盖密封。将样品混合，置于冰上30分钟。此板然后在1200rcf在4℃离心30分钟，将上清液转移至96孔V型底PP板(Greiner,651201)中用于在LC-MS上分析。
板用www.kinesis.co.uk的密封垫(MA96RD-04S)密封，样品于室温在LC-MS(ZQ1525，来自Waters)上最佳条件下采用Quanoptimize进行测定，以测定适当的分子质量。
样品在LC-MS上以1mL/min的流速进行分析。溶剂A为15mM氨，溶剂B为乙腈。样品在正离子喷雾下、在来自Waters的XBridge C18 3.5μM(2.1×30mM)柱上运行。溶剂梯度的总运行时间为2分钟，范围为5％B至95％B。
缓冲液室和血浆室中的化合物的峰面积视为100％化合物。由这些结果推导出结合于血浆的百分数，报道为结合于血浆的百分数。
通过指示是否观察到沉淀的显微镜对最终测试浓度的化合物于PBS中的溶解度进行检测。
7.4.醛氧化酶稳定性
首先用水稀释(5倍)测试化合物于DMSO中的10mM储备液以获得50μM工作溶液。醛氧化酶的选择性抑制剂(肼屈嗪)在水中制备为5mM溶液。
通过于37℃向86μL 50mM磷酸钾缓冲液pH 7.4添加10μL肝S9混悬液(人和大鼠，BDBioscience Gentest，20mg/mL)来制备培育混合物。添加2μL5mM肼屈嗪(用于在添加选择性抑制剂的情况下培育)或2μL水(用于在未添加抑制剂的情况下培育)。
在5分钟预温热后，通过向培育混合物中添加2μL 50μM测试化合物开始反应。在0、3、6、12、18和30分钟培育后，用300μL MeCN:MeOH(2:1)终止反应(100μL)，其中含10ng/mL华法林的1％乙酸混合物作为分析内标物。
混合样品，离心，通过LC-MS分析上清液。
若通过S9进行的清除被肼屈嗪抑制，则测试化合物被视为醛氧化酶的底物。测试化合物的种属特异性清除还可指示通过醛氧化酶代谢。
酞嗪(phtalazine)被包括在内作为阳性对照。
仪器反应(测试化合物与内标物的峰面积比率)参考零时间点样品(视为100％)以测定剩余化合物的百分数。使用Graph Pad Prism软件，使用剩余测试化合物的百分数的曲线图测定S9培育中的半衰期(T1/2)和内源性清除率。
为了计算体外内源性清除率(CLint(μL/min/mg)，使用下式：
7.5.肝微粒体稳定性
化合物于DMSO中的10mM储备液在96深孔板(Greiner，目录号780285)中在105mM磷酸盐缓冲液pH7.4中稀释至6μM，于37℃预温热。
700U/mL的葡萄糖-6-磷酸去氢酶(G6PDH,Roche,10127671001)工作储备液用因子1:700在105mM磷酸盐缓冲液pH7.4中稀释。含0.528M MgCl2.6H2O(Sigma,M2670)、0.528M葡萄糖-6-磷酸盐(Sigma,G-7879)和0.208M NADP+(Sigma,N-0505)的辅因子混合物用因子1:8在105mM磷酸盐缓冲液pH7.4中稀释。
制备含有1mg/mL所关注种属(人、小鼠、大鼠、犬……)的肝微粒体(Xenotech)、0.8U/mL G6PDH和辅因子混合物(6.6mM MgCl2、6.6mM葡萄糖-6-磷酸盐、2.6mM NADP+)的工作溶液。此混合物于室温预先培育15分钟，但从不超过20分钟。
在预培育后，化合物稀释液和含有微粒体的混合物以等量添加至一起，在300rpm培育30分钟。对于0分钟的时间点，向化合物稀释液添加两体积的MeOH，随后添加微粒体混合物。培育期间的终浓度为：3μM测试化合物或对照化合物、0.5mg/mL微粒体、0.4U/mLG6PDH、3.3mM MgCl2、3.3mM葡萄糖-6-磷酸盐和1.3mM NaDP+。
培育30分钟后，用2体积的MeOH停止反应。
对于两个时间点，混合、离心样品并采集上清液用于在LC-MS/MS上分析。仪器响应(即峰高度)参考零时间点样品(作为100％)以测定剩余化合物的百分数。在分析法设计中包括标准化合物***(Propanolol)和维拉帕米(Verapamil)。
微粒体稳定性的数据表示为30分钟后剩余化合物总量的百分数。
7.6.肝细胞稳定性
评估肝细胞中代谢清除率的模型由McGinnity等人,Drug Metabolism andDisposition 2008,32,11,1247进行描述。
7.7.Caco2渗透性
如下所述进行双向Caco-2分析。Caco-2细胞获自欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of Cell Cultures，ECACC，目录86010202)，在21天细胞培养后用于24孔Transwell板(Fisher TKT-545-020B)中。
在由DMEM+GlutaMAXI+1％NEAA+10％FBS(FetalClone II)+1％Pen/Strep组成的平板培养基中每孔接种2×105个细胞。每2-3天更换培养基。
在含有25mM HEPES的Hanks'平衡盐溶液(pH7.4)中制备测试和参考化合物(***和若丹明123或长春花碱，均购自Sigma)，在10μM浓度下添加至Transwell集成板的顶部(125μL)或底外侧(600μL)室中，DMSO终浓度为0.25％。
向所有孔中的供体缓冲液中添加50μM荧光黄(Sigma)以通过监测荧光黄渗透评定细胞层的完整性。因为荧光黄(LY)不能自由渗透亲脂性屏障，所以高LY运输度表明细胞层的完整性不佳。
于37℃在定轨震荡器以150rpm震荡培育1小时后，从顶部(A)和基底(B)室取70μL等分试样，添加至96孔板中100μLl含分析内标物(0.5μM卡马西平)的50:50乙腈:水溶液中。
在含150μL来自底外侧和顶侧的液体的洁净96孔板中，使用Spectramax GeminiXS(Ex 426nm和Em 538nm)测量荧光黄。
通过高效液体色谱法/质谱(LC-MS/MS)测量样品中的化合物浓度。
由以下关系计算表观渗透率(Papp)值：
Papp＝[化合物]接受室最终×V接受室/([化合物]供给室初始×V供给室)/Tinc×V供给室/表面积×60×10-6cm/s
V＝室容积
Tinc＝培育时间
表面积＝0.33cm2
流出比(为来自顶部细胞表面的活性流出物的指示)使用Papp B>A/Papp A>B的比率计算。
使用以下分析接受准则：
***：Papp(A>B)值≥20(×10-6cm/s)
若丹明123或长春花碱：Papp(A>B)值<5(×10-6cm/s)，其中流出比≥5。
荧光黄渗透率：≤100nm/s
7.8.MDCKII-MDR1渗透性
MDCKII-MDR1细胞为Madin-Darby犬肾上皮细胞，其过表达人多药耐药性(MDR1)基因，编码P-糖蛋白(P-gp)。细胞获自荷兰癌症研究所(Netherlands Cancer Institute)，在24孔Millicell细胞培养***式板(Millipore,PSRP010R5)中细胞培养3-4天后使用。如下所述进行双向MDCKII-MDR1渗透率分析。
将3×105个细胞/毫升(1.2×105个细胞/孔)接种于由DMEM+1％Glutamax-100+1％抗生素/抗霉菌素+10％FBS(Biowest,S1810)组成的平板培养基中。细胞置于CO2培育箱中3-4天。接种后24小时和实验当天更换培养基。
在Dulbecco's磷酸盐缓冲液生理盐水(D-PBS，pH7.4)中制备测试和参考化合物(安泼那韦和***)，以10μM的终浓度(安泼那韦为0.5μM)添加至Millicell细胞培养***式板集成的顶部(400μL)或底外侧(800μL)室中，DMSO终浓度为1％。
向所有供给缓冲液溶液添加100μM荧光黄(Sigma)以通过监测荧光黄渗透来评定细胞单层的完整性。荧光黄为细胞旁路径的荧光标记，其用作每个单层的内部对照以验证分析期间的紧密接合完整性。
于37℃在定轨振荡器以150rpm震荡培育1小时后，从顶部(A)和基底(B)室取75μL等分试样，添加至96孔板中225μL含有分析内标物(10ng/mL华法林)的乙腈:水溶液(2:1)中。还在实验开始时从供给溶液进行等分以获得初始(Co)浓度。
通过高效液体色谱法/质谱(LC-MS/MS)测量样品中的化合物浓度。
使用Fluoroscan Ascent FL Thermo Scientific(Ex 485nm和Em530nm)在含150μL液体的96孔板中从所有接受孔(底外侧或顶侧)测量荧光黄。
7.9.啮齿动物中的药物动力学研究
7.9.1.动物
Sprague-Dawley大鼠(雄性，5-6周龄)获自Janvier(法国)。大鼠在处理前适应至少7天，保持在12小时光/暗循环(0700-1900)。温度维持在约22℃，随意取食和饮水。施用测试化合物的前两天，将大鼠在异氟烷麻醉下进行手术以在颈静脉放置套管。手术后，将大鼠单独圈养。大鼠在口服给药前至少16小时和之后6小时禁食。随意饮水。
7.9.2.药物动力学研究
化合物配制于PEG200/生理盐水(60/40)中用于静脉内途径，配制于0.5％甲基纤维素和10％羟基丙基-β-环糊精pH 3中用于口服途径。测试化合物作为单次食道管饲形式以5mg/kg和以5mL/kg的给药体积进行口服给药，作为经尾静脉的快速浓注以1mg/kg和以5mL/kg的给药体积进行静脉内给药。每组由3只大鼠组成。在以下时间点使用肝素锂作为抗凝剂经由颈静脉采集血样：0.05、0.25、0.5、1、3、5和8小时(静脉内途径)和0.25、0.5、1、3、5、8和24小时(口服途径)。或者，在以下时间点使用肝素锂作为抗凝剂在眶后窦处采集血样：0.25、1、3和6小时(口服途径)。在5000rpm下离心全血样品10分钟，所得血浆样品在-20℃储存以待分析。
7.9.3.血浆中化合物水平的定量
各测试化合物的血浆浓度通过LC-MS/MS方法进行测定，其中质谱仪以正电喷雾模式进行操作。
7.9.4.药物动力学参数的测定
使用(美国)计算了药物动力学参数。
7.10. 7天大鼠毒性研究
在Sprague-Dawley雄性大鼠中以100、300和500mg/kg/天的日剂量通过管饲以5mL/kg/天的恒定剂量体积进行7天口服毒性研究以评价它们的毒性潜能和毒物动力学。
测试化合物配制于HPβCD在纯水中的30％(v/v)溶液中。各组包括5只主要雄性大鼠和3只卫星动物用于毒物动力学。第四组仅以相同频率、剂量体积和通过相同施用途径给予HPβCD在水中的30％(v/v)溶液，其充当媒介物对照组。
研究目标是确定不引起所鉴别的副反应事件的最低剂量(无可观察到的副作用的水平-NOAEL)。
7.11.QT延长的倾向
在hERG膜片钳分析中评估了QT延长的潜能。
使用通过Pulse v8.77软件(HEKA)控制的EPC10放大器进行全细胞膜片钳记录。串联电阻通常小于10MΩ，并且被补偿超过60％，记录未漏减。电极由GC150TF玻璃吸管(Harvard)制造。
外浴溶液含有：135mM NaCl、5mM KCl、1.8mM CaCl2、5mM葡萄糖、10mM HEPES pH7.4。
内部膜片吸管溶液含有：100mM Kgluconate、20mM KCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2、5mMNa2ATP、2mM谷胱甘肽、11mM EGTA、10mM HEPES pH 7.2。
使用Biologic MEV-9/EVH-9快速灌注***灌注药物。
对稳定表达hERG通道的HEK293细胞进行全部记录。细胞在使用两个铂杆(Goodfellow)锚定于记录室中的12mM圆形盖玻片(German glass,Bellco)上培养。hERG电流使用活化脉冲诱发至+40mV持续1000ms，随后使用尾电流脉冲诱发至-50mV持续2000ms，保持电位为-80mV。每20s施加脉波，所有实验于室温进行。
最终批注
本领域技术人员将理解，上述描述的本质是示例性和说明性的，其意欲解释说明本发明及其优选实施方案。通过常规实验，技术人员将认识到可以在不脱离本发明宗旨的情况下作出的显而易见的修改和变化。在所附权利要求的范围内进行的所有这类修改意欲被囊括在其中。因此，本发明意欲不通过上述描述进行限定，而是通过以下的权利要求及其等同物进行限定。
本说明书中引用的所有出版物、包括但不限于专利和专利申请引入本文作为参考，如同每篇单独出版物被具体和单独地指示如同全文给出那样引入本文作为参考那样。
应理解，各种化合物的诸如不同细胞穿透能力的因素可以导致体外生物化学和细胞分析中的化合物活性的差异。
如本申请中给出和阐述的本发明的化合物的化学命名中至少有一些可以通过使用市售化学命名软件程序而自动产生，尚未单独进行验证。执行该功能的代表性程序包括由Open Eye Software,Inc.出售的Lexichem命名工具和由MDL,Inc.出售的Autonom软件工具。在指定化学名称与描绘结构相异的情形中，应以描绘结构为准。
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Claims (15)

1.式I化合物，或其可药用盐或溶剂合物或可药用盐的溶剂合物，
其中
R1为H或Me；
L1为-NR2-；-O-；或-CH2-；
Cy为苯基或包含1至4个独立地选自N、O和S的杂原子的5-9元单环或稠合双环杂芳基；
R2为H或C1-4烷基；
R3为H、卤素、任选被一个或多个卤素取代的C1-4烷基或任选被一个或多个卤素取代的C1-4烷氧基；
R4为H或卤素；
R5为-CN、卤素或为-L2-R6；
-L2不存在或为-C(＝O)-、-C(＝O)NR7-、-NR7C(＝O)-、-SO2-、-SO2NR7-或-NR7SO2-；
R6为H或任选被一个或多个独立选择的R8基团取代的C1-6烷基；
R7为H或C1-4烷基；
R8为OH、CN、卤素或C1-4烷氧基，
La不存在或为-C(＝O)-、-C(＝O)O-或-C(＝O)NH-；
Ra为：
-H，
-任选被一个或多个独立选择的Rb取代的C1-4烷基，
-任选被一个或多个独立选择的Rc取代的C3-7单环环烷基，或
-包含一个或多个独立地选自O、N和S的杂原子的4-7元单环杂环烷基，或
-包含一个或多个独立地选自O、N和S的杂原子的5-6元单环杂芳基；
Rb为
-卤素，
-CN，
-OH，
-C1-4烷氧基，
-C3-7环烷基，
-包含一个或多个独立地选自O、N和S的杂原子的4-7元单环杂环烷基(该杂环烷基任选被一个或多个独立选择的卤素或氧代基取代)，
--SO2-C1-4烷基，或
--C(＝O)NRb1Rb2
Rc为
-卤素，
-CN，
-OH，
-C1-4烷基，
--C(＝O)OH，或
--C(＝O)NRc1Rc2；且
Rb1、Rb2、Rc1和Rc2各自独立地选自H和C1-4烷基。
2.根据权利要求1的化合物或可药用盐，其中R1为Me。
3.根据权利要求1的化合物或可药用盐，其中所述化合物符合式IIa、IIb或IIc：
其中L1、R3、R4、La、Ra和R5如权利要求1中所述。
4.根据权利要求1的化合物或可药用盐，其中所述化合物符合式IVa、IVb、IVc、IVd、IVe或IVf：
其中R3、R4、R5、La和Ra如权利要求1中所述。
5.根据权利要求1的化合物或可药用盐，其中所述化合物符合式Va、Vb、Vc、Vd、Ve或Vf：
其中R3、R4、R5、La和Ra如权利要求1中所述。
6.根据权利要求1至5任一项的化合物或可药用盐，其中R4为H、F或Cl。
7.根据权利要求1至6任一项的化合物或可药用盐，其中R3为H、Me或Et。
8.根据权利要求1至7任一项的化合物或可药用盐，其中R5为CN、F、Cl、-SO2Me或-SO2Et。
9.根据权利要求1至8任一项的化合物或可药用盐，其中Ra为：
10.根据权利要求1的化合物或其可药用盐，其中所述化合物为(1R,2R)-N-[6-[(6-氰基-4-甲基-3-吡啶基)氧基]-1-甲基-苯并咪唑-4-基]-2-氟-环丙烷甲酰胺。
11.医药组合物，其包含可药用载体和药物有效量的权利要求1至10任一项的化合物或其可药用盐。
12.根据权利要求11的医药组合物，其包含其它治疗剂。
13.根据权利要求1至10任一项的化合物或其可药用盐或根据权利要求11或12的医药组合物，其用于药剂中。
14.根据权利要求1至10任一项的化合物或根据权利要求11或12的医药组合物，其用于治疗或预防过敏性疾病、炎性疾病、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨转换受损的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6分泌过多或干扰素分泌过多相关的疾病。
15.根据权利要求12的医药组合物，其中所述其它治疗剂为治疗过敏性疾病、炎性疾病、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨转换受损的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6分泌过多或干扰素分泌过多相关的疾病的物质。
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