CN110632238A - 应用tlc-cms技术评价米糠中生物碱抗氧化性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明方法是应用TLC‑CMS技术评价米糠中生物碱的抗氧化性。以米糠为原料，以70%乙醇为提取剂，料液比为1:20，经微波超声波萃取仪辅助提取获得生物碱粗提取物。通过薄层色谱对生物碱进行分离纯化并测定其含量，运用质谱仪对其分子信息进行检测，紫外测定其清除DPPH、羟基自由基的能力，最后应用荧光光度法进一步证明其抗氧化性。薄层层析可快速从米糠中分离纯化生物碱，双波长薄层扫描法测定生物碱含量简便且重现性较好。通过紫外和荧光光度法测定其对DPPH、羟基自由基的抗氧化能力所得结论是一致的。

Description

应用TLC-CMS技术评价米糠中生物碱抗氧化性的方法

技术领域

本发明涉及生物碱检测领域，具体为一种应用TLC-CMS技术评价米糠中生物碱抗氧化性的方法。

背景技术

黄小米是我国北方主要的粗粮，有“杂粮王国的国王”的美名。当前，吕梁、忻州、长治为山西省的谷子主产区，谷子栽种面积大约在150万亩左右。在生产小米的过程中谷子脱壳后的副产物就是米糠，是谷子质量的5%~7%。米糠中含有维生素B、生育酚、生育三烯酚、多酚类化合物、谷维素、黄酮类化合物、甾醇、神经酰胺、生物碱等很多生理活性物质，这些物质对某些疾病有一定的诊疗作用。

生物碱是一类含氮的碱性有机化合物，有类似于碱的性质，并且有苦涩味。米糠被誉为“天赐营养源”，但是米糠都被用作饲料，甚至被大规模燃烧，既造成资源浪费又污染了环境，所以应对米糠进行开发利用。米糠中含有生物碱，生物碱有药理效应。一些生物碱在生物制药和卫生等方面有很强的实用性，其具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤的作用，因此正逐渐成为人们重点研究的对象。

许多资料和研究显示，目前生物碱的提取方法，常用的有甲醇冷浸提取法、乙醇回流提取法、超声波辅助提取法、大孔树脂吸附法等。不过，近年来随着科技的不断发展，众多学者对生物碱的提取和含量测定做了更深入的研究，如：白玛桑姆等人用薄层色谱对苦马豆中生物碱的成分进行了分析和分离；李雪俐等人用薄层色谱法对苦豆子提取物中的生物碱类活性成分进行了鉴定。关于生物碱的研究已经有很多的报道，大多数是其提取工艺的研究，生物碱的生理活性多种多样，其抗氧化作用表现出了广阔的应用前景，但是有关米糠中生物碱的分离纯化及其抗氧化性的研究还未曾见到。

发明内容

本发明是在前人研究的基础上，尝试采用超声波微波辅助提取法对米糠中的生物碱进行粗提取，用TLC技术分离纯化米糠中的生物碱，用质谱仪对其分子信息进行检测，并评价其抗氧化性。

本发明是采用如下技术方案实现的：

一种应用TLC-CMS技术评价米糠中生物碱抗氧化性的方法，包括如下步骤：

（1）、米糠中生物碱物质的粗提取

1.1、原材料处理：米糠烘干后粉碎，备用。

1.2、乙醇水溶液浸提：称取米糠于锥形瓶内，加入70%的乙醇-水溶液，拌匀至形成匀浆，放入气浴恒温振荡器内进行振荡，设置时间为24h，设置温度为45℃。

1.3、超声波微波萃取仪辅助处理：用超声波微波辅助萃取仪对悬浮液进行三阶段提取，每阶段10min，共30min；具体参数为：在超声波恒定的条件下，分别设置各阶段温度为40℃、45℃、50℃，设置超声波功率为800W、900W、1000W，设置微波功率为150W、200W、250W，超声波频率为50KHz，模式15:10，电机转速930r/min，最后形成匀浆。

1.4、离心过滤：将悬浮液在低速离心机内离心，设置4000r/min为转速，时间为10min，重复三次，获得上层清夜与滤渣，把所有上层清夜混合并过滤，收集并称重所有滤渣。

1.5、浓缩干燥：将上层清夜置于旋转蒸发仪的圆底烧瓶中，打开冷凝管，设置水浴温度为79℃，进行乙醇的旋转蒸发，直至冷凝时已无液体蒸发出来，将接收烧瓶中的乙醇回收起来进行再利用。

1.6、酸化、萃取：将旋转蒸发后的样液倒入锥形瓶中，加入质量分数2%的HCL酸化至pH2~3，将酸化后的滤液倒入分液漏斗中，加入等体积的氯仿萃取，充分摇匀，静置10min，收集下层氯仿层后，在上层溶液中再加入等体积的氯仿萃取，萃取三次后，收集上层的酸性水溶液待用。

1.7、碱化、萃取：将酸性水溶液碱化，用质量分数5% NaOH碱化至pH9~10，得到的溶液再加入氯仿:甲醇=3:1（v/v）萃取，取氯仿甲醇相，再在上层碱性水溶液中加入等体积的氯仿、甲醇溶液萃取，萃取三次后，收集上层的碱性水溶液。

1.8、蒸发浓缩、定容：取三氯甲烷甲醇层液体经旋转蒸发仪进行蒸发浓缩直至干燥，计算提取率，蒸干后的物质用色谱甲醇将其定容至25mL。

（2）、标准品的制备

精密称量吴茱萸碱标准品放置于超声洗脱干净的容量瓶中，加入色谱甲醇至刻度处，超声条件下溶解后得到1mg/mL的吴茱萸碱标准品溶液，并将其置于2~4℃的冰箱中保存备用。

（3）、薄层色谱分离纯化

3.1、点样：用微量进样器吸取25μL生物碱对照品溶液，置于全自动点样机上，设置点样参数：点样数目3、点样量分别为5μL、7μL、9μL，在薄层层析硅胶板薄膜上进行点样，再吸取25μL供试品溶液，点样数目为3，点样量均为10μL。

3.2、展开：在层析缸中配制甲醇:氯仿:苯:石油醚=1:14:2:8（v/v）混合溶液作为米糠中生物碱的展开剂，待展开剂饱和后，将点样完成的硅胶板放入层析缸内，待到展开剂前沿距硅胶板顶端1cm处时，取出硅胶板晾干。

3.3、薄层色谱成像***记录：将晾干的硅胶板放入薄层色谱成像***，在254nm的荧光灯下拍照观察层析情况，并拍照记录。

3.4、薄层色谱扫描仪测定含量：利用扫描仪将拍照记录好的薄层板进行扫描，通过轨迹跟踪确定斑点位置参数后，先进行光谱扫描确定斑点最大最小吸收峰值，再用反射扫描测定目标斑点峰面积，利用峰面积与点样量的线性关系测定目标斑点物质含量。

（4）、质谱分析

4.1、标准品的质谱检测：用色谱甲醇和超纯水作为流动相；将仪器和软件打开使其处于工作状态，用微量进样器吸取标准品溶液***到进样口处，打到Load档开始进样，进完样后打回到inject档；点开谱图界面对谱图进行分析并保存。

4.2、待测液的质谱检测：流动相与测标准品的流动相相同；使仪器和软件处于工作状态，将待测品薄层板置于TLC-质谱接口，使激光对准圈出的生物碱斑点中心处，用软件操作进行取样，点开谱图界面对谱图进行分析并保存。

（5）、清除率计算

5.1、对DPPH自由基清除能力的测定：取若干试管，准确吸取浓度为100μg/mL，80μg/mL，60μg/mL，40μg/mL，20μg/mL的生物碱样品液0.1mL，分别加入0.06mmol/L DPPH溶液3.50mL于5支试管中，严格避光30min，在515nm处测得吸光值，记为A_i；再取5支试管吸取不同浓度的样品提取液0.1mL，各加入甲醇溶液3.50mL，测量吸光值，记为A_j；再取1支试管准确吸取DPPH溶液3.50mL，加入0.10mL甲醇溶液后测量其吸光值，记为A₀。配备和样品提取液相同浓度梯度的V_C和V_E甲醇溶液，作为实验对照组；各吸光度值均取测量三次后的平均值；

清除率S=[1–(A_i–A_j)/A₀]×100%。

5.2、对羟基自由基清除能力的测定：取2.0mL 9mmol/L的FeSO₄溶液、2.0mL8.8mmol/L的H₂O₂溶液于37℃下反应15min，在536nm处测其吸光值记为A₀，然后分别加入100μg/mL，80μg/mL，60μg/mL，40μg/mL，20μg/mL的生物碱样品液1mL，在536nm处测其吸光值，记为Ax；配备和样品提取液相同浓度梯度的V_C和V_E甲醇溶液，作为实验对照组；各吸光度值均取测量三次后的平均值；

清除率S=(A₀–Ax)/A₀×100%。

（6）、荧光光度法进一步证明其抗氧化性

将经过紫外扫描后的提取液置于荧光光度计下扫描，设置波长为515nm，根据出峰个数和最大荧光值出现的位置确定是否有新物质生成，依据荧光扫描加等量DPPH溶液前后的荧光值差的变化情况，评价生物碱的抗氧化性强度。

本发明方法应用TLC-CMS技术评价米糠中生物碱的抗氧化性。以米糠为原料，以70%乙醇为提取剂，料液比为1:20，经微波超声波萃取仪辅助提取获得生物碱粗提取物。通过薄层色谱对生物碱进行分离纯化并测定其含量，运用质谱仪对其分子信息进行检测，紫外测定其清除DPPH、羟基自由基的能力，最后应用荧光光度法进一步证明其抗氧化性。结果以甲醇:氯仿:苯:石油醚=1:14:2:8（v/v）为最适展开剂，在薄层层析硅胶板上展开后，在荧光254nm下检视，供试品与生物碱对照品的 R_f值均为0.8左右，且均呈蓝紫色斑点。反射式锯齿型扫描显示，λ_S为224nm，λ_R为700nm，峰面积积分值与含量线性关系良好（r=0.9986），外标两点法测定供试品的平均含量为0.5509%。经质谱检测，供试样品与标准品均含有相同离子碎片峰。供试样液对DPPH和羟基自由基都具有清除作用，其中对羟基自由基的清除能力相对较高，且清除能力为：供试样液>V_C>V_E。结论：薄层层析可快速从米糠中分离纯化生物碱，双波长薄层扫描法测定生物碱含量简便且重现性较好。通过紫外和荧光光度法测定其对DPPH、羟基自由基的抗氧化能力所得结论是一致的。

本发明设计合理，通过该实验研究，可以确定从米糠中提取生物碱的方法，主要应用TLC-CMS技术评价生物碱的抗氧化性，为工业提取米糠中的生物碱抗氧化剂提供理论依据，并且可以促进当地经济发展。

附图说明

图1表示吴茱萸碱结构式。

图2表示254nm处的薄层板成像。

图3表示标准品TLC光谱扫描图。

图4表示供试品TLC光谱扫描图。

图5表示吴茱萸碱标准曲线。

图6表示供试品中生物碱含量的测定结果。

图7表示吴茱萸碱标准品质谱扫描曲线。

图8表示供试液质谱扫描曲线。

图9表示米糠生物碱、V_C、V_E相对DPPH自由基的清除率。

图10表示生物碱、V_C、V_E相对羟基自由基的清除率。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施例进行详细说明。

一种应用TLC-CMS技术评价米糠中生物碱抗氧化性的方法，主要以米糠为实验材料，通过乙醇浸提、微波超声波辅助处理、离心、浓缩干燥、萃取等步骤对米糠中生物碱进行粗提取；然后采用TLC-CMS技术对生物碱提取液作抗氧化活性分析。具体步骤如下：

1、实验材料

1.1、材料

选用的原料是米糠（晋谷8311红小米糠采集于大同市浑源县）。

1.2、主要试剂和仪器

表1主要试剂及药品

表2主要仪器及出厂

2、实验方法

2.1、米糠中生物碱物质的粗提取

原材料处理：取米糠于恒温箱内烘干，经高速多功能粉粹机进行粉碎后，装入玻璃瓶容器中备用。

乙醇水溶液浸提：称取10g米糠于锥形瓶内，加入70%的乙醇-水溶液，用恒温磁力搅拌器拌匀直至形成匀浆，将上述制备好的悬浮液放在气浴恒温振荡器内进行振荡，设置时间为24h，设置温度为45℃（恒温）。

超声波微波萃取仪辅助处理：用超声波微波辅助萃取仪对悬浮液进行三阶段提取，每阶段10min，共30min。在超声波恒定的条件下，分别设置各阶段温度为40℃、45℃、50℃，设置超声波功率为800W、900W、1000W，设置微波功率为150W、200W、250W，超声波频率为50KHz，模式15:10，电机转速930r/min，最后形成匀浆。

离心过滤：将悬浮液在低速离心机内离心，设置4000r/min为转速，时间为10min，重复三次，获得上层清夜与滤渣，把所有上层清夜混合并过滤，收集并称重所有滤渣。

浓缩干燥：将上层清夜置于旋转蒸发仪的圆底烧瓶中，打开冷凝管，设置水浴温度为79℃（乙醇沸点78~79℃左右，由于溶液中有水，设置为79℃），进行乙醇的旋转蒸发，直至冷凝时已无液体蒸发出来，大约为原溶液体积的1/4（乙醇:水=3:1，蒸发至原体积的1/4，即乙醇完全蒸发），将接收烧瓶中的乙醇回收起来进行再利用。

酸化、萃取：将旋转蒸发后的样液倒入锥形瓶中，加入质量分数2% HCL酸化至pH2~3，将酸化后的滤液倒入分液漏斗中，加入等体积的氯仿萃取，充分摇匀，静置10min，收集下层氯仿层后，在上层溶液中再加入等体积的氯仿萃取，萃取三次后，收集上层的酸性水溶液待用。

碱化、萃取：将酸性水溶液碱化，用质量分数5% NaOH碱化至pH9~10。得到的溶液再加入氯仿:甲醇=3:1（v/v）萃取，取氯仿甲醇相，再在上层碱性水溶液中加入等体积的氯仿、甲醇溶液萃取，萃取三次后，收集上层的碱性水溶液。

蒸发浓缩、定容：取三氯甲烷甲醇层液体经旋转蒸发仪进行蒸发浓缩直至干燥，计算提取率。蒸干后的物质用色谱甲醇将其定容至25mL（此时的提取物里含有生物碱单体）。

标准品的制备：精密称量25mg的吴茱萸碱标准品放置于超声洗脱干净的25mL容量瓶中，加入色谱甲醇至刻度处，超声条件下溶解后得到1mg/mL的吴茱萸碱标准品溶液，并将其置于2~4℃的冰箱中保存备用。

表3 最佳微波超声波条件的优化选择

2.2、薄层色谱分离纯化

点样：用微量进样器缓慢吸取25μL生物碱对照品溶液，置于全自动点样机上，设置点样参数（点样数目3、点样量分别为5μL、7μL、9μL），在薄层层析硅胶板薄膜上进行点样，再吸取25μL供试品溶液，点样数目为3，点样量均为10μL。

展开：在层析缸中配制甲醇:氯仿:苯:石油醚=1:14:2:8（v/v）混合溶液作为米糠中生物碱的展开剂，待展开剂饱和后，将点样完成的硅胶板放入层析缸内，待到展开剂前沿距硅胶板顶端约1cm处时，取出硅胶板晾干。

薄层色谱成像***记录：将晾干的硅胶板放入薄层色谱成像***，在254nm的荧光灯下拍照观察层析情况，并拍照记录。

薄层色谱扫描仪测定含量：利用扫描仪将拍照记录好的薄层板进行扫描，通过轨迹跟踪确定斑点位置参数后，先进行光谱扫描确定斑点最大最小吸收峰值，再用反射扫描测定目标斑点峰面积，利用峰面积与点样量的线性关系测定目标斑点物质含量。

2.3、质谱分析

标准品的质谱检测：用色谱甲醇和超纯水作为流动相。将仪器和软件打开使其处于工作状态，用微量进样器吸取标准品溶液***到进样口处，打到Load档开始进样，进完样后打回到inject档。点开谱图界面对谱图进行分析并保存。

待测液的质谱检测：流动相与测标准品的流动相相同。使仪器和软件处于工作状态，将待测品薄层板置于TLC-质谱接口，使激光对准圈出的生物碱斑点中心处。用软件操作进行取样，点开谱图界面对谱图进行分析并保存。

2.4、清除率计算

对DPPH自由基清除能力的测定：依据DPPH自由基存在单个电子，在515nm附近具有强吸收，并且其醇溶液呈紫色。取若干试管，准确吸取浓度为100μg/mL，80μg/mL，60μg/mL，40μg/mL，20μg/mL的生物碱样品液0.1mL，分别加入0.06mmol/L DPPH溶液3.50mL于5支试管中，严格避光30min，在515nm处测得吸光值，记为A_i。再取5支试管吸取不同浓度的样品提取液0.1mL，各加入甲醇溶液3.50mL，测量吸光值，记为A_j。再取1支试管准确吸取DPPH溶液3.50mL，加入0.10mL甲醇溶液后测量其吸光值，记为A₀。配备和样品提取液相同浓度梯度的V_C和V_E甲醇溶液，作为实验对照组。各吸光度值均取测量三次后的平均值。

清除率S=[1–(A_i–A_j)/A₀]×100%。

对羟基自由基清除能力的测定：利用H₂O₂和Fe²⁺混合发生Fenton 反应，生成具有很高反应活性的•OH，该物质在536nm下有最大吸收。取2.0mL 9mmol/L的FeSO₄溶液、2.0mL8.8mmol/L的H₂0₂溶液于37℃下反应15min，在536nm处测其吸光值记为A₀，然后分别加入100μg/mL，80μg/mL，60μg/mL，40μg/mL，20μg/mL的生物碱样品液1mL，在536nm处测其吸光值，记为A_x。配备和样品提取液相同浓度梯度的V_C和V_E甲醇溶液，作为实验对照组。各吸光度值均取测量三次后的平均值。

清除率S=(A₀–A_x)/A₀×100%。

2.5、荧光光度法进一步证明其抗氧化性

将经过紫外扫描后的提取液置于荧光光度计下扫描，设置波长为515nm，根据出峰个数和最大荧光值出现的位置确定是否有新物质生成，依据荧光扫描加等量DPPH溶液前后的荧光值差的变化情况，评价生物碱的抗氧化性强度。

3、结果与分析

3.1、薄层层析色谱分析

3.1.1、米糠生物碱薄层成像结果分析

用薄层层析法进行展开剂多次尝试后，确定米糠中生物碱的最佳展开剂为甲醇:氯仿:苯:石油醚=1:14:2:8（v/v），薄层荧光灯下观察标准品与供试品的展开图如图2所示。

该硅胶板上点样数目为6，右边三个斑点是标准品经点样后展开的，左边三个斑点是供试品经点样后展开的，在254nm荧光灯下检视。从图2观察表明：供试品与标准品在相应位置上都呈现蓝紫色荧光斑点，且荧光斑点位置一致，其R_f值均为0.8左右，由此可以判断，米糠中含有与标准品属性一样的生物碱。

3.1.2、双波长薄层扫描法检测生物碱含量

使用薄层色谱扫描仪在200~850nm波长内对斑点进行光谱扫描，结果显示，供试品与吴茱萸碱对照品在224nm处均有吸收峰，700nm后几乎无吸收，故选择λ_S=224nm，λ_R=700nm。见图3和图4。

线性范围的考察：精密吸取以上配置好的吴茱萸碱对照品溶液5μL、7μL、9μL分别点于同一薄层层析硅胶板薄膜上（100×100mm），展开后进行扫描，以对照品量为横坐标（X），吸收峰面积值为纵坐标为（Y），绘制标准曲线，试验数据经直线回归，得回归方程 Y=0.5789X－0.8861（r=0.9982）。结果表明：吴茱萸碱在5~9μg范围内，峰面积与对照品量呈良好的线性关系，见图5。由于标准曲线方程不过坐标原点，采用外标两点法测定供试品溶液中生物碱的含量。

样品含量测定：吸取吴茱萸碱标准品溶液25μL，在硅胶G板上分别点样5μL、7μL、9μL，再吸取供试品溶液25μL，在同一硅胶G板上点供试品溶液10μL，依法展开后，利用反射扫描法测定含量，见图6。

表4 供试品中生物碱含量

从表4可知，供试品中生物碱的平均含量为0.5509%。

3.2、质谱检测

标准品扫描图如图7所示；样品扫描图如图8所示。

将配制的吴茱萸碱标准品和供试液进行质谱分析，吴茱萸碱的相对分子质量为303.37，按理在质谱图中应该会出现303的强峰，但对比观察图7和图8可知，标准品和供试液分别在304.2和304.4出现了强峰，推测吴茱萸碱标准品和该物质在电子的轰击下增加了一个H离子，认为这是合理的增加，故判定该物质是生物碱化合物。

3.3、米糠中生物碱抗氧化性测定

3.3.1、对DPPH自由基清除能力的测定

表5米糠生物碱对DPPH的清除率

表6 Vc对DPPH的清除率

表7 Ve对DPPH的清除率

从表5至7，图9中数据可知：在浓度低于0.06mg/mL时，生物碱、Vc、Ve相对DPPH的清除率呈缓慢上升趋势，且清除能力为Vc>生物碱>Ve；当浓度在0.06mg/mL~0.1mg/mL之间时，Vc、Ve相对DPPH的清除率整体上升幅度增大；而当浓度在0.08mg/mL~0.1mg/mL之间时，生物碱相对DPPH的清除率呈下降趋势，且清除能力为Vc>Ve>生物碱。总体上这3种物质相对DPPH的清除率在70%左右，证明3种物质相对DPPH均具有清除能力，但清除效果不是很好。

3.3.2、对羟基自由基清除能力的测定

表8 生物碱对羟基自由基的清除率

表9 Ve对羟基自由基的清除率

表10 Vc对羟基自由基的清除率

从表8至10，图10中数据可知：在浓度低于0.02mg/mL时，生物碱、Vc、Ve相对羟基自由基的清除率上升幅度较大，且清除能力为生物碱>Vc>Ve；当浓度在0.02mg/mL~0.1mg/mL之间时，这3种物质在整体上相对羟基自由基的清除率呈缓慢上升趋势，且清除能力仍为生物碱>Vc>Ve。总体来看，生物碱的清除能力明显高于Ve和Vc，并且生物碱相对羟基自由基的清除率在浓度为0.02mg/mL时就达到了93%以上，Vc相对羟基自由基的清除率在80%左右，证明生物碱和Vc相对羟基自由基具有较强的清除能力。

3.3.3、用荧光光度法进一步证明其抗氧化性

通过用荧光分光光度计根据荧光值差的变化进一步分析生物碱的抗氧化性，并以Vc、Ve作为对照，结果表明，生物碱具有较强的抗氧化性，这一结论与紫外分析抗氧化能力所得结论是一致的。

4、结论

以米糠为原料，70%乙醇为提取剂，料液比为1:20，经微波超声波萃取仪辅助处理，通过多次实验，最终确定了最佳工艺条件为：分三阶段提取，每阶段10min，共30min。在超声波恒定的条件下，设置温度为40℃、45℃、50℃，超声波功率为800W、900W、1000W，微波功率为150W、200W、250W，超声波频率为50KHz，模式15:10，电机转速930r/min，对米糠中生物碱物质具有较好的提取性能。采用多级萃取法、蒸发浓缩获得了生物碱粗提取物。

经多次尝试后确定甲醇:氯仿:苯:石油醚=1:14:2:8（v/v）为米糠生物碱的最适展开剂，薄层成像***254nm下检视，样品中斑点与吴茱萸碱标准品位置大体一致，且均呈蓝紫色斑点，因此该色谱条件能够有效分离纯化生物碱。

双波长薄层扫描结果为：λ_S=224nm，λ_R=700nm；此条件下，薄层扫描峰面积积分值与含量线性关系良好（r=0.9982），采用外标两点法测得供试品中生物碱的平均含量为0.5509％。

用质谱仪测定其相对分子质量，与标准品相对照有一致的结果，大致推断所提物质是需要的物质。经紫外分光光度计检测不同浓度的生物碱、Vc、Ve提取液清除DPPH、羟基自由基的能力，得出各提取液对DPPH、羟基自由基都具有一定的清除能力，其中，对DPPH的清除能力为Vc>生物碱>Ve，对羟基自由基的清除能力为生物碱>Vc>Ve，因此对羟基自由基的清除能力最强，此结论与荧光光度法检测的结果具有一致性。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照本发明实施例进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明的技术方案的精神和范围，其均应涵盖于本发明权利要求书的保护范围中。

Claims (1)

1.一种应用TLC-CMS技术评价米糠中生物碱抗氧化性的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）、米糠中生物碱物质的粗提取

1.1、原材料处理：米糠烘干后粉碎，备用；

1.2、乙醇水溶液浸提：称取米糠于锥形瓶内，加入70%的乙醇-水溶液，拌匀至形成匀浆，放入气浴恒温振荡器内进行振荡，设置时间为24h，设置温度为45℃；

1.3、超声波微波萃取仪辅助处理：用超声波微波辅助萃取仪对悬浮液进行三阶段提取，每阶段10min，共30min；具体参数为：在超声波恒定的条件下，分别设置各阶段温度为40℃、45℃、50℃，设置超声波功率为800W、900W、1000W，设置微波功率为150W、200W、250W，超声波频率为50KHz，模式15:10，电机转速930r/min，最后形成匀浆；

1.4、离心过滤：将悬浮液在低速离心机内离心，设置4000r/min为转速，时间为10min，重复三次，获得上层清夜与滤渣，把所有上层清夜混合并过滤，收集并称重所有滤渣；

1.5、浓缩干燥：将上层清夜置于旋转蒸发仪的圆底烧瓶中，打开冷凝管，设置水浴温度为79℃，进行乙醇的旋转蒸发，直至冷凝时已无液体蒸发出来，将乙醇回收；

1.6、酸化、萃取：将旋转蒸发后的样液倒入锥形瓶中，加入质量分数2%的HCL酸化至pH2~3，将酸化后的滤液倒入分液漏斗中，加入等体积的氯仿萃取，充分摇匀，静置10min，收集下层氯仿层后，在上层溶液中再加入等体积的氯仿萃取，萃取三次后，收集上层的酸性水溶液待用；

1.7、碱化、萃取：将酸性水溶液碱化，用质量分数5%NaOH碱化至pH9~10，得到的溶液再加入氯仿:甲醇=3:1（v/v）萃取，取氯仿甲醇相，再在上层碱性水溶液中加入等体积的氯仿、甲醇溶液萃取，萃取三次后，收集上层的碱性水溶液；

1.8、蒸发浓缩、定容：取三氯甲烷甲醇层液体经旋转蒸发仪进行蒸发浓缩直至干燥，计算提取率，蒸干后的物质用色谱甲醇将其定容至25mL；

（2）、标准品的制备

精密称量吴茱萸碱标准品放置于超声洗脱干净的容量瓶中，加入色谱甲醇至刻度处，超声条件下溶解后得到1mg/mL的吴茱萸碱标准品溶液，并将其置于2~4℃的冰箱中保存备用；

（3）、薄层色谱分离纯化

3.1、点样：用微量进样器吸取25μL生物碱对照品溶液，置于全自动点样机上，设置点样参数：点样数目3、点样量分别为5μL、7μL、9μL，在薄层层析硅胶板薄膜上进行点样，再吸取25μL供试品溶液，点样数目为3，点样量均为10μL；

3.2、展开：在层析缸中配制甲醇:氯仿:苯:石油醚=1:14:2:8（v/v）混合溶液作为米糠中生物碱的展开剂，待展开剂饱和后，将点样完成的硅胶板放入层析缸内，待到展开剂前沿距硅胶板顶端1cm处时，取出硅胶板晾干；

3.3、薄层色谱成像***记录：将晾干的硅胶板放入薄层色谱成像***，在254nm的荧光灯下拍照观察层析情况，并拍照记录；

3.4、薄层色谱扫描仪测定含量：利用扫描仪将拍照记录好的薄层板进行扫描，通过轨迹跟踪确定斑点位置参数后，先进行光谱扫描确定斑点最大最小吸收峰值，再用反射扫描测定目标斑点峰面积，利用峰面积与点样量的线性关系测定目标斑点物质含量；

（4）、质谱分析

4.1、标准品的质谱检测：用色谱甲醇和超纯水作为流动相；将仪器和软件打开使其处于工作状态，用微量进样器吸取标准品溶液***到进样口处，打到Load档开始进样，进完样后打回到inject档；点开谱图界面对谱图进行分析并保存；

4.2、待测液的质谱检测：流动相与测标准品的流动相相同；使仪器和软件处于工作状态，将待测品薄层板置于TLC-质谱接口，使激光对准圈出的生物碱斑点中心处，用软件操作进行取样，点开谱图界面对谱图进行分析并保存；

（5）、清除率计算

5.1、对DPPH自由基清除能力的测定：取若干试管，准确吸取浓度为100μg/mL，80μg/mL，60μg/mL，40μg/mL，20μg/mL的生物碱样品液0.1mL，分别加入0.06mmol/L DPPH溶液3.50mL于5支试管中，严格避光30min，在515nm处测得吸光值，记为A_i；再取5支试管吸取不同浓度的样品提取液0.1mL，各加入甲醇溶液3.50mL，测量吸光值，记为A_j；再取1支试管准确吸取DPPH溶液3.50mL，加入0.10mL甲醇溶液后测量其吸光值，记为A₀；

配备和样品提取液相同浓度梯度的V_C和V_E甲醇溶液，作为实验对照组；各吸光度值均取测量三次后的平均值；

清除率S=[1－(A_i－A_j)/A₀]×100%；

5.2、对羟基自由基清除能力的测定：取2.0mL 9mmol/L的FeSO₄溶液、2.0mL 8.8mmol/L的H₂O₂溶液于37℃下反应15min，在536nm处测其吸光值记为A₀，然后分别加入100μg/mL，80μg/mL，60μg/mL，40μg/mL，20μg/mL的生物碱样品液1mL，在536nm处测其吸光值，记为Ax；配备和样品提取液相同浓度梯度的V_C和V_E甲醇溶液，作为实验对照组；各吸光度值均取测量三次后的平均值；

清除率S=(A₀－Ax)/A₀×100%；

（6）、荧光光度法进一步证明其抗氧化性

将经过紫外扫描后的提取液置于荧光光度计下扫描，设置波长为515nm，根据出峰个数和最大荧光值出现的位置确定是否有新物质生成，依据荧光扫描加等量DPPH溶液前后的荧光值差的变化情况，评价生物碱的抗氧化性强度。

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