CN108774630A - 一种饰纹姬蛙骨骼肌细胞的原代培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种饰纹姬蛙骨骼肌细胞的原代培养方法。它的步骤如下：取成体饰纹姬蛙进行表面消毒；解剖取出腿肌用HBSS平衡盐溶液清洗；依次经胶原酶Ⅰ和胰蛋白酶消化；组织悬液经切尖吸头和不切尖吸头吹打挤压后，依次经100μm孔径和40μm孔径细胞过滤网过滤制得细胞悬液；27℃恒温培养，每隔3‑4天换新的细胞完全培养基。本发明能快速、可重复地建立饰纹姬蛙骨骼肌细胞的原代培养，所需要的细胞培养设备简单，可操作性强。本发明是对已有的骨骼肌细胞的重要补充，为陆生适应性、***发育、肌肉发育、肌肉损伤等重大生物学及医学问题提供了新的细胞材料。

Description

一种饰纹姬蛙骨骼肌细胞的原代培养方法
技术领域
本发明属于动物细胞培养技术领域，尤其涉及一种饰纹姬蛙骨骼肌细胞的原代培养方法。
背景技术
1907年，哈里森(Harrison)采用悬滴培养法将蛙胚神经组织培养于淋巴液凝块中数周之久，并观察到从培养的组织块中长出了轴突，由此创建了盖片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法，奠定了动物组织体外培养的基础。1913年，卡雷尔(Carrel)将外科手术中严格的无菌操作技术引入到动物细胞的体外培养中，使细胞在体外能够长期生长。1916年，劳斯(Rous)和琼斯(Jones)将胰蛋白酶消化法用于组织消化和细胞传代，标志着真正意义上的动物细胞培养的开始。1948年，厄尔(Earle)从小鼠的皮下组织分离并连续传代培养了第一种细胞系：L成纤维细胞系。2006年，山中伸弥(Yamanaka)诱导体外培养的小鼠成纤维细胞重编程为了诱导多能干细胞(iPSC)。随着基因工程和其他细胞工程技术的发展，细胞培养技术已成为转基因技术、生物制药及其他许多技术的基础，在现代生物技术中发挥着重要的作用。
两栖动物，尤其无尾两栖类的细胞培养已经有一定的研究基础，从豹蛙(Ranapipiens)、中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans)、金线侧褶蛙(Pelophylax plancyi)、热带爪蟾(Xenopus tropicalis)、特别是非洲爪蟾(Xenopus laevis)的胚胎，蝌蚪或成体中分离培养出了多种组织的原代细胞及细胞系(Balls and Worley 1973；Freed andMezger-Freed 1970；Sinzelle et al.2012；Smith and Tata 1991；吴政安,1978)。然而以上两栖动物细胞培养研究主要集中在动物细胞培养历史的早期阶段，自从上个世纪90年代以后就没有大的进展。动物细胞培养技术的研究近几十年主要集中于昆虫和哺乳动物,对两栖动物的关注较少。骨骼肌细胞(skeletal muscle cells)原代培养技术的研究主要集中于鼠和人，有少量兔、犬、鸡和非洲爪蟾的研究(Charge and Rudnicki 2004；Danovizand Yablonka-Reuveni 2012；Parker MH et al.2012；Shefer and Yablonka-Reuveni2008；Shibota et al.2000；Yablonka-Reuveni and Day2011)。由于骨骼肌纤维已经失去了生长传代能力，因此通常取肌原性细胞(myogenic cell)进行培养以获得骨骼肌细胞，肌原性细胞主要为肌卫星细胞(skeletal muscle satellite cell)，少量为成肌细胞(myoblast)。早期认为肌卫星细胞在体外培养不可避免地会进入终末分化状态，因此不可传代(Yablonka-Reuveni and Day 2011)，近年发现加入P38抑制剂(SB 203580)在人肌卫星细胞培养基中(Charville et al.2015)或加入四种细胞因子(IL-1α,IL-13,TNF-α和IFN-γ)在鼠肌卫星细胞培养基中(Fu et al.2015),可多次传代。部分由成肌细胞(myoblast)构建的细胞系可多次传代，如兔源L6和L8细胞系，鼠源C2，C2C12和MM14细胞系。两栖类来源培养的骨骼肌细胞无可传代报道。
饰纹姬蛙(Microhyla fissipes)隶属于两栖纲(Amphibia)无尾目(Anura)姬蛙科(Microhylidae)，分布于东亚及东南亚，种群数量甚多，具有体形小，生存能力强，物种稳定，个体差异小，雌雄较易分辨，产卵多，蝌蚪透明，一年多次产卵且繁殖期长，性成熟较快，卵直径较大(0.8-1.0毫米)(Fei et al.,2009)，以及二倍体(Li,2006)等优点，使其在研究胚胎发育、适应性机制、人类疾病及环境健康等方面有着重要的价值(Liu et al.,2016)。此外，相对于水生生活的传统模式两栖动物爪蟾，饰纹姬蛙为陆生性物种，***后主要在陆地上生活，可作为研究水生到陆生适应性的良好模型，以上特点表明饰纹姬蛙极具成为模式生物的潜力。个体水平的生理生化研究往往需要大量遗传背景一致、发育阶段相同的蛙，对饲养场地有严格的要求，工作量大，而若有离体培养的细胞则可精准方便的研究其相关功能及机制。饰纹姬蛙骨骼肌细胞的培养目前为空白。因此，通过本发明，建立饰纹姬蛙骨骼肌细胞的原代培养方法，是对已有的骨骼肌细胞的重要补充，两栖动物细胞培养的进一步发展，不仅能促进陆生适应性、***发育、肌肉发育、肌肉损伤等重大生物学及医学问题的研究，还能增加我国细胞库的数量及种类，为日后其它两栖动物细胞系的建立提供借鉴经验。
发明内容
本发明的目的在于提供一种饰纹姬蛙骨骼肌细胞的原代培养方法，为骨骼肌生理生化研究提供技术支持和保障。
本发明通过以下技术方案完成：
一种饰纹姬蛙骨骼肌细胞的原代培养方法，包括以下步骤：
(1)配制溶液；
(2)选取体重0.5-2.0克的成蛙冷冻麻醉，用75％酒精表面消毒；
(3)将蛙置于平皿中，解剖；
(4)剪取腿肌入新培养皿，用HBSS平衡盐溶液清洗3次；
(5)转移清洗好的腿肌入离心管，吸走残余的HBSS平衡盐溶液，加入1.0-1.5mL胶原酶Ⅰ溶液，27℃消化90分钟；
(6)将全部消化液(含未消化固体肌肉组织)离心7-15分钟，离心条件为：离心力500-800g，温度4-6℃；
(7)小心吸出上清液并丢弃，加入1.0-1.5mL胰蛋白酶溶液，27℃消化15分钟；
(8)将全部消化液(含未消化固体肌肉组织)离心7-15分钟，离心条件为：离心力500-800g，温度4-6℃；
(9)小心吸出上清液并丢弃，然后加入1.0mL细胞完全培养基；
(10)用移液器(配1mL吸头，剪去吸头尖使尖头孔径约为2mm)用力缓慢吹打肌肉组织碎片，直到组织块能容易通过吸头，静置5分钟；
(11)将约3/4体积上清液用100μm孔径细胞过滤网过滤；
(12)用移液器(配1mL吸头)缓慢反复吹打剩余1/4体积肌肉组织碎片，直到组织块能容易通过吸头；
(13)将剩余1/4体积肌肉组织悬液全部转移到100μm孔径细胞过滤网(见11)过滤；
(14)滤液(见11，13)用40μm孔径细胞过滤网再过滤一次；
(15)再加入1.0-4.0mL细胞完全培养基入40μm孔径细胞过滤网(见14)过滤；
(16)将(14)(15)步得到的细胞悬液转移到细胞培养板中；
(17)将细胞培养板置于培养箱内,27℃恒温培养；
(18)每隔3-4天换细胞完全培养基。
整个操作过程在无菌条件下进行，所有耗材、试剂均要求无菌。
所述的HBSS平衡盐溶液浓度为标准HBSS平衡盐溶液的70％。
所述的胶原酶Ⅰ溶液含胶原酶Ⅰ浓度为0.25％。
所述的胰蛋白酶溶液含胰蛋白酶浓度为0.175％。
所述的细胞完全培养基为Leibovitz L-15培养基、胎牛血清、Primocin和Y27632的混合物，pH值7.0-7.4。
所述的细胞完全培养基中各成分含量为：标准Leibovitz L-15培养基60％，胎牛血清10％，纯水30％以及100μg/ml Primocin和10μM Y27632。
本发明还涉及一种由上述培养方法获得的饰纹姬蛙骨骼肌细胞。
本发明方法具有以下有益效果：
1.运用双酶依次消化法对比混合酶消化法或单独胰蛋白酶消化法，所需胰蛋白酶的消化时间更短，对细胞膜的损害程度轻，利于细胞存活；而单独胶原酶Ⅰ消化法几乎提取不到有效细胞。
2.挤压组织碎片释放肌原性细胞(见10，12)对比完全酶解获得细胞，所需酶消化时间更短，对细胞膜的损害程度轻，利于细胞存活，并且肌纤维碎片更少，利于观察。
3.培养方法技术稳定，重复性好，培养条件简单，不需要二氧化碳培养箱，培养的细胞形态均一，生长良好。
4.获得的细胞经显微镜观察、qPCR及细胞免疫化学鉴定具有典型的骨骼肌细胞形态及特点，为进一步深入研究骨骼肌的陆生适应性、***发育、肌肉发育、肌肉损伤等重大生物学及医学问题提供了丰富的实验材料来源。
附图说明
图1普通倒置相差显微镜(200×)下原代培养第2天饰纹姬蛙骨骼肌细胞；
图2普通倒置相差显微镜(200×)下原代培养第4天饰纹姬蛙骨骼肌细胞；
图3普通倒置相差显微镜(200×)下原代培养第6天饰纹姬蛙骨骼肌细胞；
图4饰纹姬蛙骨骼肌细胞的qPCR鉴定，myoG基因的相对表达量在骨骼肌细胞中远大于肺细胞和肾细胞；
图5荧光显微镜(400×)下饰纹姬蛙骨骼肌细胞，核胞浆中出现蓝色的DAPI阳性荧光反应，骨骼肌细胞浆Alpha Skeletal Muscle Actin抗原发绿色阳性荧光反应；
图6荧光显微镜(400×)下饰纹姬蛙骨骼肌细胞，核胞浆中出现蓝色的DAPI阳性荧光反应，骨骼肌细胞浆Desmin抗原发绿色阳性荧光反应；
图7饰纹姬蛙骨骼肌细胞的生长曲线图。
具体实施方式
下面结合实例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
实施例1溶液的配制
(1)HBSS平衡盐溶液(Hanks’balanced salt solution)：取350mL标准HBSS平衡盐溶液(Hyclone Cat.No.SH30030.02)，加入150mL纯水，4℃保存半年。
(2)胶原酶Ⅰ溶液(collagenaseⅠsolution)：溶解100mg胶原酶Ⅰ(InvitrogenCat.No.17100-017)于40mL HBSS平衡盐溶液(见1)，0.1μm滤头过滤，-20℃避光保存一年。
(3)胰蛋白酶溶液(Trypsin Solution)：取35mL原液(Gibco Cat.No.25200056)，加入15mL纯水，-20℃保存一年。
(4)Y27632溶液：溶解2mg Y27632(MCE Cat.No.HY-10583)于625μL DMSO(SigmaCat.No.D2650)，然后加入5.625mL纯水，-80℃保存半年。
(5)L-15培养基储液：取335mL标准Leibovitz L-15培养基(HycloneCat.No.SH30525.01)，加入165mL纯水，4℃保存半年。
(6)细胞完全培养基：临用前取45mL L-15培养基储液(见5)加入5mL胎牛血清(FBS)(WISENT Cat.No.086550),0.1mL Primocin(Invitrogen Cat.No.ant-pm-1)和0.5mLY27632溶液(见4)。
实施例2饰纹姬蛙骨骼肌细胞的原代培养
经过下列步骤：
(1)配制溶液；
(2)选取体重2.0克的成体雌蛙一只冷冻麻醉，无菌水冲洗后，用75％的酒精棉球擦拭皮肤；
(3)将蛙置于3.5厘米直径平皿中，解剖；
(4)用剪刀和镊子剪取大腿肌，切为约30-40mm3大小的肌肉块，放入新的3.5厘米直径平皿中，用HBSS平衡盐溶液清洗3次；
(5)用巴斯德管转移清洗好的肌肉块入15mL离心管，吸走残余的HBSS平衡盐溶液，加入1.5mL胶原酶Ⅰ溶液，拧紧离心管盖，27℃消化90分钟，每隔30分钟摇动离心管1次；
(6)用巴斯德管将全部消化液(含未消化固体肌肉组织)转移入一个2mL微量离心管(EP管)中，置入冷冻离心机离心7分钟，离心条件为：离心力800g，温度6℃；
(7)小心吸出上清液并丢弃，加入1.5mL胰蛋白酶溶液，27℃消化15分钟；
(8)将全部消化液(含未消化固体肌肉组织)离心7分钟，离心条件为：离心力800g，温度6℃；
(9)小心吸出上清液并丢弃，然后加入1.0mL细胞完全培养基；
(10)用移液器(配1mL吸头，剪去吸头尖使尖头孔径约为2mm)用力缓慢吹打肌肉组织碎片约25次，直到组织块能容易通过吸头，静置5分钟；
(11)放置一个100μm孔径细胞过滤网到50mL离心管上，将约3/4体积上清液转移到过滤网，轻拍管壁直到上清液基本通过滤网；
(12)用移液器(配1mL吸头)缓慢反复吹打剩余1/4体积肌肉组织碎片约15次，直到组织块能容易通过吸头；
(13)将剩余1/4体积肌肉组织悬液全部转移到100μm孔径细胞过滤网(见11)，轻拍管壁直到悬液基本通过滤网；
(14)放置一个40μm孔径细胞过滤网到50mL离心管上，将滤液(见11，13)转移到过滤网，轻拍管壁直到悬液基本通过滤网；
(15)为回收更多细胞，额外加入4.0mL细胞完全培养基到40μm孔径细胞过滤网(见14)，轻拍管壁直到细胞完全培养基通过滤网；
(16)将(14)(15)步得到的总共5.0mL细胞悬液分装到24孔细胞培养板(TC处理)的孔中，每孔1.0mL；
(17)将细胞培养板置于霉菌培养箱内,27℃恒温培养，霉菌培养箱底部内放入一盆5％的硫酸铜溶液以维持箱内湿度；
(18)每隔3天轻轻吹打一次培养基并吸出丢弃，然后换入等体积新的细胞完全培养基。
实施例3饰纹姬蛙骨骼肌细胞的原代培养
经过下列步骤：
(1)配制溶液；
(2)选取体重0.5克的成体雌蛙一只冷冻麻醉，无菌水冲洗后，用75％的酒精棉球擦拭皮肤；
(3)将蛙置于3.5厘米直径平皿中，解剖；
(4)用剪刀和镊子剪取大腿肌，切为约30-40mm3大小的肌肉块，放入新的3.5厘米直径平皿中，用HBSS平衡盐溶液清洗3次；
(5)用巴斯德管转移清洗好的肌肉块入15mL离心管，吸走残余的HBSS平衡盐溶液，加入1.0mL胶原酶Ⅰ溶液，拧紧离心管盖，27℃消化90分钟，每隔30分钟摇动离心管1次；
(6)用巴斯德管将全部消化液(含未消化固体肌肉组织)转移入一个2mL微量离心管(EP管)中，置入冷冻离心机离心15分钟，离心条件为：离心力500g，温度4℃；
(7)小心吸出上清液并丢弃，加入1.0mL胰蛋白酶溶液，27℃消化15分钟；
(8)将全部消化液(含未消化固体肌肉组织)离心15分钟，离心条件为：离心力500g，温度4℃；
(9)小心吸出上清液并丢弃，然后加入1.0mL细胞完全培养基；
(10)用移液器(配1mL吸头，剪去吸头尖使尖头孔径约为2mm)用力缓慢吹打肌肉组织碎片约25次，直到组织块能容易通过吸头，静置5分钟；
(11)放置一个100μm孔径细胞过滤网到50mL离心管上，将约3/4体积上清液转移到过滤网，轻拍管壁直到上清液基本通过滤网；
(12)用移液器(配1mL吸头)缓慢反复吹打剩余1/4体积肌肉组织碎片约15次，直到组织块能容易通过吸头；
(13)将剩余1/4体积肌肉组织悬液全部转移到100μm孔径细胞过滤网(见11)，轻拍管壁直到悬液基本通过滤网；
(14)放置一个40μm孔径细胞过滤网到50mL离心管上，将滤液(见11，13)转移到过滤网，轻拍管壁直到悬液基本通过滤网；
(15)为回收更多细胞，额外加入1.0mL细胞完全培养基到40μm孔径细胞过滤网(见14)，轻拍管壁直到细胞完全培养基通过滤网；
(16)将(14)(15)步得到的总共2.0mL细胞悬液分装到24孔细胞培养板(TC处理)的孔中，每孔1.0mL；
(17)将细胞培养板置于霉菌培养箱内,27℃恒温培养，霉菌培养箱底部内放入一盆5％的硫酸铜溶液以维持箱内湿度；
(18)每隔4天轻轻吹打一次培养基并吸出丢弃，然后换入等体积新的细胞完全培养基。
实施例4饰纹姬蛙骨骼肌细胞的生物学特性观察和测定
(1)形态特征：倒置相差显微镜下观察，该细胞为贴壁生长，培养第2天大多为球形，略有凸起，约为15-35μm，个别伸长，散在分布，(图1，箭头处)；培养第4天有增殖，呈长梭形，三角形，长约50-200μm，宽约3-25μm(图2)；培养第6天细胞明显生长增殖，呈长梭形并交联，长约100-200μm，宽约3-30μm(图3)。
(2)qPCR鉴定：用骨骼肌发育标记基因myoG设计引物，用该引物对饰纹姬蛙肺细胞、肾细胞和本发明骨骼肌细胞分别进行qPCR。myoG基因在这三种细胞的相对表达量进行Welch方差分析，结果表明本发明骨骼肌细胞、肺细胞和肾细胞中myoG的表达差异极显著(p＝0.020)；两两比较(Games-Howell test)，骨骼肌细胞中myoG的表达量显著大于肺细胞(p＝0.038)和肾细胞(p＝0.038)，而肺细胞和肾细胞中myoG的表达量无差异(p＝0.130)(图4)。以上分析表明本发明细胞的确来源于骨骼肌组织，而非其他组织的污染。
(3)细胞免疫荧光鉴定：一抗分别为小鼠单克隆抗体anti-Alpha SkeletalMuscle Actin(Abcam Cat.No.ab28052)和anti-Desmin(Abcam Cat.No.ab8976)，二抗为山羊多克隆抗体抗小鼠IgG H&L(Alexa488)(Abcam Cat.No.ab 150113)。抗体染色后，再用DAPI对所有细胞核进行染色。在荧光显微镜下观察，可见anti-Alpha SkeletalMuscle Actin(图5)或anti-Desmin(图6)标记肌肉细胞的细胞浆抗原发绿色荧光，DAPI标记的细胞核发蓝色荧光(图5-6)，表达阳性细胞占总细胞数的比例，即细胞纯度平均达95％以上。以上分析表明本发明细胞为肌肉细胞性质。
(4)结合(2)(3)得出结论：本发明细胞为饰纹姬蛙骨骼肌细胞。
(5)细胞的生长：第2天到第4天缓慢生长，第4天到第6天增殖旺盛，处于对数生长期，第7天急剧死亡，处于衰退期(图7)。

Claims (6)

1.一种饰纹姬蛙骨骼肌细胞的原代培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)配制溶液；
(2)选取体重0.5-2.0克的成蛙冷冻麻醉，用75％酒精表面消毒；
(3)将蛙置于平皿中，解剖；
(4)剪取腿肌入新培养皿，用HBSS平衡盐溶液清洗3次；
(5)转移清洗好的腿肌入离心管，吸走残余的HBSS平衡盐溶液，加入1.0-1.5mL胶原酶Ⅰ溶液，27℃消化90分钟；
(6)将全部消化液(含未消化固体肌肉组织)离心7-15分钟，离心条件为：离心力500-800g，温度4-6℃；
(7)小心吸出上清液并丢弃，加入1.0-1.5mL胰蛋白酶溶液，27℃消化15分钟；
(8)将全部消化液(含未消化固体肌肉组织)离心7-15分钟，离心条件为：离心力500-800g，温度4-6℃；
(9)小心吸出上清液并丢弃，然后加入1.0mL细胞完全培养基；
(10)用移液器(配1mL吸头，剪去吸头尖使尖头孔径约为2mm)用力缓慢吹打肌肉组织碎片，直到组织块能容易通过吸头，静置5分钟；
(11)将约3/4体积上清液用100μm孔径细胞过滤网过滤；
(12)用移液器(配1mL吸头)缓慢反复吹打剩余1/4体积肌肉组织碎片，直到组织块能容易通过吸头；
(13)将剩余1/4体积肌肉组织悬液全部转移到100μm孔径细胞过滤网(见11)过滤；
(14)滤液(见11，13)用40μm孔径细胞过滤网再过滤一次；
(15)再加入1.0-4.0mL细胞完全培养基入40μm孔径细胞过滤网(见14)过滤；
(16)将(14)(15)步得到的细胞悬液转移到细胞培养板中；
(17)将细胞培养板置于培养箱内,27℃恒温培养；
(18)每隔3-4天换细胞完全培养基。
整个操作过程在无菌条件下进行，所有耗材、试剂均要求无菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的HBSS平衡盐溶液浓度为标准HBSS平衡盐溶液的70％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的胶原酶Ⅰ溶液含胶原酶Ⅰ浓度为0.25％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的胰蛋白酶溶液含胰蛋白酶浓度为0.175％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞完全培养基为Leibovitz L-15培养基、胎牛血清、Primocin和Y27632的混合物，pH值7.0-7.4。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的细胞完全培养基中各成分含量为：标准Leibovitz L-15培养基60％，胎牛血清10％，纯水30％以及100μg/ml Primocin和10μMY27632。
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