CN107156107A - 一种包含rhMG53的人脐带间充质干细胞低温保护剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种包含rhMG53的人脐带间充质干细胞低温保护剂，该保护剂由DMEM/F12培养基、FBS、DMSO和rhMG53配制而成，首先将DMEM/F12培养基、FBS和DMSO按体积比5:4:1配制成混合液；然后在该混合液中按30μg/mL之比例添加rhMG53，混合均匀后即得到人脐带间充质干细胞低温保护剂成品。与现有的间充质干细胞冻存保护剂相比，本发明保护剂成份明确，稳定性好，安全性高。用于冻存hUC‑MSCs时，不影响其核型和干性，且能促进干细胞的增殖、提高其存活率和成脂、成骨、成神经分化效率。采用本发明配制的保护剂在冻存过程中配合使用异丙醇冻存盒，操作简单，保存方便且成本低。试验证明，采用本发明保存的细胞移植治疗TBI小鼠，能发挥较好的治疗效果，为hUC‑MSCs的临床应用提供了可靠的保证。

Description

一种包含rhMG53的人脐带间充质干细胞低温保护剂

技术领域

本发明涉及干细胞低温冷冻保存，尤其是涉及一种包含rhMG53的人脐带间充质干细胞低温保护剂。

背景技术

人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）具有获取简单和易于培养等优点，作为候选的细胞治疗产品要优于胚胎干细胞或诱导多能干细胞。无论是基础研究还是临床应用（如广泛的退行性疾病和自身免疫疾病等），都需要间充质干细胞具有稳定的功能和充足的供应量。而细胞的低温冷冻保存优势明显且技术成熟，是目前最常用的细胞存储方式。

在低温冷冻过程中，细胞内外环境中冰晶的形成会导致细胞膜的破损，从而造成细胞死亡。这一过程是决定细胞冻存能否成功的关键，而添加合适的低温保护剂是解决冷冻和解冻过程中造成细胞膜损伤的最有效的方式。

传统的细胞冻存液配方主要成分为DMSO，但DMSO具有细胞毒性，特别是胚胎干细胞的冻存复苏率受处理过程及冻存保护剂的影响较大，由于处理方式不同，其冻存复苏率从0.4-5%不等，而干细胞多能性特异标志物Oct4在细胞复苏后则会出现不同程度的缺失。神经干细胞、胚胎干细胞、肿瘤干细胞等需悬浮培养的干细胞则易造成冻存后部分干细胞特异活性标志物的弱化甚至缺失。近期研究发现，将诱导多能干细胞（iPSC）冻存在10%的DMSO中，会导致解冻后多能性的标志物Oct4的表达几乎完全丧失。胎牛血清（FBS）能为细胞冻存过程中提供蛋白质、脂肪和胆固醇等，且能提高冻存效果，作为补充或用于冷冻保存的基础培养基已被广泛使用，但由于其潜在的生物安全性和对受体传播病原体等问题，使用量也不宜过高。此外，海藻糖（Trehalose）是一种天然存在的非还原性二糖，作为非渗透性的低温保护剂，其生物安全性较高，但由于是大分子物质，不能穿透细胞膜，不能有效防止细胞内冰晶的形成，冻存后细胞存活率一般较低。现阶段，国内间充质干细胞冻存保护剂还未有标准化的配方，复苏后的效果也难以控制，国外进口干细胞相关冻存试剂价格昂贵，无法大规模推广于科研应用。因此亟待研发一种具有我国自主产权的高效冻存试剂，亟待开发出标准化的干细胞冻存模式。

MG53蛋白是近年发现的肌肉特异性表达的tripartite motif family (TRIM)蛋白，该家族蛋白常含三个特定模序结构，分别被称为RING指，B-BOX和卷曲结构域，它们共同作用结合在细胞特定蛋白上，进行泛素化降解，是一种重要的细胞膜修复机制。虽然天然的MG53蛋白主要局限于骨骼肌和心肌组织，但新近发现其在多种非肌肉细胞中过表达MG53也具有降低细胞损伤，减少凋亡发生的作用。基因重组的人源MG53蛋白（rhMG53）能定位于损伤部位，对机械外力、化学物质或紫外线等造成的肌肉和非肌肉细胞的损伤，都表现出剂量依赖性的保护作用，生物安全性好。然而，有关MG53在干细胞冻存损伤中的修复作用尚未见研究报道。

发明内容

本发明针对干细胞低温冷冻保存过程中造成的膜损伤和低存活率等问题，提供一种包含rhMG53的人脐带间充质干细胞低温保护剂，该低温保护剂中的rhMG53具有修复膜损伤的功效，可对冻存复苏过程中的膜损伤发挥保护和修复的作用。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的包含rhMG53的人脐带间充质干细胞低温保护剂，所述保护剂由DMEM/F12培养基、FBS、DMSO和rhMG53配制而成，首先将所述DMEM/F12培养基、FBS和DMSO按体积比5:4:1配制成混合液；然后在该混合液中按30μg/mL之比例添加rhMG53，混合均匀后即得到人脐带间充质干细胞低温保护剂成品，即hUC-MSCs低温保护剂。

本发明配制的hUC-MSCs低温保护液中主要成分的特征为：

1）rhMG53：由于Mitsugumin53（MG53）蛋白是一种骨骼肌和心肌特异表达的Tripartitemotif （TRIM）家族蛋白，该家族蛋白常含三个特定结构：RING指，B-BOX和卷曲结构域，它们共同作用结合在细胞特定蛋白上，进行泛素化降解，是一种重要的细胞膜修复机制。

2）DMSO（Dimethyl sulfoxide，二甲基亚砜）：具有高极性、高沸点、热稳定性好、与水混溶的特性，能溶于乙醇、丙醇等大多数有机物，被誉为“万能溶剂”。

3）DMEM/F12培养基（Dulbecco's modified Eagle medium/F12）：是hUC-MSCs的基础培养基，为干细胞的冻存提供等渗的电解质。

4）FBS（Fatal bovine serum，胎牛血清）：能为细胞冻存过程中提供蛋白质、脂肪和胆固醇等，可提高细胞的冻存效果。

与现有的间充质干细胞冻存保护剂相比，本发明配制的保护剂成份明确，稳定性好，安全性高。用于冻存hUC-MSCs时，不影响其核型和干性，且能促进干细胞的增殖、提高其存活率和成脂、成骨、成神经分化效率。采用本发明配制的保护剂在冻存过程中均采用程序化慢速冷冻法对细胞进行冷冻保存，操作简单，保存方便且成本减低。试验证明，采用本发明保存的细胞移植治疗TBI小鼠，能发挥较好的治疗效果，为hUC-MSCs的临床应用提供了可靠的保证。

附图说明

图1是hUC-MSCs表面抗原鉴定的流式图。

图2是rhMG53作用于hUC-MSCs的最适浓度和最优冻存方式。

图3 是本发明保护剂对复苏后hUC-MSCs干性基因的表达情况。

图4 是不同冻存方案对复苏后hUC-MSCs的核型变化的影响。

图5是本发明保护剂对hUC-MSCs存活率的影响。

图6 是不同冻存方案对复苏后hUC-MSCs的成脂分化的影响。

图7是不同冻存方案对复苏后hUC-MSCs的成骨分化的影响。

图8是不同冻存方案对复苏后hUC-MSCs的成神经分化的影响。

图9是采用本发明冻存保护液低温保存复苏后的hUC-MSCs对TBI模型小鼠体重和mNSS得分的影响。

图10是采用本发明冻存保护液低温保存复苏后的hUC-MSCs对TBI模型小鼠抑郁情况和认知功能恢复情况的影响。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明。

本实施例采用的冻存方法为程序化慢速冷冻法，实验方法中，若无特别说明，均为常规方法。实验所用器具、仪器、试剂均可通过商业途径获得。

一、配制本发明所述的包含rhMG53的人脐带间充质干细胞低温保护剂：该保护剂中包含DMEM/F12培养基（HyClone, 货号：SH30023.01B）、FBS（GIBCO，货号：10270106）、DMSO（Amresco，货号0231）和rhMG53（Novoprotein，货号：MG53-A-5，由美国俄亥俄州立大学麻建杰教授提供）四种组分；

首先将DMEM/F12培养基、FBS和DMSO按体积比5:4:1配制成混合液（称为冻存液A）；然后在该混合液中按30μg/mL之比例添加rhMG53，混合均匀后即得到hUC-MSCs低温保护剂（称为冻存液B）；也就是说，在1mL 本发明配制的低温保护剂成品（B液）中，含0.5mL DMEM/F12培养基、0.4mL FBS、0.1mL DMSO和30μg rhMG53。

二、采用上述配制的A液和B液冻存人脐带间充质干细胞，步骤如下：

1、hUC-MSC的分离、培养和鉴定

脐带的获取：实验室的脐带标本从郑州大学第一附属医院获取，且脐带均在无菌条件下取自于健康的剖宫产新生儿，家属知情并同意。

沃顿胶组织的剥离与培养：在超净工作台中，取出新鲜的脐带标本，放置于无菌的培养皿中，用预冷的PBS缓冲液将脐带组织冲洗干净，使用提前准备好的无菌皮钳、剪刀和镊子剥离组织块外膜，剔除2根动脉和1根静脉血管，获取沃顿胶组织；将沃顿胶组织用PBS缓冲液清洗干净后，用无菌剪刀将其剪碎并均匀涂布于25cm²培养瓶瓶底（密度约为0.2g/瓶），静置5min，待组织块完全粘附于瓶底时，向培养瓶中加入3mL干细胞完全培养基。然后，将细胞培养瓶转移至CO₂细胞培养箱（37℃、5％CO₂浓度）中培养。

hUC-MSCs的原代和传代培养：组织块培养4d后，观察组织块贴壁情况，如果贴壁较牢，则更换新鲜培养基继续培养，否则等1周后再更换新鲜培养基。经过10d左右的组织块培养，通过显微镜观察到呈长梭状的贴壁细胞从组织块中“爬”出，此时的细胞为原代细胞，随后每2~3d更换一次培养基。组织块培养2周左右时，在显微镜下可观察到干细胞在瓶底的密度已经较高（80~90％），此时，用一次性无菌吸管将培养瓶中的组织块移除，PBS缓慢清洗培养瓶底部；然后，加入1mL胰蛋白酶，在37℃条件下消化2~3min，显微镜下观察细胞回缩变圆后加入等体积的FBS终止消化；随后，用移液枪将细胞悬液在瓶底缓慢吹打几次，待贴壁细胞完全散落在悬浮液中，将悬浮液移入15mL离心管，1000g离心5min后去上清；将沉淀的细胞用2mL完全培养基重悬，分装到2个培养瓶中，补充完全培养基至5mL于培养箱中培养，此时的细胞标记为P1代。

hUC-MSCs的冻存：将P1代的细胞，传代培养为P2代细胞后，待细胞融合度达到90％左右时，胰蛋白酶消化离心并收集细胞，将细胞均分成2组，分别加入冻存液A和B，重浮并调整细胞密度为1×10⁶个/mL，分装到2mL冻存管中，每管加1ml细胞悬液，做好标记并贴上封口膜，放入提前置于4℃的细胞冻存盒中，将冻存盒转移到-80℃冰箱，过夜储存后将冻存管移入液氮罐中长期储存。

hUC-MSCs的复苏：将冻存于液氮中的P2代干细胞取出后迅速置于37℃水浴锅中，1min左右便可融化；在超净工作台中，将融化后的干细胞悬液转移至15mL离心管中，1000g离心5min；收集沉淀，用1mL干细胞完全培养基重悬并加入25cm²细胞培养瓶中，补加培养基至5mL，并将细胞悬液混合均匀后移入CO₂细胞培养箱（37℃、5％CO₂浓度）中培养。复苏后，第二天给细胞更换新鲜培养基并定期观察细胞状态。

hUC-MSCs的表面抗原鉴定：将上述复苏后的P2代细胞，经传代培养后，取生长状态良好的P3代hUC-MSCs（后续所有试验细胞均使用P3代hUC-MSCs），加入不含EDTA的胰蛋白酶消化、离心并收集细胞，然后用预冷的PBS冲洗细胞2~3次，PBS重悬细胞并调整其密度为1×10⁶ 个/mL。取100μL 细胞悬液，分别加2μL CD34-FITC、CD45-FITC、CD44-FITC、CD133-FITC和HLA-ABC-FITC抗体及相应的对照抗体，混匀后 4℃孵育30min，然后离心弃上清，并加入0.5mL的 PBS 重悬细胞，流式细胞仪检测上述细胞表面抗原的表达。

图1为使用流式细胞仪检测hUC-MSCs的表面标志物，结果显示，hUC-MSCs不表达造血系细胞表面标志CD34、CD45，高表达***标志CD44、干细胞标志CD133，同时表达人白细胞抗原 HLA-ABC，符合间充质干细胞特性。

2、CCK-8确立最佳低温保护剂组分和最优的冻存方式

最佳保护剂组分的确立：本实验以hUC-MSCs为研究对象，设置的浓度梯度为：0μg/mL（NC）、15μg/mL、30μg/mL、60μg/mL。取生长状态良好的P3代hUC-MSCs细胞，调整细胞密度为：3×10⁴个/mL，均匀接种于96孔板中，每孔加入100μL细胞悬液，培养箱中培养并观察细胞贴壁生长状况，待细胞融合度达到50%时，吸去孔板里的培养液，分别加入含不同浓度rhMG53的新鲜培养基，且每组设置三个复孔，在37℃、5%CO₂浓度下培养，分别在12h、24h、36h、48h、60h、72h时间点，去除旧培养基，每孔加入90μL新鲜培养基和10μLCCK-8，在37℃条件下孵育2h，使用酶标仪检测各处理细胞组的OD450值。重复3次，并绘制细胞生长曲线。

图2（A）为采用CCK-8法检测rhMG53作用于hUC-MSCs的最适浓度，结果发现，随着rhMG53浓度的提高，细胞增殖能力均得到提升，与正常培养组细胞相比，rhMG53浓度大于30μg/ml时对细胞增殖的促进效果明显。综合考虑rhMG53作用于细胞的量效关系，结合文献报道，可以确定rhMG53作用于细胞冻存过程中的最适浓度为：30μg/mL（细胞密度为1×10⁶个/mL）。

最优冻存方式的确立：实验分组情况为正常培养组（Fresh）、常规冻存组(NC) 、冻存复苏均添加rhMG53 (Whole+rhMG53) 、复苏时添加rhMG53 (Post+rhMG53) 、冻存时添加rhMG53 (Pro+rhMG53)。将上述处理过的细胞均匀接种于96孔板（每孔3000个细胞），细胞培养箱中培养，分别在12h、24h、36h、48h、60h、72h时间点去除旧培养基，操作和检测方法同上，绘制细胞生长曲线。

图2（B）为采用CCK-8法检测的rhMG53作用于hUC-MSCs的最优冻存方式，根据结果显示，综合考虑保护剂的成本和简化操作流程，冻存时添加30μg/mL rhMG53（即Pro+rhMG53）可为最优的添加方式。即采用细胞冻存方式时按本发明配制的低温保护剂（B液）为冻前需要添加的保护剂。

3、荧光定量PCR检测冻存复苏后hUC-MSCs干性基因的表达

3.1细胞总RNA的提取：

（1）离心收集细胞，加入500μL RL Solution，用枪头反复吹打细胞直至全部细胞溶解，吸取全部裂解液于1.5mL离心管中；

（2）加入40μL氯仿，充分混匀，12000rpm离心3min；

（3）吸取上清200~300μL于新的1.5mL离心管中，加入等体积无水乙醇，混匀；

（4）将混匀液吸入Spin column管中，12000rpm离心1min，弃上清；

（5）加入600μLWash Buffer，12000rpm离心1min，弃滤液；

（6）重复步骤（5）；

（7）Spin column管，12000rpm空转1min，彻底去除废液；然后将其放入新的无RNA酶的1.5mL离心管中；

（8）无酶枪头吸入50μLRNas free water，室温放置1~2min后，12000rpm离心1min，收集滤液，获得总RNA，并测量其浓度。

3.2总RNA逆转录成cDNA

按TaKaRa反转录试剂盒说明书，每组均取500ngRNA进行逆转录，操作如下：

（1）去除组DNA

将此反应体系置于42℃保持2min或（室温下5min），以去除组DNA。

（2）RNA逆转录合成cDNA

将此反应体系放入普通PCR仪中，设置反应条件为：“37℃ 15min，85℃ 5s”。反应结束后，收集cDNA。

3.3 qRT-PCR检测相关基因的表达

定量PCR反应体系如下：

每个样品设置3个复孔，使用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR仪，按“95℃30s,（95℃ 5s，60℃ 34s）40个循环”进行检测。PCR结束后，导出CT值，采用比较CT法(ΔΔCT)，根据公式：相对表达量(RQ)=2-ΔΔCT，计算出各个基因的相对表达量，重复3次并进行数据分析，制作柱状图。

干性相关基因的引物如下表：

图3是冻存对hUC-MSCs干性基因表达的影响，结果显示，常规冻存和添加rhMG53冻存干细胞，对干细胞的干性基因的表达均无显著影响。

4、染色体核型分析检测rhMG53 对冻存复苏hUC-MSCs核型的影响

将实验细胞分为三组：正常培养组、加本申请配制的冻存液A组和冻存液B组。核型检测实验步骤如下：

（1）取状态良好且处于对数生长期的P3代hUC-MSCs细胞，消化涂片，制成细胞标本，放入染色缸，用Geimsa染色液染色10-15分钟；染色结束后，将细胞标本在盛水塑料杯中洗涮几次，吹风机风干玻片，镜检。

（2）显微摄影：将制好的片子放在数码摄影显微镜下进行拍摄，以供分析。

（3）核型分析

核型：将一个细胞内所有染色体按一定顺序排列起来，代表着某一个体所有细胞的染色体组成，包括形态、大小、数目等，分为A、B、C、D、E、F、G等七组和一组性染色体。

组型：把核型按模式图的形式表现出来，代表一个个体的染色体组成。

（4）完成染色体组型分析。

图4是对冻存后hUC-MSCs核型的检测，三组细胞的染色体条数、形态和结构均正常且无畸变，冻存过程对常规冻存保护剂和rhMG53对hUC-MSC的核型无影响，说明rhMG53对干细胞安全、无毒。

5、台盼蓝染色检测本发明配制的冻存液A和冻存液B对hUC-MSCs存活率的影响

实验细胞分为三组：正常培养组、加本申请配制的冻存液A组和冻存液B组，对不同冻存时间（1个月、6个月和1年）进行检测。

正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡，因此，借助台盼蓝染色可以非常简便、快速地区分活细胞和死细胞。实验步骤如下：

（1）不同组的细胞、不同冻存时间，从液氮中取出后复苏，培养6个小时，待细胞状态稳定后，胰蛋白酶消化细胞，搜集所有细胞制备单细胞悬液，并作适当稀释。

（2）染色：将细胞悬液与 0.4%台盼蓝溶液以 9:1 混合混匀，轻轻吹打混匀，3~5min后滴板计数进行细胞染色。

（3）镜下观察并计数：吸取适量加有台盼蓝染色液的细胞悬液，滴加细胞计数板计数，死细胞被染成明砧的蓝色，而活细胞呈无色透明状。

（4）统计细胞存活率：活细胞率 (%)= 活细胞总数/ (活细胞总数+死细胞总数）×l00%

台盼蓝检测两种冻存液（本发明配制的保护剂为B组，不含rhMG53的混合液为A组）对hUC-MSCs存活率的影响如图5所示，结果发现，本发明配制的冻存液B组的细胞存活率较高，说明rhMG53作为hUC-MSCs的低温保护剂特殊组分，能提高干细胞的存活率。

6、油红O染色及qRT-PCR检测冻存复苏后hUC-MSCs成脂分化情况

成脂诱导分化：将冻存的两组细胞复苏和一组正常培养的细胞（3组细胞来源相同、代数相同）经传代培养后，更换成脂诱导培养基，每隔3d更换一次新鲜培养基，诱导分化14d左右观察细胞形态并进行油红O染色和RNA的提取。

Oil Red O染色：油红O是一种很强的脂溶剂和脂染剂，较易与甘油三酯结合呈小脂滴状，与磷脂结合力稍差，其染色原理一般认为是物理上的溶液作用或吸附作用，借溶液作用使脂肪染色。染料在细胞内脂质的溶解度较原溶剂中的溶解度更大，所以在染色时染料就从有机溶剂转移入脂质而使脂肪染色。因脂质浓度不同，脂肪阳性染色结果为橙黄至红色。实验步骤如下：

取诱导分化14d的干细胞消化离心并用PBS清洗后，调整细胞密度，各组取相同的细胞制备细胞涂片，其余的细胞提取RNA并进行后续实验。将制备好的细胞涂片在4％的多聚甲醛溶液中固定30min；然后，用PBS清洗两次，加入0.5％的油红O染色液，染色20min；放入60％异丙醇溶液中漂洗20~30s，流水冲洗，晾干封片并显微镜观察。

成脂分化相关基因的表达：（实验方法及步骤同3：荧光定量PCR检测冻存复苏后hUC-MSCs干性基因的表达）。成脂分化相关基因的引物序列如下表：

油红O染色和qRT-PCR结果如图6所示，成脂诱导分化14天后，进行油红 O 染色，可见各组细胞均含有被染为红色较标准的脂滴，成脂分化成功。且由冻存液B冻存的细胞阳性率染色较高，且成脂分化相关基因（FABP4、LPL、PPAR-γ）的表达有显著提升。

7、茜素红S染色及qRT-PCR检测冻存复苏后hUC-MSCs成骨分化情况

成骨诱导分化：将冻存的两组细胞复苏和一组正常培养的细胞（3组细胞来源相同、代数相同）经传代培养后，更换成骨诱导培养基，每隔3d更换一次新鲜培养基，诱导分化21d左右观察细胞形态并进行茜素红S染色和RNA的提取。

茜素红S染色：茜素红S是一种蒽醌类化合物，茜素磺酸钠盐，它能与碳酸钙或磷酸钙中的钙盐鳌合形成橙红色复合物，适用于少量钙盐组织的染色。染色步骤如下：

干细胞成骨诱导分化21天后，消化离心并用PBS清洗，适当稀释并调整细胞密度，取相同数量的细胞制备细胞涂片，其余细胞提取总RNA。将制备好的细胞涂片在4％的多聚甲醛溶液中固定30min；然后，用PBS清洗两次，加入1％茜素红S染色液（PH=8.3），染色10min后；用PBS冲洗3次，晾干后封片，显微镜观察并拍照。

成骨分化相关基因的表达：（实验方法及步骤同3：荧光定量PCR检测冻存复苏后hUC-MSCs干性基因的表达）。成骨分化相关基因的引物序列如下表：

茜素红S染色和qRT-PCR结果如图7所示 ，成骨诱导分化21天经茜素红S染色后，均可见大量钙质结节被着色，说明成骨分化成功。且由冻存液B冻存的细胞阳性率染色较高，且成骨分化相关基因（ALPL、OSX、RUNX2）的表达显著提升。

8、免疫荧光检测冻存复苏后hUC-MSCs成神经分化情况

成神经分化：将冻存的两组细胞复苏和一组正常培养的细胞（3组细胞来源相同、代数相同）经传代培养后，待细胞融合度达60％左右时，更换含20％FBS的DMEM低糖培养基处理24h；更换含10ng/mL bFGF的DMEM低糖培养基处理24h；随后，更换神经分化诱导培养基（DMEM低糖培养基，2％DMSO，100μM BHA，25mM KCl，10μM forskolin，5μg/ml胰岛素，1μM氢化可的松），诱导分化24h；更换神经分化维持诱导培养基(DMEM/F12完全培养基，10％FBS，10ng/ml EGF，10ng/ml bFGF，1×N2，1×B27），维持3-4d。分化完成的细胞一部分做免疫荧光，另一部分提取全RNA做荧光定量PCR。

免疫荧光检测成神经分化相关DCX、NSE、Neun和β-ⅢTubulin的表达：将分化完成的各组干细胞，消化离心并收集细胞，计数并用神经分化维持诱导培养基调整细胞密度为：5×105 个/mL，按每孔0.5mL细胞悬液均匀铺到24孔板底部，混匀并做好标记后，放入细胞培养箱中培养24h。免疫荧光检测，其步骤如下：

（1）吸去24孔板中的培养基，用PBST清洗细胞3次，加4％的多聚甲醛固定30min；

（2）吸除固定液，PBST清洗3，加入含0.05％Triton100的枸橼酸缓冲液(PH6.0)中，水浴锅中煮沸20min；

（3）自然冷却至室温后，使用PBS清洗3次，每孔滴加0.2mL的封闭液（含3％脱脂奶粉、5％山羊血清的TBST溶液）封闭1h；

（4）吸去封闭液，每孔加入0.2mL适当比例稀释的一抗(DCX、NSE、Neun和β-ⅢTubulin均按1：50稀释)，4℃孵育过夜；

（5）吸去一抗，用PBST清洗4次，每次5min。避光条件下，每孔滴加0.2mL相应的荧光二抗（稀释比例为：1:1000），孵育1h；

（6）吸去二抗，PBST清洗4次，每次5min。避光，每孔滴加0.2mL的DAPI溶液（稀释比例为1:2000）复染细胞核15min；

（7）吸去DAPI溶液，PBST清洗4次，每次5min，荧光显微镜观察并拍照。

两种冻存液冻存的干细胞成神经分化情况如图8，hUC-MSCs经过一周左右的成神经分化诱导后，细胞形态改变明显，由原来的长梭型变成多突触的神经样细胞形态，免疫荧染色和阳性细胞数统计结果（图8）显示：由冻存液B冻存的细胞神经分化相关DCX、NeuN和β-ⅢTubulin的表达和阳性细胞数增加明显，成神经分化效率更高。

9、低温保存后的hUC-MSCs对TBI小鼠体重变化和mNSS得分情况的影响

9.1脑损伤模型的建立

本实验采用自由落体打击法建立C57BL/6小鼠创伤新脑损伤模型。用10％水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射小鼠，待其麻醉后，于颅顶部备皮，碘伏消毒后，将小鼠固定于脑立体定位仪，从失状缝正中切开头皮3~5cm，暴露颅骨外筋膜，用棉棒尾端分离筋膜，显露出右侧颅骨，于前囟后约1.5mm、中线旁侧1.5mm，用环形钻小心钻开3mm骨窗，保证硬脑膜完整。然后，调整颅脑打击器，使撞针（直径2.5mm）正对骨窗中心，控制打击深度为2mm，将20g的砝码从20cm处垂直打击撞针，随后迅速提起撞针，造模完成。造模成功标准为：打击后，小鼠一过性四肢抽搐，呼吸暂停，但数秒后可自行缓解。术后止血，并用骨蜡闭合骨窗，缝合头皮。手术过程和术后应给予小鼠保温处理，保持肛温37±0.5℃，直至小鼠清醒。

9.2动物动物及分组

清洁级雄性C57BL/6小鼠，10~12周，体重23g~25g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，适应环境1周后，按[0059]的方法开始造模。将造模成功的12只C57BL/6小鼠随机分为TBI组（6只，术后6小时，尾静脉注射0.9％的生理盐水0.1ml）； TBI+hUC-MSCs组（6只，术后6小时后，尾静脉注射冻存液B冻存的细胞0.1mL，细胞密度为：1×10⁷个/mL）。每天1次，连续注射3天。术中、术后如果发现动物死亡，立即给予补充，确保每组实验小鼠6只。

在术后0、1、3、7、14、21和28天的固定时间称量小鼠体重变化并随后进行神经功能缺损评分（Modified Neurological Severity Score，mNSS评分），期间按时补充食物和水、定期更换垫料。根据mNSS评分量表，采用双盲法评判并记录分值。mNSS评分标准是从小鼠运动、感觉、平衡能力以及反射情况等方面进行评估：从0分（正常）-18分（最严重）。

两组小鼠术后体重变化情况如（图9A）所示。TBI造模后，小鼠体重在术后1天，3天略有减轻，从7天开始体重增加。比较不同时间点体重可发现，两组小鼠在术后1天，3天，7天，体重无明显变化。14天后，hUC-MSCs治疗组小鼠体重明显高于TBI组。

图9B是两组小鼠mNSS得分情况。术后1天，TBI组和TBI+hUC-MSCs组小鼠评分分别为（11.3±0.8）和（11.5±0.9）分，说明建模均一性较好，术后3天，TBI组小鼠评分略有上升。14天后，hUC-MSCs治疗组小鼠mNSS得分明显低于TBI组。说明冻存液B冻存的TBI+hUC-MSCs能增加TBI小鼠的体重，降低TBI小鼠的神经受损程度。

10、低温保存后的hUC-MSCs对TBI小鼠抑郁情况、认知功能恢复情况的影响

强迫游泳实验：TBI后28天，两组各选6只小鼠，做如下实验：在一个圆柱形的水容器中，放入清水（高度：25cm，直径：22cm，水温：23±1℃）。将小鼠放入水中，因小鼠怕水，将会不停游动，用摄像机记录6分钟。在电脑上分析后4分钟视频，记录小鼠游泳时间，漂浮或仅有一肢体微动不计入游泳时间。应用公式得到悬浮时间：悬浮时间（秒）=240秒-游泳时间。

糖水偏好实验：TBI后21天进行实验，持续一周。操作步骤见Zhu等报道[48]。术后21天，配制浓度为1%的蔗糖溶液，并倒入饮水瓶中。每只待测小鼠单独放入一个鼠笼，每个鼠笼放置2个饮水瓶，让小鼠适应糖水3天。脑外伤第24天，用含蒸馏水的饮水瓶更换掉其中一个糖水瓶，并做好标记。用天平称量2瓶重量重，并贴上标签标明重量。脑外伤第28天，再次称量2水瓶重量，并计算糖水和纯水的消耗量，利用公式计算两组小鼠蔗糖偏嗜度：蔗糖偏嗜度=糖水消耗量/（糖水消耗量+纯水消耗量）×100%。

新事物识别（Novel object recognition，NOR）实验：TBI后27天，将要进行实验的小鼠放置在一个50cm × 50 cm × 25cm不透明箱子中，进行环境适应10分钟。24小时后，将2个相同体积、相同颜色的物体放入箱子中（4cm×4cm×4cm红色立方体），让小鼠探索10分钟后，放入原来的笼子。1小时后，将其中1个红色立方体用绿色的球形物体（直径4cm）代替，再次将小鼠放置到此箱子中，让其探索5分钟，期间应用录像机记录小鼠探索情况。此时红色立方体为旧物体，而绿色球形物体为新物体，在电脑上分析小鼠探索新、旧物体所用时间。计算出小鼠的辨别指数，辨别指数=新物体所用时间/（新物体所用时间+旧物体所用时间）×100%。

图10是比较两组小鼠抑郁情况和认知功能。强迫游泳实验结果显示：干细胞治疗组小鼠悬浮时间（125.25±4.55s）明显低于TBI组（147.45±3.85s）；糖水偏好实验显示：与TBI组小鼠（49.15±2.32％）相比，干细胞移植治疗组小鼠糖水偏好度（56.07±2.98％）有所提高；在新事物识别实验中，干细胞治疗组小鼠的新事物辨别指数（65.16±1.89％）高于TBI（53.86±2.12％）。说明冻存液B冻存的hUC-MSCs能提高脑损伤小鼠的认知功能，减轻脑损伤小鼠的抑郁情况。

Claims (1)

1.一种包含rhMG53的人脐带间充质干细胞低温保护剂，其特征在于：所述保护剂由DMEM/F12培养基、FBS、DMSO和rhMG53配制而成，首先将所述DMEM/F12培养基、FBS和DMSO按体积比5:4:1配制成混合液；然后在该混合液中按30μg/mL之比例添加rhMG53，混合均匀后即得到人脐带间充质干细胞低温保护剂成品。