CN106497872A - 骨骼肌干细胞无血清培养基及其制备方法和应用 - Google Patents

骨骼肌干细胞无血清培养基及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106497872A
CN106497872A CN201611087240.5A CN201611087240A CN106497872A CN 106497872 A CN106497872 A CN 106497872A CN 201611087240 A CN201611087240 A CN 201611087240A CN 106497872 A CN106497872 A CN 106497872A
Authority
CN
China
Prior art keywords
content
skeletal muscle
stem cells
muscle stem
free medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201611087240.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106497872B (zh
Inventor
刘谋元
刘麟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Xin Feng Cmx Medical Technology Development Co Ltd
Original Assignee
Beijing Xin Feng Cmx Medical Technology Development Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Xin Feng Cmx Medical Technology Development Co Ltd filed Critical Beijing Xin Feng Cmx Medical Technology Development Co Ltd
Priority to CN201611087240.5A priority Critical patent/CN106497872B/zh
Publication of CN106497872A publication Critical patent/CN106497872A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106497872B publication Critical patent/CN106497872B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0658—Skeletal muscle cells, e.g. myocytes, myotubes, myoblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0037—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/35—Polyols, e.g. glycerin, inositol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/36—Lipids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C12N2500/92—Medium free of human- or animal-derived components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/90—Polysaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了骨骼肌干细胞无血清培养基及其制备方法和应用。所述培养基包含以下各成分：DMEM：F12、血清替代物、细胞因子、维生素、氨基酸、人重组胰岛素、助壮素和6‑硫酸软骨素；该培养基的pH值为7.2～7.4。本发明进一步公开了制备所述骨骼肌干细胞无血清培养基的方法。本发明血清替代物为无动物源成分，成份确定，避免了血清带来的致病风险，批次不稳定等因素，本发明培养基适用于人骨骼肌干细胞原代及规模化扩增培养，具有纯度高，细胞增殖快，扩增效率高，可稳定传代20代以上等优点。本发明有效提高了骨骼肌干细胞扩增效率及纯度，能够作为规模化的、优质的骨骼肌干细胞培养体系以满足临床研究及应用。

Description

骨骼肌干细胞无血清培养基及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种细胞培养基，尤其涉及一种人骨骼肌干细胞无血清培养基，本发明进一步涉及人骨骼肌干细胞无血清培养基的制备方法以及在培养人骨骼肌干细胞中的应用，属于人骨骼肌干细胞的培养基领域。
背景技术
骨骼肌干细胞(又名成肌细胞，肌母细胞，英文名称：myoblast)只能定向分化为肌肉组织，以骨骼肌卫星细胞的形式存在骨骼肌组织中，具有天然的细胞融合，在肌肉受到损伤后，骨骼肌干细胞被激活，大量增殖并产生收缩蛋白，修复和维持骨骼肌组织。骨骼肌干细胞移植技术在治疗肌萎缩、心脏病、糖尿病、肿瘤、疼痛、抑郁症、骨关节疾病方面近年来被国内外连续报道，骨骼肌干细胞移植技术作为一种新型疾病解决方案越来越受到全世界的关注。Gusso ni等采用双盲对照法治疗8例DMD患者,证明骨骼肌干细胞移植对DMD患者有一定的疗效。目前全球20个国家230例病人的临床研究表明，给心肌梗死患者注射人骨骼肌干细胞后可改善梗死病灶周围局部心肌功能，增加左室射血分数，灌注，生存能力，动力，壁厚，以及舒张末期和收缩末期的血容量，不伴有心律失常。这种治疗手段将可能成为治疗心肌梗死和心力衰竭最重要的新途径。骨骼肌干细胞移植用于治疗II型糖尿病也已经展开。所有以上的这些治疗效果很大程度上依赖细胞移植量，据相关报道，骨骼肌干细胞治疗心脏病，心肌梗塞等心肌病使用的细胞数量为2×109，治疗DMD患者使用的数量为5×1010。所以，探索一种能够高纯度、规模化扩增骨骼肌干细胞并应用于临床的培养体系已迫在眉睫。
目前，大多数研究机构均以DMEM：F12/1:1，α-MEM等基础培养基添加10％-20％的胎牛血清来培养骨骼肌干细胞。但胎牛血清培养基含动物源成分，成分不确定、存在风险且血清的批间差异大、不易于控制，骨骼肌干细胞难以纯化、扩增效率低成为了临床应用上难以逾越的难点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对骨骼干细胞培养基添加胎牛血清，含有动物源成分，导致骨骼肌干细胞难以纯化、扩增效率低等问题，提供了一种优化的骨骼肌干细胞无血清培养基，用于人骨骼肌干细胞原代培养及规模化扩增培养，为临床研究及应用提供优质的骨骼肌干细胞。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种骨骼肌干细胞无血清培养基，包含以下各成分：
DMEM和F12按照1:1的质量比组成的混合物，血清替代物，细胞因子，维生素，氨基酸，人重组胰岛素，转铁蛋白，L-谷氨酸酰胺，盐酸硫胺素，肌醇，尼克酰胺，胆固醇，P68，吐温80，柠檬酸铁铵和NaHCO3；pH值为7.2～7.4。
所述血清替代物为Ultroser G血淸替代物；
所述细胞因子为***，表皮细胞生长因子或碱性成纤维生长因子中的任何一种或多种；
所述的维生素是维生素C、维生素B1或维生素B6中的任何一种或二者的组合。
所述氨基酸为1水L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯基丙氨酸、L-丝氨酸、L-色氨酸、L-半胱氨酸、L-鸟氨酸盐酸或对氨基苯甲酸中的任何一种或多种。
为了达到更好的效果，每升培养基中，各成分的含量为：
DMEM：F12含量为15.6g/L，其中，DMEM：F12的质量比例为1:1；
所述血清替代物含量为20mL/L；
所述维生素B6含量为0.95～1.05mg/L，优选为0.975mg/L；所述维生素B1含量为1.0～1.03mg/L，优选为1.03mg/L；所述维生素C含量为6～6.9mg/L，优选为6.45mg/L；
所述***含量为80～100μg/L，优选为100μg/L；表皮细胞生长因子含量为18～22μg/L，优选为20μg/L；碱性成纤维生长因子含量为18～22μg/L，优选为20μg/L；
所述人重组胰岛素含量为0.01～0.02mg/L，优选为0.02mg/L；
所述1水L-天冬酰胺含量为48.45～53.25mg/L，优选为51.25mg/L；L-天冬氨酸含量为30.35～31.35mg/L，优选为30.75mg/L；L-组氨酸含量为85.12～89.12mg/L，优选为87.12mg/L；L-异亮氨酸含量为38.55～42.13mg/L，优选为41.13mg/L；L-亮氨酸含量为33.55～36.55mg/L，优选为34.55mg/L；L-赖氨酸含量为165.44～172.44mg/L，优选为168.44mg/L；L-蛋氨酸含量为4.9～5.1mg/L，优选为5.0mg/L；L-苯基丙氨酸含量为21～23mg/L，优选为22mg/L；L-丝氨酸含量为38.5～40.35mg/L，优选为39.5mg/L；L-色氨酸含量为12.3～14.46mg/L，优选为13.6mg/L；L-半胱氨酸含量为108.7～115.3mg/L，优选为113.7mg/L；L-鸟氨酸盐酸含量为27.3～30.3mg/L，优选为29.3mg/L、对氨基苯甲酸含量为1.0～1.03mg/L，优选为1.03mg/L；
所述转铁蛋白含量为11.5～12.5mg/L，优选为12.5mg/L；L-谷氨酸酰胺含量为0.2mM；盐酸硫胺素含量为1.0～1.03mg/L，优选为1.03mg/L，肌醇含量为34.5～37.01mg/L，优选为35.51mg/L；尼克酰胺含量为1.0～1.03mg/L，优选为1.03mg/L；胆固醇含量为0.015～0.019mg/L，优选为0.019mg/L；普朗尼克F68含量为97～100mg/L，优选为98mg/L；吐温80含量为5.1～5.4mg/L，优选为5.25mg/L；柠檬酸铁铵含量为179.1～186.6mg/L，优选为181.6mg/L；NaHCO3含量为1.2g/L。
本发明发现，在上述培养基中添加6-硫酸软骨素时对骨骼肌干细胞的增殖活性均有一定的促进作用；优选的，6-硫酸软骨素的添加量为50-500mg/L，其中，6-硫酸软骨素的添加量为200μg/ml附近，骨骼肌干细胞增殖活性达到最优。
本发明进一步发现，向上述骨骼肌干细胞无血清培养基中添加一定用量的助壮素(N,N-二甲基哌啶氯化物)能够有效促进骨骼肌干细胞的生长，其中，助壮素的添加量为8.7～10.7mg/L时能够明显促进骨骼肌干细胞的生长，助壮素的添加量为9.0mg/L时能够显著促进骨骼肌干细胞的生长，骨骼肌干细胞增殖活性达到最高，大于此浓度时，骨骼肌干细胞增殖活性呈现平稳趋势，表明9.0mg/L的浓度为最佳添加剂量。
本发明中的μg/L、mg/L和g/L均为基于每升培养基所述成分的重量，mL/L是基于每升培养基所述成分的体积，mM是基于每升培养基所述成分的摩尔数。
本发明进一步提供了一种制备人骨骼肌干细胞无血清培养基的方法，该培养基由以下步骤制得：
(1)将DMEM:F12(1:1)的干粉溶解在注射用水中得到基础培养基；
(2)将其余的各它成分加入到基础培养基中，搅拌至完全溶解；
(3)调节pH值至7.2～7.4，Osmo检测范围290-320mOsm/kg；
(4)用0.22μm滤膜过滤除菌，即得。
本发明骨骼肌干细胞无血清培养基中的血清替代物为无动物源成分，成份确定，避免了血清带来的致病风险，批次不稳定等因素；本发明骨骼肌干细胞无血清培养基适用于人骨骼肌干细胞原代及规模化扩增培养。应用本发明培养基具有纯度高，细胞增殖快，扩增效率高，可稳定传代20代以上等优点，其培养出的骨骼肌干细胞可以用于临床研究及应用。本发明骨骼肌干细胞无血清培养基有效提高了骨骼肌干细胞扩增效率及纯度，为临床研究及应用提供优质的骨骼肌干细胞，能够作为规模化的、优质的骨骼肌干细胞培养体系以满足临床研究及应用。
附图说明
图1骨骼肌干细胞在三种培养基中的生长曲线对比实验结果；
图2 P20代骨骼肌干细胞免疫组化染色结果；
图3 P20代骨骼肌干细胞免疫组化复染结果；
图4 P20代骨骼肌干细胞诱导分化肌管形成图(10×)；
图5 P20代骨骼肌干细胞诱导分化肌管形成图(40×)；
图6不同浓度的6-硫酸软骨素促进骨骼肌干细胞生长的实验结果。
图7不同浓度的助壮素促进骨骼肌干细胞生长的实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的主旨和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1人骨骼肌干细胞无血清培养基的制备
细胞基础培养基(DMEM：F12(1:1)干粉，货号：SH30004，购于Thermo公司)，细胞因子(购于PEPROTECH公司)，助壮素(购于Sigma公司，纯度为98％以上)，人重组胰岛素(购于Sigma公司，纯度为98％以上)，6-硫酸软骨素(购于海南葫芦娃制药有限公司)，维生素C(购于、Sigma公司，纯度为98％以上)，血清替代物(商品名称为“Ultroser G”，品牌为Lonza；也可购于Crescent Chemical Co.,Inc.)，NaHCO3(购于Sigma公司，纯度为98％以上)和氨基酸(购于Sigma公司，纯度为98％以上)，转铁蛋白(购于Sigma公司，纯度为98％以上)，L-谷氨酰胺(购于Sigma公司，纯度为98％以上)，维生素B6(购于Sigma公司，纯度为98％以上)，盐酸硫胺素(购于Sigma公司，纯度为98％以上)，肌醇(购于Sigma公司，纯度为98％以上)，尼克酰胺(购于Sigma公司，纯度为98％以上)，胆固醇(购于Sigma公司，纯度为98％以上)，P68(普朗尼克F68，购于Sigma，主要是聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物)，吐温80(购于Sigma公司，纯度为98％以上)和柠檬酸铁铵(购于Sigma公司，纯度为98％以上)。
表1本发明骨骼肌干细胞无血清培养基的各成分以及含量
人骨骼肌干细胞无血清培养基的制备：
(1)准确称取15.6g DMEM:F12(1：1)干粉，溶解在800ml注射用水中。
(2)按照表1中用量称取其余的各成分，逐次加入上述溶液中，搅拌至完全溶解。
(3)加入1.2g NaHCO3，继续搅拌，定容至1L，调节pH至7.2-7.4，Osmo检测范围290-320mOsm/kg。
(4)用0.22μm的滤膜过滤除菌，即得。
实验例1骨骼肌干细胞在三种培养基中的生长曲线对比实验
本实验所用的三种培养基分别为本发明实施例1制备的无血清培养基(以下称自制培养基)，20％胎牛血清的DMEM：F12 1:1培养基(以下称培养基A)，购于Lonza公司的骨骼肌干细胞专用低血清培养基SKGM-2(以下称培养基B)。
1.骨骼肌干细胞分离纯化
(1)手术活检无菌取年轻健康人自愿捐献股直肌或三角肌2-5g，转入装有20ml含1％青链霉素的PBS的50ml离心管中，4℃运输至实验室。
(2)从50ml离心管中取出肌肉组织,放入无菌平皿,去除脂肪和***,用无菌手术剪剪成约1mm3小块，用含1％双抗的PBS冲洗三次。
(3)加入10-15ml浓度为0.1％的II型胶原酶,用移液管吹打混匀,于37℃恒温振荡器内消化2h。
(4)加入10-20ml 0.25％胰蛋白酶,用移液管吹打混匀,于37℃恒温振荡器内消化20-30min。
(5)加入10ml含10％血清替代物培养基终止消化。
(6)依次用预先湿热灭菌的400目、200目不绣钢筛过滤，去除残渣。
(7)滤液以2000rpm,5min离心,弃上清收集细胞。
(8)用PBS清洗,2000rpm,5min离心,重复三次。
(9)用4ml含160IU/ml庆大霉素，10％血清替代物的DMEM:F12 1：1,接种到T25培养瓶,密度104/ml。
(10)放入37℃、饱和湿度、5％的二氧化碳培养箱中培养。
(11)将预培养20min后的上层液体转移到一新培养瓶，去除贴壁的纤维母细胞,然后将2h,8h,24h,48h,72h的细胞悬液更新到新的培养瓶。
(12)收集第72h后的贴壁细胞，加入自制培养基正式培养。
(13)到细胞长满瓶底面70％-80％时传代,传代比例1：2,操作方法:倒出瓶内培养液,加入PBS洗2-3次,加入0.25％胰蛋白酶2ml,37℃恒温振荡器消化3min,加入新鲜培养基3ml终止消化,混匀,年2000rpm,5min,弃上清,加入新鲜培养基8ml,分到2个培养瓶中,于37℃,饱和湿度、5％CO2条件下继续培养。
2.将按上述方法收集的P5代骨骼肌干细胞分别用本发明培养基(实施例1所制备)，20％胎牛血清(购于兰州民海公司)的DMEM:F12 1：1，Lonza公司的骨骼肌干细胞专用SKGM-2培养基等量重悬，按105/孔接种至24孔板，每三天换液，共3块板，每天计数三孔，记录生长曲线。
表2三种培养基培养结果比较
实验结果见表2和图1。从表2可见，本发明制备的骨骼肌干细胞培养基扩增骨骼肌干细胞的效率明显高于含20％胎牛血清的DMEM:F121:1培养基及SKGM-2培养基。
实验例2骨骼肌干细胞纯度鉴定及分化能力评价
Desmin抗体及免疫组化试剂盒及辅助试剂均购于武汉博士德公司；PBS为pH 7.2-7.4的磷酸盐缓冲液；SABC试剂、DAB显色剂、DAB显色剂(购于武汉博士德公司)。
1.将P20骨骼肌干细胞消化，收集以自制培养基按2×105个/孔的密度加入到1:10稀释的多聚赖氨酸包被的6孔板进行培养，当细胞长满6孔板90％以上时用于免疫组化实验。
2.用PBS溶液清洗细胞3次，2min/次。
3.加入4％多聚甲醛1ml/孔，常温下固定30min。
4.用PBS溶液清洗细胞3次，2min/次。
5.加入0.5％triton x-100 1ml/孔，10min，增强细胞的通透性。
6.用PBS溶液清洗细胞3次，2min/次。
7.加入甲醇稀释后的H2O2(1份H2O2+50份甲醇)10滴/孔，10min。
8.用PBS溶液清洗细胞3次，2min/次。
10.加入稀释后山羊血清(山羊血清：PBS＝1:10)1ml/孔，20min。
11.加入稀释后一抗Desmin抗体(一抗：PBS＝1:100)1ml/孔，避光，4℃过夜(16-18h)或者37℃，1小时。
12.用PBS溶液清洗细胞3次，2min/次。
13.加入稀释后二抗(二抗：PBS＝1:100)1ml/孔，37℃，30min，或室温1h。
14.用PBS溶液清洗细胞3次，2min/次。
15.滴加SABC试剂，1ml/孔，37℃，20min。PBS清洗5min×4次。
16.加入DAB显色剂(1ml添加A,B,C各一滴)，1ml/孔，避光，10min，显微镜下观察细胞，出现棕褐色即用蒸馏水终止显色反应。蒸馏水清洗5min×3次。
17.用苏木素复染0.5-1min，再用PBS返蓝。在显微镜下观察。随机取5个视野，记录阳性细胞数和阴性细胞数，计算阳性率。实验结果见图2、图3及表3。
表3骨骼肌干细胞培养纯度结果
从表3中结果显示：三组平行结果表明，采用本发明骨骼肌干细胞培养基培养获得的人骨骼肌干细胞纯度均达到97％以上。
实验例3骨骼肌干细胞的分化肌管鉴定实验
将骨骼肌干细胞以含2％FBS，含IGF-1(100ng/ml)，不含BFGF的DMEM:F12 1：1培养基按2×105/孔接种到6孔板内，第四天换液一次，于第七天观察到肌管形成。实验结果见图4及图5。
实验例4 6-硫酸软骨素促进骨骼肌干细胞生长的实验
本实验中用到的骨骼肌干细胞培养基，配方见表4：
表4本实验中用到的骨骼肌干细胞培养基
在上述表4的培养基中添加不同浓度的6-硫酸软骨素，实验分为六组6-硫酸软骨素干预组，即：第1、2、3、4、5、6组，各组的6-硫酸软骨素的添加浓度分别为：0μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、500μg/ml。第4天、第5天于倒置成像显微镜下观察各组骨骼肌干细胞成肌细胞的增殖情况，第6天根据分组配制6份骨骼肌干细胞细胞(1×108L-1)悬液分别接种于12孔板，每组3孔，每孔1.5mL培养于37℃，体积分数5％的CO2培养箱，第6天加入MTT(噻唑蓝)溶液160μL避光孵育，4h后终止培养，去除上清，每孔滴加1.6mL二甲基亚砜，振荡混匀10min，使得结晶充分溶解，使用酶标仪测定在490nm处的吸光度(OD值)，计算细胞存活率，本实验重复3板。比较分析6-硫酸软骨素对骨骼肌干细胞增殖作用的影响。
实验结果：MTT实验结果显示随6-硫酸软骨素浓度增加吸光度值增加，且在浓度200μg/ml时增殖活性最高。绘制不同浓度细胞活性曲线图可知骨骼肌干细胞数呈增长趋势，见图6。
统计分析得出第1组和第2、3、4、5、6组均存在显著差异，P<0.05；第2、3、5、6组之间无明显差异，P>0.05；第4组和第2、3、5、6组也存在显著差异，P<0.05；(表5)。
表5不同浓度6-硫酸软骨素干预骨骼肌干细胞活性分析结果对骨骼肌干细胞增殖活性的影响(n＝3)
实验结果显示，6-硫酸软骨素对骨骼肌干细胞的增殖活性有促进作用，且浓度200μg/ml附近，骨骼肌干细胞增殖活性达到最优。
实验例5助壮素(N,N-二甲基哌啶氯化物)促进骨骼肌干细胞生长的实验
本实验中用到的骨骼肌干细胞培养基配方如下表6：
表6
在上述表6的培养基中添加不同浓度的助壮素，实验分为七组助壮素干预组，即：第1、2、3、4、5、6、7组，各组的助壮素的添加浓度分别为：0μg/ml、3μg/ml、6μg/ml、9μg/ml、12μg/ml、15μg/ml、20μg/ml。第4天、第5天于倒置成像显微镜下观察各组骨骼肌干细胞的增殖情况，第6天根据分组配制7份骨骼肌干细胞细胞(1×108L-1)悬液分别接种于12孔板，每组3孔，每孔1.5mL培养于37℃，体积分数5％的CO2培养箱，第6天加入MTT(噻唑蓝)溶液160μL避光孵育，4h后终止培养，去除上清，每孔滴加1.6mL二甲基亚砜，振荡混匀10min，使得结晶充分溶解，使用酶标仪测定在490nm处的吸光度(OD值)，计算细胞存活率，本实验重复3板。比较分析助壮素对骨骼肌干细胞增殖作用的影响。
实验结果：MTT实验结果显示随助壮素浓度增加吸光度值增加，且浓度在9μg/ml时增殖活性较高，大于此浓度时，增殖活性比较呈现平稳趋势。绘制不同浓度细胞活性曲线图可知骨骼肌干细胞数呈增长趋势，见图7。统计分析得出第1组和第2、3、4、5、6、7组均存在显著差异，P<0.05；第2、3组之间无明显差异，P>0.05；第4、5、6、7组之间无明显差异，P>0.05；第4组和第1、2、3组存在显著差异，P<0.05(见表8)。
表8不同浓度助壮素干预骨骼肌干细胞活性分析结果对骨骼肌干细胞增殖活性的影响(n＝3)
实验结果显示助壮素对骨骼肌干细胞的增殖活性有促进作用，且浓度9μg/ml组附近，骨骼肌干细胞增殖活性达到最高，且大于此浓度骨骼肌干细胞增殖活性呈现平稳趋势，表明此浓度为最佳添加剂量。

Claims (10)

1.一种骨骼肌干细胞无血清培养基，其特征在于，包含以下各成分：DMEM：F12，血清替代物，细胞因子，维生素，氨基酸，人重组胰岛素、转铁蛋白，L-谷氨酸酰胺，盐酸硫胺素，肌醇，尼克酰胺，胆固醇，普朗尼克F68，吐温80，柠檬酸铁铵和NaHCO3；该培养基的pH值为7.2～7.4。
2.按照权利要求1所述的骨骼肌干细胞无血清培养基，其特征在于，所述血清替代物为Ultroser G血淸替代物；
所述细胞因子为***，表皮细胞生长因子或碱性成纤维生长因子中的任何一种或多种；
所述的维生素是维生素C、维生素B1或维生素B6中的任何一种或二者的组合；
所述氨基酸为1水L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯基丙氨酸、L-丝氨酸、L-色氨酸、L-半胱氨酸、L-鸟氨酸盐酸或对氨基苯甲酸中任何一种或一种以上的任意组合；
所述普朗尼克F68主要是聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物。
3.按照权利要求1或2所述的骨骼肌干细胞无血清培养基，其特征在于，每升培养基中，各成分的含量为：
DMEM：F12含量为15.6g/L，其中，DMEM：F12的质量比例为1:1；
所述血清替代物含量为20mL/L；
所述维生素B6含量为0.95～1.05mg/L，优选为0.975mg/L；所述维生素B1含量为1.0～1.03mg/L，优选为1.03mg/L；所述维生素C含量为6～6.9mg/L，优选为6.45mg/L；
所述***含量为80～100μg/L，优选为100μg/L；表皮细胞生长因子含量为18～22μg/L，优选为20μg/L；碱性成纤维生长因子含量为18～22μg/L，优选为20μg/L；
所述人重组胰岛素含量为0.01～0.02mg/L，优选为0.02mg/L；
所述1水L-天冬酰胺含量为48.45～53.25mg/L，优选为51.25mg/L；L-天冬氨酸含量为30.35～31.35mg/L，优选为30.75mg/L；L-组氨酸含量为85.12～89.12mg/L，优选为87.12mg/L；L-异亮氨酸含量为38.55～42.13mg/L，优选为41.13mg/L；L-亮氨酸含量为33.55～36.55mg/L，优选为34.55mg/L；L-赖氨酸含量为165.44～172.44mg/L，优选为168.44mg/L；L-蛋氨酸含量为4.9～5.1mg/L，优选为5.0mg/L；L-苯基丙氨酸含量为21～23mg/L，优选为22mg/L；L-丝氨酸含量为38.5～40.35mg/L，优选为39.5mg/L；L-色氨酸含量为12.3～14.46mg/L，优选为13.6mg/L；L-半胱氨酸含量为108.7～115.3mg/L，优选为113.7mg/L；L-鸟氨酸盐酸含量为27.3～30.3mg/L，优选为29.3mg/L、对氨基苯甲酸含量为1.0～1.03mg/L，优选为1.03mg/L；
所述转铁蛋白含量为11.5～12.5mg/L，优选为12.5mg/L；L-谷氨酸酰胺含量为0.2mM；盐酸硫胺素含量为1.0～1.03mg/L，优选为1.03mg/L，肌醇含量为34.5～37.01mg/L，优选为35.51mg/L；尼克酰胺含量为1.0～1.03mg/L，优选为1.03mg/L；胆固醇含量为0.015～0.019mg/L，优选为0.019mg/L；普朗尼克F68含量为97～100mg/L，优选为98mg/L；吐温80含量为5.1～5.4mg/L，优选为5.25mg/L；柠檬酸铁铵含量为179.1～186.6mg/L，优选为181.6mg/L；NaHCO3含量为1.2g/L。
4.按照权利要求1所述的骨骼肌干细胞无血清培养基，其特征在于，含有6-硫酸软骨素。
5.按照权利要求4所述的骨骼肌干细胞无血清培养基，其特征在于，所述6-硫酸软骨素含量为50～500mg/L；优选为180～200mg/L；最优选为200mg/L。
6.按照权利要求1所述的骨骼肌干细胞无血清培养基，其特征在于，还含有N,N-二甲基哌啶氯化物。
7.按照权利要求6所述的骨骼肌干细胞无血清培养基，其特征在于，所述N,N-二甲基哌啶氯化物的含量为8.7～10.7mg/L，最优选为9.0mg/L。
8.一种制备权利要求1-7任何一项所述骨骼肌干细胞无血清培养基的方法，其特征在于，包括：
(1)将DMEM:F12的干粉溶解在注射用水中得到基础培养基；
(2)将其余的各成分加入到基础培养基中，搅拌至完全溶解；
(3)调节pH值至7.2～7.4，Osmo检测范围290-320mOsm/kg；
(4)0.22μm过滤除菌，即得。
9.按照权利要求8所述的方法，其特征在于：所述DMEM:F12的干粉中，DMEM:F12的质量比例为1:1。
10.权利要求1-7任何一项所述骨骼肌干细胞无血清培养基在培养骨骼肌干细胞中的用途；优选的，所述骨骼肌干细胞是人骨骼肌干细胞。
CN201611087240.5A 2016-12-01 2016-12-01 骨骼肌干细胞无血清培养基及其制备方法和应用 Active CN106497872B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611087240.5A CN106497872B (zh) 2016-12-01 2016-12-01 骨骼肌干细胞无血清培养基及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611087240.5A CN106497872B (zh) 2016-12-01 2016-12-01 骨骼肌干细胞无血清培养基及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106497872A true CN106497872A (zh) 2017-03-15
CN106497872B CN106497872B (zh) 2019-10-11

Family

ID=58329262

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611087240.5A Active CN106497872B (zh) 2016-12-01 2016-12-01 骨骼肌干细胞无血清培养基及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106497872B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108774630A (zh) * 2018-06-13 2018-11-09 中国科学院成都生物研究所 一种饰纹姬蛙骨骼肌细胞的原代培养方法
CN111808801A (zh) * 2020-07-20 2020-10-23 中国肉类食品综合研究中心 一种鸽子骨骼肌卫星细胞提取及培养方法
CN111944752A (zh) * 2020-08-28 2020-11-17 广州同康生物科技有限公司 骨骼肌干细胞无血清培养基及其制备方法
EP4144356A4 (en) * 2020-04-26 2024-04-17 Soochow University STEM CELL MEDICINES FOR THE TREATMENT OF DIABETES

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104805054A (zh) * 2015-04-30 2015-07-29 厦门中领精准医学产业发展有限公司 干细胞无血清培养基
CN106062205A (zh) * 2013-12-20 2016-10-26 基本药品有限责任公司 细胞培养基

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106062205A (zh) * 2013-12-20 2016-10-26 基本药品有限责任公司 细胞培养基
CN104805054A (zh) * 2015-04-30 2015-07-29 厦门中领精准医学产业发展有限公司 干细胞无血清培养基

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MASSIMILIANO CERLETTI等: "Short-term calorie restriction enhances skeletal muscle stem cell function.", 《CELL STEM CELL》 *
P M GILLBERT等: "Substrate elasticity regulates skeletal muscle stem cell self-renewal in culture.", 《SCIENCE (NEW YORK,N.Y.)》 *
王琳等: "适合人肌母细胞的无血清培养基", 《中国组织工程研究》 *
陈从波等: "成年大鼠骨骼肌干细胞纯化、培养及移植的初步实验研究", 《生物医学工程与临床》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108774630A (zh) * 2018-06-13 2018-11-09 中国科学院成都生物研究所 一种饰纹姬蛙骨骼肌细胞的原代培养方法
EP4144356A4 (en) * 2020-04-26 2024-04-17 Soochow University STEM CELL MEDICINES FOR THE TREATMENT OF DIABETES
CN111808801A (zh) * 2020-07-20 2020-10-23 中国肉类食品综合研究中心 一种鸽子骨骼肌卫星细胞提取及培养方法
CN111944752A (zh) * 2020-08-28 2020-11-17 广州同康生物科技有限公司 骨骼肌干细胞无血清培养基及其制备方法
CN111944752B (zh) * 2020-08-28 2021-09-03 广州同康生物科技有限公司 骨骼肌干细胞无血清培养基及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN106497872B (zh) 2019-10-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112322580B (zh) 一种间充质干细胞无血清培养基的应用
ES2198067T3 (es) Utilizacion de compuestos a base de creatina para tratar las celulas y los tejidos oseos y cartilaginosos.
CN106497872A (zh) 骨骼肌干细胞无血清培养基及其制备方法和应用
CN106591235B (zh) 一种促进角膜内皮细胞功能和特性的方法
CN103409368A (zh) 干细胞及胚胎来源的心肌细胞及推定的心肌细胞的纯化方法
CN102634482B (zh) 一种间充质干细胞的无血清完全培养基
CN102787094B (zh) 培养基、细胞培养用试剂盒及细胞培养方法
CN103255103B (zh) 一种无血清的脂肪间充质干细胞培养基
CN101384704A (zh) 可再吸收的角膜扣状体
CN102517251A (zh) 一种间充质干细胞及其制备方法和应用
CN105112362A (zh) 一种胎盘间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法
CN110257328A (zh) 一种间充质干细胞无血清培养基
CN109749997A (zh) 一种角膜缘干细胞无血清培养基及其培养方法
CN102505005B (zh) 一种保持在体生理状态的原代呼吸道上皮细胞的培养基
KR20180122288A (ko) 사람 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포 기반 3d 바이오프린팅 조직체 및 이의 이용
CN108324993A (zh) 一种诱导毛发再生的干细胞复合体、其制备方法及应用
CN103184188A (zh) 中枢神经***药物研究的原代同源三细胞四维模型及构建方法
WO2019237812A1 (zh) 脂肪组织消化液和快速获得基质血管成分细胞的方法
RU2662172C2 (ru) Способ получения регенеративного ветеринарного препарата на основе экстракта мезенхимальных стволовых клеток и кондиционной среды
CN109479873A (zh) 一种脂肪组织保存液及其应用
CN108823158B (zh) 女贞苷和特女贞苷在促进体外培养骨髓间充质干细胞增殖和抑制复制性衰老中的应用
CN110229863A (zh) 一种增强成骨细胞能力的牦牛胶制备方法
CN105087480A (zh) 无血清干细胞培养基及其应用
CN101392235A (zh) 一种永生化猪肝细胞大规模培养的方法
CN101496815B (zh) 一种治疗肝衰竭的药物及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant