CN101638635A - 一种获得角膜内皮样细胞的方法及体外构建角膜后板层 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诱导形成角膜内皮样细胞的方法，所述的方法包括步骤：将2－8×10⁴个/ml的骨髓内皮祖细胞(bone marrow derived endothelial progenitorcells，BEPCs)和0.6－3×10⁵个/ml的角膜内皮细胞(coneal endothlial cell，CECs)共培养，使骨髓内皮祖细胞分化形成角膜内皮样细胞。本发明还公开了一种由所述方法得到的角膜内皮样细胞构建的角膜后板层及其制备方法和用途。

Description

一种获得角膜内皮样细胞的方法及体外构建角膜后板层

技术领域

本发明涉及组织工程和眼科领域，尤其涉及获得角膜内皮样细胞的方法及体外构建角膜后板层。

背景技术

角膜内皮细胞通过泵功能和屏障功能，调控了角膜的透明性。成人角膜内皮细胞数随着年龄增加、眼外伤、手术、接触镜佩戴和炎症等因素而下降，但在体内却无法增殖来补偿细胞损失，只能靠细胞体积增大来保持与相邻细胞的紧密对合，阻止房水过多地渗入基质。这是因为前房内生长因子不足，同时房水中又存在生长抑制因子，阻断了细胞的DNA合成，使其停滞在G1期，不能通过有丝***来繁殖再生。当角膜内皮细胞密度低于400-700个/mm²时，内皮失代偿，角膜水肿，视力下降或丧失。临床上内皮失代偿疾病如大泡性角膜病变、Fuch’s角膜变性等皆导致角膜内皮病变，角膜混浊和视力下降。治疗角膜内皮功能失代偿的常用手术是穿透性角膜移植。尽管常规的角膜移植已经取得了较大的成功，但仍存在不足之处，包括术后散光，屈光不正，缝线松脱感染，供体来源短缺及术后免疫排斥反应等。角膜虽然处于一个相对免疫赦免的位置，但在无血管的角膜上行角膜移植术仍存在大于10％患者发生排斥反应。1952年Stocker建立了角膜内皮细胞组织培养方法，在此基础上1972年Maurice首次提出了将组织培养的角膜内皮细胞移植到内皮细胞不健康的角膜上的设想，开辟了角膜内皮细胞移植(coneal endothelium transplantation)这一崭新的研究领域。近几年兴起的角膜后弹力层剥除内皮细胞移植术(Descemet stripping endothelialkeratoplasty，DSEK)，利用巩膜隧道小切口，撕去后弹力层和内皮层，再移植异体后板层基质和后弹力层内皮层，无需缝合，相比传统的穿透性角膜移植术，创伤小，免疫排斥进一步降低，术后视力恢复快、散光小，但依然存在供体缺乏、角膜供体老龄化等难题。目前热点研究的体外培养角膜内皮细胞移植也因受到细胞来源不足和无合适的载体而难以应用。因此，寻找种子细胞与合适的生物材料构建组织工程角膜后板层并进行移植是当务之急。

组织工程学(tissue engineering)是一门以细胞生物学和材料学相结合，进行体外或体内构建组织或器官的新兴学科。组织工程的三大要素包括种子细胞、生物材料及体内微环境。其基本方法是将体外培养扩增的自体正常组织细胞吸附于一种生物相容性良好并可被机体降解吸收的生物支架，植入机体组织缺损部位，在支架材料逐步降解过程中，细胞继续增殖并分泌基质，最终形成相应组织，达到修复组织缺损，重建功能的目的。

目前用于构建组织工程角膜内皮的种子细胞有角膜内皮细胞，内皮前体细胞和骨髓间充质干细胞(MSC)。1979年，Gospodarowicz等将培养的牛角膜内皮细胞接种于猫的角膜片上，体外培养后再移植到内皮受损的猫角膜上，植片保持透明达7天。这一实验开辟了角膜内皮细胞载体培养和移植的新领域。但是内皮细胞来源缺乏，体外虽能扩增，但数量有限。2005年，Mimura等发现角膜内皮周边的细胞增殖能力要明显超过中心的细胞，推测在近角膜缘与小梁组织结构交界处可能存在类似干细胞的角膜内皮前体细胞；又有研究通过周边角膜内皮细胞团块克隆培养方法得到了干细胞样的角膜内皮前体细胞，可以体外成克隆团块样生长增殖，无论在形态上还是增殖力等生物学特性上都具有干细胞的特征，注入前房后能修复兔角膜内皮缺损。但是角膜前体细胞的分离培养非常困难。有学者在成体干细胞MSC的诱导和移植进行了有益的探索。刘小韦等用兔自体BMSCs接种到明胶膜上移植到机械去除角膜内皮细胞的兔角膜内，术后8周水肿逐渐减轻，角膜恢复透明，术后12周逐渐分化为类似多角形的细胞，但是细胞间的间隙较大。MSC到底能否分化为角膜内皮细胞还是未知数，移植后的效果还需长期观察。

组织工程角膜后板层构建的另一重要因素是生物材料支架，常作为机械支架支持细胞生长，减轻细胞反应，并随着时间的推移，逐渐改变它们的化学和机械特性。生物相容性是其最重要的一个特性，生物材料越接近组织微环境，生物相容性越好。理想的组织工程角膜材料应满足以下条件：(1)生物相容性好，维持三维空间和促进正常细胞生长和分化外，不干扰其他生理过程；(2)无不良组织反应；(3)材料制作简单，并能按不同的形状和大小重塑；(4)植入体内后，材料可被降解或吸收。目前用于组织工程角膜后板层构建的载体有明胶、胶原、羊膜及PLGA、后弹力层等。Jumblatt等用明胶膜培养内皮细胞进行移植。Mimura等将人角膜内皮细胞接种到胶原片对撕去后弹力层和内皮层的兔进行移植，角膜能逐渐变透明。明胶和胶原的机械强度差，操作困难，易于在体内降解。Ishino等首次在羊膜上培养人角膜内皮细胞，密度超过3000个/mm²，形态与正常角膜内皮细胞相似，植入兔角膜后，未发现水肿，保持良好的透明性，但仅保持4周，内皮细胞密度在移植7天后下降27％。其不足之处在于羊膜与受体角膜基质贴附性差。Hadlock等在PLGA上种植兔角膜内皮细胞，得到单层兔角膜内皮细胞层，证明这种材料可用于细胞单层移植。虽然PLGA是可降解聚合物，具有降解过程可控，重塑性好，机械强度高，生物相容性好等优点，但缺少细胞识别信号，其疏水性使细胞不易种植，酸性降解产物也会对细胞的活性产生不利影响。Mimura T等用人角膜内皮细胞接种到去除内皮细胞的角膜后弹力层上，对裸鼠角膜行穿透性角膜移植，1个月后角膜恢复透明，但是这种技术依然受到供体缺乏的难题。

综上所述，本领域迫切需要提供扩大用于角膜移植的种子细胞来源，也迫切需要提供生物可降解材料用于制备角膜移植物。

发明内容

本发明旨在提供一种诱导骨髓内皮祖细胞分化形成角膜内皮样细胞的方法。

本发明的另一个目的是提供一种组织工程化角膜后板层。

本发明的再一个目的是提供一种制备组织工程化角膜后板层的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种诱导形成角膜内皮样细胞的方法，所述方法包括步骤：将2-8×10⁴个/ml的骨髓内皮祖细胞(bone marrow derived endothelialprogenitor cells，BEPCs)和0.6-3×10⁵个/ml的角膜内皮细胞(coneal endothlialcell，CECs)共培养，使骨髓内皮祖细胞分化形成角膜内皮样细胞；优选将3-7×10⁴个/ml的骨髓内皮祖细胞和0.8-1.2×10⁵个/ml的角膜内皮细胞共培养。

在另一优选例中，共培养中所使用的培养液是含有1-5％v/v血清的DMEM/F12或DMEM；共培养7-14天，更优选8-10天。

在另一优选例中，所述的骨髓内皮祖细胞是同种同体、同种异体或异种异体骨髓内皮祖细胞；所述的角膜内皮细胞是同种同体、同种异体或异种异体角膜内皮细胞；所述的隔离共培养的骨髓内皮祖细胞和角膜内皮细胞之间是同种同体、同种异体或异种异体。

在另一优选例中，所述的骨髓内皮祖细胞是人骨髓内皮祖细胞；所述的角膜内皮细胞是人角膜内皮细胞。

在另一优选例中，所述的共培养选自混合共培养或隔离共培养；更优选隔离共培养。

在另一优选例中，在隔离共培养的第三天再加入角膜内皮细胞培养上清液和新鲜培养液，间隔两天后再通过半量换液法加入角膜内皮细胞培养上清液和新鲜培养液；所述的培养液是含有1-5％v/v血清的DMEM/F12或DMEM；所述的角膜内皮细胞培养上清液是为角膜内皮细胞第一代或第二代细胞的培养上清液。

在另一优选例中，所述的角膜内皮细胞培养上清液是为角膜内皮细胞第一代或第二代细胞的培养上清液，这些细胞每隔1-2天加液一次，培养第三天后即可作为上清液用作共培养。

在本发明的第二方面，提供了一种如上所述的诱导方法获得的角膜内皮样细胞的用途，所述的用途是作为种子细胞制备角膜移植物。

在本发明的第三方面，提供了一种组织工程化角膜后板层，它包括：

(a)药学上可接受的生物可降解材料；和

(b)如上所述的诱导方法获得的角膜内皮样细胞；

所述的药学上可接受的生物可降解材料是角膜脱细胞基质(cornea acellularmatrix，CACM)；优选猪角膜脱细胞基质(porcine cornea acellular matrix，PCACM)。

在另一优选例中，如上所述的诱导方法获得的角膜内皮样细胞的含量为1000-4000个细胞/mm²所构建的角膜后板层。

在本发明的第四方面，提供了一种制备组织工程化角膜后板层的方法，所述的方法包括步骤：

(1)将如上所述的诱导方法获得的角膜内皮样细胞接种于角膜脱细胞基质(优选猪角膜脱细胞基质)，接种密度为1000-4000个细胞/mm²角膜脱细胞基质；和

(2)培养得到组织工程化角膜后板层。

在另一优选例中，体外培养4-10天，更优选5-7天。

在另一优选例中，步骤(2)中加入体积比为1∶1-3的角膜内皮细胞培养上清液和含有1-5％v/v血清的DMEM/F12或DMEM进行培养。

据此，本发明扩大了用于角膜移植的种子细胞来源，也提供了一种角膜移植物。

附图说明

图1显示了密度梯度离心获取骨髓单核细胞。

图2显示了体外培养的人BEPCs的形态(倒置相差显微镜100×)；其中

A：原代培养4天，克隆形态成椭圆形漩涡状，B：培养第6天，细胞呈短梭形或多边形。

图3显示了人BEPCs摄取Ac-LDL及结合UEA-1情况(荧光显微镜)；其中

A：原代第4天克隆，能摄取Dil-Ac-LDL 200×；B：BEPCs能结合UEA-1 200×；C：Hoechst染核200×；D：将Dil+UEA+Hoechst叠加，阳性率达100％ 200×；E：第一代第2天细胞，阳性率达90％以上 100×。

图4显示了人BEPCs的CD133、CD34和Flk-1表达情况200×；其中

A：人BEPCs表达CD133；B：人BEPCs表达CD34；C：人BEPCs表达Flk-1。三者阳性率均在95％以上。

图5显示了人BEPCs及人CECs VIII型胶原(496bp)表达情况，两者均表达VIII型胶原.

图6显示了Transwell隔离共培养模式图。

图7显示了原代人CECs的形态；其中

A：原代第13天组织块边缘长出CECs细胞40×；B：CECs形态呈多边形200×。

图8显示了人CECs诱导的人BEPCs的形态(倒置显微镜200×)；其中

A：未诱导的BEPCs呈短梭形或长梭形；B：人CECs诱导的BEPCs呈多边形；C：CECs呈多边形；D：人LECs诱导的BEPCs呈短梭形或长梭形。

图9显示了人CECs诱导的人BEPCs的形态，呈多边形(扫描电镜1000×)。

图10显示了人CECs诱导人BEPCs AQP1表达情况200×；其中

A：未诱导的人BEPCs不表达AQP1；B：人CECs诱导的人BEPCs大多数表达AQP1；C：人CECs表达AQP1；D：人LECs诱导的BEPCs不表达AQP1。

图11显示了RT-PCR检测AQP1(218bp)表达情况，人CECs表达AQP1.经人CECs诱导的人BEPCs表达AQP1，未经诱导的人BEPCs不表达AQP1。

图12显示了人CECs诱导的人BEPCs细胞间形成紧密连接(透射电镜17500×)。

图13显示了人CECs诱导的BEPCs的ZO-1表达情况(免疫荧光，200×)；其中

A：未诱导的BEPCs不表达ZO-1；B：人CECs诱导的BEPCs表达ZO-1。

图14显示了人CECs诱导的BEPCs的NSE表达(免疫组化200×)；其中

A：未诱导的人BEPCs不表达NSE；B：人CECs诱导的人BEPCs表达NSE；C：人CECs表达NSE。

图15显示了PCACM大体观。

图16显示了24孔板中PCACM大体观；其中PCACM(箭头所指)紧贴于皿底，平整光滑；右侧对照孔无PCACM。

图17显示了PCACM的组织学形态200×；其中

A：HE染色，胶原排列整齐；B：Hoechst染核，未见基质细胞残留。

图18显示了PCACM的电镜形态；其中

A：PCACM表面光滑(扫描电镜1000×)；B：PCACM胶原纤维排列整齐致密(透射电镜9700×)。

图19显示了不同密度接种3天后的诱导BEPCs在PCACM上形态(倒置相差显微镜，100×)；其中

A：1000个细胞/mm2接种，细胞间无有效连接；B：2000个细胞/mm2接种，细胞呈多边形，连接紧密；C：4000个细胞/mm2接种，细胞形态不清，有重叠生长。

图20显示了不同体外培养时间的诱导的BEPCs在PCACM上的形态(透射电镜1000×)；其中

A：体外培养4天，细胞成多边形，可见微绒毛，细胞间隙大；B：体外培养7天，细胞连接紧密成片状，未见明显细胞间隙。

图21显示了以PCACM培养诱导的BEPCs的组织学形态(HE染色)；其中

A：诱导的BEPCs呈单层生长BEPCs(黑色箭头所指)100×；B：诱导的BEPCs紧密地贴合在PCACM上(黑色箭头所指)400×。

图22显示了BEPCs接种PCACM后一周后形态(透射电镜17500×)；其中TEM见细胞与PCACM紧密贴合(黑箭头)，细胞间形成紧密连接(白箭头)。

图23显示了移植术后4周的情况；其中

A：BEPCs诱导组，角膜较透明，可见瞳孔；B：BEPCs未诱导组，角膜明显水肿，不能窥见瞳孔；C：单纯材料组，角膜水肿浑浊；D：模型组，单纯撕除内皮，角膜水肿浑浊。

图24显示了诱导组术后1月角膜大体观。

图25显示了移植术后4周组织学检测(HE染色)；其中

A，B：正常角膜，后弹力层较薄，上皮层完整A 100× B 400×；C，D：诱导组，PCACM及BEPCs与受体角膜基质面贴合良好，上皮细胞层完整，未见炎性细胞侵入C100× D 400×；E，F：模型组，角膜较正常角膜厚，上皮层有缺损，后弹力层和内皮层缺失E 100× F 200×。

图26显示了人BEPCs与猫CECs混合共培养后AQP1表达情况(免疫荧光)；其中

A：人BEPCs不表达AQP1 100×；B：猫CECs诱导的人BEPCs，表达AQP1 150×；C：猫CECs表达AQP1 200×。

具体实施方式

针对角膜移植中缺乏合适的种子细胞的问题，发明人经过深入的研究，惊奇地发现，将角膜内皮细胞和骨髓内皮祖细胞共培养(优选隔离共培养)，使骨髓内皮祖细胞被诱导分化，形成角膜内皮样细胞。所述的角膜内皮样细胞在细胞形态、泵功能、屏障功能、表面抗原标志NES的表达等方面，都表现出同角膜内皮细胞相似或相同的特性。

进一步地，发明人将上述得到的角膜内皮样细胞接种于角膜脱细胞基质，构建了可用于移植的组织工程化角膜后板层并修复了角膜内皮缺损。

诱导方法

本发明提供了一种诱导形成角膜内皮样细胞的方法，所述的方法包括步骤：将2-8×10⁴个/ml的骨髓内皮祖细胞(bone marrow derived endothelial progenitorcells，BEPCs)和0.6-3×10⁵个/ml的角膜内皮细胞(coneal endothlial cell，CECs)混合共培养或隔离共培养，使骨髓内皮祖细胞分化形成角膜内皮样细胞；优选将3-7×10⁴个/ml的骨髓内皮祖细胞和0.8-1.2×10⁵个/ml的角膜内皮细胞共培养，更优选隔离共培养。

在本发明提供的诱导方法中，所述的隔离共培养是指骨髓内皮祖细胞和角膜内皮细胞之间，细胞不能相互接触，但是培养过程中所产生的细胞因子等物质可以被这两种细胞共同接触。因此，培养角膜内皮细胞过程中所产生的细胞因子等物质可以为骨髓内皮祖细胞所接触，从而诱导其分化形成角膜内皮样细胞。

本发明提供的诱导方法中所采用的隔离共培养可以使用本领域熟知的各种隔离共培养的器具，只要能够起到所述的隔离共培养的作用即可。其中优选由6孔、12孔板或24孔板和悬挂式细胞池组成的隔离共培养体系；细胞池的底部材料是孔径为0.1-3.0μm的高分子材料，可允许细胞分泌的各种因子和营养物质等大分子通过，但细胞无法通过，所述的高分子材料选自聚酯膜(PolyethyleneTerephthalate，PET)、聚碳酯膜(poly carbonate，PC)、或聚四氟乙烯(polytetrafluoroethylene，PTFE)。

为了在隔离共培养中充分保证细胞因子等营养物质的量，不至于出现诱导空白期，可以优选采用加液或半量换液法，添加角膜内皮细胞培养上清液和/或新鲜培养液加强诱导。在本发明的一个优选例中，采用每两天加液或半量换液法添加角膜内皮细胞培养上清液和/或新鲜培养液；更佳地，是在隔离共培养的第3天，直接添加角膜内皮细胞培养上清液和新鲜培养液，添加的角膜内皮细胞培养上清液的体积是原隔离共培养体系中液体体积的1/10-1/3，添加的新鲜培养液的体积是原隔离共培养体系中液体体积的2/5-4/5，间隔两天后，半量换液法，去原隔离共培养体系中液体1/2，添加角膜内皮细胞培养上清液和新鲜培养液，添加的角膜内皮细胞培养上清液的体积是原隔离共培养体系中液体体积的1/4-1/2，添加的新鲜培养液的体积是原隔离共培养体系中液体体积的1/4-1/2。所述的培养液可以是本领域熟知的培养角膜内皮细胞的培养液，优选DMEM/F12或DMEM，更佳地是含有1-5％血清的DMEM/F12或DMEM。

本发明提供的诱导骨髓内皮祖细胞分化形成角膜内皮样细胞的方法中，所使用的骨髓内皮祖细胞相对于角膜移植的受体，可以是同种同体、同种异体或异种异体骨髓内皮祖细胞；所使用的角膜内皮细胞相对于角膜移植的受体，可以是同种同体、同种异体或异种异体角膜内皮细胞；所述的隔离共培养的骨髓内皮祖细胞和角膜内皮细胞之间是同种同体、同种异体或异种异体。本发明所使用的骨髓内皮祖细胞和/或角膜内皮细胞可以通过本领域熟知的途径获得，可以通过本领域熟知的方法培养得到，例如可以参阅Asahara T，Murohara T，Sullivan A，et al.Isolation of putativeprogenitor endothelial cells for angiogenesis.Science，1997，275(5302)：964-967获得骨髓内皮祖细胞Ishino Y，Sano Y，Nakamura T，et al.Amniotic membrane as a carrier for cultivated human corneal endothelial celltransplantation.Invest Ophthalmol Vis Sci，2004，45(3)：800-806获得角膜内皮细胞。

角膜内皮样细胞

骨髓内皮祖细胞经过本发明提供的方法诱导后，分化为角膜内皮样细胞，所述的角膜内皮样细胞表达了角膜内皮细胞的一些特性：

一、呈多边形，形态上与角膜内皮细胞更接近；

二、大量表达AQP1，RT-PCR从mRNA水平进一步证明了这一改变，表明初步建立了泵功能；

三、能表达ZO-1，建立了细胞间紧密连接，这两者是代表角膜内皮细胞屏障功能的重要指标，说明骨髓内皮祖细胞通过角膜内皮细胞诱导后，建立了一定的屏障功能；

四、大量表达神经烯醇化酶(neurone-specific enolase，NSE)，表明细胞发生了表型的转化。

角膜脱细胞基质

本发明用于构建角膜内皮细胞移植的载体是薄(优选39.83±3.85μm)、透明，表面光滑，胶原排列整齐，没有孔隙；优选角膜脱细胞基质，更佳地是猪角膜脱细胞基质。

在本发明的一个优选例中，取新鲜猪角膜，利用1％TritonX-100来脱除细胞，并采用逐步切薄角膜法，获得了薄而透明的角膜脱细胞基质，均匀一致富有弹性，符合组织工程角膜后板层载体材料的需求。此法可完全脱除细胞，HE染色和Hoechst染色均未见基质细胞残留。扫描电镜见PCACM表面光滑平整，透射电镜见PCACM胶原排列整齐规则致密。含血清培养液浸泡，4℃保存，至少可保存半年，脱细胞基质依然平整透明，不会水肿变形。取用前PBS洗几次即可。取出的角膜脱细胞基质平展于新的24孔板中，自然晾干20分钟，就能紧紧贴附于皿底，平展开，具备一定的力学性能，加入培养液不会漂浮。这样同时满足了生物材料的力学特性。

PCACM的干燥方法主要有冷冻干燥，真空干燥和自然干燥。本发明的一个优选例是采用自然干燥法。虽然脱细胞过程中，角膜基质膨胀，胶原疏松，但是经自然干燥，基质又恢复薄而透明，胶原排列整齐，无孔隙。

组织工程化角膜后板层

本发明提供的组织工程化角膜后板层含有本发明提供的经诱导骨髓内皮祖细胞分化得到的角膜内皮样细胞和角膜脱细胞基质。其中角膜内皮样细胞的接种密度为1000-4000个细胞/mm²角膜后板层，较佳地为1200-3000个细胞/mm²，更佳地为1500-2500个细胞/mm²。

在本发明的一个优选例中，PCACM在接种前先用培养液预湿，将角膜内皮样细胞充分打匀制成单细胞悬液，可使角膜内皮样细胞在PCACM上接种均匀。

合适的体外培养时间是体内移植的基础。种子细胞的活力、基质合成功能与特异表型的维持对构建组织成功具有决定性的影响。种子细胞在体外单层培养大规模扩增过程中，脱离了体内三维的细胞外基质环境，极易发生细胞表型丢失的“去分化”(dedifferentiation)现象，同时细胞增殖与特异细胞外基质合成能力下降，出现“老化”(aging)。进行角膜内皮层构建需要在细胞扩增与分化表型维持之间寻找一平衡点。在本发明的一个优选例中，将诱导的BEPCs接种到PCACM上后，用CECs上液对BEPCs持续诱导，体外培养时间控制在4-10天，时间过短，诱导的BEPCs密度不足以使细胞连接紧密，时间过长，细胞会老化。一周的体外培养时间可使BEPCs与PCACM贴合良好，密度与正常角膜内皮细胞密度相仿，确保了诱导的BEPCs的功能和表型的维持。

在另一优选例中，体外培养时间为一周(5-7天)。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明的主要优点在于：

1、将骨髓内皮祖细胞经角膜内皮细胞诱导得到的角膜内皮样细胞作为种子细胞，来源广泛，安全性高；

2、将角膜脱细胞基质作为构建角膜后板层的生物可降解材料，效果理想；

3、含有角膜内皮样细胞和角膜脱细胞基质的角膜后板层具有良好的修复角膜内皮细胞缺损的能力。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例中所涉及的相关参数、实验材料和检测方法

1.英文缩略词表

2.取材来源

流产胎儿(14-18周)，上海妇产科医院提供，经上海交通大学医学院附属第九人民医院伦理委员会审批通过。

新鲜猪眼球，上海猪屠宰场。

3.实验动物

健康猫，雌雄不限，体重1.5～2.0kg，上海交通大学医学院附属第九人民医院动物房提供。

4.细胞培养用液体和试剂

(1)EGM-2，Clonetics公司，含hydrocortisone 0.2ml，hfgf-β 2ml，VEGF 0.5ml，R3-IGF-1 0.5ml，ascorbic acid 0.5ml，GA-1000 0.5ml

(2)DMEM/F12，HYCLONE公司

(3)DMEM，HYCLONE公司

(4)Fn，Fibronectin，纤维蛋白，BioSource公司

(5)Histopaque，1.077g/ml，细胞分离液，Sigma-Aldrich公司

(6)0.2％复合胶原酶，Serva公司

5.细胞检测用抗体和试剂

(1)Dil-AcLDL，Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(1，1’-Dioctadecyl-3，3，3’，3’-tetramethyl indocarbocyanine-acetylatedlow-density lipoprotein，Invitrogen公司)；

(2)FITC-UEA1，FITC标记荆豆凝集素(FITC-conjugated lectin ulexeuropeaus agglutinin，Sigma公司)；

(3)羊多克隆CD133抗体(Santa Cruz，CA，1∶200稀释)，罗丹明标记的兔抗羊二抗(Santa Cruz公司，1∶200稀释)；

(4)兔多克隆CD34抗体(Santa Cruz公司，1∶200稀释)，Alexa Fluor 488兔抗羊二抗(Invitrogen公司，1∶1000稀释)；

(5)Biotin结合抗鼠Flk-1抗体(eBioscience公司，1∶200)，生物素化羊抗小鼠IgG(Boster公司，1∶200)，SABC(Boster公司，1∶100)，DAB(Dako Real公司，1∶50)。

(6)鼠单克隆AQP1抗体(Santa Cruz，1∶50)，相应二抗FITC标记的羊抗鼠二抗(Santa Cruz，1∶200稀释)；

(7)兔多克隆ZO-1抗体(Zymed公司，1∶150)，相应二抗FITC标记的羊抗兔二抗(BOSTER，1∶200稀释)；

(8)鼠单克隆γEnolase(NSE-P1)抗体(Santa Cruz公司，1∶200稀释)，相应二抗HRP标记的抗鼠二抗，DAB 1∶50稀释。

6.RT-PCR检测用试剂、引物及反应条件

(1)RT-PCR检测试剂：Trizol(Gibco，美国)，TaKaRa RNA PCR Kit(Biotech)，1％Agarose(含0.5mg/L ethidium bromide，EB)；

(2)VIII型胶原α1引物序列(上海生工生物工程技术服务有限公司合成)

上游5’-ACATGGGATACAATAAATATCCTGAAAAGG-3’

下游5’-CCCCAGGGAGAGTATCTGCCAGATATGGGG-3’

产物大小496bp。

β-actin作为内参照，引物扩增片段长度为318bp。

PCR反应体系：1μlcDNA/20μl体系。

PCR反应条件：30循环，变性94℃，1分钟；退火55℃，1分钟；延伸72℃，1分钟。

凝胶电泳：1.2％的琼脂糖凝胶。

(3)AQP1引物序列(上海生工生物工程技术服务有限公司合成)：

上游5’-GTCCAGGACAACGTGAAGGT-3’

下游5’-GAGGAGGTGATGCCTGAGAG-3’

产物大小218bp。

PCR反应：lμlcDNA/20μl体系。

反应条件：30个循环，94℃，30秒；65℃，30秒；72℃，1分钟。

凝胶电泳：1.8％的琼脂糖凝胶。

7.细胞培养用耗材

细胞池(6 Well Millicell cellculture inserts，Millipore公司，美国)，适合***六孔板应用。细胞池的薄膜为聚酯(PET)膜，透明，膜直径24mm，膜厚度11μm，膜的有效面积为452mm²，孔径1.0μm，孔密度2×10⁶。

显微手术器械包：直径7.5mm环钻，宽度1.5mm钻石刀，1ml针筒针头改良，内皮钩，角膜移植镊(苏州六六视觉科技股份有限公司制作)，持针器，显微剪，显微镊，双头虹膜恢复器。

粘弹剂(ProVisc 0.55ml，Alcon公司)；10-0尼龙线(强生爱惜康)。

8.检测方法

AcLDL-UEA1荧光染色

1)用24孔板培养原代细胞，取原代第4天的细胞，PBS洗1次，换新鲜培养液200ul/孔，加入10μg/mlDiI-AcLDL(1∶100稀释)，混匀后置37℃培养箱孵育4小时，PBS洗2遍。

2)常温下10％多聚甲醛固定20分钟，PBS洗2遍。

3)加入10μg/mlFITC-UEA1(1∶100稀释)，置37℃培养箱孵育2小时，PBS洗2遍。

4)Hoechst染核10分钟，PBS洗。

5)荧光显微镜下观察，三色荧光均表达的为阳性细胞，取3个视野，计数阳性细胞，取平均值。

CD133/CD34/AQP1免疫荧光

1)细胞准备：细胞爬片

2)固定：4％多聚甲醛固定10分钟，PBS漂洗3遍；

3)破细胞膜：0.25％Triton X-100与5％DMSO室温10分钟，PBS漂洗3遍；

4)阻断内源性过氧化酶：双氧水37℃烘箱15分钟，PBS漂洗3遍；

5)封闭非特异性抗体：CD133组加兔血清，CD34组加羊血清，AQP1加羊血清，37℃烘箱30分钟；

6)一抗：弃血清后(勿漂洗)加一抗CD133，CD34，AQP1，4℃冰箱过夜，PBS漂洗3遍；

7)二抗：加相应二抗，37℃烘箱孵育30分钟；

8)观察：荧光显微镜观察，拍照。

免疫组化检测生物素结合Flk-1抗体

1)加二抗前步骤同免疫荧光。

2)加二抗：根据一抗选择生物素化羊抗鼠孵育30分钟，37℃

3)漂洗

4)加三抗：ABC 1∶100，1小时，37℃

5)漂洗

6)显色：DAB显色1-2分钟

7)衬染：苏木素染1min，盐酸酒精分化，流水冲洗半小时

8)酒精脱水：80％-90％-100％

9)透明化：二甲苯I-II-III

10)树脂封片

免疫组化检测NSE

1)细胞准备：细胞爬片

2)固定：4％多聚甲醛固定10分钟，PBS漂洗3遍；

3)破细胞膜：0.25％Triton X-100与5％DMSO室温10分钟，PBS漂洗3遍；

4)阻断内源性过氧化酶：双氧水37℃烘箱15分钟，PBS漂洗3遍；

5)封闭非特异性抗体：CD133组加兔血清，CD34组加羊血清，37℃烘箱30分钟；

6)一抗：弃血清后(勿漂洗)加一抗CD133，CD34，4℃冰箱过夜，PBS漂洗3遍；

7)二抗：加相应二抗1∶200稀释，37℃烘箱孵育30分钟；

8)显色：DAB显色1-2分钟

9)衬染：苏木素染1min，盐酸酒精分化，流水冲洗半小时

10)酒精脱水：80％-90％-100％

11)透明化：二甲苯I-II-III

12)树脂封片

扫描电镜样品制备过程

1)前固定：2％戊二醛PBS固定液固定2小时4℃。

2)漂洗：PBS缓冲液洗涤二次每次10分钟4℃。

3)后固定：1％锇酸PBS固定液固定2小时4℃。

4)漂洗：PBS缓冲液洗涤二次每次10分钟4℃。

5)脱水：30％-50％-70％-80％-95％-100％-100％乙醇逐级脱水

        每次10分钟    醋酸异戊脂 二次  每次10分钟。

6)干燥：HITACHI HCP-2 临界点干燥

7)导电：BAL-TEC 离子溅射

8)观察：荷兰菲利浦公司QUANTA-200环境扫描电镜观察

透射电镜样品制备过程

1)前固定：2％戊二醛PBS固定液固定2小时4℃。

2)漂洗：  PBS缓冲液洗涤二次每次10分钟4℃。

3)后固定：1％锇酸PBS固定液固定2小时，4℃

4)漂洗：  PBS缓冲液洗涤二次每次10分钟，4℃。

5)脱水：  30％-50％-70％乙醇逐级脱水每次10分钟

          (70％乙醇含3％醋酸双氧铀)4℃ 块染

          80％-95％-100％-100％乙醇逐级脱水 每次10分钟。

6)置换：环氧丙烷 二次 每次10分钟。

7)浸透：环氧树脂618包埋液与环氧丙烷1∶1  2小时

        环氧树脂618包埋液与环氧丙烷2∶1  过夜

        纯环氧树脂618包埋液浸透  37℃    6小时。

8)包埋：60℃烘箱内48小时。

9)切片：LKB V型超薄切片机切片。

10)染色：枸橼酸铅电子染色。

11)观察：PHILIP(荷兰菲利浦公司)CM-120透射电镜观察HE染色

1)烤片：将切片置于70℃恒温箱中烘烤30分钟；

2)脱蜡及水化：将切片依次置于二甲苯I、II各10分钟，二甲苯III中5分钟脱蜡，100％、95％、85％、75％梯度酒***化；

3)流水冲洗2分钟；

4)苏木素染色10分钟；

5)自来水冲洗1分钟；

6)0.5％盐酸酒精快速分化，流水冲洗30-60分钟；

7)95％酒精脱水1分钟；

8)伊红染色2分钟；

9)95％酒精，100％酒精，二甲苯I、II、III；

10)二甲苯透明，中性树脂封片，待干后镜下观察。

冰冻切片Hoechst染色

1)OCT包埋组织块；

2)常规冰冻切片；

3)烤片：将切片置于70℃恒温箱中烘烤30分钟；

4)80％酒精2-3下，流水冲洗；

5)Hoechst1：1000染色；

6)荧光显微镜下观察。

人BEPCs与猫CECs混合共培养后AQP1及鼠抗人核抗体检测

1)免疫荧光步骤同前

2)弃血清后加一抗人核抗体(1∶50)，4℃冰箱过夜。

3)PBS振洗，加相应的二抗，37℃烘箱孵育30分钟。

4)荧光显微镜下观察人EPC表达人抗核抗体

5)重复免疫荧光步骤

6)再加一抗AQP1，过夜

7)再加相应的二抗。

9.主要仪器设备

倒置相差显微镜            OLYMPUS公司，日本和NIKON公司，日本

荧光显微镜                Nikon ECLIPSE E600/OLYMPUS

双筒显微镜                OLYMPUS

凝胶成像***              Tanon 2500

电泳仪                    ELITE 300 WELTEC，台湾

三槽PCR仪                 Thermocycler 3000，Biometra，Germany

核酸蛋白分析仪            DU 800  BECKMAN COULTER，美国

QUANTA-200环境扫描电镜    飞利浦公司，荷兰

CM-120透射电镜            飞利浦公司，荷兰

冷冻切片机                SHANDON CRYOTOME

石蜡切片机                    Thermo ELECTRON CORPORATION

手术显微镜，40倍              镇江光学仪器厂

裂隙灯                        厦门强本科技有限公司

SP-3000型超声角膜测厚仪       Tomey公司，日本

实施例1

骨髓内皮祖细胞(BEPCs)的分离、培养和鉴定

1.实验方法

1.1人骨髓内皮祖细胞的分离与培养

取流产胎儿(14-18周)的四肢骨，放入含DMEM培养液(低糖，10％FBS)培养皿中，用血管钳将骨咬碎，150目滤网过滤到离心管中，去除骨碎片，脂肪等，1500转/分钟×5分钟离心，去上液，进一步去除脂肪，细胞碎片等。将骨髓用培养液稀释到6ml打匀，Histopaque密度梯度离心400g×30分钟，可见分为四层(图1)，第一层为培养液，第二层呈云雾状，为白色单核细胞层，第三层为透明的Histopaque液，第四层为沉淀的红细胞等。吸除第一层，小心吸取第二层置于新的50ml离心管中，PBS 10ml稀释离心250g×10分钟，重复2次，彻底洗去Histopaque液，因为该分离液对细胞有毒性。EGM-2(10％FBS)培养液混匀单核细胞，接种Fn铺层的6孔板，平均1×10⁶个单核细胞/孔，置于37℃、5％CO₂、100％饱和湿度的条件下培养。加40ng/ml Fn 2ml/孔到6孔板中，4℃冰箱过夜，第二天吸出Fn(可回收再利用)，超净台上自然晾干后即为Fn铺层的6孔板。第4天全量换液，PBS将未贴壁细胞洗去，加EGM-2(含5％FBS)，37℃培养箱培养。第7-10天时传代，先用PBS洗去培养液，再加入0.25％胰酶37℃下消化2-3分钟，细胞呈圆亮时，等量培养液终止消化，用细胞刮子将细胞从皿底刮下来，予1∶4传代。

1.2人BEPCs的常规鉴定

取原代第4天的细胞和第一代第2天的细胞，加入Dil-AcLDL孵育，观察细胞摄入AcLDL情况，并与FITC-UEA1孵育，观察其与细胞膜的结合情况。荧光显微镜下观察，三色荧光均表达的为阳性细胞，阳性细胞除以总细胞数即为阳性率。取3个视野，取平均值。

取7天的BEPCs消化后传代到细胞爬片上，培养箱孵育4小时待大多数细胞贴到爬片上后，再加足量培养液过夜，第二天用4％多聚甲醛固定细胞，行CD133、CD34和Flk-1的免疫组化鉴定

设立空白对照组(不加一抗)和阴性对照组(人成纤维细胞，购自上海交通大学医学院附属第九人民医院组织工程实验室)。

1.3人BEPCs VIII型胶原鉴定

RT-PCR检测原代第7天的人BEPCs的VIII型胶原表达情况，并以人角膜内皮细胞为阳性对照组，人角膜内皮细胞的培养见实施例2。

2结果

2.1BEPCs的生长与增殖

原代取材一般可得到1.2×10⁷个单核细胞，BEPCs原代接种24小时后即有细胞贴壁，呈多边形，克隆样生长，克隆形态成小放射状，未见线状排列。4天后克隆数增加，形态成椭圆形漩涡状(图2A)，细胞形态呈短梭形或多边形。培养第6天，细胞生长渐失去克隆样形态，细胞呈短梭形或多边形(图2B)。培养第7天，细胞可长满培养皿，消化时细胞呈片状或团块状脱落，需用1ml可调微量移液枪轻柔吹打分散均匀。以后4-6天可传一代，接种密度1×10⁵个/ml，至少可传7代，随着传代次数增加，细胞接种密度的高低明显影响细胞的形态，接种密度低细胞呈成纤维样，密度高细胞呈短梭形或多边形，后几代细胞接种密度以2×10⁵个/ml为宜。

2.2BEPCs的鉴定

2.2.1Ac-LDL及UEA-1检测

BEPCs原代第4天，细胞成椭圆形克隆样生长，能摄取Ac-LDL，细胞饱满，呈红色荧光(图3A)，并能结合UEA-1，呈绿色荧光(图3B)，叠加后呈橙色荧光，Hoechst染核呈蓝色(图3C)，计数三色均表达的细胞数除以蓝核细胞数即为阳性率(图3D)，阳性率达100％。人BEPCs第一代，细胞呈短梭形，也能摄取Ac-LDL并结合UEA-1，阳性率达90％以上(图3E)。

2.2.2CD133，CD34及Flk-1检测

人BEPCs表达CD133，呈红色荧光(图4A)，同时表达CD34，呈绿色荧光(图4B)，表达Flk-1，呈棕色(图4C)。阳性率均高于95％。

2.3RT-PCR检测VIII型胶原表达情况

RT-PCR检测发现人BEPCs与人CECs一样，表达VIII型胶原(图5)。

结果表明，本发明实验分离培养的人BEPCs形态成短梭形或多边形，形态上与角膜内皮细胞相似，能摄取Ac-LDL，结合UEA-1，表达CD133，CD34和Flk-1，而且还表达角膜内皮细胞较特异的VIII型胶原。

骨髓内皮祖细胞主要通过密度梯度离心法分离出骨髓单核细胞，通过Fn铺层以及EGM-2培养得到。

EPC缺乏特异的表面标志，最常用的鉴定方法是EPC能摄取AcLDL并结合UEA-1，表面抗原标志表达CD133、CD34和Flk-1，这种细胞称为功能性内皮祖细胞。早期不成熟的EPC表达造血干细胞标志CD133和CD34，进入更分化的阶段后造血干细胞标志渐消失，开始表达内皮细胞标志，如：VE钙粘蛋白、vW因子，CD31和一氧化氮合酶。本发明实验中培养的BEPCs能摄取Ac-LDL，结合UEA-1，并表达CD133、CD34和Flk-1表面抗原。为了进一步提高BEPCs的纯度，也可以用CD133磁珠分选，或者流式分选。

VIII型胶原由角膜内皮细胞分泌，是组成后弹力层的组成成分之一，也是角膜内皮细胞比较特异性的标志，经常用于角膜内皮细胞的鉴定。发明人发现人BEPCs也表达VIII型胶原。当然血管内皮细胞也会分泌VIII型胶原，是BEPCs表达VIII型胶原还是BEPCs已经分化为了血管内皮细胞所以表达VI II型胶原，为了排除假阳性结果，本发明实验中采用了原代第7天的BEPCs，并且做了CD133的鉴定，证明是BEPCs后再行VIII型胶原检测，保证了实验结果的可靠性。

实施例2

BEPCs向角膜内皮细胞诱导分化

1.实验方法

1.1人CECs的培养扩增

取流产胎儿角膜，刮除上皮后将内皮面向下，贴于50ml培养瓶壁，待5分钟后加入DMEM/F12培养液(10％FBS)4ml，润湿角膜片后，即把培养瓶竖立于培养箱内2小时后，放平培养瓶，使培养液淹没角膜。10-13天可将细胞传代。第一代CECs培养用Fn铺层的24孔板，接种密度为5×10⁴个/ml×600μl/孔，以后可5-7天传代，可用Fn铺层6孔板。

1.2人晶状体上皮细胞(Lens epithelial cells，LECs)的培养扩增

取流产胎儿的完整晶状体，置于Transwell的inserts(细胞池)中，将囊膜撕开，平铺于细胞池的膜上，待5分钟后加入少量DMEM(10％FBS)润湿晶状体囊膜，2小时后加足培养液。12-14天可传代，传代后细胞用6孔板培养。

1.3人BEPCs与人CECs隔离共培养

所用BEPCs、CECs均为第1代和第2代。实验分为3组：

第1组，人CECs诱导实验组，细胞池预先用少量培养液湿润10分钟，再接种1×10⁵个/ml CECs，实施例1得到的BEPCs则以5×10⁴接种于铺层的6孔板中，CECs在上，BEPCs在下，进行隔离共培养(图6)，隔离共培养采用Transwell共培养体系，由6孔板和悬挂式细胞池组成，细胞池的底部是聚酯膜(PolyethyleneTerephthalate，PET)，孔径1μm，透明，可允许细胞分泌的各种因子和营养物质等大分子通过，但细胞无法通过，以此起到诱导作用。一般细胞分泌细胞因子是在培养第3天。培养液用含5％FBS的DMEM/F12或DMEM，池内1ml，池外4ml。

第2组，未诱导对照组，用含5％FBS的EGM-2培养液培养，接种密度5×10⁴个/ml，每2天换液一次。

第3组，实施例2得到的人CECs组，用DMEM/F12(10％FBS)培养，接种密度5×10⁴个/ml，每2天半量换液一次。

第4组，人LECs诱导对照组，所有方法同第一组，仅将人CECs换成人LECs。

采用每2天加液或半量换液法，另添加CECs培养上清液加强诱导，细胞密集时予传代。共培养7-14天。

第3天，池内加DMEM/F12或DMEM(5％FBS)1ml，池外加DMEM/F12或DMEM(5％FBS)1ml+第3组中CECs上清液1ml

第6天，池内半量换液，吸走1ml，加新鲜培养液DMEM/F12或DMEM(5％FBS)1ml，池外半量换液，吸走3ml，加DMEM/F12或DMEM(5％FBS)1.5ml+第3组中CECs上清液1.5ml

第9天，同第6天。

所述的角膜内皮细胞培养上清液是为角膜内皮细胞第一代或第二代细胞的培养上清液，这些细胞每隔1-2天加液一次，培养第三天后即可作为上清液用作共培养。

1.4共培养后检测

共培养7-14天后从以下四个方面对诱导的细胞进行检测：

细胞形态变化：光镜观察细胞形态；

泵功能：免疫荧光，RT-PCR检测AQP1表达情况；

屏障功能：电镜观察细胞间的紧密连接，免疫荧光检测Z0-1；

表面抗原标志：免疫组化检测NSE；

阴性对照均采用人皮肤成纤维细胞(购自上海第九人民医院附属第九人民医院组织工程实验室)。

2结果

2.1人CECs的培养扩增

利用培养瓶组织块培养法，可以使CECs贴壁，第4天即可见细胞从组织块边缘爬出，呈短梭形，原代第13天，可见CECs已较密集，形态呈多边形，并分泌大量的细胞外基质，与培养瓶贴附紧密(图7)。此时可予传代。CECs的传代培养需Fn铺层，可较好地维持细胞的多边形形态。CECs至少可传6代，随着代次增加，细胞形态渐呈梭形。

2.2人LECs的培养扩增

晶状体囊膜贴壁非常困难，易漂浮，利用inserts膜的粘附能力，可促进囊膜贴壁。通过inserts组织块培养法可培养出人LECs，形态呈典型立方形。

2.3BEPCs与CECs隔离共培养

10天后倒置显微镜下观察第1组CECs诱导的BEPCs形态呈多边形，呈铺路石样(图8B)，与第3组CECs形态相似(图8C)，第2组未诱导的BEPCs成短梭形或长梭形(图8A)，第4组LECs诱导的BEPCs形态为短梭形或长梭形(图8B)。0.6-3×10⁵个/ml CECs均能起到诱导作用，2-8×10⁴个/ml的骨髓内皮祖细胞均能被CECs良好诱导，而3-7×10⁴个/ml的骨髓内皮祖细胞和0.8-1.2×10⁵个/ml的角膜内皮细胞隔离共培养效果最佳，被诱导的BEPCs形态呈明显铺路石样。

2.4共培养后检测

2.4.1细胞形态及超微结构

扫描电镜观察人CECs诱导的人BEPCs呈多边形，细胞连接紧密无间隙(图9)。

2.4.2泵功能

免疫荧光检测发现人CECs诱导的BEPCs大多数能表达水通道蛋白1(AQP1)，呈绿色荧光。未诱导BEPCs及人LECs诱导的BEPCs均不表达AQP1(图10)

从mRNA水平也检测到人CECs诱导的人BEPCs大量表达AQP1，未诱导的人BEPCs只有微量的AQP1表达(图11)。

2.4.3屏障功能

透射电镜观察人CECs诱导的人BEPCs呈单层生长，细胞间可形成紧密连接(图12)。

免疫荧光检测CECs诱导的BEPCs表达细胞紧密连接相关蛋白-1(ZonulaOccludens-1，ZO-1)，呈绿色荧光；未诱导的BEPCs不表达ZO-1(图13)。

2.4.4表面抗原标志神经烯醇化酶(neurone-specific enolase，NSE)

经CECs诱导的BEPCs大部分开始表达NSE，免疫组化检测见棕色颗粒，颜色较CECs浅(图14)。

结果表明，采用BEPCs与CECs隔离共培养，同时添加CECs培养上清液，可联合诱导BEPCs表达角膜内皮细胞的一些特性，诱导的BEPCs形态上与角膜内皮细胞更接近，初步建立了泵功能和屏障功能，并发生了表型的转化，表达NSE，为进一步角膜后板层的构建和移植提供了实验基础；也就是说，BEPCs与CECs通过隔离共培养，分化得到了一种角膜内皮样细胞。同样的隔离共培养方法下，人LECs不能诱导BEPCs向晶状体上皮细胞方向分化。

CECs分泌的细胞因子在诱导中起着重要作用。

隔离共培养体系联合目标细胞培养上清液诱导是干细胞定向诱导分化的良好的体外研究模型。

本发明实验中采用加液或半量换液法，充分保证了细胞因子的量，不至于出现诱导空白期。被诱导细胞采用低密度接种，保证能被充分诱导，而不会过早出现细胞密度抑制。血清中含有各种生长因子，为了减少这些因子在诱导中的影响，同时又要给细胞提供足够的营养成分，实验中采用含低浓度血清的培养液进行共培养。

目前对干细胞分化状态改变的检测指标主要有三个：形态变化、生理功能分析和组织特异的基因表达。分化状态的改变伴随着明显的形态变化，这是最初步最直观的一个指标。而细胞分化最本质的变化即是否表达了组织特异的蛋白。从临床治疗的角度来看，生理功能的实现是比特异基因表达更具实践意义的一个指标。角膜内皮细胞缺乏特异的表面标志抗原，但在形态上比较独特。呈现六边形或多边形态。角膜内皮细胞还有特殊的泵功能和屏障功能，是维持角膜半脱水状态以及角膜透明的重要因素。

形态上，经CECs诱导后，BEPCs更接近角膜内皮细胞，呈多边形。

泵功能的检测主要用水通道蛋白1(AQP1)衡量。水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)是一类对水分子具有高度选择性的跨膜转运蛋白，主要存在于细胞膜和细胞浆，介导水的快速跨膜转运过程，对维持正常的水代谢和水平衡具有重要作用。角膜内皮细胞和晶状体上皮细胞均能表达AQP1，AQP1在角膜基质到角膜内皮到前房的排水过程起着重要作用。AQP1是衡量角膜内皮细胞泵功能的重要指标之一。免疫荧光从蛋白水平发现BEPCs经CECs诱导后大量表达AQP1，RT-PCR从mRNA水平进一步证明了这一改变，说明诱导后BEPCs具备了一定的泵功能，而晶状体上皮细胞诱导的BEPCs不表达AQP1，说明BEPCs没有向晶状体上皮细胞方向分化。

透射电镜从形态学上证明了诱导后BEPCs细胞间能形成紧密连接。免疫荧光从蛋白水平检测ZO-1(Zonula Occludens-1，细胞紧密连接相关蛋白)，发现诱导后BEPCs能表达ZO-1。细胞间紧密连接和ZO-1是代表角膜内皮细胞屏障功能的重要指标。说明BEPCs通过CECs诱导后，建立了一定的屏障功能。

由于血管内皮细胞与角膜内皮细胞不仅在形态上相似，也具备泵功能，表达VIII型胶原和AQP1，那么经过这样的诱导，会不会使BEPCs变成了血管内皮细胞，而并非角膜内皮细胞呢？这就得从这两种细胞的特异标志进行鉴别：神经烯醇化酶(neurone-specific enolase，NSE)是高特异性存在于神经元及神经内分泌细胞的特殊蛋白质。血管内皮细胞是中胚层来源，不表达NSE。BEPCs为中胚层来源，也不表达NSE。角膜内皮细胞是神经嵴来源，表达NSE。通过免疫组化检测发现，BEPCs不表达NSE，通过诱导后大量表达NSE，说明BEPCs发生了表型的转化，即向角膜内皮细胞方向分化，而不是血管内皮细胞。

实施例3

PCACM的制备和检测

1.实验方法

1.1PCACM的制备

取新鲜猪角膜，75％酒精中浸泡30min，机械法刮去角膜上皮层，浸入含1％TritonX-100的离心管中，摇床上振荡24h，用刀片将角膜片分成4片后换1％TritonX-100再振荡24h，再将角膜片一分为二，TritonX-100振荡24h，换PBS反复振洗至无泡沫。弃上皮层和内皮层。将角膜片用滤纸吸干后放入24孔板中，摊平置于超净台下，紫外线消毒过夜，角膜片自然晾干。将干燥的PCACM加入DMEM/F12培养液(含10％胎牛血清)浸泡，4℃冰箱保存。

1.2PCACM的组织学检测

PCACM用4％多聚甲醛固定24h，常规石蜡包埋切片，苏木素二伊红(HE)染色；常规冰冻切片，Hoechst染色；观察细胞的脱除情况。

1.3PCACM的电镜检测

PCACM用电镜液固定，扫描电镜观察PCACM表面的平整度，透射电镜观察胶原排列及细胞脱除情况情况。

2结果

2.1PCACM的大体形态

PCACM复水后，薄而柔软，有韧性，表面光滑，透明度高，仍能紧贴于24孔板皿底(图15，图16)。

2.2PCACM的组织学检测

HE染色见CACM光整，胶原纤维排列整齐，未见基质细胞残留。Hoechst染色未见蓝色基质细胞核(图17)。

2.3PCACM的电镜检测

扫描电镜见PCACM表面光整。透射电镜观察PCACM胶原排列规则，较致密，呈小波浪状，未见基质细胞。(图18)。

结果表明，利用TritonX-100脱细胞，联合逐步切薄法及自然晾干，可以完全脱除角膜细胞，获取薄而透明的PCACM，具有一定的韧性。PCACM是良好的组织工程角膜后板层构建材料。

实施例4

诱导的BEPCs与PCACM体外构建角膜后板层

1材料和方法

1.1材料

实施例2获得的诱导的BEPCs和实施例3得到的PCACM

1.2实验方法

1.2.1不同接种密度的细胞在PCACM上生长情况

将实施例2得到的经CECs诱导的BEPCs以不用的密度1000个细胞/mm²(即1×10⁵个细胞/孔)，2000个细胞/mm²(即4×10⁵个细胞/孔)，4000个细胞/mm²(即8×10⁵个细胞/孔)，分别接种于PCACM上，并相应接种无PCACM的孔中作为对照观察细胞生长情况。培养液用人CECs上清液：DMEM/F12(5％FBS)(1ml∶1ml)继续诱导培养。接种后3天倒置相差显微镜观察细胞形态。

1.2.2不同体外培养时间的细胞在PCACM上生长情况

将诱导的BEPCs以2000个细胞/mm²(即4×10⁵个细胞/孔)接种到PCACM上，培养液用人CECs上清液：DMEM/F12(5％FBS)(1ml∶1ml)继续诱导培养，体外培养4天、7天和10天，扫描电镜观察细胞在PCACM上的生长情况。

1.2.3细胞与PCACM复合后组织学检测

以2000个细胞/mm²(即4×10⁵个细胞/孔)将诱导的BEPCs接种到PCACM上，培养液用人CECs上清液：DMEM/F12(5％FBS)(1ml∶1ml)继续诱导培养，体外培养一周后多聚甲醛固定，包埋成石蜡块，做石蜡切片，HE染色，观察细胞与材料贴附情况以及PCACM的胶原排列情况。

1.2.4细胞与PCACM复合后电镜检测

细胞与PCACM复合一周后电镜液固定，行扫描电镜观察细胞形态，透射电镜观察细胞与材料贴附情况。

2结果

2.1不同接种密度的细胞在PCACM上生长情况

不同密度的细胞接种3天后光镜下观察，1000个细胞/mm²接种的密度过低，细胞间不能形成有效连接。2000个细胞/mm²接种的密度较合适，可见多边形的细胞轮廓，细胞连接紧密，细胞可培养一周，形态维持良好。4000个细胞/mm²接种的密度偏高，细胞很快达到密度抑制，细胞形态不清，细胞有重叠生长，死细胞较多(图19)。

2.2不同体外培养时间的细胞在PCACM上生长情况

将诱导的BEPCs以2000个细胞/mm²接种到PCACM上培养4天，扫描电镜见细胞成多边形，可见微绒毛，细胞与细胞间空隙大，细胞不能形成有效的连接(图20A)。体外培养第7天，扫描电镜见细胞连接紧密成片，无明显细胞间隙，细胞形态良好(图20B)。体外培养10天，细胞已非常密集。

2.3诱导的人BEPCs与PCACM复合后组织学形态

诱导的BEPCs接种材料一周后，HE染色见载体薄，平整光滑，无角膜基质细胞残留；诱导的BEPCs在PCACM表面生长良好，形成连续的单层，未见BEPCs侵入PCACM；诱导的BEPCs与PCACM紧密贴合，无明显间隙，细胞呈单层，与正常角膜后板层相似(图21)。

2.4诱导的人BEPCs与PCACM复合后超微结构

BEPCs接种PCACM一周后透射电镜见细胞呈单层生长，细胞与材料紧密贴合，细胞间形成紧密连接(图22)。

本发明将诱导的BEPCs接种到PCACM上后，我们仍然用CECs上液对BEPCs持续诱导，体外培养时间控制在一周，时间过短，诱导的BEPCs密度不足以使细胞连接紧密，时间过长，细胞会老化。一周的体外培养时间可使BEPCs与PCACM贴合良好，密度与正常角膜内皮细胞密度相仿，确保了诱导的BEPCs的功能和表型的维持。

通过体外培养一周，可见诱导的BEPCs在PCACM上生长良好，细胞成多边形，PCACM有利于BEPCs的黏附，不影响细胞的生长和增生。透射电镜见细胞间形成紧密连接，细胞与材料贴附紧密。HE染色见细胞成连续的单层生长，与正常角膜后板层相似。

结果表明，将人CECs诱导的人BEPCs接种到PCACM上可体外构建的组织工程角膜薄后板层，合适的体外培养时间是4-10天，尤其5-7天更佳。

实施例5

构建的角膜后板层移植治疗角膜内皮缺损

1材料和方法

1.1材料

实施例4中所得到的角膜后板层

1.2方法

1.2.1手术方法

***全麻，猫右眼为手术眼，消毒，铺巾，手术显微镜下操作。环钻在角膜表面中央压痕直径7.5mm，钻石刀于角巩膜缘9点钟位置行巩膜隧道切口，切口2mm，注入粘弹剂撑起前房，1ml针头折弯30度，稍剪去箭头后从切口进入前房，沿压痕将内皮层-后弹力层撕开，换刮内皮刀，将压痕范围内的内皮层-后弹力层一起刮下来。刮干净后生理盐水冲洗。扩大切口至5mm。取培养皿中细胞材料复合物(即构建的角膜后板层)，细胞面向上，用环钻钻取直径7.5mm的大小，滴1滴粘弹剂，角膜移植镊将植片两边折起，使细胞面在内，轻轻夹住从切口送入前房，用虹膜恢复器轻轻将植片拨开，细胞面向前房。为使植片紧贴角膜内面，可打入空气泡，固定10-20分钟后，注入生理盐水制造前房，用10-0尼龙线在切口处缝2针。术毕，红霉素眼膏涂眼，青霉素钠40万单位和***磷酸钠注射液0.5ml(2.5mg)肌注后送回动物房。术后每周观察，并拍照，测角膜厚度。

实验共分4组，第一组为诱导组：人CECs诱导的人BEPCs与材料复合一周后移植(实施例4得到的角膜后板层)；第二组为未诱导组：人BEPCs与材料复合1周后移植；第三组为材料组，单纯PCACM移植；第四组为模型组，撕除后弹力层内皮层，不植入材料或细胞。每组包括4只猫的4只右眼。

1.2.2术后观察

术后每周观察术眼，并于术后第7，14，21和28天裂隙灯观察和拍照，用超声测厚仪测量角膜中央厚度，角膜厚度数值均以均数±标准差(X±SD)表示。

1.2.3组织学检测

术后1个月，予深麻醉后心脏打空气针处死，取下角膜，4％多聚甲醛固定，行常规组织切片HE染色，观察细胞和材料的位置，并测量植片厚度。

2结果

2.1移植术后观察

术后1周内四组角膜均浑浊水肿，不能窥入瞳孔；2周后BEPCs诱导组角膜开始水肿减退，术后4周角膜较透明，可见瞳孔，中央处尚有少许水肿浑浊，未见新生血管长入。而另外三组在术后4周仍角膜水肿，浑浊，看不清瞳孔(图23)。

2.2角膜厚度测量

未诱导组、单纯材料组和模型组的角膜在术后1个月内水肿严重，始终无法用超声测厚仪测出厚度，BEPCs诱导组在术后3周测出角膜厚度平均882±31.8μm，术后4周水肿进一步减轻，角膜厚度减少为612±20.64μm，接近正常角膜的厚度503.3±16.45μm。

2.3形态及组织学检测

将诱导组取材，大体观察角膜较透明，但植片明显，没有降解，植片边缘高出受体角膜少许(图24)。

HE染色见诱导组的植片紧贴于受体角膜基质层，诱导的BEPCs成单层，紧附于PCACM上，与正常角膜内皮层及后弹力层相似(图25)。诱导组的角膜上皮层完整，基质层未见炎性细胞侵入，植片的PCACM密度较高，胶原排列致密，不同于疏松的受体角膜基质。模型组角膜较厚，上皮层被破坏，内皮层缺如，基质层疏松，也未见炎性细胞侵入(图25)

2.4植片厚度测量

活体超声角膜测厚正常角膜厚度为503.3±16.45μm。利用Image-ProPlus图像处理***中长度测量工具，结合正常角膜厚度，可以计算出植片厚度为39.83±3.85μm，正常后弹力层-内皮层厚度为13.22±2.00μm，植片厚度约为正常后弹力层-内皮层的3倍。

本发明实验采用Descemet撕取内皮移植术(Descemet stripping endothelialkeratoplasty，DSEK)手术方案，将人CECs诱导的BEPCs与PCACM复合体外培养一周后通过5mm的巩膜隧道切口移植到撕去后弹力层和内皮层的猫角膜内面，1个月后角膜开始恢复透明，而未诱导组、单纯材料组和模型组都仍浑浊。说明经诱导的BEPCs在体内可起到角膜内皮细胞的部分生理功能。利用人CECs诱导的BEPCs与PCACM复合构建的组织工程角膜后板层能修复角膜内皮缺损。

本发明实验进一步说明，CECs诱导的BEPCs具备了一定的泵功能和屏障功能，能修复角膜内皮细胞缺损，具有良好的应用前景。

实施例6

混合共培养使BEPCs向角膜内皮细胞诱导分化

1.人BEPCs与猫CECs混合共培养实验方法

1.1猫CECs的培养扩增

取猫角膜，撕下后弹力层和内皮层，剪碎，0.2％胶原酶，37℃摇床140转/分钟消化40分钟，再加2ml0.25％胰酶消化5分钟，同体积DMEM/F12(10％FBS)终止消化，1500转/分钟离心5分钟，培养液重悬后以1×10⁵个/ml接种。7-10天可见细胞铺满培养皿，0.25％胰酶消化，1∶2到1∶4传代，以后每6-8天1∶16传代。

1.2人BEPCs的分离和培养同实施例1

1.3人BEPCs与猫CECs混合共培养

所用人BEPCs、猫CECs均为第1代和第2代。实验分为3组：第1组，人BEPCs组，取第7-10天的细胞，用含5％FBS的EGM-2培养液培养，接种密度均为5×10⁴个/ml；第2组，混合共培养组，人骨髓内皮祖细胞：猫角膜内皮细胞＝1∶2-4，即3-7×10⁴个/ml的骨髓内皮祖细胞和0.8-1.2×10⁵个/ml的角膜内皮细胞，培养液用含5％FBS的DMEM/F12或DMEM；第3组，猫CECs组，用含10％FBS的DMEM/F12培养，接种密度均为5×10⁴个/ml。每2天加液或半量换液，平均5-6天传一次代。共培养7-14天后检测AQP1的表达情况，人BEPCs用鼠抗人核抗体标记。

2.人BEPCs与猫CECs混合共培养结果

2.1猫CECs的培养扩增

用此种培养方法培养可培养出大量的猫CECs，形态呈多边形。

2.2人BEPCs与猫CECs混合共培养

人BEPCs与猫CECs混合共培养7-14天后，免疫荧光检测发现，人BEPCs不表达AQP1(图26A)，用猫CECs诱导后的人BEPCs表达AQP1(图26B)，猫CECs表达AQP1(图26C)。利用人核抗体可以方便地从混合细胞中检测出人BEPCs。

将3-7×10⁴个/ml的人BEPCs和0.8-1.2×10⁵个/ml的猫CECs混合共培养，可以诱导人BEPCs向角膜内皮方向分化。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种诱导形成角膜内皮样细胞的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：将2-8×10⁴个/ml的骨髓内皮祖细胞(bone marrow derived endothelial progenitorcells，BEPCs)和0.6-3×10⁵个/ml的角膜内皮细胞(coneal endothlial cell，CECs)共培养，使骨髓内皮祖细胞分化形成角膜内皮样细胞；优选将3-7×10⁴个/ml的骨髓内皮祖细胞和0.8-1.2×10⁵个/ml的角膜内皮细胞共培养。

2.如权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，共培养中所使用的培养液是含有1-5％v/v血清的DMEM/F12或DMEM；共培养7-14天；优选8-10天。

3.如权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，所述的骨髓内皮祖细胞是同种同体、同种异体或异种异体骨髓内皮祖细胞；所述的角膜内皮细胞是同种同体、同种异体或异种异体角膜内皮细胞；所述的隔离共培养的骨髓内皮祖细胞和角膜内皮细胞之间是同种同体、同种异体或异种异体。

4.如权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，所述的共培养选自混合共培养或隔离共培养；优选隔离共培养。

5.如权利要求4所述的诱导方法，其特征在于，在隔离共培养的第三天再加入角膜内皮细胞培养上清液和新鲜培养液，间隔两天后再通过半量换液法加入角膜内皮细胞培养上清液和新鲜培养液；所述的培养液是含有1-5％v/v血清的DMEM/F12或DMEM；所述的角膜内皮细胞培养上清液是为角膜内皮细胞第一代或第二代细胞的培养上清液。

6.一种如权利要求1-5任一所述的诱导方法获得的角膜内皮样细胞的用途，其特征在于，所述的用途是作为种子细胞制备角膜移植物。

7.一种组织工程化角膜后板层，其特征在于，它包括：

(a)药学上可接受的生物可降解材料；和

(b)如权利要求1-5任一所述的诱导方法获得的角膜内皮样细胞；

所述的药学上可接受的生物可降解材料是角膜脱细胞基质(cornea acellularmatrix，CACM)；优选猪角膜脱细胞基质(porcine cornea acellular matrix，PCACM)。

8.如权利要求7所述的角膜后板层，其特征在于，如权利要求1-5任一所述的诱导方法获得的角膜内皮样细胞的含量为1000-4000个细胞/mm²所构建的角膜后板层。

9.一种制备组织工程化角膜后板层的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(1)将如权利要求1-5任一所述的诱导方法获得的角膜内皮样细胞接种于角膜脱细胞基质(优选猪角膜脱细胞基质)，接种密度为1000-4000个细胞/mm²角膜脱细胞基质；和

(2)培养得到组织工程化角膜后板层。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(2)中加入体积比为1∶1-3的角膜内皮细胞培养上清液和含有1-5％v/v血清的DMEM/F12或DMEM进行培养。

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