CN109402041A - 一种人肾小管上皮细胞分离及培养方法 - Google Patents

一种人肾小管上皮细胞分离及培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种人肾小管上皮细胞分离及培养方法，包括步骤：(a)含双抗预冷PBS清洗组织标本；(b)剪碎并研磨组织，收集研磨后的组织块；(c)混合酶消化，筛网过滤，收集滤液离心；(d)Percoll分离；(e)完全培养基重悬细胞沉淀，接种于培养瓶中；(f)培养数天后更换混合完全培养基继续培养。本发明提供了一种操作简单、高效获得活性高、生长快的人肾小管上皮细胞的方法。

Description

一种人肾小管上皮细胞分离及培养方法
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种人肾小管上皮细胞分离及培养方法。
背景技术
肾小管上皮细胞对于研究肾小管-间质疾病的发病机制，筛选合适治疗药物，并对该细胞生物学特性和病理生理学机制的充分了解具有科学价值，因此提供良好的人肾小管上皮细胞模型是非常重要的。由于在哺乳类动物肾脏至少有15～20种细胞，因此肾小管上皮细胞培养相对于其它组织细胞的培养相对困难，主要体现在分离纯化同种细胞难度大，传代培养时易呈退行性发育。目前对肾小管上皮细胞的研究多采用培养难度低、准备时间短的细胞株，但细胞株离体时间长，细胞会产生变异而影响实验结果，而原代培养具有与体内状态更相近的优点。本发明提供一种相对完善的肾小管上皮细胞分离培养的方法，为研究肾小管上皮细胞缺血、缺氧以及肾脏疾病的发病机制及治疗药物的筛选提供一个良好的实验平台。
发明内容
本发明的目的是建立一种耗时短、高效获得人肾小管上皮细胞的方法。
为了解决上述所涉及到的问题，本发明采取如下方法获得人肾小管上皮细胞：
本发明提供一种人肾小管上皮细胞分离及培养方法，包括步骤：(a)含双抗预冷PBS清洗组织标本；(b)剪碎并研磨组织，收集研磨后的组织块；(c)混合酶消化，筛网过滤，收集滤液离心；(d)Percoll分离；(e)完全培养基重悬细胞沉淀，接种于培养瓶中；(f)培养数天后更换混合完全培养基继续培养。
可选的组织标本为离体2-4 h的新鲜组织；可选的研磨收集组织块的方式为组织块置于重叠的孔径分别为80目和100目的不锈钢筛网上，用注射器内芯在80目筛网上研磨剪碎组织块，无菌PBS充分冲洗筛网，收集100目不锈钢筛网上的组织块；可选的混合酶液为0.025-0.05% 胰蛋白酶、0.05-0.1% IV胶原酶和0.05-0.075% I型胶原酶，消化时间为8-10min/次；可选的筛网孔径大小为200目；可选的Percoll分离方式为选择浓度为45%的Percoll分离液，4℃，15000×g ~18000×g离心25-30 min，离心后吸取近管底第2层细胞悬液。
本发明提供原代人肾小管上皮细胞的培养方法，简化了操作步骤，提高了细胞培养的稳定性和可靠性，可重复性强，为后续实验和原代肾小管上皮细胞培养应用奠定了基础。
附图说明
图1培养48 h细胞图片 (100×)。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优势更清晰地展现，现将具体实施方式进一步阐述。此处所阐述的具体实施方式仅针对本发明进行解释，并不用于限定本发明。
本发明选择新鲜的人肾组织，分离人肾小管上皮细胞。具体操作如下：
1、无菌条件下取出肾组织，置于含预冷生理盐水和双抗的培养皿中，无菌PBS反复清洗3-4次，分离肾皮质和肾髓质；
2、用无菌眼科剪将肾皮质剪碎至约1mm3的小块，无菌PBS清洗2-3次，1500 rpm/min离心5min，弃上清；
3、将组织块置于重叠的，孔径分别为80目和100目的不锈钢筛网上，用注射器内芯在80目筛网上研磨剪碎组织块，无菌PBS充分冲洗筛网，收集100目不锈钢筛网上的组织块，并转至离心管中，充分吹吸后，1500 r/min离心5 min；
4、离心后弃上清液，加入混合酶液于37 ℃水浴消化，消化时间为8-10 min，消化结束后吸管吹打数次，收集上清，同时向未消化完全的组织块中再次加入混合酶液，按照前述步骤消化收集上清，直至组织块消化完全，合并上清液，混合酶液为0.025-0.05% 胰蛋白酶、0.05-0.1% IV胶原酶和0.05-0.075% I型胶原酶；
5、消化后的细胞悬液经200目不锈钢筛网过滤，收集滤液转移到离心管中，1500 rpm/min离心5 min；
6、弃上清液，无菌PBS清洗2-3次，无菌PBS重悬细胞沉淀，缓慢加入45%的Percoll分离液，4℃，15000×g ~18000×g离心25-30 min，离心后吸取近管底第2层细胞悬液；
7、将上述细胞悬液用无菌PBS离心洗涤2次，1000 rpm/min离心10 min；
8、细胞沉淀加入含有20%胎牛血清的DMEM培养液，充分吹打混匀后接种于25 cm2培养瓶中，置37 ℃、5％(m/v)的CO2、饱和湿度的培养箱中培养，24 h后全量更换培养液，以后3d换液1次；
9、刚分离的以肾小管节段以及单个游离肾小管上皮细胞，在倒置显微镜下圆形透亮，体积较大，强折光性好，培养24-48 h的肾小管上皮细胞呈典型鹅卵石铺路样细胞间相连紧密。
以上已经对本发明创造的较佳实施例进行详细阐述，但本发明创造不限定于上述实施例，凡在本发明的精神和原则之内作出任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种人肾小管上皮细胞分离及培养方法，包括步骤：(a)含双抗预冷PBS清洗组织标本；(b)剪碎并研磨组织，收集研磨后的组织块；(c)混合酶消化，筛网过滤，收集滤液离心；(d)Percoll分离；(e)完全培养基重悬细胞沉淀，接种于培养瓶中；(f)培养数天后更换混合完全培养基继续培养。
2.根据权利要求1所述的人肾小管上皮细胞分离及培养方法，其特征在于，所述的组织为离体2-4 h的新鲜组织。
3.根据权利要求1所述的人肾小管上皮细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤b中研磨收集组织块的方式为组织块置于重叠的孔径分别为80目和100目的不锈钢筛网上，用注射器内芯在80目筛网上研磨剪碎组织块，无菌PBS充分冲洗筛网，收集100目不锈钢筛网上的组织块。
4.根据权利要求1所述的人肾小管上皮细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤c中混合酶为0.025-0.05% 胰蛋白酶、0.05-0.1% IV胶原酶和0.05-0.075% I型胶原酶，消化时间为8-10 min/次。
5.根据权利要求1所述的人肾小管上皮细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤c中筛网孔径大小为200目。
6.根据权利要求1所述的人肾小管上皮细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤d中Percoll分离方式为选择浓度为45%的Percoll分离液，4℃，15000 ×g~18000×g离心25-30 min，离心后吸取近管底第2层。
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