CN110241183A - 一种fgfr融合基因的检测方法、试剂盒以及探针库 - Google Patents
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Abstract
本发明开发了基于杂交选择而捕获特定FGFR融合基因序列的方法,采用该方法可以获得成几千倍富集的FGFR融合基因DNA片段,该经富集的FGFR融合基因片段样本可以选择性地应用于各种基因检测技术,特别是可以应用下一代测序技术进行基因突变、缺失、增加、和颠换等方面的检测,以取得高效且准确的结果。
Description
技术领域
本发明涉及一种FGFR融合基因的检测方法、试剂盒以及探针库,属于基因测序技术领域。
背景技术
FGFR(Fibroblast growth factor receptor:成纤维细胞生长因子受体)家族为作为 FGF(Fibroblast growth factor:成纤维细胞生长因子)的受体发挥作用的跨膜型酪氨酸激酶分子的总称。在人类中,属于FGFR家族的分子已知有FGFR1~4一共4种。FGFR蛋白在细胞外区域具有3个Ig-like(免疫球蛋白样)区域、1处跨膜区域,在细胞内区域具有2个酪氨酸激酶区域,在细胞外Ig区域与配体FGF蛋白结合之后,发生二聚化和磷酸化,并激活下游信号通路。已知FGFR家族成员基因的突变、扩增与融合与肺癌、胃癌、乳腺癌、子宫癌、膀胱癌、尿路上皮癌、黑色素瘤、脑胶质瘤等多种实体瘤的发生或发展相关。其中,FGFR可以和多种伙伴基因发生融合导致活化,这些伙伴基因多数存在二聚体化功能域,使FGFR在没有配体的情况下保持激活状态。FGFR3与TACC3(transforming acidic coiled-coilcontaining protein3: 转化酸性含卷曲螺旋蛋白3)的融合在脑胶质瘤、膀胱癌、肺鳞癌以及头颈癌中较为常见,并激活下游MAPK-ERK(mitogen-activated protein kinase丝裂素活化蛋白激酶-Extracellular Signal-regulated Kinase-1细胞外信号调节激酶-1)及JAK-STAT(Janus Kinase/Signal Transducer and Activator of Transcription,Janus激酶/信号转导和转录激活因子)信号通路。15%的FGFR2 融合发现于肝胆管细胞癌中,并存在多个融合伴侣基因,包括CCDC6、CCAR2(又称为 KIAA1967)、OFD1及BICC1等等,融合主要发生在FGFR2细胞质的一端,使其蛋白C端发生缺失。FGFR蛋白N端融合也有发生,如SLC45A3-FGFR2(Solute Carrier Family 45 Member 3),导致整个FGFR2编码区在SLC45A3的启动子控制下,从而导致蛋白过表达。此外,FGFR融合也广泛存在于血液肿瘤中,约20%的多发性骨髓瘤患者会发生FGFR3易位,而骨髓增生综合征也报道过FGFR1OP2-FGFR1嵌合蛋白,造成激酶激活,从而促进造血千细胞的增殖和白血病等恶性肿瘤的形成(非专利文献1)因此以FGFR作为标靶的小分子抑制化合物也在积极的研发过程当中。目前,FGFR络氨酸激酶抑制剂(TKI)主要包括非选择性和选择性两种。其中泊那替尼(ponatinib)作为一种多靶点TKI,针对FGFR2融合的胆管癌二期临床试验当中。此外选择性抑制剂包括针对非小细胞肺癌的AZD4547、针对泛癌种FGFR阳性的NVP-BGJ398、针对多种消化道及泌尿***癌症的JNJ-42756493等等也在积极的I/II期临床试验中。另外,以FGFR为标靶的单克隆抗体抗癌药的开发目前也在进行中(非专利文献 2)。
非专利文献1:Touat et al.2015.Clin Cancer Res.21(12):2684-94.
非专利文献2:Babina&Turner.2017.Nat Rev Cancer.17(5):318-332.
发明内容
本发明的目的是:提供一种用于检测FGFR融合基因的探针库,利用本发明的探针库可以较好地检测到FGFR家族的融合基因,应用于二代测序过程中,能够具有高覆盖率、测序深度均一性好、灵敏度高的优点。
一种FGFR家族的融合基因突变的探针库,其中包括有核苷酸序列如SEQ ID NO.1~189 所示的任意一条探针,或者与其具有相同功能的探针。
优选的:探针库中包括上述的全部探针。
优选的:所述的具有相同功能的探针,是指将SEQ ID NO.1~186任意一条探针经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同杂交捕获功能的探针。
优选的:所述的具有相同功能的探针与原探针具有80%以上相同的碱基,更优选是90%以上相同碱基,再优选是95%以上相同碱基。
本发明提供一种检测FGFR融合基因的方法,所述方法包括以下步骤:
1)获得受试者的DNA样本库;
2)获得所述的检测FGFR融合基因突变的探针;
3)使所述DNA探针库与所述DNA样本库进行杂交;
4)分离步骤3)的杂交产物,然后释放经杂交富集的FGFR融合基因DNA片段;
5)通过高通量测序的方法对FGFR融合基因DNA片段进行检测。
其中,所述步骤1)中的DNA样本库由双链DNA片段组成,并且,所述步骤1)包括:
1-1)提取全基因组DNA,然后将其片段化;或者
1-2)提取mRNA,将其片段化,然后以该经片段化的mRNA为模板合成双链cDNA;
其中,所述受试者为哺乳动物,优选人,且从受试者的细胞、组织或体液样本中提取全基因组DNA或mRNA。
优选地,所述DNA片段的长度为150~600bp;
进一步优选地,所述DNA片段的长度为150~200bp。
一种检测FGFR融合基因的试剂盒,包括有上述的探针库。
有益效果
本发明开发了基于杂交选择而捕获特定FGFR融合基因序列的方法,采用该方法可以获得成几千倍富集的FGFR融合基因DNA片段,该经富集的FGFR融合基因片段样本可以选择性地应用于各种基因检测技术,特别是可以应用下一代测序技术进行基因突变、缺失、增加、和颠换等方面的检测,以取得高效且准确的结果,对相关症状的后续治疗提供有意义的理论及临床指导。
并且,对于将通过本发明的方法富集得到的FGFR融合基因片段用于基于下一代测序技术的基因结构突变检测的应用而言,还具有以下有益效果:
使用本发明的基因富集方法及筛选得到的特定DNA探针库,能够成数千倍地富集FGFR融合基因片段,从而可以应用下一代测序技术、利用该FGFR融合基因片段的测序,而准确地获得FGFR融合基因的各种突变。并且,由于采用下一代测序技术,因此能够一次性检测多个基因的多种类型基因突变;准确性高,传统技术例如基因芯片技术,通常需要重复两次以上才能确定检测结果,而本发明在一次反应中,对单个碱基进行反复测序,保证了数据的精准度,并且缩短了检测周期;敏感性高,本发明提供的方法和试剂盒能够有效地使对于低突变丰度样本的检测灵敏性得到提高,和传统检测技术相比,本发明产生的数据能够达到碱基级的分辨率。
附图说明
图1为本发明技术方案的示例性工艺流程图,其中富集得到目标基因群,并用于基于下一代测序技术的基因结构突变检测。
图2为本发明的重复区域探针设计示意图。
图3为本发明的外显子临近内含子探针设计示意图。
图4是重复区传统探针设计测序结果图。
图5是外显子临近内含子传统探针设计测序结果图。
图6是重复区域本发明探针设计测序结果图。
图7是外显子临近内含子设计本发明探针设计测序结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
在本文中所使用的术语”DNA”为脱氧核糖核酸(英文:Deoxyribonucleicacid,缩写为 DNA)是一种由脱氧核糖核苷酸组成的双链分子。可组成遗传指令,引导生物发育与生命机能运行,其碱基排列顺序构成了遗传信息,所以在遗传病的诊断中具有重要的作用。
在本文中所使用的术语“高通量测序技术”指的是第二代高通量测序技术及之后发展的更高通量的测序方法。第二代高通量测序平台包括但不限于Illumina-Solexa(Miseq、Hiseq-2000、 Hiseq-2500、Hiseq X ten等)、ABI-Solid和Roche-454测序平台等。随着测序技术的不断发展,本领域技术人员能够理解的是还可以采用其他方法的测序方法和装置进行本检测。根据本发明的具体示例,可以将根据本发明实施例的核酸标签用于Illumina-Solexa、ABI-Solid和 Roche-454测序平台等的至少一种进行测序。高通量测序技术,例如Miseq测序技术具有以下优势:(1)高灵敏度:高通量测序,例如Miseq的测序通量大,目前一个实验流程下来可以产生最多15G碱基数据,高的数据通量可以再测序序列数确定的情况下,使得每条序列获得高的测序深度,所以可以检测到含量更低的突变,同时因其测序深度高,其测序结果也更为可靠。(2)高通量,低成本:利用根据本发明实施例的标签序列,通过一次测序可以检测上万份样本,从而大大降低了成本。
本发明中的“突变”、“核酸变异”、“基因变异”可通用,本发明中的“SNP”(SNV)、“CNV”、“***缺失”(indel)和“结构变异”(SV)同通常定义,但本发明中对各种变异的大小不作特别限定,这样这几种变异之间有的有交叉,比如当***/缺失的为大片段甚至整条染色体时,也属于发生拷贝数变异(CNV)或是染色体非整倍性,也属于SV。这些类型变异的大小交叉并不妨碍本领域人员通过上述描述执行实现本发明的方法和/或装置并且达到所描述的结果。
本发明提供一种富集FGFR融合基因片段的方法。具体而言,本发明的方法包括:从哺乳动物例如人的细胞、体液或组织样本中提取基因组DNA或mRNA,经处理或合成cDNA,从而获得片段化的双链DNA作为DNA样本库;此外,针对要富集的FGFR融合基因片段,设计与该FGFR融合基因杂交的DNA探针,从中筛选出多个探针作为DNA探针库;然后,将该DNA样本库与DNA探针库进行杂交,从而从DNA样本库中富集得到FGFR融合基因 DNA片段。根据本发明的具体实施方式,可以先将DNA探针库中的各个探针进行生物素化,然后在杂交后用链霉亲和素磁珠吸附杂交产物,再从磁珠上释放出富集的FGFR融合基因片段。经适应性处理,可以采用下一代测序基因对FGFR融合基因片段进行基因结构突变的检测,以确认FGFR融合基因的各类突变。
常见的FGFR融合包括FGFR1-ADAM18、RHOT-FGFR1、NSD3-FGFR1、BAG4-FGFR1、FGFR2-CCDC6、FGFR2-BICC1、FGFR2-KIAA1598、FGFR2-AHCYL1、FGFR3-TACC3等等 (非专利文献1-3),在FGFR蛋白的N端与C端都有可能出现断裂,造成蛋白持续激活或过表达(非专利文献2,4)。FGFR融合伴侣及断裂位点的多样性,使一代基因检测方法难以有效地捕获所有可能出现的基因例如融合,而通过NGS设计DNA探针库可以一次性全面覆盖包括罕见融合伴侣、罕见断裂位点在内的FGFR基因融合。此外,相对于点突变的检出,基因融合由于需要更大DNA片段的抓取和匹配,对探针的特异性要求更高,相应地,给探针的设计也带来更大的挑战。
非专利文献3:Helsten et al.2016.Clin Cancer Res.22(1):259-67.
非专利文献4:Wu et al.2013.Cancer Discov.3(6):636-47.
下面以富集得到的FGFR融合基因片段用于基于下一代测序技术的基因突变检测为例,示例性地说明本发明。
一、准备mRNA/DNA样本库
1.准备基因组DNA样本(采用此种方式获得的DNA样本库称为“源自全基因组的DNA样本库”)
1.1 DNA提取
DNA提取,包括新鲜组织,新鲜血液和细胞,固定和石蜡样本,商业化公司提取试剂盒。以上均按说明书指示方法操作。
使用分光光度定量仪以及凝胶电泳***检测DNA模板质量和浓度。DNA模板260nm吸光率大于0.05以上,吸光率A260/A280比值在1.8到2之间为合格。
1.2 DNA片段化
将3微克高质量的基因组DNA用低TE缓冲液稀释至120微升。按照组织匀浆机使用说明书,将DNA片段化,片段长度为150~200碱基。
DNA过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
1.3 DNA样本库质量检测
用生物分析仪进行DNA定性定量分析,确认DNA片段长度峰值合理。
2.准备cDNA样本(采用此种方式获得的DNA样本库称为“源自mRNA的DNA样本库”即cDNA样本库)
2.1 mRNA提取
mRNA提取,包括新鲜组织,新鲜血液和细胞,固定和石蜡样本,商业化公司提取试剂盒。以上均按说明书指示方法操作。
使用分光光度定量仪以及凝胶电泳***检测mRNA质量和浓度,吸光率A260/A280比值在1.8到2之间为合格。
2.2 mRNA片段化
采用NEBNext RNA Fragmentation***或者其他商业化公司mRNA片段化试剂盒。
mRNA过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
2.3用商业化公司cDNA合成试剂盒进行mRNA合成第一链以及第二链cDNA。
cDNA过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
3.cDNA/DNA末端修补
将DNA片段进行末端修复可以利用Klenow片段、T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行,其中,所述Klenow片段具有5’-3”聚合酶活性和3’-5’聚合酶活性,但缺少5’-3’外切酶活性。由此,能够方便准确地对DNA片段进行末端修复。根据本发明的实施例,还可以进一步包括对经过末端修复的DNA片段进行纯化的步骤,由此能够方便地进行后续处理。
利用T4聚合酶及Klenow大肠杆菌聚合酶片断,对于cDNA/DNA 5’突出粘末端补平以及 3’突出粘末端打平,产生平末端,用于后续的平端连接。反应在PCR扩增仪中进行,20摄氏度,30分钟。
cDNA/DNA过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
4.在cDNA/DNA样本3’末端加上碱基A
在经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A,以便获得具有粘性末端A的DNA片段。根据本发明的一个实施例,可以利用Klenow(3’-5’exo-),即具有3’-5’外切酶活性的Klenow,在经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A。由此,能够方便准确地将碱基A添加到经过末端修复的DNA片段的3’末端。根据本发明的实施例,还可以进一步包括对具有粘性末端A的DNA片段进行纯化的步骤,由此能够方便地进行后续处理。
反应在PCR扩增仪中进行,37℃,30分钟。
cDNA/DNA过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
5.在cDNA/DNA两端加上接头
cDNA/DNA过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
如使用mRNA→cDNA,进行6和7;
如果是用基因组DNA,直接跳到8。
6.分离出合适长度的cDNA片段
使用电泳凝胶,对照DNA梯度标准,在凝胶上剪切出150-250碱基cDNA片段。
将含有cDNA样本库的凝胶样本过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
7.cDNA片段样本库质量检测
使用生物分析仪,进行cDNA定性定量分析,并确认分离出的cDNA片断长度峰值合理。
PCR条件:置于PCR扩增仪中,98℃预变性30秒,98℃变性30秒,65℃退火30秒,72℃延伸30秒,共循环15次(cDNA样本库)或者4-6次(DNA样本库)。最后在72℃延伸5分钟。
PCR扩增产物过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
8.扩增DNA模板
在本发明的一个实施例中,样本为含微量游离DNA片段的血浆样本,包含极其微量的目标游离DNA片段,第一扩增使得核酸的量能满足芯片/探针杂交捕获的需求
聚合酶链反应(PCR),在PCR扩增仪中进行。
PCR条件:置于PCR扩增仪中,98℃预变性30秒,98℃变性30秒,65℃退火30秒,72℃延伸30秒,共循环15次(cDNA样本库)或者4-6次(DNA样本库)。最后在72℃延伸5分钟。
PCR扩增产物过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
9.扩增后cDNA/DNA样本库质量检测
使用生物分析仪,进行cDNA/DNA定性定量分析,并确认纯化后片段长度峰值合理,约 200bp。
对于得到的cDNA/DNA样本库,如果cDNA小于30纳克/微升,DNA浓度小于150纳克/微升,须将样品经过真空浓缩机低温干燥(低于45℃),再用无核酸酶水溶解至所需浓度。
二、探针的设计
针对FGFR融合基因准备DNA探针库。
本领域技术人员知晓:捕获的特异性受各种因素影响,如捕获探针的设计不佳,捕获条件不理想,基因组DNA中重复序列的封闭不充分及基因组DNA与捕获探针的比例不合适等因素都会影响捕获的特异性、敏感性、测序覆盖率等诸多结果。为了实现目标基因的高度富集和低脱靶率,本领域技术人员需要对探针的类型、长度、序列、杂交条件等进行大量实验摸索,需要通过创造性的探索工作才能够获得最佳的参数组合,没有在相应的证据证明下,其是否能够达到相同的效果,是本领域技术人员无法预期的。同时,对于产生突变的样本进行检测时,由于突变样本在组织样本中所占的比例会因个体而不同,因此,如果突变样本的丰度较低时,较容易导致的问题是探针往往无法准确地与突变的片断杂交,而导致检测的灵敏度低,这也需要对探针序列进行试验进行摸索。
另外,探针捕获测序中探针的特异性和均一性与捕获后的测序质量密切相关:探针特异性过低可导致捕获大量无效区域,大量非目标区域的DNA序列被捕获测序,产生大量无效测序数据,浪费测序成本,而探针特异性过高可导致杂交错配容忍度低,在捕获测序中我们需要研究目标DNA片段中发生的突变、***/缺失、融合等突变类型,对探针的杂交错配容忍度有一定要求,杂交错配容忍度低可能导致突变后的DNA序列无法捕获,导致突变漏检,导致假阴性结果;探针均一性差可导致不同区域DNA序列捕获效果差异显著,部分目标区域捕获效果较好,具有合格甚至过度的测序覆盖,部分目标区域捕获效果较差,测序覆盖较浅甚至不覆盖,引起部分区域漏检,导致假阴性结果。因此在探针设计过程中需要开展大量摸索试验,设计出特异性适中以及高度均一性的探针库。
探针特异性和均一性受多种因素影响,其中有些因素是所有基因探针设计中涉及的共同问题,包括探针长度、探针GC含量、探针overlap区域、杂交条件等因素。探针长度与探针特异性相关,在一定范围内探针长度越长探针特异性越高,探针长度太短可能导致无法将 DNA片段捕获;探针GC含量与探针覆盖均一性相关,探针GC含量过高或差异过于显著,可能导致不同探针结合效率存在显著差异,导致捕获序列不均一;相邻探针间的overlap与探针覆盖均一性相关,探针与探针间不存在overlap的情况,探针间的Gap区域仅依靠探针的连带捕获效应覆盖,可能导致Gap区域覆盖度偏低,影响探针覆盖均一性;杂交条件与探针 GC含量高度相关,不同的杂交条件可能导致探针结合效率存在差异,从而影响探针覆盖均一性。BRCA1/2探针设计综合参考了多次摸索试验结果以及本单位前期研究成果,采用了120bp 长度的DNA探针,绝大部分探针与探针间存在5bp以上的overlap,所有探针GC含量控制在40-55%范围内,在一定程度上保证了探针合适的特异性和高度的均一性。
除了所有基因探针设计涉及共性因素外,FGFR融合基因自身的特征导致了其探针设计的过程需要进行更多的考量:FGFR即使与同一个基因发生融合,也可能存在多个断裂位点。例如,FGFR3可能在第16外显子、17号内含子、18号外显子或18号内含子等不同位置,可以分别与TACC3的第4号、8号或11号外显子发生融合(非专利文献5,6)。因此,在探针设计的时候,充分参考了大量已知文献报道,对于四种FGFR基因常见及罕见融合发生的断裂位置进行全外显子以及重要内含子覆盖,确保各种类型及不同位点的融合发生时都可以成功捕获。
非专利文献5:Williams et al.2013.Hum Mol Genet.22(4):795–803.
非专利文献6:Stefano et al.2015.Clin Cancer Res.21(14):3307–3317.
使用每个探针分别对全基因组进行了富集和扩增并根据结果进行筛选。通过IDTDNA Technologies,单独合成了每一个探针并用质谱分析保证质量,在5’端有生物素(Biotin)。三、DNA捕获探针杂交
1.将DNA样本库与生物素化的DNA探针库杂交
将cDNA/DNA样本库与杂交缓冲液混合,反应条件为95℃5分钟,之后保持在65℃。反应在PCR扩增仪中进行。
然后将该混合物与探针库混合,反应条件为65℃5分钟。将杂交反应置于PCR扩增仪中,65℃孵育24小时。
四、得到经杂交富集的FGFR融合基因片段
1.准备链霉亲和素(Streptavidin-Coated)磁珠
使用Dynabeads链霉亲和素磁珠或者其它商业化公司链霉亲和素磁珠。将磁珠置于混匀仪上混匀,每个样本需要50微升磁珠。
磁珠洗涤:混合50微升磁珠和200微升结合缓冲液,在混匀仪上混匀,使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机,将磁珠与缓冲液分离纯化,缓冲液弃掉不用。重复三次,每次加入200微升结合缓冲液。
2.分离杂交产物
混合1中的杂交反应混合物与2中的链霉亲和素磁珠,反复颠倒试管5次。在室温下振摇30分钟。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机,将磁珠分离纯化。
然后向磁珠中加入500微升洗涤缓冲液,在65℃孵育10分钟,每隔5分钟混匀一次。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机,将磁珠分离纯化。
以上步骤重复三次。
3.cDNA/DNA富集样本释放
将磁珠与50微升洗脱缓冲液混合,室温孵化10分钟,每隔5分钟混匀一次。使用Dynal 磁选机或者其它商业化公司磁选机,将磁珠分离弃掉。此时上清液中即含有富集过的FGFR 融合基因片段cDNA/DNA样本库。
将样本库过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
五、PCR扩增与纯化
因杂交捕获会损耗一定量的核酸,第二扩增能使捕获下的目标片段获得再次扩增以满足上机测序和质控检测的要求。本发明的这一文库构建方法特别适用于总游离核酸不低于10ng 或者常规组织基因组DNA不低于1μg的样本的测序文库构建。
将富集cDNA/DNA样本库进一步扩增,为测序仪器上样做准备。
PCR条件:置于PCR扩增仪中,98℃预变性30秒,98℃变性30秒,65℃退火30秒,72℃延伸30秒,共循环15次(cDNA样本库)或者4-6次(DNA样本库)。最后在72℃延伸5分钟。
PCR扩增产物过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
六、采用下一代测序技术检测FGFR融合基因的突变
使用下一代商业化的测序仪器进行测序,如Roche 454、Illumina Hiseq等。测序结果用已有的测序软件分析包进行分析。
示例性地,使用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS,使用桥式PCR对DNA样本库模板进行扩增:每个DNA样本片段将会在芯片上形成克隆簇,每条泳道上产生数百万这样的克隆簇。使用Illumina HiSeq2000下一代测序***。和传统Sanger方法相比,利用“可逆性末端终结反应”技术,四种dNTP碱基末端被保护基团封闭,并分别以不同颜色荧光标记。
经过QC筛选后,对测序结果使用了Bowtie对所得片段进行序列映射,利用Bioconductor 软件,成功映射片段进行突变分析。
实施例1富集并检测FGFR融合基因
一、构建样本库
1.DNA的提取
按照常规的组织样本的DNA提取方法提取样本DNA。
2.DNA片段化
按照DNA破碎仪使用说明书,将DNA样本片段化,使片段长度为150-200碱基。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63880)将DNA过柱纯化。
3.DNA样本库质量检测
用生物分析仪进行DNA定性定量分析,确认DNA片段长度峰值合理。
4.DNA末端修补
利用T4聚合酶及Klenow大肠杆菌聚合酶片断,对于cDNA/DNA 5’突出粘末端补平以及 3’突出粘末端打平,产生平末端,用于后续的平端连接。反应在PCR扩增仪中进行,20摄氏度,30分钟。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63880)将cDNA/DNA过柱纯化。
5.在DNA样本3’末端加上碱基A
反应在PCR扩增仪中进行,37℃,30分钟。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63880)将cDNA/DNA过柱纯化。
6.在DNA两端加上接头
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63880)将cDNA/DNA过柱纯化。
7.扩增6获得的DNA片段样本库
聚合酶链反应(PCR),在PCR扩增仪中进行。
PCR条件:置于PCR扩增仪中,98℃预变性30秒,98℃变性30秒,65℃退火30秒,72℃延伸30秒,共循环15次(cDNA样本库)或者4~6次(DNA样本库)。最后在72℃延伸5分钟。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63880)将PCR扩增产物过柱纯化。
8.扩增后DNA样本库的质量检测
使用生物分析仪,进行DNA定性定量分析,并确认纯化后片段长度峰值合理,约200bp。
对于得到的DNA样本库,如果DNA浓度小于150纳克/微升,须将样品经过真空浓缩机低温干燥(低于45℃),再用无核酸酶水溶解至所需浓度。
二、针对FGFR融合基因准备DNA探针库
根据上述的探针设计方法和思路,设计并合成探针进行试验,在5’端有生物素(Biotin)。
三、将DNA样本库与生物素化的DNA探针库杂交
将DNA样本库与杂交缓冲液(10mM Tris-HCl,2%牛血清白蛋白,pH8.0)混合(混合后, DNA样本库浓度至多不超过50ng/ul),反应条件为95℃5分钟,之后保持在65℃。反应在PCR扩增仪中进行。
然后以DNA样本库:探针库为1:100的摩尔比,将探针库加入上述混合物,反应条件为 65℃5分钟。将杂交反应置于PCR扩增仪中,65℃孵育24小时。
四、得到经杂交富集的FGFR融合基因片段
1.准备链霉亲和素磁珠
使用Dynabeads(Life technologies,货号:11206D)链霉亲和素磁珠或者其它商业化公司链霉亲和素磁珠。将磁珠置于混匀仪上混匀。
磁珠洗涤:混合50微升磁珠和200微升结合缓冲液(10mM Tris-HCl,2%牛血清白蛋白, pH8.0),在混匀仪上混匀,使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机,将磁珠与缓冲液分离纯化,缓冲液弃掉不用。重复三次,每次加入200微升结合缓冲液。
2.分离杂交产物
混合步骤三中得到的杂交反应混合物与步骤四的1中得到的链霉亲和素磁珠,反复颠倒试管5次。在室温下振摇30分钟。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机,将磁珠分离纯化。
然后向磁珠中加入500微升洗涤缓冲液(磷酸缓冲液,0.1%Tween-20,0.1%SDS,pH7.4),在65℃孵育10分钟,每隔5分钟混匀一次。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机,将磁珠分离纯化。以上步骤重复三次。
3.DNA富集样本释放
将磁珠与50微升洗脱缓冲液(10mM氢氧化钠溶液)混合,室温孵化10分钟,每隔5分钟混匀一次。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机,将磁珠分离弃掉。此时上清液中即含有富集过的FGFR融合基因片段DNA样本库。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63880)将样本库过柱纯化。
五、PCR扩增与纯化
将富集cDNA/DNA样本库进一步扩增,为测序仪器上样做准备。
PCR条件:置于PCR扩增仪中,98℃预变性30秒,98℃变性30秒,65℃退火30秒,72℃延伸30秒,共循环15次(cDNA样本库)或者4-6次(DNA样本库)。最后在72℃延伸5分钟。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63880)将PCR扩增产物过柱纯化。
六、采用下一代测序技术检测FGFR融合基因的基因结构突变
使用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS,使用桥式PCR对DNA样本库模板进行扩增:每个DNA样本片段将会在芯片上形成克隆簇,每条泳道上产生数百万这样的克隆簇。使用 Illumina HiSeq2000下一代测序***,其原理是边合成边测序。和传统Sanger方法相比,利用“可逆性末端终结反应”技术,四种dNTP碱基末端被保护基团封闭,并分别以不同颜色荧光标记。
根据以上方法,采用不同探针进行测试结果如下:
一、不同探针长度检测数据对比
探针长度与探针特异性密切相关,因此我们设计了5种长度的探针,长度分别为80bp、 100bp、120bp、140bp、160bp,使用上述探针捕获后进行NGS测序,测序后对数据进行质控,评估捕获序列ontarget率以及目标区域的覆盖率,ontarget率是指位于目标区域的序列在总测序序列中的占比,覆盖率是指目标区域的覆盖情况,具体质控结果见下表:
长度为120bp的探针相比80bp和100bp长度探针ontarget率以及目标区域覆盖率均显著提高,进一步加长至140bp以及160bp并未显著提升ontarget率以及目标区域覆盖率,但长探针合成效率显著降低,合成成本较高,因此选用120bp长度探针。
二、不同探针overlap长度对比
相邻探针间的相连方式可能与探针覆盖均一性相关,因此我们设计了三种相连形式,分别为10bp gap、5bp overlap和20bp overlap,捕获后进行NGS测序,质控结果如下:
相邻探针间存在5bp overlap相比于10bp gap时50%覆盖率显著升高,与20bpoverlap 无显著差异,综合考虑选用了5bp overlap。
六、检测灵敏度的验证
现有技术中,对于融合基因的高通量测序法存在着检测灵敏度不高的问题,通常灵敏度为约为10%以上,因此如何提高检测灵敏度是一个亟需解决的问题。
针对FGFR-融合突变FGFR3-TACC3构建了突变型和野生型的质粒,按照突变型在野生型中拷贝数比例混合而不同丰度的样品,采用上述的探针库进行捕获、测序考察灵敏性,将采用将SEQ ID NO.187-188的探针作为SEQ ID NO.186探针的对照,考察检测灵敏度,每个样本重复测试3次,结果如下:
从表中可以看出,本发明提供的检测探针库和检测方法能够对低丰度的样本也具有较好的检测灵敏度,能够达到0.5%左右的检测灵敏度水平。
采用优化后的探针库对肿瘤患者的FGFR融合情况检测,下表为检出FGFR融合的44例患者的具体融合情况和位置总结,其中包括肺癌22例,胃癌5例,肝胆癌及乳腺癌各4例,膀胱癌、及食道癌各2例,以及***、结直肠癌、淋巴癌、***癌及神经内分泌瘤各一例。检测FGFR1融合13例、FGFR2融合10例、FGFR3融合17例以及FGFR4融合5例。
从上表中可以看出,本发明提供的检测探针库和检测方法能够较好地对多种癌种中的不同FGFR融合类型进行检测。另外,经过DNA提取、PCR扩增和Sanger测序法,以上突变已被验证。
序列表
<110> 南京世和基因生物技术有限公司
南京世和医疗器械有限公司
<120> 一种FGFR融合基因的检测方法、试剂盒以及探针库
<130> 无
<160> 188
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
accccatgcc ttacgaacca tgccttcctc agtatccaca cataaacggc agtgttaaaa 60
catgaatgac tgtgtctgcc tgtccccaaa caggacagca ctgggaacct agctacactg 120
<210> 2
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tctttcagga atacttggac ctcagccaac ctctcgaaca gtattcacct agttaccctg 60
acacaagaag ttcttgttct tcaggagatg attctgtttt ttctccagac cccatgcctt 120
<210> 3
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cctcccagag accaacgttc aagcagttgg tagaagactt ggatcgaatt ctcactctca 60
caaccaatga ggtaagaact tccttctaga agccccttgt ccttggttgt cttgtgagac 120
<210> 4
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctattaaaac tgactataac cacgtaccca gtgcatatga aattaattca aggaaatcca 60
tttttcccag gtacatgatg atgagggact gttggcatgc agtgccctcc cagagaccaa 120
<210> 5
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaggacacag aatggataag ccagccaact gcaccaacga actgtaaggg ctgttgtctt 60
tcctgccggt gccccagtgg acttgccaca ccagtaatac ctctcctgat gtatctcgtt 120
<210> 6
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttctcctttt gttgcagctg gtccttcggg gtgttaatgt gggagatctt cactttaggg 60
ggctcgccct acccagggat tcccgtggag gaacttttta agctgctgaa ggaaggacac 120
<210> 7
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atatatttag tttttgcatt ttcctctaca tttgcagggg cggcttccag tcaagtggat 60
ggctccagaa gccctgtttg atagagtata cactcatcag agtgatgtgt gagtaactct 120
<210> 8
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tatagactat tacaaaaaga ccaccaatgt aagtcgatgg cagtaacaca gtgggcaggg 60
gcgggggtga ggctcagaat gttccaggaa gaaaggccgt caatgttgag agctgggtgg 120
<210> 9
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tctttcttga tttcagtgta ttcatcgaga tttagcagcc agaaatgttt tggtaacaga 60
aaacaatgtg atgaaaatag cagactttgg actcgccaga gatatcaaca atatagacta 120
<210> 10
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgttcctgag gagcagatga ccttcaagga cttggtgtca tgcacctacc agctggccag 60
aggcatggag tacttggctt cccaaaaagt gagtctttca cattctactt ggctgggtgg 120
<210> 11
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cagggcctct ctatgtcata gttgagtatg cctctaaagg caacctccga gaatacctcc 60
gagcccggag gccacccggg atggagtact cctatgacat taaccgtgtt cctgaggagc 120
<210> 12
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgatgaagat gattgggaaa cacaagaata tcataaatct tcttggagcc tgcacacagg 60
atggtgagta ggaggaaaaa ctgcattcgc ccaaatactc tgcagtttga ttgaatcatt 120
<210> 13
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctaacagtag ctgcccatga gttagaggaa atgaactgat ttgtgaatat gcctactgtt 60
catagatgat gccacagaga aagacctttc tgatctggtg tcagagatgg agatgatgaa 120
<210> 14
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cctgggagaa ggttgctttg ggcaagtggt catggcggaa gcagtgggaa ttgacaaaga 60
caagcccaag gaggcggtca ccgtggccgt gaagatgttg aaaggtgagc ggggaggcgg 120
<210> 15
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gtaagccgct gaaagatttt tatatttagt tctggaattt ccctcactac accccatcac 60
cagatgctat gtgctaatcc cctatttaca catttaggct gacactgggc aagcccctgg 120
<210> 16
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
acccccatgc tggcaggggt ctccgagtat gaacttccag aggacccaaa atgggagttt 60
ccaagagata agtgagtact tctcttggcc atgtcccagg atggagactc agctataaat 120
<210> 17
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tgtgtctttg cattttgtat ccaggtttcg gctgagtcca gctcctccat gaactccaac 60
accccgctgg tgaggataac aacacgcctc tcttcaacgg cagacacccc catgctggca 120
<210> 18
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ccgaatgaag aacacgacca agaagccaga cttcagcagc cagccggctg tgcacaagct 60
gaccaaacgt atccccctgc ggagacaggt aacagaaagt agataaagag tttaaagaaa 120
<210> 19
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tggaagagaa aaggagatta cagcttcccc agactacctg gagatagcca tttactgcat 60
aggggtcttc ttaatcgcct gtatggtggt aacagtcatc ctgtgccgaa tgaagaacac 120
<210> 20
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gaatatacgt gcttggcggg taattctatt gggatatcct ttcactctgc atggttgaca 60
gttctgccag gtatatactg ttctttctct ctgggttttt ttcccttttc ttggttgact 120
<210> 21
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tgtcgtctag ccttttcttt tgcttccctt gttttctagg ccgccggtgt taacaccacg 60
gacaaagaga ttgaggttct ctatattcgg aatgtaactt ttgaggacgc tggggaatat 120
<210> 22
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ctgcaaggtt tacagtgatg cccagcccca catccagtgg atcaagcacg tggaaaagaa 60
cggcagtaaa tacgggcccg acgggctgcc ctacctcaag gttctcaagg tgaggacttt 120
<210> 23
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tcctttcttc cctctctcca ccagagcgat cgcctcaccg gcccatcctc caagccggac 60
tgccggcaaa tgcctccaca gtggtcggag gagacgtaga gtttgtctgc aaggtttaca 120
<210> 24
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tccatcaatc acacgtacca cctggatgtt gtgggtgagt ttgcctctcc tcgtgtggcg 60
gctgcatacc agcccattct tgcttgactc gtttgaaagc atgaacgtta agtcctgttt 120
<210> 25
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ttgctttgat cttttcaggt acgaaaccag cactggagcc tcattatgga aagtgtggtc 60
ccatctgaca agggaaatta tacctgtgta gtggagaatg aatacgggtc catcaatcac 120
<210> 26
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
aaccatgcgg tggctgaaaa acgggaagga gtttaagcag gagcatcgca ttggaggcta 60
caaggtagaa ttaagctttc agaacatcac atttcttaca tttttgttta tttatttatt 120
<210> 27
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ggagcaccat actggaccaa cacagaaaag atggaaaagc ggctccatgc tgtgcctgcg 60
gccaacactg tcaagtttcg ctgcccagcc ggggggaacc caatgccaac catgcggtgg 120
<210> 28
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gaatatgttc ttttgcatac agatgccatc tcatccggag atgatgagga tgacaccgat 60
ggtgcggaag attttgtcag tgagaacagt aacaacaaga gtaagtaact gcccggctcc 120
<210> 29
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
actgccagta ggactgtaga cagtgaaact tggtacttca tggtgaatgt cacaggtgag 60
ttggcccgcc agcactatgc tctctcttct ctgtagccat tacatttttt tggccaagtg 120
<210> 30
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gactaaggat ggggtgcact tggggcccaa caataggaca gtgcttattg gggagtactt 60
gcagataaag ggcgccacgc ctagagactc cggcctctat gcttgtactg ccagtaggac 120
<210> 31
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ttctgcagag ccaccaacca aataccaaat ctctcaacca gaagtgtacg tggctgcgcc 60
aggggagtcg ctagaggtgc gctgcctgtt gaaagatgcc gccgtgatca gttggactaa 120
<210> 32
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
cagaatgcta accgaagata attaaccccc aattctgtgt tagggattga gaaatagacc 60
aggagccctg ccccctcctc tctcatttcc tgaccttcca cactgagaag acctggctag 120
<210> 33
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
atggatacag gaggggtggc agggaaggag aaatttccta gaaaggcgag aagtcctcct 60
tgacatgttc ctgtccataa gaacacatac gcacatgtac gcaccagcag gaagcagaat 120
<210> 34
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gcagggactt gagtggcatc tgcggggagg aggtgggaaa agccacacgt gcccaggaga 60
ctggaatgca gggaaaggac cagaagagcc agaggtagaa ttctgggtat atccatggat 120
<210> 35
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gctggtggag gaggaggagg ttgaaggtca cttgcttgtt ttggatacga cctctgtaga 60
catccaggtt atgtatttcc tccccccggg caggtggaaa tatgaaccta caagcaggga 120
<210> 36
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gggtgtgggg actgatcaga ggaagggcca gaggaaaaga ggggcttcag ggccgacttg 60
gagcttgggc ggcagttcag tggtgtgact cccttcatcg tgtaagagaa gaggctggtg 120
<210> 37
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
attgcagagg tcttgtggag gactggagga gacctgtggg atgcagtttt gcctgtactt 60
tctttcagag ctaagctttc tatcagggat aggcctaata ggtgaagggg tgtggggact 120
<210> 38
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gtggtctgtg cctttttaaa agagtagaga tcatgtgctt ttcagaagat tcctctgggg 60
gtctgcggtg gctacaagag gcgcaccatg ggtgatgggt taggcgcatt gcagaggtct 120
<210> 39
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
aagctgttgt atattctttc ctttaacccc ttgtctaact aaagaatggt aaattccaat 60
tcatttcaga atggaatgca cacatataga gtttcaggtt atgctgaatg tgttttatga 120
<210> 40
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
cactttggaa tactgtaagt aattctgcgc cattgtggac tttggccaca tcatgccact 60
ctcaaaaact tctgattctt tttgacagta ccaagtcagg gggctaagct gttgtatatt 120
<210> 41
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
atccttgaag agtgtgtgtc aagtaaaata ggcgtgcttt agattttcag taattttggt 60
tttgggaaac cggtaccatg gaagagcttt cagatgctga atgtgtaatt tactccactt 120
<210> 42
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
tcactgtgat ttgtatgtgg tagctgactt ctatttatat aacttcaagc tcttaccatt 60
taaatattta tacacaagta tgaatcattg ggacaagcca tggccatcct tgaagagtgt 120
<210> 43
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ggagaggtct gattgaacaa gatgctggac aggtcattgt ggtgatcctt cacgtcttga 60
agatgtctcc ttctgtaata gacaaaagtc acacttttta caagtttctc tttcctcact 120
<210> 44
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
gttaccgtag ccccacagta tagtttgaag tcaggtaatg tgatgccccc agctttgtta 60
tttttgctta ggattgcctt ggctattcag aggctaagtt cttttaagga gaggtctgat 120
<210> 45
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
tcagatggtc gtaggtgtgc ggtaggtgtg tggccttatt tctgggctct ctattctgtt 60
ccattggtct acgtgcctgt ttttatacca gtaccatgct gttttggtta ccgtagcccc 120
<210> 46
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
cgttacacag agggatggca gctctataat taacaggtgt ggtgacatct ccctgcgtct 60
ctgggaaggg aatctggtag gagtttgtgt ctgaggcttg tatagctaca gctacaggcc 120
<210> 47
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
gttctgagag acatgggctc cccaggaaga ccccaggcac ttgtcattga aggatgagga 60
ccgaagcact tatcacctga agcaatcgtg tgagactggg gaacttttcg ttacacagag 120
<210> 48
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
aatgaacagc acacttaccc agtggggtag gctgggagag gacagagagc ccagcctcct 60
tagctggatc aggacagttt aggaaggagg gttgcgtcca tctgagatga gagttctgag 120
<210> 49
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
tgtttgtgga gagtccacct ggtgcctgcc tggctttagg aacccgcagc agtccgagtg 60
gtgtctgggg taagctgagc tgctctggga acacatctcg tgcgtggggt gaatgaacag 120
<210> 50
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
ctgcactgaa atctgtcatc agtagggaat attggtagct gagttatttt tcgagtggta 60
atccgagaat aaaacggcag atcccagcac tcatcgccac ttaatgaacc tgtttgtgga 120
<210> 51
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
tcaaggtgta agtccaatta cgaggactac atgaggctga attattcagc ttagcagatt 60
tggaacctct ctcccagccc tttggagaca acgtgagcca agcctctact tggtgctgca 120
<210> 52
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
gataccacat tagagccaga aggtaagtca tttaatttca cttttcaggt ttgttttggg 60
atttgtctgg gggcagattg ttaaggcctg ttttagaatc agctaccctt gcattgtaaa 120
<210> 53
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
ggggattggt accgtaacca tggtcagctg gggtcgtttc atctgcctgg tcgtggtcac 60
catggcaacc ttgtccctgg cccggccctc cttcagttta gttgaggata ccacattaga 120
<210> 54
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
cgctcgcccc acgacgcgct gctccgtccc caaggactcc gaggaggcgc cggccacgat 60
ggccacggcc acgcagagcg cgagggcgca ggcaggggcg cccatggcgg gggcgggggc 120
<210> 55
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
gggcgtcact cacacccggc ggcccctccg acccggggcc ggttcccgtc cccaacgcct 60
ctgcccgcac gggccggcct ctcccgtgcc tagtgggtcc cttcttacct gccgctcgcc 120
<210> 56
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
acccccgggc gggggacagc tcagctccac agcatccccg ctgccgaaga ccaactgctc 60
ctgctggccg ggctctgggc ccgggacttc tgtggggaag atgggcaacc atgaggcagg 120
<210> 57
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
gagtcctcgt gggaggcatt cagcacctgc agccgctggg gccccaccag gacacgctcc 60
gagggcacca gccctgtgcc atccttgacc cagacagtgg gccccatggg accacccccg 120
<210> 58
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
ggctcctttc tgtagctggc gtggccccag agctcacctg tcacccgcac actgaagtgg 60
cacagtacgc gctgcgtgag ccgctgccgg cagctgtagg ccccggagtc ctcgtgggag 120
<210> 59
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
tcccccattt gggcagcact tcctgggggt gccctcctct ccaccaatga ccagagagac 60
ccccagccgc tcctgaccca cgcagggact cagggagccc ggcactcggc tcctttctgt 120
<210> 60
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
gtcttcgtca tctcccgagg atggagcgtc tgcaaggcag agatggccgc aaccaatgcc 60
caacctgccc caggaggccc ccaggtgccc ctcccagatg gggcagggtc ccccatttgg 120
<210> 61
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
cagcggctgg gcagcggaag cggacggtgt tggcggccgg cacggccagc agcttcttgt 60
ccatccgctc gggccgtgtc cagtaagggg cccctgcggg ccgaggtgcg tgtgaaggcc 120
<210> 62
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
cgcctgccag gcccagagcc accccgccgc gcccaccttg atgcctccaa tgcggtgctc 60
gccgcggaac tccctgccgt tcttcagcca ggagatggag ggagtggggt tgccagcggc 120
<210> 63
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
gtagttgccg cggtccgagg gcaccacgct ttccatgacc aggctccact gctgatgccg 60
cagctgcacc gggacgcggg cgggtgagtg agcggaggca gcaaccaccg cgcctgccag 120
<210> 64
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
caccaccacc gccactgccg cccccacccc cgcgccgccc cagggccctc acccagcacg 60
tccagcgtgt acgtctgccg gatgctgcca aacttgttct ccacgacgca ggtgtagttg 120
<210> 65
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
tcgctgccca gcaccgccgt ctggttggcc ggcagccccg cctgcaggat gggccggtgc 60
ggggagcgct ctgtgggggc agatgacgct caggggccac cccctccctc accaccaccg 120
<210> 66
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
aacgtagggt gtgccgtccg ggcccacctt gctgccattc acctccacgt gcttgagcca 60
ctggatgtgg ggctgtgcgt cactgtacac cttgcagtgg aactccacgt cgctgcccag 120
<210> 67
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
atagaattgc ccgccaggca ggtgtactcc ccggcgtcct caaaggtgac gttgtgcaag 60
gagagaacct ctagctcctt gtcggtggtg ttagcgcccg ccgtctacaa agagagagca 120
<210> 68
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
cagctttggc gtgtcccgag ccagcgtccc ccagacagtg cggagcagca gcagcagcag 60
aagccggtac ctggcagcac caccagccac gcagagtgat gagaaaaccc aatagaattg 120
<210> 69
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
tgggaccagg accgggccag gccaactttg tccccacact gggcacaggg ccaggagtga 60
gggctcaaga agcgggacgg ccgtaagtca caggattccc gtccgtcctg gcagctttgg 120
<210> 70
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
agccagccag tcccacaccg ccaccaggcg cccgggagac accagagcca caggagaggc 60
ctttggggac ccagatggga agtgggctcg agggggctga gggggcccct ctgggaccag 120
<210> 71
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
ggagcggaag ggggctcaga acctcagcac gcgccttgtc tggagggtct cgcagtcagt 60
aacgccagtg agtctagagg gccagaccct ggagagaagg agcccagcag agccagccag 120
<210> 72
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
accagctcct cctcggctgc aaagacatgg gcgttgaggc ctggcctggc cccccccccc 60
acggggctcc catggatgcc cctggcccag agccgcaggc accactggga gcggaagggg 120
<210> 73
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
gcgcaggcgg cagagcgtca cagccgccac caccaggatg aacaggaaga agcccacccc 60
gtagctgagg atgcctgcat acacactgcc cgcctcgtca gcctccacca gctcctcctc 120
<210> 74
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
gcgggcaggc agctcagaac ctggtatcta ctttctgtta cctgtcgctt gagcgggaag 60
cgggagatct tgtgcacggt gggggagccc aggcctttct tgggggggct gcgcaggcgg 120
<210> 75
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
ggctctacat ggtgagcaga gacgaggaga ggggagcccg cctggctgca gagagggctc 60
acacagccca ggaccagcgt gggccgaggt ggggctccag gaggcctggc gggcaggcag 120
<210> 76
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
ggaggtacag ccgggggtca gtgctgggcc agaagggggg gcgttctgac ttccaccagc 60
attgaatgaa gatttttaga atgtttcgtg ccccaaagta ccctaggctc tacatggtga 120
<210> 77
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
cagccttgcg atgcgcacca gtggtgtgtt ggagctcatg gacgcgttgg actccaggga 60
cacctgcttg ggtcagcagg ggcaggttgg cgccgcgtgg gcgacagggc gtggaggtac 120
<210> 78
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
cgctggccct cagcaccact gaccgggccc gagacagctc ccatttgggg tcggcaggca 60
gctcgagctc ggagacattg gccagcgtgg ggccctcccc tgaggacagc cttgcgatgc 120
<210> 79
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
ccccagccac acccaacatc cgccacatcc ctgacggccc ctaaacccag ccgggcctct 60
gactggtggc tgtttcaccc ccaccaccaa gccccctaca gccaacgctg gccctcagca 120
<210> 80
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
aggacgaaga gtgtcaccca cagcctcccg cccttgctgc ccctccagac agggcacctt 60
gagaggggca gtccctgcca tacacccgtc ccaggagcat ctccacagaa ccccagccac 120
<210> 81
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
gcccactctc agcccaccac ggtccccacc ccagcctggc ccagcccttg aggcccagag 60
ccaccacctc caggaagccc tccatgctcc ccctacagcc tgctcgtaag gacgaagagt 120
<210> 82
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
tcaatgccga tggcctccgc catgaccacc tggccgaagc agccctcccc aaggggcttg 60
cccagggtca gcctggcagt ggaggcagag ggaccatgag tgtgcaaact cgcccactct 120
<210> 83
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
ctgtgtcagg cggcggcggc gcccccagcc ctgctctgca cccctggccg ccccctcctc 60
acctttcagc atcttcacgg ctacggtgac aggcttggcg gcccggtcct tgtcaatgcc 120
<210> 84
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
aggttgatga tgtttttgtg tttcccgatc atcttcatca tctccatctc agacaccagg 60
tccgacaggt ccttgtcagt ggcatcgtct gtgcacggag cggggggcct gtgtcaggcg 120
<210> 85
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
acaggggccc tggggacacg ggctcctcag acgggctgcc aggcccagga gggccgccca 60
gccggcacca ccgccgctac cgcacctacc gccctgcgtg caggcgccca gcaggttgat 120
<210> 86
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
gctgctcctc gggcggcttg caggtgtcga aggagtagtc caggcccggg ggccgccgcg 60
cccgcagaaa ctcccgcagg ttacccttgg ccgcgtactc caccagcacg tacaggggcc 120
<210> 87
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
ccagcctact ccacccacac ctgccgccct gcccaccttc tgggaggcca agtactccat 60
gccccgggcc acctggtagg cacaggacac caggtccttg aaggtgagct gctcctcggg 120
<210> 88
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
gcacattgcg ggcagccagg tccctgtgga tgcactgggg aaggggtggg aggcagggct 60
gaagcctctc cacctctccc cgctgctccc agcatctcag ggcagggccc agcctactcc 120
<210> 89
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
ccgcacccca gggccgggct cacgttggtc gtcttcttgt agtagtcgag gttgtgcacg 60
tcccgggcca gcccgaagtc tgcgatcttc atcacgttgt cctcggtcac cagcacattg 120
<210> 90
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
tagactcggt caaacaaggc ctcaggcgcc atccacttca cgggcagccg gccctgggag 60
ggtgtgggaa ggcggtgttg gcgccaggcg tcctactggc atgaccccca cccccgcacc 120
<210> 91
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
gggcacaggc ctggggactg cagctggggt cctggctctg cccagttccc gcctccaccc 60
ctgaagcctg agctctgcag gacacgtaca cgtcactctg gtgagtgtag actcggtcaa 120
<210> 92
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
ggtcaggctg tcctgagact cccaggacag acacctgggc gggcaccagg ggaataggcc 60
agggctgcgc tgctgccccc agggaggggt agaaaccaca cccaggagct ccagggcaca 120
<210> 93
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
cctccttcag cagcttgaag agctcctcca cagggatgcc ggggtacggg gagcccccca 60
gcgtgaagat ctcccagagc aggaccccaa aggaccagct gcaggggaag gtgaggtcag 120
<210> 94
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
ctcccccgcc cagccccgga gggaccccca cccctgagga cccagtggag ggccagggat 60
gccactcaca ggtcgtgtgt gcagttggcg ggcttgtcca tgcggtggcc ctccttcagc 120
<210> 95
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
cgcggcatgc cagcactccc gcatgatcat gtacctgcgg gcagggcgct caggagtgag 60
ccccgccgct tcccgcctta ttcgggaaca gcctgaaggg ctgccagtcc ctcccccgcc 120
<210> 96
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
ggcgggtggc accaggccag agccagcact cacgtcggtg gacgtcacgg taaggacacg 60
gtccaggtcc tccaccagct gcttgaaggt gggcctctgg gagggcgcgg catgccagca 120
<210> 97
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
tcagaagcca taccaagctc cacttcctca gaggcctcca gggacaagac tggaggccca 60
ggcacactca gcaggacccc caacagggcc agcagcagcc gcatctcctt ctcacagctc 120
<210> 98
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
agctcctgct cttgctgctc caggctggga gccaggcagg gctctgtggg cagagggcag 60
aggtcagcag accccgcagc cccatctgag gcagcctcct gtgtacaaag aacacaccgc 120
<210> 99
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
tccagccccg tacacggcca gcaggtgcca ggcgactgcc ctccttgtac cagtggccac 60
cacgctcagc ccgcccacag cacagacgca caggctgccc aagggctact gtcagctcct 120
<210> 100
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
accacctgta atcaaggtga gattctgcag gacgatcatg gagcctcgtg ccaggcagag 60
gtagcggcca gcatcctcag gtaggaagct ggcaatctct aggcggcccc tccagccccg 120
<210> 101
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
cgttgctgga ggtcaaggag tctacatcag ggacagaggg aagcatctaa ggtccaagag 60
gggcaggtct gtctccccag gcatcccttc actccctgct agagtctctt accacctgta 120
<210> 102
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
gtgatcagat gagcagcagc ggggacacaa gtccttggag acctactgac cttgctgggg 60
gtaactgtgc ctattcgagg ggtccctatg ggacttgggg tcctcatcat cgttgctgga 120
<210> 103
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
actgcatgca gtttcttctc catgcgctgg gggtgtgtcc agtagggtgc tggagggcag 60
gggaaggccc ctagaatgac cgtgtgttcc cacacaggcc tcctcttctc agtgatcaga 120
<210> 104
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
aatgcctcca atgcggttct ccccatgaaa ggcctgtcca tccttaagcc agcggatggt 60
gggcgtgggg ttgcctgcag ctggacagcg gaacttgacg gtgttccccg caggtactgc 120
<210> 105
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
atcgcttcac tcattcgatt gatttatagg tatgcttgta ggtatgaggg gactgatgaa 60
ggaatgaaaa tgggggagca gacggtcttg gaacccagag actcacccga atgcctccaa 120
<210> 106
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
tttacaaatg gagttgctga ggctgagagg ttaagtcact tgccagagag tagcagaagg 60
ggaaccagag ctgcccaggt ccacagtcca gggctccttc cggggccccg caatcgcttc 120
<210> 107
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
tctgagactc agttgcctca tgacagcatg gagccgaccc tgcagggtct catcaagacg 60
atgagatgct aaggcttatg cagaccaacc agtcagtgat tcttctccct ttacaaatgg 120
<210> 108
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
atggcacaaa ggagtaggct ccccagggcg cttgagcctt gggtttgagc ctttggaatt 60
ttagctctcc ctctccctag ctgtgctact ttgagccaac ccttgccttc tctgagactc 120
<210> 109
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
cggaccatgt ccaccaaggg ggccagagga ccaggaggct agatcctcat cctgcccaca 60
gggctcttgt caagctctct aggccctgag aacatcaggc ccaggccaag gactatggca 120
<210> 110
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
gttctctacc aggcaggtgt atgtgccgcg gtccgagggc accacgctct ccatcacgag 60
actccagtgc tgatggcgca gctgcaggca gagagagtgt ccgggaccac cggaccatgt 120
<210> 111
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
caccaagagg gcacaactga gcccaaaatg ggtcaggcct cccctgttcc cagccccgcg 60
ctcacccagc acatctagca ggtagttata gcggatgctg cccacagcgt tctctaccag 120
<210> 112
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
gcagacctct gctcctccag ccccacacta acccctgtgc tttcccctga cccacctgct 60
caccaagctg cctgactcat ctgagtccat cctgcctgcc agactagacc ccaccaagag 120
<210> 113
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
aaacgccacg ccctacgaat atgctggcct gcaagtgcag ggcgtttgtt atactcaggc 60
cctccgctcg ggctgcgccc tctgcctgga tgtccttctt gtttttcctc ttggcagacc 120
<210> 114
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
ttgtctgtct cctgcttacc ctgcttaaac cttccctggc tccctattgc ttcgggtcaa 60
ggacaacatc tcagcctagc attcaaaacc ctccaccacc tggctcccca tataaacgcc 120
<210> 115
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
ggaccgggcg agacagtcaa ccctgaccac cggcacccat agaagcaccc tgtttgcctc 60
cctccagcct tcctcaagtt caagggaggg acctttctgc agcttcttgt ctgtctcctg 120
<210> 116
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
atcgctgtac accttgcaca gcagctccac gtcgctgccc accacggctg tggtgttggc 60
cgggagcccg gcctgcagga tgggccggtg cggggaccgc tctggggacc gggcgagaca 120
<210> 117
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
agggtgcacc ttttaccttt aggacttgca cataggggaa accgtcggct ccgaagctgc 60
tgccgttgat gacgatgtgc ttcagccact ggatgtgggg ctgggcatcg ctgtacacct 120
<210> 118
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
gggacatgct ctggggtcac agcagggcct ggggccacac tgtggccaac agggaagctg 60
gggagccccc caacccaagg tgggagaaga atggggccca ggctgcagca gggtgcacct 120
<210> 119
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
aggccgatgg aattgcctgc gaggcaggtg tactcgcctg cgtcctcggc tgacacgttc 60
cgcaggtaca ggacctccac ctctgagcta ttgatgtctg cagtctgggg tgggggacat 120
<210> 120
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
accacccaac aggccacagc ccccactgct ggcccagagg ggcatctcgc agcatctcct 60
ggcccttcag gtgctcacct ggcagcaccg tgagccaggc agactggtag gagaggccga 120
<210> 121
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
gtcacatgga cggccacgtg tggagaggca cagaggggct gtcatacagc tcaaacccac 60
aaatccacac actgcccccc aggccagacc ccacaggcca acagagactg accacccaac 120
<210> 122
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
actggccgcc ccgtgcaccc taactcagtc cctcccagct cccaacatat gtggggacac 60
acacggagga agctgtagtt atgcccagtc ccaggcaccc acacctcagc agacggtcac 120
<210> 123
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
gcgtacagga tgatgtccgt atacctggcc tcgggcgctg ctgcggtcca tgtggggtcc 60
tcctctgccc tcgcacatgg acacacacag acagacaaac tggtcagtgg tgagactggc 120
<210> 124
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
gggagagctt ctgcacagtg gcgggcgggc gggggtgccg gccgtggagc gcctgccctc 60
gatacagccc ggccagcagc aggagcacag ccaaggccag ggagcccgac gcgtacagga 120
<210> 125
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
tccagggaga actgcaaagt gggagacttg gttctgcctg ctggagtcag gctgtcacat 60
gtgaggtggg ggatgcgccc agtacctgtc gggccagagg gaagcgggag agcttctgca 120
<210> 126
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
ggtcgagagg tagatctaga ctcacgaggc cggcgagcaa ggcggggccg ctggaggaga 60
gacgcacgcc tcgtaccagg gatgagcttg acttgccgga agagcctgac tccagggaga 120
<210> 127
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
gttgatgatg ttcttgtgtc ggccgatcag cttcatcacc tccatctccg agaccaggtc 60
ggccaggtcc ttgtcagagg cgttgtctgt aagggcagca gacggggtga agaggctgcc 120
<210> 128
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 128
ggagtggagg gagcgtggag aggctgccaa agctttggct ctgcacccta acggcccgtg 60
cagccagccc cgcctcggcc ccaccttcct gggtgcagac accaagcagg ttgatgatgt 120
<210> 129
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
ccgtcggggc tgaggtcggg gcctgggggg cgccgggccc gcaggaactc ccgcaggttt 60
cccttggcgg cgcactccac gatcacgtac aggggccctg cagagggagt ggagggagcg 120
<210> 130
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 130
agccctagcg cctgtacctt ccgggactcc agatactgca tgcctcgggc cacctggtag 60
gcgcaggaga ccaggactgg gaaggagagc ggcccctcac tgctccgagg accgtcgggg 120
<210> 131
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 131
aatgcctggg gacactgagg tggggtcatg aaaaagagca gagagggaga agtcgggaca 60
ttgaatgcca caggcctgag agtggagctg gagagactga gaggggctca gagccctagc 120
<210> 132
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 132
cactttacag aggaggaggt caaggtttag aaacggggag tgccttctcc tgcgtcccct 60
ctcccctctg gggaagggtg aggaacgagt ggggaatgca ggaaagcgtg aatgcctggg 120
<210> 133
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 133
ccggtggata cactgcaggg agcgggggct tgggtgcctc aggacacctg gcctggagtt 60
gagcacacac caccccccag caggcccggg ggcaggggcc ctccacccac tttacagagg 120
<210> 134
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 134
ttgctggttt tcttatagta gtcaatgtgg tggacgccgc gggccagccc aaagtcagca 60
atcttcatca cattgtcctc agtcaccagc acattgcggg cagccaggtc ccggtggata 120
<210> 135
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 135
tggaggggag agagggcctc agtgcagagt cccacaggtc ctcgtgcctg ccaccccggg 60
cccagtgccc ctccaccccc atccagttct gccccatctc cctcacgttg ctggttttct 120
<210> 136
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 136
gtggggtagg acagtgaccg ccggcaggac tcacacgtca ctctggtgtg tgtacacccg 60
gtcaaacaag gcctcgggcg ccatccactt cacaggcagg cggccctgga ggggagagag 120
<210> 137
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 137
ggaatgggct cctcctggag tctgggccca ctcgggtccc agaccaaatc tgaaggagcc 60
ctcgagcgca tgactcctgg ggccacgtga ctttgggcag tgccttgccc tttttgtggg 120
<210> 138
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 138
gatcccaaaa gaccacctgg aggtagggcc agggctcagt gtggctcagc gccctcccga 60
cgaccggggc taggacgggg gaccccacag acatgaccca ccacagctgt tggggaatgg 120
<210> 139
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 139
gtgtgggggt cggtccatcc gatgtccctc ccgcagcagc gagaacagct cctccaccgg 60
gatgccagga tacggggagc ccccgagggt gaagatctcc catagcagga tcccaaaaga 120
<210> 140
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 140
gttagtgttg tccttctggc cgggacacac cctgaggcca tggtcagggc agaggaggag 60
gaggactgga aagtggggtc gagggcaggg tgaggcctca cagctctggg gggcagtgtg 120
<210> 141
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 141
ggaggaagag gaggaggagg aagaggagga ggaggaagag gaggaggaag aggaggagga 60
ggaagaggag gaggaggaag aggaagagga ggaggaggac gaggagttgt tgttagtgtt 120
<210> 142
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 142
gaaggaggag gaagaggagc aggaggagaa ggaggaagag gaggaggagg aagaggagga 60
ggaggaagag gaggaggagg aagagaagga ggaggaagag gagcaggagg agaaggagga 120
<210> 143
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 143
tcatcagtag aagccaggcc aggacactcc actaggctga ggaggaggaa gaggaggagg 60
aggaagagga gcaggaggag gaggaggaag agaaggagga ggaagagaag gaggaggaag 120
<210> 144
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 144
cgagaggtgg ggcggagggt cacagggagc ctcaggcctt caggaggaag gggaggaccg 60
ggggttctct gggtggggag gagtttggtg gggagtttga tgagggatag gagggtcatc 120
<210> 145
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 145
tcagagacgg ccagcaggac cttgtccagc gcctccacca gctgcttgaa ggtaggcctc 60
tgggagggcg ctgcgtgcca gcactcacgc atcagcccgt acctgcgaga ggtggggcgg 120
<210> 146
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 146
cctctgcagc gcccgggatg ggacggggcg catgtccacg cggtcaggcc agatgaggcc 60
tggaggggag caggcagagg gaggtggtgg gtgggagggg ctgtacctcc tcagagacgg 120
<210> 147
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 147
gaggattccg tcttctctca tgagccgctg cccgaggagc cctgcctgcc ccgacaccca 60
gcccagcttg ccaatggcgg actcaaacgc cgctgactgc cacccacacg ccctccccag 120
<210> 148
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 148
tcgctgcttc ctctcgccca tcacaggagt acctggacct gtccatgccc ctggaccagt 60
actcccccag ctttcccgac acccggagct ctacgtgctc ctcaggggag gattccgtct 120
<210> 149
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 149
cgtggccttg acctccaacc aggtaaggct gcccgtgcca gagccagagc tcaggccgtc 60
cccactgcgt gcacgcacct ccctgagcag ggaggagggg cccggcccat cgctgcttcc 120
<210> 150
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 150
cctgacctta cagtcctgcc gcaggtacat gatgatgcgg gactgctggc atgcagtgcc 60
ctcacagaga cccaccttca agcagctggt ggaagacctg gaccgcatcg tggccttgac 120
<210> 151
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 151
gctgtaagcc cgaggagatg tcggaggccc tgagccaggc cttggggcaa gagtgggctt 60
gaggggcagg gggctagact agagagtatc catctccagg agacgtccct gaccttacag 120
<210> 152
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 152
ggagatcttc actctgggcg gctccccata ccccggtgtg cctgtggagg aacttttcaa 60
gctgctgaag gagggtcacc gcatggacaa gcccagtaac tgcaccaacg agctgtaagc 120
<210> 153
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 153
gcactgccct gggtagagga tttgtgctgg gggaggggag gcggagaagc tctaacaccc 60
tgtggctctc cgcccatttg caggtggtct ttcggggtgc tcctgtggga gatcttcact 120
<210> 154
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 154
gactgaggag tcctctttct gccccagaga gaaaaacaaa acattgtctg tggccattcc 60
ctctgctcca gatgttgaaa ggctgatctg ttctccatgc tgtctcctgg cactgccctg 120
<210> 155
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 155
ttatttgacc ggatctacac ccaccagagt gatgtgtgag tttgtaatag caattgccag 60
ggaggtgtgg gatagagagc ttctagcact gtagagtcct gctttctccc tggactgagg 120
<210> 156
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 156
ccacccccca gtcccttccc acctgtgccc tcatggccct gcctggggcc actccaacct 60
cccctgtgct gctttcaggg ccgactgcct gtgaagtgga tggcacccga ggcattattt 120
<210> 157
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 157
tcaccacatc gactactata aaaagacaac caacgtgagt gccgacaagg ccgccctgtg 60
ctggtggttt catctgagaa gcaaggagtg gggtgggctg agaacccacc ccccagtccc 120
<210> 158
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 158
caacccagag gagcagctct cctccaagga cctggtgtcc tgcgcctacc aggtggcccg 60
aggcatggag tatctggcct ccaagaaggt gtggaacctg aaggctcccc tgggtaatgc 120
<210> 159
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 159
tgcctgcagg tcccttgtat gtcatcgtgg agtatgcctc caagggcaac ctgcgggagt 60
acctgcaggc ccggaggccc ccagggctgg aatactgcta caaccccagc cacaacccag 120
<210> 160
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 160
tcatcaacct gctgggggcc tgcacgcagg atggtgggtg ccggccagac tggctttccc 60
tgcccagcgg ggagaagatc tgagctgggg tatcagtccc aaggcctctc tcagccacag 120
<210> 161
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 161
taaatgagtc tcaacgtgtt ctttaaagcg gacgcaacag agaaagactt gtcagacctg 60
atctcagaaa tggagatgat gaagatgatc gggaagcata agaatatcat caacctgctg 120
<210> 162
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 162
agtttggatg aagtggggag gagagaatca agtcccaggg aaaagcagcc cctcgacaca 60
taccccactc ccttagcctt tatcctgccc tcctcccttc ccaagtaaat gagtctcaac 120
<210> 163
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 163
tggtcaggtg tttatcctgg atccatcgct tgcaggcttt cctcaccaca tccctgccca 60
ctcactacca cctattgcaa caacggctcc catgagaggg aagagaaaac aagtttggat 120
<210> 164
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 164
tgctgcccac acctgctccg ctgcctgctt ggggttacct gggagtggag ggggtgttct 60
gcaccttgag attgttctat gacgtcactc tgttccttgg cgtcaacctg ggctgtggtc 120
<210> 165
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 165
aagatgttga agtgtaagtg atgcttctgt ccttgcaaag aaaatcttgt cccattccaa 60
gcaaacagca ggcctcgggc ccagcagaac agcttctctg gtgcctttgc tgcccacacc 120
<210> 166
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 166
aaagactggt cttaggcaaa cccctgggag agggctgctt tgggcaggtg gtgttggcag 60
aggctatcgg gctggacaag gacaaaccca accgtgtgac caaagtggct gtgaagatgt 120
<210> 167
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 167
tcattccact ttctgctcgc agttgggtga aatacagaga ggtggagatg gggtgcctct 60
caaggtttga acttcaccag ccccaactta tgccactctc tgtttccccc gaaagactgg 120
<210> 168
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 168
actttgactc ccaacttttt gaaggcattc cttgcttgct attctagtgg tggaaggtgt 60
gtatactaac accttctggg cggtgaaggt tcatgaaatg cctgcagaaa cattcattcc 120
<210> 169
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 169
tctggttcgg ccatcacggc tctcctccag tgggactccc atgctagcag gggtctctga 60
gtatgagctt cccgaagacc ctcgctggga gctgcctcgg gacaggtaat aatactttga 120
<210> 170
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 170
tacaagatga agagtggtac caagaagagt gacttccaca gccagatggc tgtgcacaag 60
ctggccaaga gcatccctct gcgcagacag gtaacagaaa gtagatgggg gatttgcaca 120
<210> 171
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 171
agccctggaa gagaggccgg cagtgatgac ctcgcccctg tacctggaga tcatcatcta 60
ttgcacaggg gccttcctca tctcctgcat ggtggggtcg gtcatcgtct acaagatgaa 120
<210> 172
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 172
tatacgtgct tggcgggtaa ctctatcgga ctctcccatc actctgcatg gttgaccgtt 60
ctggaaggta cacactgtaa cttctcctct cgatgtcctg ccctcgccac gggcacgggg 120
<210> 173
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 173
gtccattttg cttccgttgt ctcttctaga ctgctggagt taataccacc gacaaagaga 60
tggaggtgct tcacttaaga aatgtctcct ttgaggacgc aggggagtat acgtgcttgg 120
<210> 174
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 174
acccgcagcc gcacatccag tggctaaagc acatcgaggt gaatgggagc aagattggcc 60
cagacaacct gccttatgtc cagatcttga aggtaatcat ggcaccagtc ttcgtgggcc 120
<210> 175
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 175
catcttccac agagcggtcc cctcaccggc ccatcctgca agcagggttg cccgccaaca 60
aaacagtggc cctgggtagc aacgtggagt tcatgtgtaa ggtgtacagt gacccgcagc 120
<210> 176
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 176
ggcaactaca cctgcattgt ggagaatgag tacggcagca tcaaccacac ataccagctg 60
gatgtcgtgg gtaagagggc agaggcagca ggaggaatga gtttagtggg aagagccagg 120
<210> 177
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 177
tggggcctgc attttcctct ggaccctcaa tgtatccctt tggcatttcc cctcaggtcc 60
gttatgccac ctggagcatc ataatggact ctgtggtgcc ctctgacaag ggcaactaca 120
<210> 178
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 178
ctgcgctggt tgaaaaatgg caaagaattc aaacctgacc acagaattgg aggctacaag 60
gtacgtgtgt gtgcatgcga aagttagagt aatgggaaca ggggaggccg agttaggaag 120
<210> 179
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 179
gctccatatt ggacatcccc agaaaagatg gaaaagaaat tgcatgcagt gccggctgcc 60
aagacagtga agttcaaatg cccttccagt gggaccccaa accccacact gcgctggttg 120
<210> 180
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 180
ttgggcagat gggcaagaca cctccaggtc ctggcctggg ccctgctcct gagcctgacc 60
agctgctcct ctccaccctg cctgtctctc ttggctttcc ccgggcagcc gtagctccat 120
<210> 181
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 181
tgggcattgg gtttaagagg ggaggggaag gctgaaaggg gaggaagagg agggcacatg 60
gggtcacggt gcctgttctg ctaagtgcca ggcactgctc acaggtgttg ggcagatggg 120
<210> 182
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 182
tcggaggatg atgatgatga tgatgactcc tcttcagagg agaaagaaac agataacacc 60
aaaccaaacc gtatgcgtga gacactgttt cctatcttac tgccctttgg gtctgggcat 120
<210> 183
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 183
ggaggtggag gtgcaggact ccgtgcccgc agactccggc ctctatgctt gcgtaaccag 60
cagcccctcg ggcagtgaca ccacctactt ctccgtcaat gtttcaggtt ggtagccaag 120
<210> 184
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 184
gtgacctgct gcagcttcgc tgtcggctgc gggacgatgt gcagagcatc aactggctgc 60
gggacggggt gcagctggcg gaaagcaacc gcacccgcat cacaggggag gaggtggagg 120
<210> 185
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 185
ctctccctgt cttcctctct cgccccttgg cttcccttcc cggccccgtg gtggctgcag 60
cccagccctg gggagcccct gtggaagtgg agtccttcct ggtccacccc ggtgacctgc 120
<210> 186
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 186
tctaactgca gaactgggat gtggagctgg aagtgcctcc tcttctgggc tgtgctggtc 60
acagccacac tctgcaccgc taggccgtcc ccgaccttgc ctgaacaagg taaggtgctg 120
<210> 187
<211> 121
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 187
agctggaagt gcctcctctt ctgggctgtg ctggtcacag ccacactctg caccgctagg 60
ccgtccccga ccttgcctga acaaggtaag gtgctgcctg atgcggttac tcatgtttac 120
g 121
<210> 188
<211> 121
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 188
gcttaggtaa agcttgcatc taactgcaga actgggatgt ggagctggaa gtgcctcctc 60
ttctgggctg tgctggtcac agccacactc tgcaccgcta ggccgtcccc gaccttgcct 120
g 121
Claims (9)
1.一种FGFR家族的融合基因突变的探针库,其特征在于,其中包括有核苷酸序列如SEQID NO. 1~186所示的任意一条探针,或者与其具有相同功能的探针。
2.根据权利要求1所述的FGFR家族的融合基因突变的探针库,其特征在于,探针库中包括上述的全部探针。
3.根据权利要求1所述的FGFR家族的融合基因突变的探针库,其特征在于,所述的具有相同功能的探针,是指将SEQ ID NO. 1~186任意一条探针经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同杂交捕获功能的探针。
4.根据权利要求1所述的FGFR家族的融合基因突变的探针库,其特征在于,所述的具有相同功能的探针与原探针具有80%以上相同的碱基,更优选是90%以上相同碱基,再优选是95%以上相同碱基。
5.一种检测FGFR融合基因的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
1)获得受试者的DNA样本库;
2)获得所述的检测FGFR融合基因突变的探针;
3)使所述DNA探针库与所述DNA样本库进行杂交;
4)分离步骤3)的杂交产物,然后释放经杂交富集的FGFR融合基因DNA片段;
5)通过高通量测序的方法对FGFR融合基因DNA片段进行检测。
6.根据权利要求5所述的检测FGFR融合基因的方法,其特征在于,所述步骤1)中的DNA样本库由双链DNA片段组成,并且,所述步骤1)包括:1-1)提取全基因组DNA,然后将其片段化;或者1-2)提取mRNA,将其片段化,然后以该经片段化的mRNA为模板合成双链cDNA;其中,所述受试者为哺乳动物,优选人,且从受试者的细胞、组织或体液样本中提取全基因组DNA或mRNA。
7.根据权利要求5所述的检测FGFR融合基因的方法,其特征在于,所述DNA片段的长度为150~600bp。
8.根据权利要求5所述的检测FGFR融合基因的方法,其特征在于,所述DNA片段的长度为150~200bp。
9.一种检测FGFR融合基因的试剂盒,包括有权利要求1所述的探针库。
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