CN106676169A - 一种用于乳腺癌易感基因brca1和brca2突变检测的杂交捕获试剂盒及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开的一种用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突变检测的杂交捕获试剂盒，包括杂交用试剂、PCR扩增试剂及富集度检测试剂；其中所述杂交用试剂包括如下SEQ NO.1‑SEQ NO.173探针混合物，且摩尔数比为SEQ NO.1:SEQ NO.(2‑172):SEQ NO.173＝1：1：1,检测时，浓度为2nM each的上述探针混合物用量为1μl。本发明的试剂盒可用于高灵敏度、高通量、低成本、易操作的BRCA1和BRCA2基因全外显子突变检测，协助临床医生筛选出具有乳腺癌易感风险的个体，达到预防乳腺癌发生的目的。

Description

一种用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突变检测的杂交捕获 试剂盒及其方法
技术领域
本发明涉及基因突变检测领域，具体涉及为一种用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突变检测的杂交捕获试剂盒及其检测方法。
背景技术
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，被称为女性杀手，发病率仅次于肺癌。其中遗传性乳腺癌约占乳腺癌发病率的5％～7％。患乳腺癌及卵巢癌的最大风险因素是乳腺癌易感基因BRCA1或BRCA2基因发生遗传性突变。BRCA1和BRCA2是两个肿瘤抑制基因，其结构、功能的异常与乳腺癌、卵巢癌的发生密切相关，不仅能抑制细胞生长，还参与细胞周期调控、基因转录调节、DNA损伤修复以及凋亡等多种重要细胞活动，在维持基因组稳定性中起重要作用。由于BRCA1和BRCA2基因的突变与遗传性乳腺癌的发生有一定的联系，所以对BRCA基因进行检测，寻找其致病突变位点，可帮助筛选出高危人群，有助于风险评估和早期诊断。
目前，用于BRCA基因突变检测的方法主要有高分辨率熔解曲线法(HRM)、多重PCR扩增捕获技术、限制小片段长度多态性分析法(RFLP)和DNA直接测序法。
高分辨率溶解曲线法是一种基于PCR新型技术，它是在有荧光嵌合染料的情况下PCR扩增片段，扩增后的产物通过一个快速的可控的加热处理开始熔解。荧光水平在升温的过程中实时监测，染料随着双链DNA的熔解，荧光信号逐渐减少。DNA双链体的熔解温度差异反应了基因的变异。该方法存在的缺点是：通过熔解曲线的图不能判断某一特异性的变异体，下游分析中检测仍需要有测序等补充。
多重PCR扩增捕获技术利用多重PCR扩增富集样品基因组中目标区域的DNA片段，再进行文库构建和高通量测序，该技术的缺点：通量小，目前一次PCR获取最长的基因组DNA片段长度应该不会超过50kb，而且需要特殊的酶和特殊的PCR条件，成本高昂，稳定性差。当然100kb以下的片段，通过多次PCR的方式也是可行的，一般每个扩增片段的长度在500bp左右性价比最佳。
RFLP法是将PCR与限制性酶切相结合的方法。该方法存在以下缺点：RFLP实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，存在第一轮酶切不完全导致的假阳性，非闭管操作，易于污染，难以满足临床检测要求。
DNA直接测序法存在以下缺点：检测周期较长，花费昂贵，非闭管操作，难以避免交叉污染，通量不高。另外，该方法灵敏度较低，杂合突变、胶压缩、GC富集区的存在等问题使得很难通过一次测序获得精确的数据，需要多次重复测序才可能避免假阳性等，因此直接测序方法难适用于临床检测。
发明内容
本发明的目的之一在于针对现有用于BRCA基因突变检测的方法所存在的不足而提供一种可用于高通量、高灵敏度、高稳定性、低成本检测BRCA1和BRCA2基因突变的试剂盒。本发明主要是利用液相探针杂交捕获技术对BRCA1和BRCA2基因全外显子区进行捕获富集，然后通过高通量测序技术对富集后的全外显子序列进行测定，最终通过生物信息学分析高通量测序数据，从而发现全外显子区的突变情况及其突变频率。
本发明另一目的是提供一种检测乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突变杂交富集的方法。
为了实现本发明目的，本发明采取的技术方案是：
一种用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突变检测的杂交捕获试剂盒，包括杂交用试剂、PCR扩增试剂及富集度检测试剂；其中所述杂交用试剂包括如下SEQ NO.1-SEQNO.173探针混合物，且摩尔数比为SEQ NO.1:SEQ NO.(2-172):SEQ NO.173＝1：1：1,检测时，浓度为2nM each的上述探针混合物用量为1μl；
所述PCR扩增试剂包括如下SEQ NO.176和SEQ NO.177构成的引物对：
SEQ NO.176 AATGATACGGCGACCACCGA
SEQ NO.177 CAAGCAGAAGACGGCATACGA
所述富集度检测试剂包括如下SEQ NO.156和SEQ NO.157构成的引物对：
SEQ NO.156 ACCATCACGTGCACTAACAAGACAG
SEQ NO.157 GTCCTCTTACTCTCTCACCTCAAG
在本发明的一个优选实施例中，所述乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突变检测的杂交捕获试剂盒还包括杂交体系所用试剂：Block3.1/3.2、Human Cot-1PerfectHybTMPlus hybridization buffer；其中，Block3.1/3.2包括如下SEQ NO.174和SEQ NO.175构成的引物：
SEQ NO.174 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
SEQ NO.175 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATIIIIIIGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
且摩尔数比为SEQ NO.174：SEQ NO.175＝1：1，检测时浓度为300μM each的上述混合液用量为1μl。
在本发明的一个优选实施例中，所述杂交体系所用试剂由以下体积的各组分组成：
在本发明的一个优选实施例中，所述乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突变检测的杂交捕获试剂盒还包括杂交后通过生物素亲和素的反应使目标DNA片段锚定在带有亲和素的Streptavidin beads，以及用于洗去非目标DNA的1×washing buffer、0.1×washingbuffer和将捕获的DNA洗脱下来的FE buffer。
在本发明的一个优选实施例中，所述1×washing buffer缓冲液包括0.15M浓度的氯化钠、15mM的柠檬酸钠和0.1％SDS。
在本发明的一个优选实施例中，所述0.1×washing buffer缓冲液包括0.015M的氯化钠、1.5mM的柠檬酸钠、0.1％SDS。
在本发明的一个优选实施例中，所述FE buffer缓冲液为pH8.2的含95％甲酰胺的10mM EDTA的溶液。
在本发明的一个优选实施例中，所述乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突变检测的杂交捕获试剂盒还包括杂交后用于洗涤Streptavidin beads的BW缓冲液。
在本发明的一个优选实施例中，BW缓冲液包括5mM Tris·Cl、0.5mM EDTA、1.0M氯化钠和0.01％吐温-20。
在本发明的一个优选实施例中，所述PCR扩增试剂还包括PCR预混液和去离子水。
在本发明的一个优选实施例中，所述PCR预混液为2×预混液，使用时终浓度为1×。
在本发明的一个优选实施例中，所述2×预混液包括2×Q5buffer、1×GCenhancer buffer、各组分浓度为0.4mM的dNTP、用量为0.2μl的浓度2000U/ml为Q5高保真DNA聚合酶。
在本发明的一个优选实施例中，所述富集度检测试剂还包括2×SYBR GreenMaster Mix(vazyme)、Primer mix(10uM each)、dH2O和input/R1/R2。
一种检测乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突变杂交富集的方法，具体包括如下步骤：
1)文库构建。
2)杂交捕获：对构建好的文库等比例混合后使用SEQ NO.1-SEQ NO.173探针混合物进行液相探针捕获杂交，富集获得DNA；其中SEQ NO.1-SEQ NO.173探针混合物的摩尔数比为SEQ NO.1:SEQ NO.(2-172):SEQ NO.173＝1：1：1,检测时，浓度为2nM each的上述探针混合物用量为1μl；
杂交捕获所采用的杂交体系由以下体积的各组分组成：
杂交程序如下：
将H1、H2混匀离心后分别放入PCR中，变性退火程序如下：
程序运行完毕后将H1用移液枪一次性小心加入到H2中，由于PerfectHybTM Plushybridization buffer比较粘稠请勿用枪头吹打混匀；将混合液放在漩涡振荡器上振荡混匀离心后放入PCR仪中，50℃杂交过夜；
用1ml BW重新悬浮Streptavidin beads，洗涤两次；
将杂交完毕的混合液用移液枪小心转移至含SA beads的离心管中，缓慢地一次性将管壁上的SA beads冲到离心管底部，漩涡振荡10s后甩一下，于50℃1200rpm孵育45min；
取预热好的500μl 1×washing buffer/each sample洗涤SA beads两次，每次50℃1200rpm孵育1min；
然后用500μl 0.1×washing buffer/each sample洗涤SA beads两次，每次50℃1200rpm孵育1min；
向洗涤后的磁珠加入20μl FE buffer，漩涡振荡混匀短暂离心后95℃1200rpm孵育10min；
最后使用Nucleotide Removal Kit对上清进行纯化；
3)PCR扩增：对一轮富集获得DNA进行PCR扩增，扩增使用的引物对(SEQ NO.176和SEQ NO.177)，扩增后使用1×AMPur XP beads进行纯化。
所述的扩增体系包括：杂交产物20μl、5ul引物(SEQ NO.176和SEQ NO.177)、50μlPCR预混液、去离子水，总体积100μl。
PCR扩增程序如下：
4)二轮杂交富集：对纯化后的一轮PCR产物留取20ng用于富集度检测，其余全部用于二轮杂交。其中，二轮杂交input量为100ng-500ng，杂交时间为4h，其余条件与步骤同一轮杂交；
5)PCR扩增：对二轮富集获得DNA进行PCR扩增，扩增使用的引物对SEQ NO.176和SEQ NO.177，扩增所用循环数为10，扩增后使用1×AMPur XP beads进行纯化；
6)富集度检测：对步骤2)所得的multiplex DNA sample library pool、步骤3)和步骤5)经过PCR扩增后的一轮、二轮DNA分别使用StepOneTM and StepOnePlusTM RealtimePCR system进行Realtime PCR富集度检测，每个样本做三个重复，以超纯水做阴性对照，以混合前任意一个文库做阳性对照。模板使用量均为3.44ng；计算每个样本Ct的平均值，然后使用富集前DNA样本Ct的平均值减去富集后的DNA样本Ct的平均值得到ΔCt；计算富集度，富集度计算方法为：Fold enrichment＝EΔCp，其中E为引物对为SEQ NO.156和SEQ NO.157的PCR扩增效率，经检测该引物对的扩增效率为2.0，R2为0.991；
7)测序：对经步骤6)检测后有一定富集度的步骤2)获得的PCR扩增产物进行测序。
8)分析：对步骤7)获得的测序结果进行分析，完成全外显子区的突变检测。
与现有技术相比，本发明的检测方法和试剂盒具有如下优点：
1)平铺间隔式探针设计，在全外显子区间距均匀的排列173条探针，可实现全外显子区的突变检测，不但能对已知突变进行分析，还能发现新的突变；
2)成本低，稳定性高，重复性好，通量高，可同时检测多个样本文库；
3)通过序列捕获聚焦关键序列，减少了后续测序需要覆盖的区域大小，转而增加测序深度，有效减小数据处理难度，提高了灵敏度，增加混合样本中突变的检出率。
4)样品来源广泛，可使用多种来源的基因组DNA如FFPE组织、FF组织、血细胞、唾液及血浆来源的游离DNA片段，对待检测样品要求量低。
总体来说，本发明的试剂盒可用于高灵敏度、高通量、低成本、易操作的BRCA1和BRCA2基因全外显子突变检测，协助临床医生筛选出具有乳腺癌易感风险的个体，达到预防乳腺癌发生的目的。
附图说明
图1是本发明乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突变检测杂交捕获试剂盒一轮杂交富集度检测图；
图2是本发明乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突变检测杂交捕获试剂盒二轮杂交富集度检测图；
图3是本发明乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突变检测杂交捕获试剂盒富集文库Agilent Bioanalyzer2100检测图；
图4是本发明乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突变检测杂交捕获试剂盒数据分析结果图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明一种用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突变检测的杂交捕获试剂盒及其方法进行详细地描述说明。
乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突变检测的杂交捕获试剂盒，包括杂交用试剂、PCR扩增试剂及富集度检测试剂。
1)杂交捕获：所述杂交试剂包括探针混合物(SEQ NO.1-SEQ NO.173)，且摩尔数比为SEQ NO.1:SEQ NO.(2-172):SEQ NO.173＝1：1：1。检测时，浓度为2nM each的上述探针混合物用量为1μl。所述乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突变检测的杂交捕获试剂盒还包括杂交体系所用试剂：Block3.1/3.2(SEQ NO.174和SEQ NO.175)、Human Cot-1PerfectHybTM Plus hybridization buffer。Block3.1/3.2摩尔数比为SEQ NO.174：SEQNO.175＝1：1，检测时浓度为300μM each的上述混合液用量为1μl。另外，Human Cot-1的规格为1mg/ml，检测时用量为1μl。PerfectHybTM Plus hybridization buffer的用量为50μl。所述杂交体系中还包括Multiplex DNA sample library pool，该library pool是将各待富集文库使用Agilent Bioanalyzer2100高灵敏性DNA芯片进行检测得到文库片段分布范围及主峰的平均片段长度和浓度。然后按照等质量等比例混合，得到520ng的文库，其中500ng用于杂交，剩余20ng用于杂交后富集度检测用。
优选的，杂交体系由以下体积的各组分组成：
杂交程序如下：
将H1、H2混匀离心后分别放入PCR中，变性退火程序如下：
程序运行完毕后将H1用移液枪一次性小心加入到H2中，由于PerfectHybTM Plushybridization buffer比较粘稠请勿用枪头吹打混匀。将混合液放在漩涡振荡器上振荡混匀离心后放入PCR仪中，50℃杂交过夜。用1ml BW重新悬浮Streptavidin beads，洗涤两次。将杂交完毕的混合液用移液枪小心转移至含SA beads的离心管中，缓慢地一次性将管壁上的SA beads冲到离心管底部，漩涡振荡10s后甩一下，于50℃1200rpm孵育45min。取预热好的500μl 1×washing buffer/each sample洗涤SA beads两次，每次50℃1200rpm孵育1min。然后用500μl 0.1×washing buffer/each sample洗涤SA beads两次，每次50℃1200rpm孵育1min。向洗涤后的磁珠加入20μl FE buffer，漩涡振荡混匀短暂离心后95℃1200rpm孵育10min。最后使用Nucleotide Removal Kit对上清进行纯化。
2)PCR扩增：对一轮富集获得DNA进行PCR扩增，扩增使用的引物对(SEQ NO.176和SEQ NO.177)，扩增后使用1×AMPur XP beads进行纯化。
所述的扩增体系包括：杂交产物20μl、5ul引物(SEQ NO.176和SEQ NO.177)、50μlPCR预混液、去离子水，总体积100μl。
PCR扩增程序：
3)二轮杂交富集：对纯化后的一轮PCR产物留取20ng用于富集度检测，其余全部用于二轮杂交。其中，二轮杂交input量为100ng-500ng，杂交时间为4h，其余条件与步骤同一轮杂交。
4)PCR扩增：对二轮富集获得DNA进行PCR扩增，扩增使用的引物对(SEQ NO.176和SEQ NO.177)，扩增所用循环数为10，扩增后使用1×AMPur XP beads进行纯化。
5)富集度检测：对步骤1)所得的multiplex DNA sample library pool、步骤2)和步骤4)经过PCR扩增后的一轮、二轮DNA分别使用StepOneTM and StepOnePlusTM RealtimePCR system进行Realtime PCR富集度检测，每个样本做三个重复，以超纯水做阴性对照，以混合前任意一文库做阳性对照。模板使用量均为3.44ng。计算每个样本Ct的平均值，然后使用富集前DNA样本Ct的平均值减去富集后的DNA样本Ct的平均值得到ΔCt。计算富集度，富集度计算方法为：Fold enrichment＝EΔCp，其中E为引物对(SEQ NO.156和SEQ NO.157)的PCR扩增效率，经检测该引物对的扩增效率为2.0，R2为0.991。
效果说明：图1可以看出，经过一轮杂交后，检测引物所在的DNA富集度为210。图2可以看出，经过二轮杂交后，检测引物所在的DNA富集度为216。结果表明，经过两轮杂交后目的片段确实得到了一定程度的富集，且富集效果显著。图3为二轮杂交富集产物质量分析，从图中可以看出文库主峰单一且大小与杂交前文库大小一致，可用于进一步测序分析。图4中对杂交后的4个文库进行了信息分析，结果表明该杂交试剂盒对BRCA全外显子实现了有效富集，可有效地用于BRCA1和BRCA2基因全外显子突变的检测。应当指出的是虽然在某些情况下，对该基因的检测对于相关癌症的诊断、预防和治疗有重要的辅助意义，但这些基因的突变不是必然导致所述疾病的发生，因此对这些基因的检测并不涉及疾病的诊断或治疗方法。
本发明的试剂盒具有灵敏度高、通量高、成本低、易于操作、稳定性高等特点，可协助临床医生筛选出具有乳腺癌易感风险的个体，达到预防乳腺癌发生的目的。与高分辨率溶解曲线法相比，HRM通过熔解曲线的图不能判断某一特异性的变异体，下游分析中检测仍需要有测序等进行补充说明。多重PCR扩增捕获技术通量小，目前一次PCR获取最长的基因组DNA片段长度应该不会超过50kb，而且需要特殊的酶和特殊的PCR条件，成本高昂，稳定性差。RFLP实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，存在第一轮酶切不完全导致的假阳性，非闭管操作，易于污染，难以满足临床检测要求。DNA直接测序法检测周期较长，花费昂贵，非闭管操作，难以避免交叉污染，通量不高，灵敏度较低，杂合突变、胶压缩、GC富集区的存在等问题使得很难通过一次测序获得精确的数据，需要多次重复测序才可能避免假阳性等，难适用于临床检测。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例，应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人依本发明构思在现有技术基础上通过逻辑分析、推理或者根据有限的实验可以得到的技术方案，均应该在由本权利要求书所确定的保护范围之中。

Claims (14)

1.一种用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突变检测的杂交捕获试剂盒，其特征在于，包括杂交用试剂、PCR扩增试剂及富集度检测试剂；其中所述杂交用试剂包括如下SEQNO.1-SEQ NO.173探针混合物，且摩尔数比为SEQ NO.1:SEQ NO.(2-172):SEQ NO.173＝1：1：1,检测时，浓度为2nM each的上述探针混合物用量为1μl；
所述PCR扩增试剂包括如下SEQ NO.176和SEQ NO.177构成的引物对：
所述富集度检测试剂包括如下SEQ NO.156和SEQ NO.157构成的引物对：
2.如权利要求1所述的乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突变检测的杂交捕获试剂盒，其特征在于，还包括杂交体系所用试剂：Block3.1/3.2、Human Cot-1PerfectHybTMPlus hybridization buffer；其中，Block3.1/3.2包括如下SEQ NO.174和SEQ NO.175构成的引物：
SEQ NO.174 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT SEQ NO.175 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATIIIIIIGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
且摩尔数比为SEQ NO.174：SEQ NO.175＝1：1，检测时浓度为300μM each的上述混合液用量为1μl。
3.如权利要求1所述的乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突变检测的杂交捕获试剂盒，其特征在于，所述杂交体系所用试剂由以下体积的各组分组成：
4.如权利要求3所述的乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突变检测的杂交捕获试剂盒，其特征在于，还包括杂交后通过生物素亲和素的反应使目标DNA片段锚定在带有亲和素的Streptavidin beads，以及用于洗去非目标DNA的1×washing buffer缓冲液、0.1×washing buffer缓冲液和将捕获的DNA洗脱下来的FE buffer缓冲液。
5.如权利要求4所述的乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突变检测的杂交捕获试剂盒，其特征在于，所述1×washing buffer缓冲液包括0.15M浓度的氯化钠、15mM的柠檬酸钠和0.1％SDS。
6.如权利要求4所述的乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突变检测的杂交捕获试剂盒，其特征在于，所述0.1×washing buffer缓冲液包括0.015M的氯化钠、1.5mM的柠檬酸钠、0.1％SDS。
7.如权利要求4所述的乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突变检测的杂交捕获试剂盒，其特征在于，所述FE buffer缓冲液为pH8.2的含95％甲酰胺的10mMEDTA的溶液。
8.如权利要求4所述的乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突变检测的杂交捕获试剂盒，其特征在于，还包括杂交后用于洗涤Streptavidin beads的BW缓冲液。
9.如权利要求8所述的乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突变检测的杂交捕获试剂盒，其特征在于，BW缓冲液包括5mM Tris·Cl、0.5mM EDTA、1.0M氯化钠和0.01％吐温-20。
10.如权利要求1所述的乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突变检测的杂交捕获试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增试剂还包括PCR预混液和去离子水。
11.如权利要求10所述的乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突变检测的杂交捕获试剂盒，其特征在于，所述PCR预混液为2×预混液，使用时终浓度为1×。
12.如权利要求11所述的乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突变检测的杂交捕获试剂盒，其特征在于，所述2×预混液包括2×Q5buffer、1×GC enhancer buffer、各组分浓度为0.4mM的dNTP、用量为0.2μl的浓度2000U/ml为Q5高保真DNA聚合酶。
13.如权利要求1所述的乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突变检测的杂交捕获试剂盒，其特征在于，所述富集度检测试剂还包括2×SYBR Green Master Mix(vazyme)、Primer mix(10uM each)、dH2O和input/R1/R2。
14.一种检测乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突变杂交富集的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
1)文库构建。
2)杂交捕获：对构建好的文库等比例混合后使用SEQ NO.1-SEQ NO.173探针混合物进行液相探针捕获杂交，富集获得DNA；其中SEQ NO.1-SEQ NO.173探针混合物的摩尔数比为SEQ NO.1:SEQ NO.(2-172):SEQ NO.173＝1：1：1,检测时，浓度为2nM each的上述探针混合物用量为1μl；
杂交捕获所采用的杂交体系由以下体积的各组分组成：
杂交程序如下：
将H1、H2混匀离心后分别放入PCR中，变性退火程序如下：
程序运行完毕后将H1用移液枪一次性小心加入到H2中，由于PerfectHybTMPlushybridization buffer比较粘稠请勿用枪头吹打混匀；将混合液放在漩涡振荡器上振荡混匀离心后放入PCR仪中，50℃杂交过夜；
用1ml BW重新悬浮Streptavidin beads，洗涤两次；
将杂交完毕的混合液用移液枪小心转移至含SA beads的离心管中，缓慢地一次性将管壁上的SA beads冲到离心管底部，漩涡振荡10s后甩一下，于50℃1200rpm孵育45min；
取预热好的500μl 1×washing buffer/each sample洗涤SA beads两次，每次50℃1200rpm孵育1min；
然后用500μl 0.1×washing buffer/each sample洗涤SA beads两次，每次50℃1200rpm孵育1min；
向洗涤后的磁珠加入20μl FE buffer，漩涡振荡混匀短暂离心后95℃1200rpm孵育10min；
最后使用Nucleotide Removal Kit对上清进行纯化；
3)PCR扩增：对一轮富集获得DNA进行PCR扩增，扩增使用的引物对(SEQ NO.176和SEQNO.177)，扩增后使用1×AMPur XP beads进行纯化。
所述的扩增体系包括：杂交产物20μl、5ul引物(SEQ NO.176和SEQ NO.177)、50μl PCR预混液、去离子水，总体积100μl。
PCR扩增程序如下：
4)二轮杂交富集：对纯化后的一轮PCR产物留取20ng用于富集度检测，其余全部用于二轮杂交。其中，二轮杂交input量为100ng-500ng，杂交时间为4h，其余条件与步骤同一轮杂交；
5)PCR扩增：对二轮富集获得DNA进行PCR扩增，扩增使用的引物对SEQ NO.176和SEQNO.177，扩增所用循环数为10，扩增后使用1×AMPur XP beads进行纯化；
6)富集度检测：对步骤2)所得的multiplex DNA sample library pool、步骤3)和步骤5)经过PCR扩增后的一轮、二轮DNA分别使用StepOneTM and StepOnePlusTM Realtime PCRsystem进行Realtime PCR富集度检测，每个样本做三个重复，以超纯水做阴性对照，以混合前任意一文库做阳性对照。模板使用量均为3.44ng；计算每个样本Ct的平均值，然后使用富集前DNA样本Ct的平均值减去富集后的DNA样本Ct的平均值得到ΔCt；计算富集度，富集度计算方法为：Fold enrichment＝EΔCp，其中E为引物对为SEQ NO.156和SEQ NO.157的PCR扩增效率，经检测该引物对的扩增效率为2.0，R2为0.991；
7)测序：对经步骤6)检测后有一定富集度的步骤2)获得的PCR扩增产物进行测序。
8)分析：对步骤7)获得的测序结果进行分析，完成全外显子区的突变检测。
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Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107201401A (zh) * 2017-05-23 2017-09-26 深圳市第二人民医院 一种用于乳腺癌发病风险预测的多因素模型及其建立方法
CN107760771A (zh) * 2017-11-16 2018-03-06 杭州迪安医学检验中心有限公司 一种乳腺癌易感基因brca1和brca2全基因捕获引物、试剂盒及其方法
CN107858426A (zh) * 2017-08-22 2018-03-30 上海派森诺生物科技股份有限公司 一种用于肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒及其方法
CN108085387A (zh) * 2017-11-27 2018-05-29 天津诺禾致源生物信息科技有限公司 检测人brca1/2基因突变的特异性捕获探针、试剂盒、测序文库及其构建方法
CN108179177A (zh) * 2017-12-29 2018-06-19 博迪泰（厦门）生物科技有限公司 一种快速检测核酸突变的试剂盒及检测方法
CN108624686A (zh) * 2018-03-30 2018-10-09 南京世和基因生物技术有限公司 一种检测brca1/2突变的探针库、检测方法和试剂盒
CN108753954A (zh) * 2018-06-26 2018-11-06 中南大学湘雅医院 痴呆相关基因的捕获探针组、试剂盒、文库构建方法和用途
CN109097443A (zh) * 2017-06-21 2018-12-28 苏州吉赛基因测序科技有限公司 一种用于高通量测序的捕获基因组靶序列的方法
CN109234396A (zh) * 2018-10-10 2019-01-18 无锡市第五人民医院 一种乳腺癌易感基因BRCA2位点g.32336534T＞C突变体及其应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010004591A2 (en) * 2008-07-07 2010-01-14 Decode Genetics Ehf Genetic variants for breast cancer risk assessment
CN102409047A (zh) * 2010-09-21 2012-04-11 深圳华大基因科技有限公司 一种构建杂交测序文库的方法
CN103667254A (zh) * 2012-09-18 2014-03-26 邵阳 目标基因片段的富集和检测方法
CN104032001A (zh) * 2014-06-11 2014-09-10 上海交通大学医学院附属新华医院 用于胆囊癌预后评估的erbb信号通路突变靶向测序方法
CN104178817A (zh) * 2014-08-13 2014-12-03 邵华武 杂交富集捕获dna测序文库洗涤溶液及洗涤方法
CN105063208A (zh) * 2015-08-10 2015-11-18 北京吉因加科技有限公司 一种血浆中游离的目标dna低频突变富集测序方法
CN105779433A (zh) * 2014-12-15 2016-07-20 天津华大基因科技有限公司 试剂盒及其用途
CN105925671A (zh) * 2016-04-22 2016-09-07 艾吉泰康生物科技(北京)有限公司 一种从核酸样品富集目标序列核酸的方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010004591A2 (en) * 2008-07-07 2010-01-14 Decode Genetics Ehf Genetic variants for breast cancer risk assessment
CN102409047A (zh) * 2010-09-21 2012-04-11 深圳华大基因科技有限公司 一种构建杂交测序文库的方法
CN103667254A (zh) * 2012-09-18 2014-03-26 邵阳 目标基因片段的富集和检测方法
CN104032001A (zh) * 2014-06-11 2014-09-10 上海交通大学医学院附属新华医院 用于胆囊癌预后评估的erbb信号通路突变靶向测序方法
CN104178817A (zh) * 2014-08-13 2014-12-03 邵华武 杂交富集捕获dna测序文库洗涤溶液及洗涤方法
CN105779433A (zh) * 2014-12-15 2016-07-20 天津华大基因科技有限公司 试剂盒及其用途
CN105063208A (zh) * 2015-08-10 2015-11-18 北京吉因加科技有限公司 一种血浆中游离的目标dna低频突变富集测序方法
CN105925671A (zh) * 2016-04-22 2016-09-07 艾吉泰康生物科技(北京)有限公司 一种从核酸样品富集目标序列核酸的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SCHENKEL LC, KERKHOF J, STUART A, REILLY J, ENG B,ET AL.: "Clinical Next-Generation Sequencing Pipeline Outperforms a Combined Approach Using Sanger Sequencing and Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification in Targeted Gene Panel Analysis.", 《JOURNAL OF MOLECULAR DIAGNOSTICS》 *
严汝帆: "全外显子组测序技术寻找马尔尼菲青霉病的易感基因", 《广西医科大学硕士学位论文》 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107201401A (zh) * 2017-05-23 2017-09-26 深圳市第二人民医院 一种用于乳腺癌发病风险预测的多因素模型及其建立方法
CN109097443B (zh) * 2017-06-21 2022-03-22 苏州吉赛基因测序科技有限公司 一种用于高通量测序的捕获基因组靶序列的方法
CN109097443A (zh) * 2017-06-21 2018-12-28 苏州吉赛基因测序科技有限公司 一种用于高通量测序的捕获基因组靶序列的方法
CN107858426A (zh) * 2017-08-22 2018-03-30 上海派森诺生物科技股份有限公司 一种用于肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒及其方法
CN107858426B (zh) * 2017-08-22 2021-04-09 上海派森诺生物科技股份有限公司 一种用于肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒及其方法
CN107760771A (zh) * 2017-11-16 2018-03-06 杭州迪安医学检验中心有限公司 一种乳腺癌易感基因brca1和brca2全基因捕获引物、试剂盒及其方法
CN108085387A (zh) * 2017-11-27 2018-05-29 天津诺禾致源生物信息科技有限公司 检测人brca1/2基因突变的特异性捕获探针、试剂盒、测序文库及其构建方法
CN108085387B (zh) * 2017-11-27 2020-03-27 天津诺禾致源生物信息科技有限公司 检测人brca1/2基因突变的特异性捕获探针、试剂盒、测序文库及其构建方法
CN108179177A (zh) * 2017-12-29 2018-06-19 博迪泰（厦门）生物科技有限公司 一种快速检测核酸突变的试剂盒及检测方法
CN108624686B (zh) * 2018-03-30 2019-06-04 南京世和基因生物技术有限公司 一种检测brca1/2突变的探针库、检测方法和试剂盒
CN108624686A (zh) * 2018-03-30 2018-10-09 南京世和基因生物技术有限公司 一种检测brca1/2突变的探针库、检测方法和试剂盒
CN108753954A (zh) * 2018-06-26 2018-11-06 中南大学湘雅医院 痴呆相关基因的捕获探针组、试剂盒、文库构建方法和用途
CN109234396A (zh) * 2018-10-10 2019-01-18 无锡市第五人民医院 一种乳腺癌易感基因BRCA2位点g.32336534T＞C突变体及其应用

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