CN111542522B - 可用作激酶抑制剂的被取代的吡唑并嘧啶 - Google Patents

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CN111542522B CN201880051836.0A CN201880051836A CN111542522B CN 111542522 B CN111542522 B CN 111542522B CN 201880051836 A CN201880051836 A CN 201880051836A CN 111542522 B CN111542522 B CN 111542522B
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    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Abstract

公开了新型的式(I)的吡唑并嘧啶、其衍生物、其药学上可接受的盐、溶剂化物和水合物。所述化合物具有蛋白激酶抑制活性，并且预期可用于治疗蛋白激酶介导的疾病和状况。

Description

可用作激酶抑制剂的被取代的吡唑并嘧啶
交叉引用
本申请要求于2017年8月11日提交的美国临时专利申请第62/605,390号的权益，该美国临时专利申请通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本公开内容涉及激酶抑制剂。本公开内容还涉及包含激酶抑制剂的药物组合物，以及涉及激酶抑制剂和包含激酶抑制剂的药物组合物治疗疾病诸如癌症的用途。
背景
蛋白激酶代表催化靶蛋白质底物的磷酸化的一大类酶。磷酸化通常是磷酸酯基团从ATP到蛋白质底物的转移反应。磷酸酯基团与蛋白质底物的常见附接点包括例如酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基。例如，蛋白质酪氨酸激酶(PTK)是催化细胞蛋白质中特定酪氨酸残基的磷酸化的酶。蛋白激酶家族中的激酶的实例包括而不限于Abl1(v-Abl Abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1)、Akt、Alk、Bcr-Abl1、Blk、Brk、Btk、c-Kit、c-Met、c-Src、c-Fms、CDK1-10、b-Raf、c-Raf1、CSF1R、CSK、EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、Erk、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FGFR5、Flt-1、Fps、Frk、Jak、KDR、MEK、PDGFR、PIK、PKC、PYK2、Ros、Tie、Tie2和Zap70。由于它们在许多细胞过程中的活性，蛋白激酶已经成为重要的治疗靶点。
如关于以下进行的研究所看到的，Trk的过表达、激活、扩增和/或突变与若干种癌症之间的关联支持了有效的Trk抑制剂的治疗意义可能远远超出疼痛疗法的推理：神经母细胞瘤(Brodeur,G.M.,Nat.Rev.Cancer 2003,3,203-216)、卵巢癌(Kruettgen等人,BrainPathology 2006,16:304-310)、***癌(Dionne等人,Clin.Cancer Res.1998,4(8):1887-1898)、胰腺癌(Dang等人,J.Gastroenterol.Hepatol.2006,21(5):850-858)、大细胞神经内分泌肿瘤(Marchetti等人,Human Mutation 2008,29(5),609-616)和结肠直肠癌(Bardelli,A.,Science 2003,300,949)。还参见WO07013673、WO07025540、WO08052734、WO20121158413和美国专利申请USSN.61/650,019。
概述
在本公开内容的一个方面中，提供了式I的化合物：
Figure BDA0002381403520000021
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、立体异构体、互变异构体或代谢物，其中
Ar是被取代的C6-C12芳基或被取代的C5-C12杂芳基，条件是当Ar是被取代的C5-C12杂芳基时，Ar是以下残基：
Figure BDA0002381403520000022
其中Y1是键或CR23R24；
R31是独立地选自由以下组成的组的一个或更多个基团：氢、C1-C3烷基和氘；
R32是C1-C3烷基、CO(C1-C3烷基)或氢；
R23和R24中的每个独立地是氢、氘或C1-C3烷基。
在本公开内容的另一个方面中，提供了式II的化合物：
Figure BDA0002381403520000031
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、立体异构体、互变异构体或代谢物，其中
Ar是被取代的C6-C12芳基或被取代的C5-C12杂芳基，条件是当Ar是被取代的C5-C12杂芳基时，Ar是以下残基：
Figure BDA0002381403520000032
其中Y1是键或CR23R24；
R31是独立地选自由以下组成的组的一个或更多个基团：氢、C1-C3烷基和氘；
R32是C1-C3烷基、CO(C1-C3烷基)或氢；
R23和R24中的每个独立地是氢、氘或C1-C3烷基。
在本公开内容的另一个方面中，提供了药物组合物，所述药物组合物包含本公开内容的化合物和药学上可接受的载体。
在本公开内容的还另一个方面中，提供了治疗或预防患者的过度增殖性紊乱的方法，包括向有相应需要的患者施用上文描述的药物组合物的步骤。
在本公开内容的另一个方面中，提供了本公开内容的化合物，用作药物。
在本公开内容的还另一个方面中，提供了本公开内容的化合物，用作用于治疗或预防多种癌症的药物。
在本公开内容的还另一个方面中，提供了本公开内容的化合物，用于在调节激酶信号转导的方法中使用。
在本公开内容的还另一个方面中，提供了与一种或更多种抗癌剂组合的本公开内容的化合物，用于在治疗或预防过度增殖性紊乱的方法中使用。
详细描述
在本公开内容的一个方面中，提供了式I的化合物：
Figure BDA0002381403520000041
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、立体异构体、互变异构体或代谢物，其中
Ar是被取代的C6-C12芳基或被取代的C5-C12杂芳基，条件是当Ar是被取代的C5-C12杂芳基时，Ar是以下残基：
Figure BDA0002381403520000051
其中Y1是键或CR23R24；
R31是独立地选自由以下组成的组的一个或更多个基团：氢、C1-C3烷基和氘；
R32是C1-C3烷基、CO(C1-C3烷基)或氢；
R23和R24中的每个独立地是氢、氘或C1-C3烷基。
在本公开内容的一些实施方案中，提供了式II的化合物：
Figure BDA0002381403520000052
或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药或立体异构体或互变异构体或代谢物，其中
Ar是被取代的C6-C12芳基或被取代的C5-C12杂芳基，条件是当Ar是被取代的C5-C12杂芳基时，Ar是以下残基：
Figure BDA0002381403520000061
其中Y1是键或CR23R24；
R31是独立地选自由以下组成的组的一个或更多个基团：氢、C1-C3烷基和氘；
R32是C1-C3烷基、CO(C1-C3烷基)或氢；
R23和R24中的每个独立地是氢、氘或C1-C3烷基。
在本公开内容的一些实施方案中，提供了根据式I的化合物：
Figure BDA0002381403520000062
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、立体异构体、互变异构体或代谢物，其中
Ar是
Figure BDA0002381403520000063
其中R1、R2、R3、R4和R5中的至少一个不是氢，R1、R2、R3、R4和R5独立地是氢、卤化物(halide)、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、C6-C12芳基、3-12元杂脂环基、5-12元杂芳基、NO2、–NR6R7、–CR8R9(CR8R9)nOR6、CN、–C(O)R6、–O(CO)R6、–OCR8R9(CR8R9)nNR6R7、–OCR8R9(CR8R9)nOR6、–NR6C(O)R7、–(CR8R9)nC(O)OR6、–(CR8R9)nC(O)NR6R7、–CR8R9(CR8R9)nNR6R7、–NR6(CO)–NR6R7、–NR6S(O)pR7、–S(O)tR6或–S(O)2NR6R7，其中苯基的相邻原子上的R1、R2、R3、R4和R5中的两个基团可以与这两个基团被结合至其的相邻原子一起组合以形成C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C3-C12环烷基或3-12元杂脂环基，其中每个芳基、杂脂环基和杂芳基是未被取代的，或者独立地被一个或更多个氘或C1-C3烷基取代；条件是3-12元杂脂环基的杂原子未附接至苯基；
每个R6、R7、R8和R9独立地是氢、C1-C6烷基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C3-C12环烷基或3-12元杂脂环基；或者与相同氮原子结合的R6、R7、R8和R9中的任何两个可以与它们被结合至其的氮一起组合以形成3至12元杂脂环基或5-12元杂芳基基团，该3至12元杂脂环基或5-12元杂芳基基团任选地含有1个至3个选自由N、O和S组成的组的另外的杂原子；或者与相同碳原子结合的R6、R7、R8和R9中的任何两个可以与它们被结合至其的碳一起组合以形成C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C3-C12环烷基或3-12元杂脂环基基团；
每个n独立地是0、1、2、3或4；
每个p独立地是1或2；以及
每个t独立地是0、1或2。
在本公开内容的一些实施方案中，提供了式II的化合物：
Figure BDA0002381403520000071
或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药或立体异构体或互变异构体或代谢物，其中
Ar是被取代的苯基，即以下残基：
Figure BDA0002381403520000081
其中R1、R2、R3、R4和R5中的至少一个不是氢，R1、R2、R3、R4和R5独立地是氢、卤化物、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、C6-C12芳基、3-12元杂脂环基、5-12元杂芳基、NO2、–NR6R7、–CR8R9(CR8R9)nOR6、CN、–C(O)R6、–O(CO)R6、–OCR8R9(CR8R9)nNR6R7、–OCR8R9(CR8R9)nOR6、–NR6C(O)R7、–(CR8R9)nC(O)OR6、–(CR8R9)nC(O)NR6R7、–CR8R9(CR8R9)nNR6R7、–NR6(CO)–NR6R7、–NR6S(O)pR7、–S(O)tR6或–S(O)2NR6R7，其中苯基的相邻原子上的R1、R2、R3、R4和R5中的两个基团可以与这两个基团被结合至其的相邻原子一起组合以形成C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C3-C12环烷基或3-12元杂脂环基，其中每个芳基、杂脂环基和杂芳基是未被取代的，或者独立地被一个或更多个氘或C1-C3烷基取代；条件是3-12元杂脂环基的杂原子未附接至苯基；
每个R6、R7、R8和R9独立地是氢、C1-C6烷基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C3-C12环烷基或3-12元杂脂环基；或者与相同氮原子结合的R6、R7、R8和R9中的任何两个可以与它们被结合至其的氮一起组合以形成3至12元杂脂环基或5-12元杂芳基基团，该3至12元杂脂环基或5-12元杂芳基基团任选地含有1个至3个选自由N、O和S组成的组的另外的杂原子；或者与相同碳原子结合的R6、R7、R8和R9中的任何两个可以与它们被结合至其的碳一起组合以形成C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C3-C12环烷基或3-12元杂脂环基基团；
每个n独立地是0、1、2、3或4；
每个p独立地是1或2；以及
每个t独立地是0、1或2。
在本公开内容的一些实施方案中，提供了式I或式II的化合物，其中Ar是被取代的苯基，即以下残基：
Figure BDA0002381403520000091
其中R1、R2、R3、R4和R5中的至少一个不是氢，R1、R2、R3、R4和R5独立地是氢、卤化物、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、C6-C12芳基、3-12元杂脂环基、5-12元杂芳基、NO2、–NR6R7、–CR8R9(CR8R9)nOR6、CN、–C(O)R6、–O(CO)R6、–OCR8R9(CR8R9)nNR6R7、–OCR8R9(CR8R9)nOR6、–NR6C(O)R7、–(CR8R9)nC(O)OR6、–(CR8R9)nC(O)NR6R7、–CR8R9(CR8R9)nNR6R7、–NR6(CO)–NR6R7、–NR6S(O)pR7、–S(O)tR6或–S(O)2NR6R7，其中苯基的相邻原子上的R1、R2、R3、R4和R5中的两个基团可以与这两个基团被结合至其的相邻原子一起组合以形成C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C3-C12环烷基或3-12元杂脂环基，其中每个芳基、杂脂环基和杂芳基是未被取代的，或者独立地被一个或更多个氘或C1-C3烷基取代。
在本公开内容的一些实施方案中，提供了式I的化合物，其中Ar是以下残基：
Figure BDA0002381403520000092
其中Y2是键或CR23R24；
R1、R2、R4和R5独立地是氢、卤化物、CF3、C1-C3烷基、NO2、C1-C3烷氧基或氧杂环己-4-基氨基；
R21是独立地选自由以下组成的组的一个或更多个基团：氢、C1-C3烷基和氘；
R22是C1-C3烷基、CO(C1-C3烷基)或氢；
R23和R24中的每个独立地是氢、氘或C1-C3烷基。
在本公开内容的一些实施方案中，提供了式II的化合物，其中Ar是以下残基：
Figure BDA0002381403520000101
其中Y2是键或CR23R24；
R1、R2、R4和R5独立地是氢、卤化物、CF3、C1-C3烷基、NO2、C1-C3烷氧基或氧杂环己-4-基氨基；
R21是独立地选自由以下组成的组的一个或更多个基团：氢、C1-C3烷基和氘；
R22是C1-C3烷基、CO(C1-C3烷基)或氢；
R23和R24中的每个独立地是氢、氘或C1-C3烷基。
在本公开内容的一些实施方案中，提供了式I的化合物，其中Ar是以下残基：
Figure BDA0002381403520000111
其中Y1是键或CR23R24；
R31是独立地选自由以下组成的组的一个或更多个基团：氢、C1-C3烷基和氘；
R32是C1-C3烷基、CO(C1-C3烷基)或氢；
R23和R24中的每个独立地是氢、氘或C1-C3烷基。
在本公开内容的一些实施方案中，提供了式I的化合物，其中Ar是以下残基：
Figure BDA0002381403520000112
其中Y1是键或CR23R24；
R31是独立地选自由以下组成的组的一个或更多个基团：氢、C1-C3烷基和氘；
R32是C1-C3烷基、CO(C1-C3烷基)或氢；
R23和R24中的每个独立地是氢、氘或C1-C3烷基。
在本公开内容的一些实施方案中，提供了选自由以下组成的组的化合物：
Figure BDA0002381403520000121
Figure BDA0002381403520000131
Figure BDA0002381403520000141
Figure BDA0002381403520000151
Figure BDA0002381403520000161
Figure BDA0002381403520000171
Figure BDA0002381403520000181
Figure BDA0002381403520000191
Figure BDA0002381403520000201
Figure BDA0002381403520000211
在本公开内容的一些实施方案中，提供了药物组合物，所述药物组合物包含本公开内容的化合物和药学上可接受的载体。
在本公开内容的一些实施方案中，提供了治疗或预防患者的过度增殖性紊乱的方法，包括向有相应需要的患者施用上文描述的药物组合物的步骤。
在本公开内容的一些实施方案中，提供了本公开内容的化合物，用作药物。
在本公开内容的一些实施方案中，提供了本公开内容的化合物，用作用于治疗或预防过度增殖性紊乱的药物。
在本公开内容的一些实施方案中，提供了本公开内容的化合物，用作用于治疗或预防多种癌症的药物。
在本公开内容的一些实施方案中，提供了本公开内容的化合物，用于在调节激酶信号转导的方法中使用。
在本公开内容的一些实施方案中，提供了包含与一种或更多种抗癌剂组合的本公开内容的化合物的药物组合物，用于在治疗或预防过度增殖性紊乱的方法中使用。
在某些实施方案中，提供了选自而不限于由以下组成的组的化合物：
Figure BDA0002381403520000221
和/或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药或立体异构体或代谢物。
在某些实施方案中，提供了选自而不限于由以下组成的组的化合物：
Figure BDA0002381403520000222
和/或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药或代谢物。
在其他实施方案中，本公开内容的化合物呈药学上可接受的盐的形式。在一些实施方案中，本公开内容的化合物呈溶剂化物的形式。在其他实施方案中，本公开内容的化合物呈代谢物的形式。在其他实施方案中，本公开内容的化合物呈前药的形式。在一些实施方案中，本公开内容的化合物是对映异构体。在其他实施方案中，本公开内容的化合物是非对映异构体。在另一种实施方案中，本公开内容的化合物中的氘富集是至少约1％。
在一些实施方案中，提供了包含本公开内容的化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。在某些实施方案中，组合物用于治疗由蛋白激酶调节的疾病。在某些实施方案中，组合物用于预防或治疗过度增殖性紊乱和/或血管生成紊乱。在一些实施方案中，药物组合物还包含抗肿瘤剂(anti-neoplastic agent)、免疫抑制剂、免疫刺激剂或其组合。在其他实施方案中，药物组合物适合用于口服施用、肠胃外施用或静脉内施用。
在一些实施方案中，本公开内容提供了用于调节激酶信号转导的方法，该方法包括向哺乳动物受试者施用治疗有效量的本文描述的任何本发明的化合物。
在其他实施方案中，本文提供了用于治疗或预防原肌球蛋白相关激酶介导的紊乱的方法，所述方法包括向哺乳动物受试者施用治疗有效量的本文描述的任何本发明的化合物。
在其他实施方案中，本文提供了用于治疗瘤形成(neoplasia)的方法，该方法包括向有相应需要的哺乳动物受试者施用治疗有效量的本文描述的任何本发明的化合物。在某些实施方案中，瘤形成选自皮肤癌、白血病、结肠癌、肾细胞癌、胃肠间质癌、实体瘤癌、骨髓瘤、乳腺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、肝细胞癌、甲状腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌和***癌。在一些实施方案中，所述方法还包括施用一种或更多种抗癌剂。在一些实施方案中，提供了用于治疗神经母细胞瘤、卵巢癌、***癌、胰腺癌、大细胞神经内分泌肿瘤和结肠直肠癌的方法，该方法向有相应需要的哺乳动物受试者施用治疗有效量的式I或式II的化合物，或包含式I或式II的化合物的药物组合物。
在其他实施方案中，提供了Trk抑制剂。如本文中所使用的，术语Trk通常指的是原肌球蛋白受体激酶或酪氨酸受体激酶。Trk受体家族被命名为癌基因trk。最初在结肠癌中被鉴定的Trk在甲状腺***状癌中频繁地被激活。据报道癌基因trk是由1号染色体中的突变产生的。正常Trk受体不包含与原肌球蛋白相关的氨基酸或DNA序列。Trk受体的三种最常见类型是TrkA、TrkB和TrkC，它们中的每一种都可以对某些类型的神经营养因子(neurotrophins)具有不同的结合亲和力。Trk受体是调节哺乳动物神经***中的突触强度和可塑性的酪氨酸激酶家族。由这些不同类型的受体引发的信号传导的差异可以产生不同的生物应答。Trk受体的神经营养因子配体可以是以未成熟形式合成并且然后通过蛋白酶裂解转化的经加工的配体。未成熟的神经营养因子可以仅对一种常见的p75NTR受体是特异性的。然而，蛋白酶裂解可以产生与其相应的Trk受体具有更高亲和力的神经营养因子。这些经加工的神经营养因子仍然可以与p75NTR结合，但可能以较低的亲和力结合。
在其他实施方案中，提供了用于治疗或预防过度增殖和/或血管生成的方法，该方法包括向哺乳动物受试者施用治疗有效量的本文描述的任何本发明的化合物。
在其他实施方案中，提供了用于使用式I或式II的化合物的药物组合物来治疗哺乳动物过度增殖性紊乱(包括癌症)的方法。术语“过度增殖性紊乱”和/或“癌症”不仅指的是实体瘤，诸如乳腺癌、呼吸道癌、脑癌、生殖器官癌、消化道癌、泌尿道癌、眼癌、肝癌、皮肤癌、头颈癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌及其远端转移癌，而且还包括淋巴瘤、肉瘤和白血病。
以下定义应当有助于理解本文描述的公开内容。
术语“烷基”意图包括直链、支链和环状烃基团，这些烃基团仅包含单一碳-碳键，并且它们可以是未被取代的或者任选地被一个或更多个官能团取代。烷基基团的优选的链长度是从1个至6个碳原子。C1-C6烷基意图包括C1烷基基团、C2烷基基团、C3烷基基团、C4烷基基团、C5烷基基团和C6烷基基团。烷基可以是被取代的或者未被取代的。典型的取代基基团包括氘、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环基、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷基硫基、芳基硫基、氰基、卤代(halo)、羰基、硫代羰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、C-羧基、O-羧基、硝基、甲硅烷基、氨基和-NRXRY，其中RX和RY独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、环烷基、芳基、羰基、乙酰基、磺酰基、三氟甲磺酰基和组合的五元杂脂环或六元杂脂环。说明性的被取代的烷基基团包括但不限于CD3、CD2CD3、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氨基甲基、氨基乙基、羟甲基、甲氧基甲基、2-氟乙基和2-甲氧基乙基等。
术语“烷氧基”指的是–O–(烷基)基团和–O–(未被取代的环烷基)基团两者。C1-C6烷氧基意图包括C1-C6烷基基团，其中C1-C6烷基在上文中定义。代表性的实例包括但不限于OCD3、OCD2CD3、甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基和类似基团。
“卤素”或“卤化物”意指氟、氯、溴和碘。“卤代”意指氟代、氯代、溴代和碘代，优选地氟或氯。
“芳基”指的是具有完全共轭的π-电子体系的6个至12个碳原子的全碳单环或稠环多环基团。芳基基团的实例但不限于是苯基、萘基和蒽基。芳基基团可以是被取代的或未被取代的。典型的取代基包括卤代、三卤代甲基、烷基、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷基硫基、芳基硫基、氰基、硝基、羰基、硫代羰基、C-羧基、O-羧基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、亚磺酰基、磺酰基、氨基和-NRXRY，其中RX和RY如上文所定义，芳基也可以是含有1个、2个、3个或4个选自N、O和S的环杂原子、剩余环原子是C并且此外具有完全共轭的π-电子体系的5个至12个环原子的单环或稠环基团。未被取代的杂芳基基团的实例但不限于是吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、喹啉、异喹啉、嘌呤、四唑、三嗪和咔唑。杂芳基基团可以是被取代的或未被取代的。典型的取代基包括烷基、环烷基、卤代、三卤代甲基、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷基硫基、芳基硫基、氰基、硝基、羰基、硫代羰基、磺酰氨基、C-羧基、O-羧基、亚磺酰基、磺酰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、氨基和-NRXRY，其中RX和RY如上文所定义。
本公开内容还包括同位素标记的本公开内容的化合物，其中一个或更多个原子被具有相同原子序数但原子质量或质量数与自然界中通常发现的原子质量或质量数不同的原子替代。适合于包含在本公开内容的化合物中的同位素的实例包括氢的同位素诸如氘和碳的同位素诸如13C。用更重的同位素诸如氘取代可以提供某些治疗优点，这是由于更高的代谢稳定性；例如，体内半衰期的增加或降低的剂量需求，并且因此在一些情况下可以是优选的。
氘(D或2H)是氢的非放射性稳定同位素，氘的自然丰度是0.015％。如果化合物的氘水平已经被富集至大于0.015％的自然丰度水平，那么该化合物应当被认为是非自然的。在本公开内容的化合物中，应理解，当特定位置被指定为氘时，氘的丰度显著地大于0.015％的氘的自然丰度。在所述化合物中在被指定为氘的每个原子处，被指定为氘的位置通常具有至少3000的最小同位素富集因子。与本公开内容的化合物的稳定同位素取代的程度相比，自然丰富的稳定氢的浓度小且不重要。
当提及本公开内容的化合物使用时，术语“药学上可接受的”意图指的是对于向受试者施用安全的化合物形式。例如，已经被管理当局或监管机构诸如美国食品和药物管理局(FDA)批准经由口服摄入或任何其他施用途径用于哺乳动物使用的本公开内容的化合物的游离碱、盐形式、溶剂化物、水合物、前药或衍生物形式是药学上可接受的。
短语“有效量”意图量化每种剂的量，该量将实现在每种剂单独治疗中改善紊乱严重程度和发生频率，同时避免通常与替代疗法相关的不良副作用的目标。在一种实施方案中，有效量以单一剂型或以多剂型施用。
本公开内容的起始材料是已知的、商业上可获得的、或者可以类似于本领域中已知的方法或根据本领域中已知的方法来合成。许多起始材料可以根据已知工艺来制备，并且特别地，可以使用实施例中描述的工艺来制备。在合成起始材料时，在一些情况下，官能团在必要时用合适的保护基团保护。保护基团、它们的引入和去除在下文中描述。
在根据期望的程序合成式I或式II的化合物时，在一些实施方案中步骤以适合制备化合物的顺序进行，包括本文描述的程序或者通过本文描述的步骤的交替顺序，并且在一种实施方案中，根据需要，在之前或之后是另外的保护/去保护步骤。在一些实施方案中，中间体在纯化的情况下或在未纯化的情况下被分离或者原位进行。可用于合成本文描述的抑制剂化合物的合成化学转化和保护基团方法(保护和去保护)在本领域中是已知的，并且包括例如诸如在以下中描述的那些：R.Larock,Comprehensive OrganicTransformations,VCH Publishers(1989)；T.W.Greene和P.G.M.Wuts,Protective Groupsin Organic Synthesis,第3版,John Wiley and Sons(1999)；L.Fieser和M.Fieser,Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis,John Wiley and Sons(1994)；A.Katritzky和A.Pozharski,Handbook of Heterocyclic Chemistry,第2版(2001)；M.Bodanszky,A.Bodanszky,The Practice of Peptide Synthesis,Springer-Verlag,Berlin Heidelberg(1984)；J.Seyden-Penne,Reductions by the Alumino-andBorohydrides in Organic Synthesis,第2版,Wiley-VCH,(1997)；以及L.Paquette,编辑,Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis,John Wiley and Sons(1995)。
在一些实施方案中，本公开内容的化合物也以多种互变异构形式表示。本公开内容明确地包括本文描述的化合物的所有互变异构形式。
在一种实施方案中，化合物也以顺式-或反式-或者E-或Z-双键异构形式存在。这样的化合物的所有这样的异构形式都明确地被包括在本公开内容中。
适应症
本公开内容提供了能够调节一种或更多种信号转导途径的化合物，所述信号转导途径包括但不限于原肌球蛋白相关的激酶。
术语“调节”意指与在不存在化合物时的其正常活性相比，途径(或其组分)的功能活性改变。这种效果包括任何性质或程度的调节，包括增加、激动、增大、增强、促进、刺激、减少、阻断、抑制、降低、削减、拮抗等。
本公开内容的化合物还可以调节以下过程中的一个或更多个，包括但不限于例如细胞生长(包括例如，分化、细胞存活和/或增殖)、肿瘤细胞生长(包括例如，分化、细胞存活和/或增殖)、肿瘤退化、内皮细胞生长(包括例如，分化、细胞存活和/或增殖)、血管生成(血管生长)、***生成(***生长)和/或血细胞生成(例如，T-细胞和B-细胞发育、树突细胞发育等)。
虽然不希望受任何理论或作用机理的束缚，但已经发现本公开内容的化合物具有调节激酶活性的能力。然而，本公开内容的方法不限于任何特定的机理或化合物如何实现它们的治疗效果。短语“激酶活性”意指其中来自三磷酸腺苷(ATP)的γ-磷酸酯转移至蛋白质底物中的氨基酸残基(例如，丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸)的催化活性。化合物可以调节激酶活性，例如，通过直接与ATP竞争激酶的ATP结合口袋，通过在酶的结构中产生影响其活性的构象变化(例如，通过破坏生物活性的三维结构)，通过与激酶结合并且将其锁定在无活性构象中等来抑制激酶活性。
制剂和使用方法
施用的化合物的量以及用本公开内容的化合物和/或组合物治疗癌症的剂量方案取决于多种因素，包括受试者的年龄、体重、性别和医学状况、疾病的类型、疾病的严重程度、施用的途径和频率以及所使用的特定化合物。因此，剂量方案可能变化很大，但可以使用标准方法来常规地确定。约0.01mg/kg至500mg/kg、有利地在约0.01mg/kg和约50mg/kg之间、更有利地在约0.01mg/kg和约30mg/kg之间、甚至更有利地在约0.1mg/kg和约10mg/kg之间的每日剂量可以是合适的，并且应当可用于本文公开的所有使用方法。每日剂量可以以每天一剂至四剂施用。
虽然可以单独施用本公开内容的化合物，但在所描述的方法中，施用的化合物通常将作为活性成分存在于药物组合物中。因此，在本公开内容的另一种实施方案中，提供了药物组合物，所述药物组合物包含与药学上可接受的载体组合的本公开内容的化合物，所述药学上可接受的载体包括如本文所描述的稀释剂、赋形剂、佐剂和类似物(本文中被统称为“载体”材料)，并且如果需要还包含其他活性成分。本公开内容的药物组合物可以包含有效量的本公开内容的化合物或有效剂量量的本公开内容的化合物。本公开内容的化合物的有效剂量量包括小于、等于或大于该化合物的有效量的量；例如，其中需要两种或更多种单位剂量(诸如以片剂、胶囊和类似物)来施用有效量的化合物的药物组合物，或者可选择地，其中通过施用组合物的一部分来施用有效量的化合物的多剂量药物组合物，诸如粉末、液体和类似物。
施用途径
合适的施用途径包括但不限于口服施用、静脉内施用、直肠施用、气雾剂施用、肠胃外施用、眼施用、肺施用、经粘膜施用、经皮施用、***施用、耳施用、鼻施用和局部施用。此外，仅通过实例的方式，肠胃外递送包括肌内注射、皮下注射、静脉内注射、髓内注射，以及鞘内注射、直接脑室内注射、腹膜内注射、***内注射和鼻内注射。
本公开内容的化合物可以口服施用。口服施用可以包括吞咽，使得化合物进入胃肠道，或者可以采用含服施用或舌下施用，通过含服施用或舌下施用化合物直接从口进入血流。适合于口服施用的制剂包括固体制剂诸如片剂，含有微粒、液体或粉末的胶囊，锭剂(包括液体填充的锭剂)，咀嚼剂，多微粒和纳米微粒，凝胶，固体溶液，脂质体，膜(包括粘膜粘着剂)，胚珠，喷雾剂和液体制剂。
本公开内容的化合物也可以以快速溶解、快速崩解的剂型使用，诸如Liang和Chen(2001)在Expert Opinion in Therapeutic Patents,11(6),981-986中描述的那些剂型，该文献的公开内容通过引用以其整体并入本文。
用于肠胃外施用的制剂可以被配制成立即释放和/或改性释放(modifiedrelease)。改性释放制剂包括延迟释放、持续释放、脉冲释放、受控释放、靶向释放和程序释放。因此，本公开内容的化合物可以被配制为固体、半固体或触变性液体，用于作为植入的贮库施用，提供活性化合物的改性释放。这样的制剂的实例包括药物涂覆的支架和PGLA微球。
组合
虽然本公开内容的化合物可以作为唯一的活性药物剂给药或施用，但它们也可以与一种或更多种本公开内容的化合物组合使用，或者与其他剂结合使用。
在一种实施方案中，本文描述的化合物中的一种的治疗效果通过施用佐剂来增强(即，佐剂本身可以具有最小的治疗益处，但与另一种治疗剂组合时，对于患者的整体治疗益处被增强)。或者，在一些实施方案中，通过将本文描述的化合物中的一种与也具有治疗益处的另一种治疗剂(其也包括治疗方案)一起施用，增加了患者所经历的益处。
在一种具体实施方案中，式I或式II的化合物与第二治疗剂共同施用，其中式I或式II的化合物和第二治疗剂调节被治疗的疾病、紊乱或状况的不同方面，从而提供比单独施用任一种治疗剂更大的总体益处。
在任何情况下，不管被治疗的疾病、紊乱或状况如何，患者所经历的总体益处可以简单地是两种治疗剂的叠加，或者患者可以经历协同益处。
在某些实施方案中，当本文公开的化合物与一种或更多种另外的剂(诸如另外的治疗有效药物、佐剂或类似物)组合施用时，本文公开的化合物的不同治疗有效剂量将被用于配制药物组合物和/或治疗方案中。用于联合治疗方案的药物和其他剂的治疗有效剂量可以通过与上文关于活性物质本身所阐述的手段(means)类似的手段来确定。此外，本文描述的预防/治疗的方法包括节律给药(metronomic dosing)的使用，即，提供更频繁的、更低的剂量，以便最小化毒副作用。在一些实施方案中，联合治疗方案包括这样的治疗方案：其中式I或式II的化合物的施用在用本文描述的第二剂治疗之前、期间或之后开始，并且持续直到用第二剂治疗期间或用第二剂治疗终止之后的任何时间。它还包括这样的治疗：其中式I或式II的化合物和组合使用的第二剂同时施用，或者在不同时间和/或在治疗期期间以减小的间隔或增加的间隔施用。联合治疗还包括在不同时间开始和停止的周期性治疗，以帮助患者的临床管理。
应理解，治疗、预防或减轻寻求缓解的状况的剂量方案根据多种因素来修改。这些因素包括受试者所遭受的疾病、紊乱或状况，以及受试者的年龄、体重、性别、饮食和医学状况。因此，在一些情况下，实际采用的剂量方案变化，并且在一些实施方案中，偏离本文阐述的剂量方案。
对于本文描述的联合疗法，共同施用的化合物的剂量取决于所采用的复合药物(co-drug)的类型、所采用的特定药物、待被治疗的疾病或状况等而变化。在另外的实施方案中，当与一种或更多种其他治疗剂共同施用时，本文提供的化合物与一种或更多种其他治疗剂同时施用，或者顺序施用。
在联合疗法中，多种治疗剂(其中一种是本文描述的化合物中的一种)以任何顺序或者甚至同时施用。如果同时施用，则仅通过实例的方式，多种治疗剂以单一、统一的形式或以多种形式(例如，作为单一丸剂或作为两种单独的丸剂)提供。在一种实施方案中，治疗剂中的一种以多剂量给予，并且在另一种实施方案中，两种(或更多种，如果存在)作为多剂量给予。在非同时施用的一些实施方案中，多个剂量之间的时间从大于零周至小于四周变化。此外，组合方法、组合物和制剂不限于仅使用两种剂；也设想使用多种治疗组合。
式I或式II的化合物以及包括式I或式II的化合物的联合疗法在疾病或状况发生之前、期间或之后施用，并且施用包含化合物的组合物的时间变化。因此，在一种实施方案中，本文描述的化合物被用作预防剂(prophylactic)，并且被连续施用至具有发展状况或疾病的倾向的受试者，以便防止疾病或状况的发生。在另一种实施方案中，在症状发作期间或在症状发作之后尽快将化合物和组合物施用至受试者。在具体实施方案中，在检测到或怀疑疾病或状况的发作之后，在可行的情况下尽快施用本文描述的化合物，并且持续治疗疾病所必需的时间长度。在一些实施方案中，治疗所需的长度变化，并且治疗长度被调节以适应每个受试者的特定需求。例如，在具体实施方案中，本文描述的化合物或包含该化合物的制剂被施用持续至少2周、约1个月至约5年。
具体地，在一些实施方案中，本公开内容的化合物的施用与癌症的预防或治疗领域的技术人员已知的另外的疗法相结合。
化合物的合成
式I或式II的化合物根据本领域技术人员在以下方案中描述的程序来合成，其中取代基如上文关于式I或式II所定义，除非另外说明。下文描述的合成方法仅仅是示例性的，并且本公开内容的化合物也可以通过替代的路线来合成，如本领域普通技术人员所理解的。
本公开内容中式II的化合物的合成在方案1中描述。化合物1与ArCOCl或ArCOOH的酰化反应提供了式II或式I中的化合物(方案1)。
方案1
Figure BDA0002381403520000321
实施方案的描述
这些详细描述仅仅是为了说明性目的而呈现，并且不意图作为对权利要求的范围的限制。
质子NMR谱
除非另外指示，否则所有1H NMR谱都在Varian系列Mercury 300，400MHz仪器或Bruker系列400MHz仪器上运行。在如此表征的情况下，所有观察到的质子都被报告为在适当溶剂指示中从四甲基硅烷(TMS)或其他内部参考起向低场的百万分率(ppm)。
缩写
DCM 意指二氯甲烷。
RT 意指室温。
EA 意指乙酸乙酯。
DIPEA 意指N,N-二异丙基乙胺。
TLC 意指薄层色谱法
HATU 意指1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-***并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐或六氟磷酸盐氮杂苯并***四甲基脲鎓。
合成的实施例：
实施例1：(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-胺的合成
Figure BDA0002381403520000331
步骤1：(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-3-硝基吡唑并[1,5-a]嘧啶的合成
将(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷(R)-2-羟基琥珀酸盐(7.6g，5.5mmol，1.1当量)、5-氯-3-硝基吡唑并[1,5-a]嘧啶(10.0g，5.0mmol，1.0当量)和乙醇添加到装备有机械搅拌器的圆底烧瓶中。在溶解之后，在室温将DIPEA(22.7g，17.6mmol，3.5当量)添加到反应混合物中。将反应在室温搅拌持续3小时。过滤并且将滤饼用乙醇(30ml×2)洗涤。在40℃干燥以给出产物(11.3g)。
步骤2：(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-胺的合成
向装配有机械搅拌器的圆底烧瓶中添加(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-3-硝基吡唑并[1,5-a]嘧啶(50.0g，145mmol，1.0当量)，并且随后添加甲醇/DCM(625ml/625ml)。在溶解之后，将Zn(94.2g，1.45mol，10.0当量)添加到反应混合物中。将反应的温度调节到在25℃至30℃之间。在该温度，将饱和的氯化铵水溶液(657ml)逐滴添加到反应混合物中，并且搅拌持续3小时。通过TLC来监测反应。
然后将反应混合物经硅藻土床过滤。将滤床用DCM(200ml×2)洗涤，分离，并且将水相用DCM(250ml×2)提取。分离并且与有机层合并，经无水硫酸钠干燥。通过真空蒸发并且通过快速硅胶柱色谱法纯化，以给出产物(51g)。
实施例2：(R)-N-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)苯甲酰胺的合成
Figure BDA0002381403520000341
将水和(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-胺(46.4g，147.2mmol，1.0当量)混合在一起。将混合物的温度调节到在0℃至5℃之间。在该温度范围内，将4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)苯甲酰氯二盐酸盐(95.9g，294.4mmol，2.0当量)经由5份添加到混合物中，其中每10分钟将一份添加到混合物中。
在反应完成之后，将活性炭(5.0g)添加到反应混合物中，并且将反应混合物搅拌持续15分钟。然后将反应混合物经硅藻土床过滤。将滤床用水(100ml×2)洗涤。
将滤液用EA(200ml×2)提取，随后用DCM/EA(v/v＝3:7，200ml×3)提取，最后将滤液再次用EA(200ml)提取。将水相加热至50℃-55℃，然后用含水的NaOH(20％)将反应溶液的pH调节至9-10。将其用EA(250ml)提取，形成一些沉淀，将该沉淀过滤并且分离。将水相用EA(200ml×2)提取。将有机层合并。
将活性炭(5.0g)添加到有机层中，然后将反应混合物加热至50℃-55℃并且搅拌持续30分钟。然后将反应混合物经硅藻土床过滤。将滤床用EA(100ml×3)洗涤，将滤液经无水硫酸钠干燥。在40℃通过真空蒸发，以给出作为黄色固体的产物(71.3g)。
1HNMR(CDCl3):2.08(s,3H),2.32(d,J＝10.0,6H),2.48-2.51(m,8H),3.59(s,2H),4.12(s,1H),6.01(brs,1H),6.78(s,1H),6.91-6.93(m,1H),7.01-7.04(m,1H),7.47(d,J＝8.4,2H),7.88(d,J＝6.8,2H),8.16(d,J＝7.2,2H),8.64(s,1H)。MS m/z 532[M+1]。
实施例3：(R)-N-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯甲酰胺的合成
Figure BDA0002381403520000351
步骤1：2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯甲酸甲酯的合成
将4-氟-2-甲氧基苯甲酸甲酯(1.84g，10.0mmol，1.0当量)和1-甲基哌嗪(2.0g，20.0mmol，2.0当量)的混合物添加到100ml三颈圆底烧瓶中。将反应加热至80℃并且搅拌持续40小时。然后将水(20ml)倒入反应溶液中，并且将混合物用乙酸乙酯(20ml×3)提取，并且将有机层合并，并且经无水硫酸钠干燥。在45℃在真空下蒸发给出黄色油状物。将黄色油状物用DCM(30ml)溶解，将在异丙醇中的HCl(30％，4ml)添加到反应溶液中，出现一些固体。将固体通过过滤收集，并且将收集的固体用DCM(10ml×2)洗涤，以给出粗制产物1.32g。
步骤2：2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯甲酸的合成
将2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯甲酸甲酯(200mg，0.66mmol，1.0当量)和MeOH(5.0ml)添加到100ml三颈圆底烧瓶中。搅拌，并且将NaOH水溶液(4mol/L，5.0ml)添加到反应溶液中。将反应溶液在60℃加热持续3小时。通过TLC来监测反应。将甲醇在45℃在真空下除去，并且用HCl水溶液(4mol/L)将剩余混合物的pH调节至6，然后用n-BuOH(10ml×3)提取。将有机层收集，经无水硫酸钠干燥。在真空下蒸发给出产物(60mg)。
步骤3：(R)-N-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯甲酰胺的合成
将2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯甲酸(50.0mg，0.17mmol，1.0当量)、(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-胺(55.0mg，0.17mmol，1.0当量)和HATU(79.2g，0.21mmol，1.2当量)的混合物溶解在DCM(5ml)中。将DIPEA(45.2mg，0.35mmol，2.0当量)添加到反应混合物中。将反应混合物在室温搅拌持续3小时。将水(20ml)添加到反应混合物中，用DCM(10ml×3)提取。将有机层合并，经无水硫酸钠干燥。在真空下蒸发提供了粗制物，将该粗制物通过硅胶柱色谱法纯化，以给出作为黄色固体的产物(20mg)。1HNMR(CDCl3):2.11-2.12(m,4H),2.40(s,3H),2.48(s,1H),2.62(t,J1＝5.2,J2＝5.2,4H),3.39(t,J1＝4.8,J2＝5.2,4H),3.80(s,1H),4.02(s,3H),4.01(s,1H),6.0(brs,1H),6.45(s,1H),6.65(dd,J1＝2.0,J2＝8.8,1H),6.75-6.79(m,1H),6.93-6.95(m,1H),7.04-7.06(m,1H),8.20(d,J＝8.8,2H),8.76(s,1H),8.89(brs,1H)。MS m/z 548[M+1]。
实施例4：(R)-N-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4-(乙基磺酰氨基)苯甲酰胺的合成
Figure BDA0002381403520000371
步骤1：4-(乙基磺酰氨基)苯甲酸甲酯的合成
将4-氨基苯甲酸甲酯(2.0g，13.2mmol，1.0当量)溶解在DCM(15ml)中，搅拌并且将吡啶(2.1g，26.4mmol，2.0当量)添加到反应混合物中。用冰浴将反应混合物冷却至0℃-5℃。然后将乙磺酰氯(2.0当量，15.8mmol，1.2当量)逐滴添加到反应混合物中，并且将反应的温度保持在不超过10℃。将反应升温至室温并且保持持续3小时。将反应混合物倒入水中，出现一些固体。将固体通过过滤收集，并且将收集的固体用水(20ml×2)洗涤，以给出湿产物(4.6g)。
步骤2：4-(乙基磺酰氨基)苯甲酸的合成
将4-(乙基磺酰氨基)苯甲酸甲酯(2.3g，湿)和MeOH(15ml)添加到100ml三颈圆底烧瓶中。将反应混合物用冰浴搅拌。在0℃-5℃将NaOH水溶液(15ml)逐滴添加到反应混合物中。然后允许反应升温至室温并且保持持续6小时。将甲醇在45℃在真空下除去，并且将剩余的混合物用HCl(浓)处理以将其pH调节至2。出现一些固体。将固体通过过滤收集，并且将收集的固体用水洗涤，以给出湿产物(1.3g)，在室温保持过夜。
步骤3：(R)-N-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4-(乙基磺酰氨基)苯甲酰胺的合成
将4-(乙基磺酰氨基)苯甲酸(144.5mg，0.63mmol，1.0当量)、(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-胺(200mg，0.63mmol，1.0当量)和HATU(287.3mg，0.76mmol，1.2当量)的混合物溶解在DCM(10ml)中，并且将DIPEA(162.5mg，1.26mmol，2.0当量)添加到反应混合物中。将反应混合物在室温搅拌持续1小时。将水(15ml)添加到反应混合物中。将有机层分离，并且将水层用DCM(10ml)提取。将有机层合并，经无水硫酸钠干燥。在真空下蒸发并且通过硅胶柱色谱法纯化给出作为黄色固体的产物(240.9mg)。LC-MS(M+1＝527.2)。
1HNMR(CDCl3):1.41(t,J＝7.2,3H),2.02-2.12(m,5H),2.51-2.52(m,1H),3.22(q,J1＝7.6，J2＝7.2,2H),3.951(s,1H),6.0(brs,1H),6.79(s,1H),6.91(s,1H),7.03(s,1H),7.33-7.36(d,J＝8.4,2H),7.70(s,1H),7.88-7.90(d,J＝7.2,2H),8.21(s,2H),8.61(s,1H)。MS m/z 527[M+1]。
生物测定：
激酶测定；
对于大多数测定，在源自BL21菌株的大肠杆菌(E.coli)宿主中制备激酶标记的T7噬菌体菌株。将大肠杆菌生长至对数期，并且用T7噬菌体感染，并且在32℃摇动孵育直到裂解。将裂解物离心并且过滤以除去细胞碎片。剩余的激酶在HEK-293细胞中产生，并且随后用DNA标记用于qPCR检测。链霉亲和素包被的磁珠在室温用生物素化小分子配体处理持续30分钟，以产生用于激酶测定的亲和树脂。经配体结合的珠(liganded bead)用过量的生物素封闭，并且用封闭缓冲液(SeaBlock(Pierce)，1％BSA，0.05％吐温20(Tween 20)，1mMDTT)洗涤，以除去未结合的配体并且减少非特异性结合。结合反应通过将激酶、经配体结合的亲和珠和测试化合物合并在1×结合缓冲液(20％SeaBlock，0.17×PBS，0.05％吐温20，6mM DTT)中来组装。所有反应都在以0.135ml的最终体积的聚苯乙烯96孔板中进行。将测定板在室温在摇动的情况下孵育持续1小时，并且将亲和珠用洗涤缓冲液(1×PBS，0.05％吐温20)洗涤。然后将珠重新悬浮在洗脱缓冲液(1×PBS，0.05％吐温20，0.5μM非生物素化亲和配体)中，并且在室温在摇动的情况下孵育持续30分钟。洗脱物中的激酶浓度通过qPCR来测量。
其他测定：
测定化合物1-4：
化合物1(LOXO-101)为
Figure BDA0002381403520000391
化合物2为
Figure BDA0002381403520000392
化合物3为
Figure BDA0002381403520000393
化合物4为
Figure BDA0002381403520000394
(a)确定测试化合物抑制激酶活性的能力的体外测定
I.制备1×激酶基础缓冲液和终止缓冲液用于测试激酶
1)1×激酶基础缓冲液(用于TRK-A)
50mM HEPES，pH 7.5
0.0015％Brij-35
2)终止缓冲液
100mM HEPES，pH 7.5
0.015％Brij-35
0.2％包被试剂#3
50mM EDTA
II.用化合物制备源板
1)通过100％DMSO将化合物稀释至反应最终浓度的50×。将100μl的该化合物稀释液转移至96孔板中的孔中。例如，如果期望的最高抑制剂浓度是10μM，那么在该步骤中制备500μM的化合物DMSO溶液。
2)用100％DMSO对步骤1)中获得的化合物稀释液进行3×系列稀释，以提供9个以上的化合物的稀释溶液。
3)将100μl的100％DMSO添加到两个空孔中，用于在同一96孔板中的无化合物对照和无酶对照。将该板标记为源板。
4)制备中间板
将10μl的化合物从源板转移至作为中间板的新的96孔板。
将90μl的1×激酶基础缓冲液添加到中间板的每个孔中。
在摇床上将化合物在中间板中混合持续10min。
5)制备测定板
将每个孔的5μl从96孔中间板转移到384孔板，一式两份。例如，将96孔板的A1转移至384孔板的A1和A2。将96孔板的A2转移至384孔板的A3和A4，以此类推。
III.激酶反应
1)制备2.5×酶溶液
在1×激酶基础缓冲液中添加激酶。
2)制备2.5×肽溶液
在1×激酶基础缓冲液中添加FAM标记的肽和ATP。
3)将2.5×酶溶液转移至测定板
测定板已经含有5μl的在100％DMSO中的化合物。
将10μl的2.5×酶溶液添加到384孔测定板的每个孔中。
在室温孵育持续10min。
4)将2.5×肽溶液转移至测定板
将10μl的2.5×肽溶液添加到384孔测定板的每个孔中。
5)激酶反应和终止
在28℃孵育持续特定的一段时间。
添加25μl的终止缓冲液以终止反应。
IV.Caliper读取
收集Caliper上的数据。
V.曲线拟合
从Caliper程序中拷贝转化率数据。
将转化率值转换为抑制值。
抑制百分比＝(最大-转化率)/(最大-最小)*100。
“最大”代表DMSO对照；“最小”代表无酶活性对照。
在Xlfit中拟合数据以获得IC50值。
所使用的等式是
Y＝底部+(顶部-底部)/(1+10^((LogIC50-X)*希尔斜率(Hill Slope)))
以下表A列出了代表本公开内容的化合物及其在ROS1测定和TRK-A测定中的活性，这两种测定都是上文一般描述的激酶测定。
表A
Figure BDA0002381403520000411
(b)针对TEL-NTRK1-BaF3细胞测定了代表性数量的化合物。
I.制备化合物板
将待测定的化合物溶解在100％DMSO中以制备4mM母溶液，该母溶液经历3×系列稀释以制备具有10mM、3.333mM、1.111mM、0.370mM、0.123mM、0.041mM、0.014mM的浓度的溶液，将所有这些溶液储存在0.5mL无菌eppendorf(Corning，NY，USA)中。同时，制备空白样品作为对照，该样品仅含有与化合物溶液相同体积的DMSO。将化合物板上的9个样品在-20℃在真空中储存。
II.细胞培养条件
在复苏之后，在RPMI 1640(Corning，NY，USA)+10％胎牛血清(Gibco/Invitrogen，USA)中培养TEL-NTRK1-BaF3细胞系持续两代。储存用于将来使用。
III.测定和数据分析
将对数期的细胞(每孔2,000-2,500个细胞)收获，并且接种在白色不透明的细胞培养板(Corning 3570，NY，USA)的孔中。每个孔中的包含细胞的悬浮液的体积是100μL。将来自化合物板的化合物以每孔0.1μL添加到细胞培养板中，以达到10μM、3.3μM、1.1μM、0.37μM、0.12μM、0.04μM和0.014μM的最终化合物浓度。在37℃和5％CO2培养室中孵育持续72小时。将10μL的CellTiter-
Figure BDA0002381403520000421
荧光细胞生存力测定试剂添加到每个孔中，等待持续10分钟，然后使用Evision Plate-读取器读取。
以下表B列出了代表本公开内容的化合物及其在TEL-NTRK1-BaF3细胞测定中的活性。
表B
TEL-NTRK1-BaF3 GI50(nM)
LOXO-101 25
化合物2 <1
化合物3 3
化合物4 24
(c)代表性数量的化合物的溶解度测量
溶解度测量程序可以包括：
参考标准溶液的制备：将2mg的测试化合物各自单独地添加到100mL容量瓶中。将化合物用乙腈稀释至100mL。
样品溶液的制备：将2mg的测试化合物单独地添加到2mL eppendorf管(EP)中，随后添加1mL的pH 4.0缓冲溶液(20mM)。将溶液摇动持续2分钟，并且在25℃放置持续30分钟。在静置持续30分钟之后，在EP的底部形成沉淀。将溶液通过0.2μm膜过滤器过滤，并且然后用水稀释50倍。
将标准溶液和样品溶液以相同体积注入到Shim-Pack CLC-ODS C18柱(150mm×6.0mm，5um)上的HPLC中。流动相由含2％三氯甲烷的乙腈–20mM KH2PO4缓冲液(pH＝7.0)组成(40:60)，流量为1mL/分钟。检测波长为264nm。计算：样品的溶解度＝标准的浓度×样品的面积×50/标准的面积。
以下表C列出了选定化合物的溶解度数据。
表C
Figure BDA0002381403520000431
(d)代表性数量的化合物的药代动力学研究
PK(药代动力学)测定的代表性方案如下：将化合物静脉注射(IV)或口服给予相同的动物。每种化合物的剂量是静脉注射2mg/kg(体积5ml/kg)和口服5mg/kg(体积10ml/kg)。静脉注射的制剂是在以0.4mg/mL的10％Solutol HS 15+90％磷酸盐缓冲盐水中。以0.5mg/mL的100％(0.5％吐温80(Tween 80)在含0.5％MC的水中)悬浮液用于口服制剂。
样品收集：对于静脉注射途径，在0.083小时、0.25小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时、8小时和24小时的时间点收集血浆样品。对于口服途径，在0.25小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时、8小时和24小时的时间点收集血浆样品。
分析：LC-MS/MS用于计算PK参数：t1/2、tmax、Cmax、Vss和AUC等。
以下表D列出了选定的化合物及其生物利用度。
表D
化合物 F(％)
LOXO-101 33
3 56
在大鼠中，化合物1或LOXO-101示出了33％的口服生物利用度。令人惊讶地，化合物3具有大幅改善的生物利用度(F＝56％)。
化合物1(LOXO-101)具有低的脑渗透，相反，化合物2和化合物3两者都具有非常高的脑血浆比率(分别为0.96和5.47)，指示化合物2和化合物3可以渗透血脑屏障。
(e)毒性研究
在典型的一个月的大鼠毒性研究中，测试了代表性数量的化合物，包括化合物1(LOXO-101)和化合物3，其中剂量为30mg/kg和100mg/kg。在该实验的条件下，在化合物施用期结束和恢复期结束时，以30mg/kg和100mg/kg剂量施用LOXO-101的组中的一些动物显示血液中#LYMPH和/或％LYMPH的略微减少，以及血液中#NEUT和/或％NEUT的略微增加的趋势。相应的动物骨髓显示出骨髓:红系比率(myeloid:erythroid ratio)的增加或增加的趋势。相反，在以30mg/kg或100mg/kg剂量的化合物3治疗组中或媒介物对照组中没有观察到类似的变化。

Claims (10)

1.一种根据式I的化合物：
Figure FDA0003202430430000011
或其药学上可接受的盐、或立体异构体，其中Ar是以下残基：
Figure FDA0003202430430000012
其中Y2是键或CR23R24；
R1、R2、R4和R5独立地是氢、卤素、CF3、C1-C3烷基、NO2、C1-C3烷氧基或氧杂环己-4-基氨基；
R21是独立地选自由以下组成的组的一个或更多个基团：氢、C1-C3烷基和氘；
R22是C1-C3烷基、CO(C1-C3烷基)或氢；以及
R23和R24中的每个独立地是氢、氘或C1-C3烷基。
2.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物是根据式II：
Figure FDA0003202430430000021
或其药学上可接受的盐、或立体异构体，其中Ar是以下残基：
Figure FDA0003202430430000022
其中Y2是键或CR23R24；
R1、R2、R4和R5独立地是氢、卤素、CF3、C1-C3烷基、NO2、C1-C3烷氧基或氧杂环己-4-基氨基；
R21是独立地选自由以下组成的组的一个或更多个基团：氢、C1-C3烷基和氘；
R22是C1-C3烷基、CO(C1-C3烷基)或氢；以及
R23和R24中的每个独立地是氢、氘或C1-C3烷基。
3.选自以下的化合物或其药学上可接受的盐、或立体异构体：
Figure FDA0003202430430000023
Figure FDA0003202430430000031
Figure FDA0003202430430000041
Figure FDA0003202430430000051
Figure FDA0003202430430000061
Figure FDA0003202430430000071
4.如权利要求3所述的化合物，其中所述化合物选自由以下组成的组：
Figure FDA0003202430430000072
Figure FDA0003202430430000081
Figure FDA0003202430430000091
Figure FDA0003202430430000101
Figure FDA0003202430430000111
5.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-4中任一项所述的化合物和药学上可接受的载体。
6.权利要求5所述的药物组合物在制备治疗或预防患者的过度增殖性紊乱的药物中的用途。
7.如权利要求1-4中任一项所述的化合物在制备治疗或预防过度增殖性紊乱的药物中的用途。
8.如权利要求1-4中任一项所述的化合物在制备治疗或预防多种癌症的药物中的用途。
9.如权利要求1-4中任一项所述的化合物在制备调节激酶信号转导的药物中的用途。
10.一种药物组合物在制备治疗或预防过度增殖性紊乱的药物中的用途，所述的药物组合物包含与一种或更多种抗癌剂组合的权利要求1-4中任一项所述的化合物。
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