CN108467839A - 黄芪促生内生菌及其促生长方法与应用 - Google Patents

黄芪促生内生菌及其促生长方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属黄芪促生技术领域，为解决目前黄芪促进生长、品质改善的问题，提供黄芪促生内生菌及其促生长方法与应用。促生内生菌为：鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.）菌株KSCO1和草假单胞菌（Pseudomonas poae）菌株KSCO2；2017年11月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.14945、CGMCC No.14946。2～10μM的E‑2‑己烯醛和5～625μM的正己醇促进KSC01的生长、25～625μM的正己醇促进KSCO2的生长。为中药材黄芪种植提供了一种绿色、无药材残留的环境友好型农药组分。

Description

黄芪促生内生菌及其促生长方法与应用
技术领域
本发明属于黄芪促生技术领域，具体涉及黄芪促生内生菌及其促生长方法与应用。
背景技术
绿叶挥发物（Green leaf volatiles, GLVs）是植物在受到昆虫啃食、机械损失、病原菌感染时产生的一类含6个碳原子的挥发性有机化合物，主要包括：正己醛、E-2-己烯醛、正己醇等[1]。针对GLVs生态生理作用的系列研究表明：该类挥发物不仅具有介导植物生物与非生物胁迫防御应答、促进花青苷等次生代谢物质积累等作用[2]，Gueldner和Nakamura等研究小组还发现GLVs还具有抑制多种致病菌繁殖、抑制黄曲霉毒素产生等作用[3~4]。此外，GLVs具有抑制蚜虫、螨虫和甲虫等繁殖的作用[5~7]。以盆栽黄芪为材料开展的研究还发现，GLVs具有促进黄芪多糖、黄芪皂苷Ⅳ等活性成分积累的作用[8]。挖掘GLVs在药用植物中具有潜在促生效应的内生菌生长中的作用，解决目前黄芪种植中存在的农药残留、药材品质下降等问题，是黄芪种植产业稳定、持续发展的关键之一。
黄芪为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，属常用补益类中药，目前主产于我国黑龙江、甘肃、内蒙古、山西、陕西等地。不同产地的黄芪药材中均含有正己醛、正己醇和E-2-己烯醛，是黄芪道地药材豆香气的主要气味成分。
含有1-氨基环丙烷-1-羧酸（1-Aminocyclopropane-1-carboxylate, ACC）脱氨酶是一大类植物促生菌共有特性之一，该类促生菌具有分解植物体内ACC（乙烯合成的直接前体）为氨和α-丁酮酸，减少植物体内乙烯水平，具有增强植物抗胁迫能力的作用[9]。因此，促进含ACC脱氨酶内生菌生长的GLVs组分挖掘，将有助于将二者结合应用于黄芪种植业。
发明内容
本发明为了解决目前黄芪促进生长、品质改善的问题，提供了黄芪促生内生菌及其促生长方法与应用。
本发明由如下技术方案实现的：黄芪促生内生菌，所述促生内生菌为含1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶即ACC脱氨酶的内生菌菌株：鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.）菌株KSCO1和草假单胞菌（Pseudomonas poae）菌株KSCO2；两菌株于2017年11月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号分别为：CGMCC No.14945、CGMCCNo.14946，菌种来源于黄芪鲜药材。
所述黄芪促生内生菌的分离方法为：以5年生黄芪鲜根为材料，采用组织块分离培养法从黄芪鲜根中分离黄芪内生菌，在加入ACC的DF盐固体培养基上，连续培养5次，均可以生长的菌株即为含ACC脱氨酶活性的菌株；用不含(NH4)2SO4的 DF 盐固体培养基连续传代5次，仍能生长的菌株，具有固氮活性；牛肉膏蛋白胨液体培养基中添加色氨酸的过夜培养物，与Salkowski反应液定性判断菌株分泌植物生长激素—吲哚乙酸；LB固体培养基连续传代培养5次，确定菌株产色素稳定性；参照《常见细菌***鉴定手册》进行菌株形态学、运动性、耐盐度、耐受酸碱度及接触酶实验；16SrRNA结合形态学特征进行菌株鉴定，并保存菌种；其中分离纯化所得的内生菌分别为鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.）菌株KSCO1和草假单胞菌（Pseudomonas poae）菌株KSCO2。两菌株于2017年11月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号分别为：CGMCC No.14945、CGMCC No.14946，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。菌种来源于黄芪鲜药材。
一种促进上述黄芪促生内生菌生长的方法为：培养基中添加浓度为2～10μM的E- 2-己烯醛促进鞘氨醇杆菌菌株KSC01的生长、添加浓度为5～625μM的正己醇促进鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.）菌株KSCO1的生长、添加浓度为25～625μM的正己醇促进草假单胞菌（Pseudomonas poae）菌株KSCO2的生长。
所述的黄芪促生内生菌在促进胁迫条件下黄芪生长中的应用。
所述的黄芪促生内生菌促生长的方法在增强黄芪胁迫条件生长中的应用。
本发明涉及的GLVs组分：E-2-己烯醛和正己醇是黄芪药材自身释放的一类挥发性有机物，使用过程中不存在二次污染的问题；合适浓度的GLVs组分促进黄芪促生菌生长作用应属道地药材的生态适应特征，其应用满足绿色、可持续发展的中药种植需要。
本发明确定了GLVs促进的含ACC脱氨酶的内生菌菌株分别为鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.）菌株KSCO1和草假单胞菌（Pseudomonas poae）菌株KSCO2，草假单胞菌（Pseudomonas poae）菌株KSCO2还具有固氮、耐高浓度盐及耐酸碱等特性。确定了具有促进鞘氨醇杆菌菌株KSC01和草假单胞菌菌株KSC02生长的GLVs组分及其浓度：2～10μM的E-2-己烯醛、25～625μM的正己醇，为中药材黄芪种植提供了一种绿色、无药材残留的环境友好型农药组分。
黄芪药材，目前以栽培为主，田间管理普遍存在喷施农药控制病虫害、施用化学肥料促进生长等现象，不仅容易造成药材中农药残留量超标、品质下降，同时也造成土壤污染和土壤板结等，不利于黄芪种植业的持续、绿色发展。本发明所确定的GLVs组分，是不同解剖学部位的山西鲜黄芪药材中共有的GLVs组分，在黄芪促生内生菌中的应用，不存在二次污染的问题。此外，GLVs本身不仅具有促进黄芪多糖、皂苷类成分积累的作用[8]，在玉米等经济作物中的研究还发现GLVs具有介导植物防御应答，增强植物抗病性等有益作用[1]。
本发明GLVs促进生长的含ACC脱氨酶内生菌菌株，还具有固氮、耐盐碱等生物活性。植物在干旱、盐碱等胁迫条件下，会合成更多的乙烯以抑制植物的生长，含ACC脱氨酶的内生菌具有分解乙烯合成前体ACC的能力，从而降低胁迫条件下植物体内的乙烯水平，间接发挥促生效应。菌株KSC02可以在含7%的NaCl培养液中生长，也可以在pH5～9的培养液生长，耐盐碱、耐酸活性佳，菌株KSC01最高耐盐浓度为4%、耐碱最高pH为9，也具有比较好的耐盐碱性。两菌株与GLVs协同作用，有望提高栽培黄芪的抗胁迫能力，开发为绿色农药，起到提高药材品质、降低化学合成农药的双重作用。此外，耐盐碱菌株与GLVs协同喷施，还有望将黄芪种植在盐碱地，发挥修复盐碱地、扩大黄芪种植面积的双重效应。
附图说明
图1为黄芪根挥发物总离子流图谱；图2为鞘氨醇杆菌菌株KSC01（A、B）和草假单胞菌菌株KSC02（C、D）菌落形态和革兰氏染色显微形态图，图中：A为鞘氨醇杆菌菌落形态图，B为鞘氨醇杆菌革兰氏染色显微形态图，C为草假单胞菌菌落形态图，D为草假单胞菌革兰氏染色显微形态图，图B和D放大倍数：10×100；图3为 E-2-己烯醛添加对鞘氨醇杆菌菌株KSC01生长的影响结果图，图中a、b、c表示组间存在显著性差异；由于空白对照与溶剂对照（CK2）间存在显著差异，故相对生长率计算时以溶剂对照作为参照；图4为正己醇添加对鞘氨醇杆菌菌株KSC01生长的影响结果图，图中a、b、c表示组间存在显著性差异；由于空白对照与溶剂对照（CK2）间存在显著差异，故相对生长率计算时以溶剂对照作为参照；图5为正己醇添加对草假单胞菌菌株KSC02生长的影响结果图，图中a、b、c表示组间存在显著性差异；由于空白对照与溶剂对照（CK2）间存在显著差异，故相对生长率计算时以溶剂对照作为参照。
具体实施方式
实施例1：黄芪主要绿叶挥发物组分的确定
以山西浑源2、5、7年生鲜黄芪为材料，无菌操作分离为周皮、次生韧皮部和次生木质部，液氮研磨后取0.2g样品，采用顶空GC-MS法分析其挥发物谱。以正己醛、E-2-己烯醛和正己醇为对照品，根据其代表性离子碎片及保留时间，进行样品中有关物质的指认。根据样品中三者峰面积，计算其相对含量。GraphPad Prism (5.01)进行数据处理与差异显著性分析，阈值设定为P<0.05。
代表性总离子流图谱见图1。从该图可以看出，不同的黄芪解剖学部位均可以检测到正己醛、E-2-己烯醛和正己醇，属黄芪主要GLVs组分。
以样品中正己醛、E-2-己烯醛和正己醇色谱峰面积除以色谱峰面积总和，得相对含量数据，结果见表1。从该表可以看出，三部位含有的正己醛含量相对较高，E-2-己烯醛和正己醇含量较低，周皮E-2-己烯醛含量显著低于次生木质部和次生韧皮部，正己醇分布特征正好与E-2-己烯醛相反，周皮中正己醇含量最高。
表1 黄芪周皮、次生韧皮部和木质部正己醛、E-2-己烯醛和正己醇含量分析
GLVs组分 周皮 (%) 次生韧皮部 (%) 次生木质部 (%)
正己醛 20.61±9.86b 45.64±24.29a 54.44±20.26a
E-2-己烯醛 0.91±0.86b 3.65±2.02a 4.22±2.31a
正己醇 5.22±4.34a 1.33±1.13b 1.72±2.17b
注：含量数据以平均值±标准偏差的形式表示。数字右上标不同的字母代表部位间含量存在显著差异，并以abc的顺序标示着含量的高低。
实施例2：黄芪药材中含ACC脱氨酶等促生活性的内生菌菌株确定
以山西浑源5年生黄芪鲜根为材料，采用组织块分离法分离黄芪内生菌。具体操作如下：将采回的鲜黄芪用自来水冲洗若干次，洗去残留在根表泥土，紧接着用含10% 吐温-20的无菌水冲洗；在无菌条件下，将黄芪根切成1 cm长的小段，置于75% 酒精中浸泡1min，无菌水冲洗3次，放入5% NaClO中浸泡10 min，无菌水冲洗3次，然后放入75%酒精中漂洗40 s，无菌水冲洗 5次，用无菌滤纸吸去多余水分，将处理好的材料置于无菌研砵中，加入2 mL生理盐水捣碎，研磨。
取100 μL上清液涂布于LB固体培养基（培养基配方：蛋白胨1.0g、酵母粉0.5 g、NaCl 1.0 g、琼脂粉1.5克）平板，28℃避光培养2 d。同时将最后一次无菌水洗液作为对照，若没有任何菌落长出，证明材料表面消毒彻底，分离到的菌为黄芪内生菌。
内生菌的纯化：根据菌落长出时间、形态及颜色，挑选代表性菌落转接于新的LB固体培养基平皿，进行纯化培养，经几次转接后得到菌落形态完全一致的单菌落即视为纯化后的内生菌。将纯化好的内生菌进行编号，然后转接于LB液体培养基中28 ℃培养至对数生长期，无菌条件下，将菌液与灭菌甘油混合均匀，甘油终浓度为20%，置于-80 ℃冰箱内保存。
含ACC脱氨酶的内生菌筛选：参照文献[10]，筛选获得2株含ACC脱氨酶的内生菌菌株。具体操作如下：将冰箱中保存的菌种划线接种于LB固体培养基，28℃培养过夜，选取单菌落再划线培养一次，挑取单菌落转接到ADF固体平板，采用划线法连续传代5次，仍能正常生长者，说明该菌含ACC脱氨酶。
DF盐培养基配方：KH2PO4 4.0 g，Na2HPO4 6.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，葡萄糖 2.0g，葡萄糖酸钠 2.0 g，柠檬酸 2.0 g，(NH4)2SO4 2.0 g，组分1、组分2 各0.1 mL，H2O 1000mL，pH 7.2。其中组分1的配方为：H3BO4 10 mg，MnSO4·H2O 11 mg，ZnSO4·7H2O 124.6 mg，CuSO4·5H2O 78.2 mg，MoO3 10.0 mg，溶于100 mL灭菌水中；组分2的配方为：FeSO4·7H2O100.0 mg溶于10 mL灭菌水中，将配置好的组分1、组分2置于4 ℃保存，备用。
ADF培养基：将ACC溶于超纯水，用无菌滤膜过滤除菌后，加入不含(NH4)2SO4的DF盐培养基中，其中，ACC的终浓度为3.0 mmol/L。
参照文献[11]，进行菌株鉴定，具体步骤如下：挑取少量细菌培养物混悬于50μL无菌水中，100℃裂解5min，作为DNA模板，以27F[(5’-3’)：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG]和1492R[(5’- 3’)：TACGGYTACCTTGTTACGACTT]作引物，进行PCR扩增：
PCR反应扩增体系：
10×PCR buffer（Mg2+ plus） 2.5 μL
dNTPs(2.5 mM) 1.2 μL
引物1(3pmol) 0.3 μL
引物2(3pmol) 0.3 μL
rTaq酶 0.4 μL
DNA模板 1 μL
无菌水 19.3 μL
Total 25 μL
PCR反应扩增程序：94℃预变性3 min，94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min 共35个循环，72℃延伸10 min后4℃冷却10 min。
PCR产物检测：将扩增得到的PCR产物用1% 琼脂糖凝胶电泳检测，放入紫外凝胶成像仪中观察并保存。
将扩增后的PCR产物进行碱基序列测序，测序工作由深圳华大基因公司完成，将得到的序列在NCBI数据库中进行Blast同源比对，分析相似度并与形态学相结合，最后鉴定菌株到属或种。结果见表2。其中鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.）菌株KSCO1的16S rRNA序列为SEQ ID NO:1、草假单胞菌（Pseudomonas poae）菌株KSCO2的16S rRNA序列为SEQ IDNO:2。
表2：含ACC脱氨酶等促生效应的黄芪内生菌菌株信息汇总
种属分类 草假单胞菌 鞘氨醇杆菌
种属拉丁名 Pseudomonas poae Sphingobacterium sp.
GenBank登录号（同源性） EU111704.2 (99%) KT766060.1 (97%)
革兰氏染色及形态 阴性、短杆状 阴性、短杆状
固氮活性 阳性 阴性
接触酶 阳性 弱阳性
运动性及其氧的需求 运动性、兼性好氧 运动性、兼性好氧
耐盐度 0～7% 0～4%
耐酸碱性 pH5～pH9 pH7～pH9
形态学等特征观察与分析：参照《常见细菌***鉴定手册》进行菌株显微形态、运动性、耐盐度、耐受酸碱度及接触酶等实验。
如图2中C、D所示，在LB培养基上：草假单胞菌菌株KSC02菌落呈浅黄色，表面光滑，边缘整齐，随培养时间延长，菌落中心颜色加深，呈土黄色，LB培养基连续传代5次，产色素性能稳定；革兰氏阴性，菌体呈短杆状。
如图2中A、B所示，在LB培养基上：鞘氨醇杆菌菌株KSC01菌落呈白色，表面光滑，边缘整齐，随培养时间延长，菌落中心呈黄色；革兰氏阴性，菌体呈短杆状。
利用不含(NH4)2SO4的 DF 盐固体培养基，连续传代5次，仍能生长者，具有固氮活性。接种与培养条件与含ACC脱氨酶菌株筛选方法相同。
参照文献[12]，定性判断菌株是否具有分泌植物生长激素—吲哚乙酸的性能。具体方法为：将挑取活化后菌株单菌落，转接后含0.5mg/mL 的LB液体培养基，28℃摇床培养过夜。取50μL培养物于白瓷板上，再加入等体积的Salkowski显色剂（10ml 0.5mol/L FeCl3，500ml 35%过氯酸，使用前混合之，避光保存），充分混合后避光放置30分钟。混合物变为红色者，吲哚乙酸合成活性阳性。分析结果见表2。菌落形态及革兰氏染色显微形态观察结果见图2。
实施例3：正己醛促生菌株及其促生浓度范围的确定
以50%乙醇为溶剂，配制2、10、50、250、1250、6250 mM的E-2-己烯醛储备液，按照1‰体积的添加量，添加于LB液体培养基中。1‰的接种量，将上述菌株接种于含不同浓度E-2-己烯醛的LB培养基，28℃摇床培养至对数生长期，测定OD600。以加入相同体积无菌水和50%乙醇者，分别作为空白对照和溶剂对照。每个浓度设置三个生物学重复。
以空白对照OD600平均值为参照，计算E-2-己烯醛添加对菌株生长的影响。结果表明，E-2-己烯醛具有促进鞘氨醇杆菌菌株KSC01生长的作用，详见图3。
实施例4：正己醇促生菌株及其促生浓度范围的确定
采用实施例3类似的实验方案和相同的实验条件，考察了LB液体培养基中添加5、25、125、625、3125、6250μM 正己醇对菌株KSC01和KSC02生长的影响。结果表明，正己醇对两菌株生长均有促进作用，详见图4、图5。
黄芪药材，目前以栽培为主，田间管理普遍存在喷施农药控制病虫害、施用化学肥料促进生长等现象，不仅容易造成药材中农药残留量超标、品质下降，同时也造成土壤污染和土壤板结等，不利于黄芪种植业的持续、绿色发展。本发明所确定的GLVs组分，是不同解剖学部位的山西鲜黄芪药材中共有的GLVs组分，在黄芪促生内生菌中的应用，不存在二次污染的问题。此外，GLVs本身不仅具有促进黄芪多糖、皂苷类成分积累的作用[8]，在玉米等经济作物中的研究还发现GLVs具有介导植物防御应答，增强植物抗病性等有益作用[1]。
本发明GLVs促进生长的含ACC脱氨酶内生菌菌株，还具有固氮、耐盐碱等生物活性。植物在干旱、盐碱等胁迫条件下，会合成更多的乙烯以抑制植物的生长，含ACC脱氨酶的内生菌具有分解乙烯合成前体ACC的能力，从而降低胁迫条件下植物体内的乙烯水平，间接发挥促生效应。菌株KSC02可以在含7%的NaCl培养液中生长，也可以在pH5～9的培养液生长，耐盐碱、耐酸活性佳，菌株KSC01最高耐盐浓度为4%、耐碱最高pH为9，也具有比较好的耐盐碱性。两菌株与GLVs协同作用，有望提高栽培黄芪的抗胁迫能力，开发为绿色农药，起到提高药材品质、降低化学合成农药的双重作用。此外，耐盐碱菌株与GLVs协同喷施，还有望将黄芪种植在盐碱地，发挥修复盐碱地、扩大黄芪种植面积的双重效应。
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序列表
<110> 山西大学
<120> 黄芪促生内生菌及其促生长方法与应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 957
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agtcgagcgg tagagagaag cttgcttctc ttgagagcgg cggacgggtg agtaatgcct 60
aggaatctgc ctggtagtgg gggataacgt tcggaaacgg acgctaatac cgcatacgtc 120
ctacgggaga aagcagggga ccttcgggcc ttgcgctatc agatgagcct aggtcggatt 180
agctagttgg tggggtaatg gctcaccaag gcgacgatcc gtaactggtc tgagaggatg 240
atcagtcaca ctggaactga gacacggtcc agactcctac gggaggcagc agtggggaat 300
attggacaat gggcgaaagc ctgatccagc catgccgcgt gtgtgaagaa ggtcttcgga 360
ttgtaaagca ctttaagttg ggaggaaggg cagttaccta atacgtaatt gttttgacgt 420
taccgacaga ataagcaccg gctaactctg tgccagcagc cgcggtaata cagagggtgc 480
aagcgttaat cggaattact gggcgtaaag cgcgcgtagg tggtttgtta agttggatgt 540
gaaatccccg ggctcaacct gggaactgca ttcaaaactg actgactaga gtatggtaga 600
gggtggtgga atttcctgtg tagcggtgaa atgcgtagat ataggaagga acaccagtgg 660
cgaaggcgac cacctggact aatactgaca ctgaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag 720
gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgtcaa ctagccgttg gaagccttga 780
gcttttagtg gcgcagctaa cgcattaagt tgaccgcctg gggagtacgg ccgcaaggtt 840
aaaactcaaa tgaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa 900
gcaacgcgaa gaaccttacc aggccttgac atccaatgaa ctttctagag atagatt 957
<210> 2
<211> 844
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaggtagctt gctatcaatg gtgagagtgg cgcacgggtg cgtaacgcgt gagcaaccta 60
cctctatcag ggggatagcc tctcgaaaga gagattaaga ccgcataata taatctaccg 120
gcatcgggag attattaaat atttatagga tagagatggg ctcgcgtgac attagctagt 180
tggtagggta acggcttacc aaggcgacga tgtctagggg ctctgagagg agaatccccc 240
acactggtac tgagacacgg accagactcc tacgggaggc agcagtaagg aatattggtc 300
aatgggcgga agcctgaacc agccatgccg cgtgcaggat gactgcccta tgggttgtaa 360
actgcttttg tccaggaata aacctagata cgagtatcta gctgaatgta ctggaagaat 420
aaggatcggc taactccgtg ccagcagccg cggtaatacg gaggatccga gcgttatccg 480
gatttattgg gtttaaaggg tgcgtaggcg gcctattaag tcaggggtga aatacggtgg 540
ctcaaccatc gcagtgcctt tgatactgat gggcttgaat ccatttgaag tgggcggaat 600
aagacaagta gcggtgaaat gcatagatat gtcttagaac tccgattgcg aaggcagctc 660
actaagctgg tattgacgct gatgcacgaa agcgtgggga tcgaacagga ttagataccc 720
tggtagtcca cgccctaaac gatgataact cgatgttggc gatagacagc cagcgtctta 780
gcgaaagcgt taagttatcc acctggggag tacgcccgca agggtgaaac tcaaaggaat 840
tgac 844

Claims (5)

1.黄芪促生内生菌，其特征在于：所述促生内生菌为含1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶即ACC脱氨酶的内生菌菌株：鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.）菌株KSCO1和草假单胞菌（Pseudomonas poae）菌株KSCO2；两菌株于2017年11月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号分别为：CGMCC No.14945、CGMCC No.14946，菌种来源于黄芪鲜药材。
2.根据权利要求1所述的黄芪促生内生菌，其特征在于：所述黄芪促生内生菌的分离方法为：以5年生黄芪鲜根为材料，采用组织块分离培养法从黄芪鲜根中分离黄芪内生菌，在加入ACC的DF盐固体培养基上，连续培养5次，均可以生长的菌株即为含ACC脱氨酶活性的菌株；用不含(NH4)2SO4的 DF 盐固体培养基连续传代5次，仍能生长的菌株，具有固氮活性；牛肉膏蛋白胨液体培养基中添加色氨酸的过夜培养物，与Salkowski反应液定性判断菌株分泌植物生长激素—吲哚乙酸；LB固体培养基连续传代培养5次，确定菌株产色素稳定性；参照《常见细菌***鉴定手册》进行菌株形态学、运动性、耐盐度、耐受酸碱度及接触酶实验；16SrRNA结合形态学特征进行菌株鉴定，并保存菌种；其中分离纯化所得的内生菌分别为鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp）菌株KSCO1和草假单胞菌（Pseudomonas poae）菌株KSCO2。
3.一种促进权利要求1或2所述的黄芪促生内生菌生长的方法，其特征在于：具体方法为：培养基中添加浓度为2～10μM的E-2-己烯醛促进鞘氨醇杆菌菌株KSC01的生长、添加浓度为5～625μM的正己醇促进鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp）菌株KSCO1的生长、添加浓度为25～625μM的正己醇促进草假单胞菌（Pseudomonas poae）菌株KSCO2的生长。
4.权利要求1所述的黄芪促生内生菌在促进胁迫条件下黄芪生长中的应用。
5.权利要求3所述的促进黄芪促生内生菌生长的方法在增强黄芪胁迫条件生长中的应用。
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