CN107779420B - 一种两株拮抗烟草青枯病的内生贝莱斯芽胞杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种两株拮抗烟草青枯病的内生贝莱斯芽胞杆菌及其应用，通过在恩施州烟草青枯病发病区域中的健康烟株的根中分离、筛选、纯化后得到两株生防内生芽胞杆菌R‑3和R‑9，两株菌株对青枯菌有明显的拮抗作用，并且均可产生耐高温的抗青枯病菌物质。通过gyrB基因序列鉴定，并构建***发育树，结果显示R‑3、R‑9均为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)；通过盆栽灌根实验验证：芽胞杆菌R‑3和R‑9在烟草根中具有良好的定殖能力，并且能通过根部运输进入茎中；通过田间实验验证：贝莱斯芽胞杆菌R‑3和R‑9防治烟草青枯病效果良好，显著优于化学药剂春雷霉素，而且无污染。芽胞杆菌R‑3和R‑9的研究进一步丰富了生防内生菌的研究领域，对烟草青枯病的防治具有指导意义。

Description

一种两株拮抗烟草青枯病的内生贝莱斯芽胞杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物工程技术领域，特别是涉及一种两株拮抗烟草青枯病的内生贝莱斯芽胞杆菌及其应用。

背景技术

烟草青枯病又称为烟瘟，是由青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的一种土传性细菌病害，也是一种典型的维管束病害，最显著的发病症状是枯萎，一旦发病可造成烟草全株死亡，是烟草的毁灭性病害之一，严重影响烟叶的产量(冯吉等2016)。烟草青枯病在热带和亚热带区域发生尤为严重，在我国长江流域及其以南烟区普遍发生。由于气候等方面的原因，近年来烟草青枯病的危害范围逐渐由南向北蔓延，病情不断加剧，据2015年统计，因青枯病造成全国烟草的损失达14451.79万元(陈雪等2016)。

目前，烟草青枯病的防治仍无十分有效的措施，生产上主要采取农业防治、生物防治和化学防治相结合的综合防治方针，将青枯病发病高峰推迟至采收后期，从而减少损失(李勇和卓东2011)。生物防治具有经济、安全无公害、长效等特点，是防治烟草青枯病研究的热门方向。目前研究的生物防治种类主要包括微生物源和植物源的生物防治(陈程等2011)，其中利用拮抗微生物防治植物病害已成为研究的重要方向。

植物内生菌是生活史的一定阶段或者全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或者细菌(邹文欣和谭任祥2001)。植物内生菌是一种新的微生物资源，具有很大的潜在应用价值。利用植物内生菌防治植物病害是生物防治的重要方法，内生菌和病原菌具有相同的生态位，相互竞争空间和营养，使病原菌缺乏营养而死亡，从而达到抵御病害的目的(匡传富等2012)。此外，植物内生菌产生的代谢物中包含促生和抗菌的活性物质，能够促进植物生长发育，提高植物抗逆性、抗胁迫、抗病害的能力(徐玲玲等2013)。李艳嫦等从不同烟草品种的根茎叶中分离出7株拮抗内生菌，其中B8-5田间防效达66.64％(李艳嫦等2011)。彭细桥等从发病区域健康烟草中分离出32株对青枯病有拮抗作用的细菌，其中H-1、H-9和H-11有较强的拮抗作用，初步鉴定均为芽胞杆菌 (彭细桥等2007)。夏艳等从烟株及其根际土中分离纯化出3株对烟草青枯病有明显抑制作用的拮抗细菌，经鉴定3株拮抗细菌均为芽胞杆菌，都能产生铁载体以及吲哚-3-乙酸(IAA)，而且都能显著促进烟株生长并降低发病率(夏艳等 2014)。

内生菌以其独特的内生性在生物防治中越来越受重视，而且内生菌广泛存在于植物体内，其理论研究和开发价值越来越受到人们的关注，在生物防治中有着至关重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种能够产生烟草青枯病拮抗活性物质，并能在烟草根茎组织中良好的定殖的烟草内生菌，该内生菌对环境无污染，且易于工业化生产。

本发明提供一种两株拮抗烟草青枯病的内生贝莱斯芽胞杆菌及其应用，其特征在于从青枯病发病区域中健康的烟株根茎中分离出内生菌，采用平板对峙实验获得2株对青枯病具有明显拮抗作用的芽胞杆菌菌株，命名为R-3和R-9，并对 2株芽胞杆菌的发酵液进行115℃灭菌处理10min后进行平板抑菌实验，发现2 株芽胞杆菌高温处理后的发酵液对青枯雷尔氏菌有拮抗作用；经gyrB基因序列分析并构建***发育树鉴定2株芽胞杆菌均为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)；于2017年2月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉。保藏号为 CCTCC NO:M2017050和CCTCC NO:M2017051；所述的一种两株拮抗烟草青枯病的内生贝莱斯芽胞杆菌及其应用的贝莱斯芽孢杆菌R-3的gyrB基因序列为：

GTCTGTCGTAAACGCCTTGTCGACCACTCTTGACGTTACGGTTCATCG TGACGGAAAAATCCACTATCAGGCGTACGAGCGCGGTGTACCTGTGG CCGATCTTGAAGTGATCGGTGATACTGATAAGACCGGAACGATTACGCACTTCGTTCCGGATCCGGAAATTTTCAAAGAAACAACCGAATACGA CTATGACCTGCTTTCAAACCGTGTCCGGGAATTGGCCTTCCTGACAAA AGGTGTAAACATCACGATTGAAGACAAACGTGAAGGACAAGAACGG AAAAACGAGTACCACTACGAAGGCGGAATCAAAAGCTATGTTGAGT ACTTAAACCGTTCCAAAGAAGTCGTTCATGAAGAGCCGATTTATATC GAAGGCGAGAAAGACGGCATAACGGTTGAAGTTGCATTGCAATACA ACGACAGCTATACAAGCAATATTTATTCTTTCACAAATAATATCAACA CATACGAAGGCGGCACGCACGAAGCCGGATTTAAAACCGGTCTGACC CGTGTTATAAACGACTATGCAAGAAGAAAAGGGATTTTCAAAGAAAA TGATCCGAATTTAAGCGGGGATGATGTGAGGGAAGGGCTGACTGCCA TTATTTCAATTAAGCACCCTGATCCGCAATTCGAAGGGCAGACGAAA ACGAAGCTCGGCAACTCCGAAGCGAGAACGATCACTGATACGCTGTT TTCTTCTGCGCTGGAAACATTCCTTCTTGAAAATCCGGACTCAGCCCG CAAAATCGTTGAAAAAGGTTTAATGGCCGCAAGAGCGCGGATGGCA GCGAAAAAAGCGCGGGAATTGACCCGCCGCAAAAGTGCGCTTGAGA TTTCCAATCTGCCGGGCAAACTGGCGGACTGTTCTTCTAAAGATCCGA GCATTTCCGAGCTGTATATCGTAGAGGGTGACTCTGCGGGCGGATCA GCGAAACAGGGACGGGACCGTCATTTCCAAGCCATTCTGCCGCTGCG CGGTAAGATTCTGAACGTTGAGAAAGCCAGACTTGATAAGATTCTCT CAAACAATGAGGTCAGATCAATGATCACGGCCCTCGGAACAGGAATC GGAGAAG

贝莱斯芽孢杆菌R-9的GYRB基因序列为：

GCGTCTGTCGTAAACGCCTTGTCGACCACTCTTGACGTTACGGTTCAT CGTGACGGAAAAATCCACTATCAGGCGTACGAGCGCGGTGTACCTGT GGCCGATCTTGAAGTGATCGGTGATACTGATAAGACCGGAACGATTACGCACTTCGTTCCGGATCCGGAAATTTTCAAAGAAACAACCGAATAC GACTATGACCTGCTTTCAAACCGTGTCCGGGAATTGGCCTTCCTGACA AAAGGTGTAAACATCACGATTGAAGACAAACGTGAAGGACAAGAAC GGAAAAACGAGTACCACTACGAAGGCGGAATCAAAAGCTATGTTGA GTACTTAAACCGTTCCAAAGAAGTCGTTCATGAAGAGCCGATTTATA TCGAAGGCGAGAAAGACGGCATAACGGTTGAAGTTGCATTGCAATAC AACGACAGCTATACAAGCAATATTTATTCTTTCACAAATAATATCAAC ACATACGAAGGCGGCACGCACGAAGCCGGATTTAAAACCGGTCTGAC CCGTGTTATAAACGACTATGCAAGAAGAAAAGGGATTTTCAAAGAAA ATGATCCGAATTTAAGCGGGGATGATGTGAGGGAAGGGCTGACTGCC ATTATTTCAATTAAGCACCCTGATCCGCAATTCGAAGGGCAGACGAA AACGAAGCTCGGCAACTCCGAAGCGAGAACGATCACTGATACGCTGT TTTCTTCTGCGCTGGAAACATTCCTTCTTGAAAATCCGGACTCAGCCC GCAAAATCGTTGAAAAAGGTTTAATGGCCGCAAGAGCGCGGATGGC AGCGAAAAAAGCGCGGGAATTGACCCGCCGCAAAAGTGCGCTTGAG ATTTCCAATCTGCCGGGCAAACTGGCGGACTGTTCTTCTAAAGATCCG AGCATTTCCGAGCTGTATATCGTAGAGGGTGACTCTGCGGGCGGATC AGCGAAACAGGGACGGGACCGTCATTTCCAAGCCATTCTGCCGCTGC GCGGTAAGATTCTGAACGTTGAGAAAGCCAGACTTGATAAGATTCTCTCAAACAATGAGGTCAGATCAATGATCACGGCCCTCGGAACAGGAAT CGGAGAAGA

本发明一种两株拮抗烟草青枯病的内生贝莱斯芽胞杆菌及其应用的内生菌，将菌株固体发酵培养后，获得发酵液，使用菌株的发酵液浇灌烟草60天内能够在烟草植株根、茎中定殖，且定殖生物量保持在103-106cfu/g。

本发明一种两株拮抗烟草青枯病的内生贝莱斯芽胞杆菌及其应用的内生菌，能产生一种耐高温的抗青枯菌的活性物质，该活性物质在115℃处理10min后仍具有抗青枯菌的活性。

本发明一种两株拮抗烟草青枯病的内生贝莱斯芽胞杆菌及其应用的内生菌，以2株菌株的发酵液稀释10倍，浇灌于田间烟株根围土壤中，每个小区100株烟草，两个月后进行病情调查；分别以4％春雷霉素和清水浇灌烟株作为药剂对照和空白对照；每个处理设置3个小区；菌株R-3田间防治效果为55.72％，菌株R-9田间防治效果为50.71％，显著优于4％春雷霉素。

通过利福平梯度筛选获得R-3和R-9抗60μg/ml利福平菌株，并分别进行盆栽灌根定殖试验，分别在7d，14d，21d，28d，45d，60d检测烟草根和茎中R-3和R-9的浓度。在烟草根中菌株R-3以高于1×106cfu/g的生物量保持稳定，菌株R-9稍有上下变化浮动，但生物量一直保持1×104cfu/g以上；在烟草茎中菌株R-3以高于1×105cfu/g的生物量保持稳定，菌株R-9呈现下降趋势，但60d后生物量仍保持在103cfu/g以上的。

通过田间小区试验验证，菌株R-3田间防治效果高达55.72％，菌株R-9田间防治效果为50.71％，均显著优于田间防效为31.55％的4％春雷霉素，表明菌株R-3 和R-9在防治烟草青枯病上显著优于农用抗生素，是一种优势菌株。

本发明的优点：从青枯病发病区域中健康烟株根中分离出2株对烟草青枯雷尔氏菌有明显拮抗作用的内生贝莱斯芽孢杆菌，而且2株内生菌可产生耐高温的抑菌物质。两株内生菌在烟草植株中均具有良好的定殖能力，田间防治效果均显著优于农用抗生素，对环境安全无公害，具有良好的开发前景和应用潜力，对烟草青枯病的防治具有重要的意义。

附图说明

附图1是菌株R-3和R-9对青枯雷尔氏菌的拮抗作用示意图；

附图2是菌株R-3和R-9发酵液对青枯雷尔氏菌的抑菌效果示意图；

附图3是菌株R-3和R-9单菌落图；

附图4是菌株R-3和R-9芽胞染色图；

附图5是菌株R-3和R-9依据gyrB基因序列构建的***发育树；

附图6是菌株R-3和R-9在烟草根中定殖能力折线示意图；

附图7是菌株R-3和R-9在烟草茎中定殖能力折线示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。

实施例1：

拮抗内生细菌的筛选及鉴定

1、烟草内生菌的分离

从云烟87青枯病发病烟田中挑选健康烟株，分离根、茎中的内生细菌。分别称取0.5g的根、茎进行表面消毒：75％乙醇10s-30s，无菌水冲洗两次，0.1％升汞1-3min，无菌水冲洗三次(李艳嫦等2011)，然后，加入5ml无菌水研磨充分，稀释10倍涂布于LB平板，于37℃培养48h，挑取菌落形态不同的细菌分离纯化，将纯化的菌株-20℃甘油管保存。

2、拮抗内生细菌的筛选

接种青枯雷尔氏菌于LB中，37℃，180rpm，过夜培养，稀释10倍后，均匀喷洒于LB平板上。挑取37℃培养24h的内生菌单菌落点接于平板上，每个菌株重复三次，37℃培养48h，筛选出产生抑菌圈的菌株(图1)。

3、拮抗内生细菌发酵液活性检测

选取有抗菌活性的菌株，接种LB中，28℃，180rpm，培养48h。发酵液 10000rpm离心10min，取上清液115℃灭菌10min，4℃保存备用。将青枯雷尔氏菌均匀喷洒于LB平板上。平板上放置4个无菌滤纸片，每个滤纸片加10μl 发酵液，37℃培养24h后，观察有无抑菌圈产生(图2)。

4.菌落形态特征及其芽胞染色

菌株R-3和R-9菌体杆状，产芽胞，芽胞端生(图4)，在LB平板上菌落圆形扁平，中间呈星状褶皱突起，表面粗糙，白色不透明，有扩张(图3)。

5、菌株gyrB基因序列分析鉴定

gyrB基因扩增引物和反应条件参考SATOSHI等方法(Yamamoto S和 Harayama S1995)。将gyrB基因扩增产物纯化后测序，通过NCBI数据库进行 BLAST比对，采用MEGA5.2软件构建拮抗菌的***发育树。经鉴定菌株R-3 和R-9菌均为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillusvelezensis)(图5)。

实施例2：

内生拮抗细菌在烟草植株中定殖试验

1、抗利福平的拮抗细菌的筛选

在LB固体培养基中加入2μg/ml利福平，取100μl菌液涂布，37℃培养 2-4d，待菌落生长后，挑选单菌落转移至5μg/ml的利福平抗性平板上，经培养后筛选抗性菌落。逐步提高利福平的浓度分别至10、20、40、60μg/ml，最后获得抗60μg/ml利福平菌株。将抗性菌株在添加60μg/ml利福平的LB平板上连续传代3-5次，稳定抗性菌株的抗性。检测利福平抗性菌株对青枯雷尔氏菌的拮抗能力，选择抗菌活性与出发菌株相似的抗性菌株用于定殖研究。

2、拮抗细菌在烟草体内的定殖试验

按1％接种抗利福平的拮抗菌株于LB中，37℃，180rpm发酵48h。烟草移栽7天后每棵苗灌溉50ml发酵液，每个菌处理18棵烟株，每6棵烟株为一组，三组平行试验，以灌溉50ml水的烟株作为对照组。分别在7d，14d，21d，28 d，45d，60d后，检测烟草根和茎中拮抗细菌的浓度：清洗烟草根表面的根际土，晾干表面水分，称取0.5g根和茎，对根和茎进行表面消毒，方法同上。加入5ml无菌水研磨充分，研磨液稀释10倍、100倍，取100μl涂布于60μg/ml 利福平LB平板，37℃培养48h，记录菌落数，重复三次，计算每克根、茎中拮抗细菌的含量：每g根(茎)中拮抗细菌含量＝平板菌落数×稀释倍数×(无菌水质量+根(茎)质量)×10/根(茎)质量(备注：1ml无菌水质量为1g)。结果如图6、图7。菌株R-3在烟草根茎中定殖能力较好，在浇灌处理60天根中含菌量维持在106cfu/g以上，茎中含菌量维持在105cfu/g以上；菌株R-9在浇灌60天后，在烟草根中含菌量维持在105cfu/g，在茎中含菌量下降到103cfu/g。

实施例3：

2016年在宣恩县椒园镇凉风村开展田间试验。菌株R-3和R-9按1％接种于 2.5L发酵培养基中，37℃，180rpm发酵48h，稀释10倍，取200ml浇灌于田间烟株根围土壤中。每个小区100株烟草，两个月后进行病情调查。分别以4％春雷霉素和清水浇灌烟株作为药剂对照和空白对照。每个处理设置3个小区。

在浇灌处理2个月后，调查各处理青枯病的发病情况，并计算发病率、病情指数、防治效果。结果见表1，R-3，R-9的防治效果分别为55.72％、50.71％，显著高于春雷霉素的防效。

表1 2016年内生拮抗细菌对烟草青枯病的田间防效

注：不同字母之间有显著性差异(p<0.05)。

青枯病的病情指数按照中华人民共和国烟草行业标准烟草病害分级及调查方法调查，发病率、病情指数和防治效果按下式计算。

烟草青枯病病情分级标准(以株为单位)：

0级：全株无病；

1级：茎部偶有褪绿斑，或病侧二分之一以下叶片凋萎；

3级：茎部有黑色条斑，但不超过二分之一，或病侧二分之一至三分之二叶片凋萎；

5级：茎部黑色条斑超过二分之一，但未到达茎顶部，或病侧三分之二以上叶片凋萎；

7级：茎部黑色条斑到达茎顶部，或病株叶片全部凋萎：

9级：病株基本枯死。

发病率＝发病植株/调查植株总数×100％

病情指数＝Σ[(病情级数×此级株数)/(最高级数×总株数)]×100

防治效果(％)＝(对照组病情指数－处理组病情指数)/对照组病情指数×100。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北省烟草公司恩施州公司

<120> 一种两株拮抗烟草青枯病的内生贝莱斯芽胞杆菌及其应用

<130> 2017

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1088

<212> DNA

<213> 芽胞杆菌菌株

<400> 1

gtctgtcgta aacgccttgt cgaccactct tgacgttacg gttcatcgtg acggaaaaat 60

ccactatcag gcgtacgagc gcggtgtacc tgtggccgat cttgaagtga tcggtgatac 120

tgataagacc ggaacgatta cgcacttcgt tccggatccg gaaattttca aagaaacaac 180

cgaatacgac tatgacctgc tttcaaaccg tgtccgggaa ttggccttcc tgacaaaagg 240

tgtaaacatc acgattgaag acaaacgtga aggacaagaa cggaaaaacg agtaccacta 300

cgaaggcgga atcaaaagct atgttgagta cttaaaccgt tccaaagaag tcgttcatga 360

agagccgatt tatatcgaag gcgagaaaga cggcataacg gttgaagttg cattgcaata 420

caacgacagc tatacaagca atatttattc tttcacaaat aatatcaaca catacgaagg 480

cggcacgcac gaagccggat ttaaaaccgg tctgacccgt gttataaacg actatgcaag 540

aagaaaaggg attttcaaag aaaatgatcc gaatttaagc ggggatgatg tgagggaagg 600

gctgactgcc attatttcaa ttaagcaccc tgatccgcaa ttcgaagggc agacgaaaac 660

gaagctcggc aactccgaag cgagaacgat cactgatacg ctgttttctt ctgcgctgga 720

aacattcctt cttgaaaatc cggactcagc ccgcaaaatc gttgaaaaag gtttaatggc 780

cgcaagagcg cggatggcag cgaaaaaagc gcgggaattg acccgccgca aaagtgcgct 840

tgagatttcc aatctgccgg gcaaactggc ggactgttct tctaaagatc cgagcatttc 900

cgagctgtat atcgtagagg gtgactctgc gggcggatca gcgaaacagg gacgggaccg 960

tcatttccaa gccattctgc cgctgcgcgg taagattctg aacgttgaga aagccagact 1020

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cggagaag 1088

<210> 2

<211> 1091

<212> DNA

<213> 芽胞杆菌菌株

<400> 2

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cttgataaga ttctctcaaa caatgaggtc agatcaatga tcacggccct cggaacagga 1080

atcggagaag a 1091

Claims (4)

1.贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)R-3和R-9，于2017年2月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌株R-3的保藏号为CCTCC NO:M2017050,菌株R-9的保藏号为CCTCCNO:M2017051。

2.权利要求1所述贝莱斯芽胞杆菌R-3或R-9在拮抗烟草青枯病的应用，将菌株R-3或R-9发酵培养获得发酵液，使用菌株R-3或R-9发酵液浇灌烟草60天内能够在烟草植株根、茎中定殖，且定殖生物量保持在10³-10⁶cfu/g。

3.根据权利要求2所述的应用，菌株R-3或R-9能产生一种耐高温的抗青枯菌的活性物质，该活性物质在115℃处理10min后仍具有抗青枯菌的活性。

4.根据权利要求2所述的应用，将菌株R-3或R-9发酵液稀释10倍，浇灌于田间烟株根围土壤中，每个小区100株烟草，两个月后进行病情调查；分别以4％春雷霉素和清水浇灌烟株作为药剂对照和空白对照；每个处理设置3个小区；菌株R-3田间防治效果为55.72％，菌株R-9田间防治效果为50.71％，优于4％春雷霉素。

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