CN109096393A

CN109096393A - 猫瘟热治疗性抗体的制备方法

Info

Publication number: CN109096393A
Application number: CN201811016401.0A
Authority: CN
Inventors: 吴健敏; 刘金凤; 张振江; 覃绍敏; 白安斌; 唐海波; 陈凤莲; 马玲; 秦树英; 林俊; 杨磊
Original assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Current assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Priority date: 2018-08-31
Filing date: 2018-08-31
Publication date: 2018-12-28

Abstract

本发明公开了一种猫瘟热治疗性抗体，以FPV灭活苗和FPV亚单位疫苗为免疫原，通过免疫马匹制得。据此建立了相应制备方法，该法创造性的以两种不同类型FPV免疫原按一定程序接种健康马匹，以FPV灭活苗为基础免疫原，以FPV亚单位疫苗为加强免疫原，产生高效价抗体后收集高免血，经IgG提纯、切除Fc’片段后制备获得高活性免疫球蛋白F(ab’)2。应用该法可大量制备马源抗FPV高免血清，提取和纯化高效价F(ab’)2抗体。试验表明，本发明制备猫瘟热治疗性抗体不仅具有较高的效价，同时具有确切的猫瘟热预防和治疗效果，可用于紧急预防和治疗猫瘟热，具有重要的现实意义和广阔的应用前景。

Description

猫瘟热治疗性抗体的制备方法

技术领域

本发明属于猫瘟热治疗技术领域，尤其涉及一种猫瘟热治疗性抗体的制备方法。

背景技术

猫瘟热又名猫泛白细胞减少症、猫传染性肠炎等，是由猫细小病毒(FPV)引起的以猫科动物发生高热、呕吐、白细胞急剧减少和肠炎为主要特征的致死性传染性传染病。FPV在自然条件下可直接或间接感染猫科、浣熊科和鼬科等多种动物，是目前肉食兽细小病毒中感染范围最广、致病性最强的一种病毒，其中以小体型猫科动物和水貂最易感，FPV常呈地方性流行，感染FPV猫的病死率一般为60％～70％，最高可达90％以上，危害极为严重。

FPV是一种依赖宿主细胞进行复制的细小病毒，VP1和VP2为其结构蛋白，共同构成FPV病毒粒子的主要病毒衣壳蛋白。但在两种结构蛋白中，VP1只占10％，而VP2占到90％，因此VP2是形成FPV衣壳蛋白的主要成分。研究表明，VP2蛋白不仅具有血凝活性，同时也是FPV诱导机体产生中和抗体的主要保护性抗原，并且VP2蛋白能在哺乳动物细胞和杆状病毒表达***中有效表达，自行组装形成病毒样粒子，而以FPV病毒样粒子制备FPV亚单位疫苗具有良好的免疫原性。

猫瘟热是猫科动物疾病预防的重点，目前，国内外均采用定期进行免疫注射的方法进行预防。然而，对于发病的动物，除注射单克隆抗体及高度免疫血清外，尚无有效可靠的药物治疗方法。虽然抗病毒高免血清是一种比较安全的免疫制剂，但因猫血液含量有限，猫源抗FPV高免血清制备成本高，且直接使用同源高免血清会因其纯度不高易造成动物产生不良反应，同时还可能会因血清中含有其它病原而导致某些传染病的扩散传播，因此，开发高纯度异源抗FPV抗体成了治疗猫瘟热的最佳选择。目前，国内对异源猫瘟热治疗抗体相关研究较少。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种猫瘟热治疗性抗体的制备方法，以缓解猫瘟热治疗抗体缺乏且防治效果不佳的现状。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

猫瘟热治疗性抗体，以FPV灭活苗和FPV亚单位疫苗为免疫原，通过免疫马匹制得。

上述猫瘟热治疗性抗体，以FPV灭活苗为基础免疫原，以FPV亚单位疫苗为加强免疫原，通过先后免疫马匹制得。

FPV灭活苗以FPV-GX01毒株(FPV临床分离株GX01)为基础制备；FPV亚单位疫苗以N-端连接信号肽HBM并经昆虫细胞密码子偏好优化的FPV-VP2基因在杆状病毒/昆虫细胞表达***中形成的FPV病毒样粒子为基础制备。

上述猫瘟热治疗性抗体的制备方法，包括以下步骤：

(1)分别利用FPV灭活苗和FPV亚单位疫苗对马匹进行免疫；

(2)当马匹血清中FPV血凝抑制效价≥1：32时，采集高免血；

(3)取高免血分离血清，用正辛酸-硫酸铵沉淀优化法提取IgG，制备获得免疫球蛋白F(ab’)2。

FPV灭活苗是利用FPV-GX01毒株与白油佐剂(按体积比1∶2(V/V)充分乳化制得。

FPV亚单位疫苗是以FPV-VLPs制备的；FPV-VLPs是由经昆虫细胞密码子偏好优化并融合信号肽HBM的FPV VP2基因所编码，在杆状病毒/昆虫细胞表达***中表达形成。

FPV亚单位疫苗按以下操作制备：

(1)按昆虫细胞密码子偏好将FPV VP2基因进行密码子优化，并在其N端引入HBM信号肽序列，获得密码子优化型FPV VP2基因；

(2)通过定向克隆将优化的FPV VP2基因连接于转移载体pFastBacI中，构建重组杆状病毒转移载体pFast-VP2；

(3)将步骤(2)转移载体转化DH10Bac感受态细胞，制备含优化型FPV VP2基因的重组杆状病毒DNA；

(4)将重组杆状病毒DNA转染昆虫sf9细胞，制备表达VP2蛋白的重组杆状病毒；

(5)将重组杆状病毒感染昆虫sf9细胞，表达VP2蛋白，获得FPV-VLPs(FPV病毒样粒子)；

(6)收集含FPV-VLPs细胞培养液上清，初步纯化浓缩后与ISA206佐剂按照体积比1∶1(V/V)充分乳化制备FPV亚单位疫苗。

优化型FPV VP2基因具有序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列，VP2蛋白具有序列表SEQ.ID.No.2的氨基酸序列。

步骤(1)按以下操作进行：免疫注射程序分基础免疫和加强免疫两个阶段；每匹马颈部多点肌肉注射5mL FPV灭活苗进行第一次基础免疫，间隔14d后同样方式注射5mLFPV灭活苗进行第二次基础免疫；基础免疫结束后21d，每匹马肌肉注射6mL FPV亚单位疫苗进行第一次加强免疫，以后每间隔4d再进行下一次加强免疫，总共进行4次加强免疫，每次FPVVLPs疫苗免疫剂量增加1.5mL；若FPV血凝抑制效价低于1：32时，进行第5次加强免疫。

步骤(3)按以下操作进行：

(1)分离高免血清，用pH值为4.5，0.06M的醋酸盐缓冲液对血清进行2-5倍稀释，调溶液pH值至4.0-4.5，并以每毫升稀释液加25μL正辛酸的比例，在磁力搅拌条件下缓慢加入正辛酸，室温搅拌30min后，4℃、10000rpm离心20-30min，收集上清；

(2)取上清液，加入等体积PBS，调pH至7.2-7.5，在磁力搅拌条件下按照每毫升溶液加入0.227g硫酸铵的比例缓慢加入硫酸铵粉末，室温搅拌30min后，4℃过夜，4℃、5000rpm离心15-30min，收集沉淀；

(3)用PBS溶解沉淀恢复到原血清体积，缓慢加入饱和硫酸铵溶液使溶液中硫酸铵饱和度为33.3％，室温静置30-60min，5000rpm离心15-30min，收集沉淀，PBS溶解沉淀，透析过夜，离心去除沉淀即为精制IgG；

(4)测定IgG含量，调IgG溶液pH至3.2-3.5，按每毫克IgG加入10-20μg胃蛋白酶的比例加入胃蛋白酶，30-37℃消化1-3h，收集酶切溶液进行Protein A+G柱纯化，收集流出液，过滤除菌，即为免疫球蛋白F(ab′)2。

针对目前异源猫瘟热治疗抗体缺乏的现状，发明人设计并制备了一种猫瘟热治疗性抗体，以FPV灭活苗和FPV亚单位疫苗为免疫原，通过免疫马匹制得。据此建立了相应制备方法，该法创造性的以两种不同类型FPV免疫原按一定程序接种健康马匹，以FPV灭活苗为基础免疫原，以FPV亚单位疫苗为加强免疫原，产生高效价抗体后收集高免血，经IgG提纯、切除Fc’片段后制备获得高活性免疫球蛋白F(ab’)2——马抗猫细小病毒(FPV)特异免疫球蛋白F(ab’)2。其中，FPV灭活苗以FPV-GX01毒株(FPV临床分离株GX01)为基础制备；FPV亚单位疫苗以N-端连接信号肽HBM并经昆虫细胞密码子偏好优化的FPV-VP2基因在杆状病毒/昆虫细胞表达***中形成的FPV病毒样粒子为基础制备。应用该法可大量制备马源抗FPV高免血清，提取和纯化高效价F(ab’)2抗体。试验表明，本发明制备猫瘟热治疗性抗体不仅具有较高的效价，同时具有确切的猫瘟热预防和治疗效果，可用于紧急预防和治疗猫瘟热，具有重要的现实意义和广阔的应用前景。

具体实施方式

一、FPV灭活疫苗的制备

将FPV-GX01毒株按1/10的体积同步接种到猫肾传代细胞FK81细胞中，37℃CO₂培养箱中静置24h后弃掉生长液并换成维持液继续培养，逐日观察细胞病变，待75％细胞出现病变时，收集细胞，反复冻融3次，然后4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片，收集上清液，测定其TCID₅₀/0.1mL值≥5.0，血凝效价≥1∶2¹⁰后，加入胸腺肽至终浓度为0.3mg/mL后，加入甲醛至终浓度为0.1％，37℃灭活24h，每隔4h振荡1次，随后加入4％吐温-80作为水相；Span80与10号白油按3∶47的体积比(V/V)混合作为油相，水相与油相按体积比1∶2混合进行油包水搅拌乳化，制得FPV油乳剂灭活苗。

二、FPV亚单位疫苗的制备

FPV VP2基因经昆虫细胞密码子偏好优化，在其N端引入HBM信号肽序列后进行人工合成，获得密码子优化型FPV VP2基因(SEQ.ID.No.1)；将其定向克隆到杆状病毒转移载体pFastBacI上，构建重组质粒pFastBac-VP2。重组质粒转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，进行100倍稀释后，涂布于含四环素(10μg/mL)、卡那霉素(50μg/mL)、庆大霉素(7μg/mL)、β-半乳糖苷(100μg/mL)和IPTG(40μg/mL)的SOB平板中，培养72小时后，挑取白色菌落重新接种于新的SOB平板中，37℃培养过夜，挑取白色单克隆接种于含(50μg/mL)卡那霉素，(7μg/mL)庆大霉素，(10μg/mL)四环素的LB培养液中，37℃培养8-12h后提取重组杆粒Bac-VP2，并用M13引物进行鉴定，获得含目的基因的重组杆粒。用3000将鉴定正确的重组杆粒转染Sf9细胞27℃培养4-5天后收取重组杆状病毒。重组杆状病毒按10％接种量感染Sf9细胞，待细胞出现病变后以80％预冷丙酮固定，以FITC荧光标记的羊抗鼠IgG为一抗对重组杆状病毒表达产物进行IFA鉴定；同时收集重组杆状病毒培养物进行电镜观察；经IFA及电镜观察确定VP2蛋白(SEQ.ID.No.2)表达并形成病毒样粒子后，大量培养收集细胞及其培养物上清，-20～20℃反复冻融3次，4℃，1200rpm离心15min，收集上清液，用饱和(NH₄)₂SO₄沉淀蛋白，Triton X-100和磷酸三丁酯(TBP)灭活杆状病毒，透析袋初步纯化蛋白，测定并调整其血凝效价为1∶2⁹，最后按照抗原/佐剂体积比例1∶1加入ISA 206佐剂完全乳化，制备成为重组FPV亚单位疫苗。

三、F(ab’)2的制备

(1)免疫注射程序分基础免疫和加强免疫两个阶段。

每匹马颈部多点肌肉注射5mL FPV灭活苗进行第一次基础免疫，间隔14d后同样方式注射5mL FPV灭活苗进行第二次基础免疫；基础免疫结束后21d，每匹马肌肉注射6mLFPV亚单位疫苗进行第一次加强免疫，以后每间隔4d再进行下一次加强免疫，总共进行4次加强免疫，每次FPV VLPs疫苗免疫剂量增加1.5mL；若FPV血凝抑制效价低于1∶32时，进行第5次加强免疫。

(2)当马匹血清中FPV血凝抑制效价≥1∶32时，采马匹高免血，室温放置1-2h后，4℃、10000rpm离心5min，分离血清，用pH值为4.0，0.06M的醋酸盐缓冲液对血清进行4倍稀释，调溶液pH值至4.5，并以每毫升稀释液加25μL正辛酸的比例，在磁力搅拌条件下缓慢加入正辛酸，室温搅拌30min后，4℃、10000rpm离心30min，收集上清；

(3)取上清液，加入等体积PBS，调pH至7.5，在磁力搅拌条件下按照每毫升溶液加入0.227g硫酸铵的比例缓慢加入硫酸铵粉末，室温搅拌30min后，4℃过夜，4℃、5000rpm离心20min，收集沉淀；

(4)用PBS溶解沉淀恢复到原血清体积，缓慢加入饱和硫酸铵溶液使溶液中硫酸铵饱和度为33.3％，室温静置40min，5000rpm离心20min，收集沉淀；

(5)PBS溶解沉淀，装入透析袋，置于PBS中透析48h，其间更换3次PBS，5000rpm离心20min去除沉淀获得精制IgG；

(6)测定IgG含量，调IgG溶液pH至3.5，按每毫克IgG加入20μg胃蛋白的比例加入胃蛋白酶，37℃消化2h，收集酶切溶液进行Protein A+G柱纯化，收集流出液，过滤除菌，即为免疫球蛋白F(ab′)2。

四、F(ab’)2抗体效价测定

调整F(ab’)2浓度为10mg/mL，进行血凝抑制试验，所制备的F(ab’)2能有效抑制FPV病毒液，血凝抑制效价高达1∶256。

五、F(ab’)2抗体临床治疗效果试验

取4月龄感染FPV病猫12只，随机分3组，每组4只，第1组使用本发明制备的F(ab’)2抗体，第2组使用市售猫瘟热单克隆抗体注射液，第3组使用生理盐水。其中第1组每只病猫每次肌肉注射F(ab’)2抗体4mL，连续注射3天；第2组注射市售单克隆抗体2mL，连续注射3天；第3组同样方法注射4mL生理盐水；此外每组猫在注射抗体治疗的同时给予消炎、止吐、止血等辅助治疗。观察记录治疗情况。

结果显示(表1)，在治疗前，病猫普遍精神沉郁、嗜睡、呕吐、腹泻等，经过治疗后，猫的精神状况得到明显改善，临床症状明显减轻，治疗7天后，75％的猫临床症状消失，而注射生理盐水的病猫，发病后7天均死亡。结果表明，所制备的F(ab’)2抗体与单克隆抗体治疗猫瘟热的作用相似，具有良好的瘟热治疗效果。

表1 F(ab’)2临床治疗效果

六、F(ab’)2抗体临床预防效果试验

取健康4月龄猫12只，同时按上述分组方式进行分组开展预防试验，用相同方式对试验组和对照组分别肌肉注射3mLF(ab’)2抗体、2mL单克隆抗体和3mL生理盐水，连续注射3天。第5天，所有试验猫皮下注射lmL FPV细胞培养液进行人工攻毒，观察其发病情况。以粪便检出FPV，体温升高、腹泻和呕吐为发病判断标准。

结果显示，生理盐水注射组4只猫均发病，发病率为100％，F(ab’)2抗体和单克隆抗体注射组的发病率均为50％，显著低于生理盐水对照组。结果表明，与单克隆抗体显示，所制备的F(ab’)2抗体具有良好的预防猫瘟热的作用。

表2 F(ab’)2临床预防效果

序列表

<110> 广西壮族自治区兽医研究所

<120> 猫瘟热治疗性抗体的制备方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1857

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaagttct tggtgaacgt ggctttggtg ttcatggtgg tgtacatcag ctacatctac 60

gccggtctcg agatcgatat gtccgacggt gctgtgcagc cggacggagg acagcccgct 120

gtccgtaacg agcgtgctac tggttcgggt aatggctccg gtggtggtgg tggaggtggt 180

agcggtggtg tgggaatcag tactggtact tttaataacc agactgagtt taagttcctg 240

gagaacggat gggtggagat tactgctaac tcctccaggc tggtgcattt gaatatgcca 300

gagtctgaga attacaagcg cgtggtggtg aacaacatgg acaagaccgc cgttaaaggt 360

aacatggctt tggacgacac ccacgtgcag atcgtgaccc cttggtccct ggtggacgct 420

aacgcttggg gcgtgtggtt caatcctggc gactggcagc tgatcgtgaa cacgatgagc 480

gagctgcact tggtatcctt tgagcaggag attttcaacg tggtgctcaa aaccgtgtca 540

gagtctgcga cccagcctcc caccaaggtg tacaacaacg acctgacggc ctccctgatg 600

gtggccctgg actccaacaa tacaatgcct ttcacccctg ctgctatgcg ctccgagaca 660

ctcggtttct atccctggaa gcctaccatc cccacccctt ggcgctacta cttccagtgg 720

gatcgcaccc tgatcccttc ccacaccggc acctccggca ctcccaccaa cgtgtaccac 780

ggcaccgacc ccgatgacgt ccaattctac accatcgaga attccgtccc cgtccacctt 840

ctgcgcactg gtgacgagtt cgcaaccggc accttcttct tcgactgcaa gccttgccgc 900

ctgacccaca cctggcaaac caaccgcgcc ctgggtctgc ctcctttcct taactccctc 960

cctcagtccg agggtgctac caactttggc gacatcggtg tgcagcagga caagagacgc 1020

ggcgtcaccc agatgggcaa caccgattac atcaccgagg ctaccatcat gcgccctgct 1080

gaggttggat actccgcccc ttactattcc ttcgaggctt ccacccaggg ccctttcaaa 1140

acccccatcg ctgctggtcg cggtggcgct caaaccgacg agaaccaggc tgctgacggt 1200

gatcctcgct acgctttcgg ccgccagcac ggacaaaaaa ccactaccac tggtgagacc 1260

cctgagcgct tcacctacat cgctcaccag gacactggtc gctaccctga gggtgactgg 1320

attcaaaaca tcaacttcaa cctgcctgtg accaacgaca acgtgctgct gcctactgac 1380

cctatcggtg gtaagactgg tatcaactac accaacatct tcaacaccta cggtcctctg 1440

accgctctga acaacgtgcc tcctgtgtac cctaacggtc agatctggga caaggagttc 1500

gacaccgacc tgaagcctcg cctgcacgtg aacgctcctt tcgtgtgcca gaacaactgc 1560

cctggtcagc tgttcgtgaa ggtggctcct aacctgacca acgagtacga ccctgacgct 1620

tccgctaaca tgtcccgcat cgtgacctac tccgacttct ggtggaaggg taagctggtg 1680

ttcaaggcta agctgcgcgc ttcccacacc tggaacccta tccagcagat gtccatcaac 1740

gtggacaacc agttcaacta cgtgcctaac aacatcggtg ctatgaagat cgtgtacgag 1800

aagtcccagc tggctcctcg caagctgtac accggtcacc accaccacca ccactaa 1857

<210> 2

<211> 618

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile

1 5 10 15

Ser Tyr Ile Tyr Ala Gly Leu Glu Ile Asp Met Ser Asp Gly Ala Val

20 25 30

Gln Pro Asp Gly Gly Gln Pro Ala Val Arg Asn Glu Arg Ala Thr Gly

35 40 45

Ser Gly Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Val

50 55 60

Gly Ile Ser Thr Gly Thr Phe Asn Asn Gln Thr Glu Phe Lys Phe Leu

65 70 75 80

Glu Asn Gly Trp Val Glu Ile Thr Ala Asn Ser Ser Arg Leu Val His

85 90 95

Leu Asn Met Pro Glu Ser Glu Asn Tyr Lys Arg Val Val Val Asn Asn

100 105 110

Met Asp Lys Thr Ala Val Lys Gly Asn Met Ala Leu Asp Asp Thr His

115 120 125

Val Gln Ile Val Thr Pro Trp Ser Leu Val Asp Ala Asn Ala Trp Gly

130 135 140

Val Trp Phe Asn Pro Gly Asp Trp Gln Leu Ile Val Asn Thr Met Ser

145 150 155 160

Glu Leu His Leu Val Ser Phe Glu Gln Glu Ile Phe Asn Val Val Leu

165 170 175

Lys Thr Val Ser Glu Ser Ala Thr Gln Pro Pro Thr Lys Val Tyr Asn

180 185 190

Asn Asp Leu Thr Ala Ser Leu Met Val Ala Leu Asp Ser Asn Asn Thr

195 200 205

Met Pro Phe Thr Pro Ala Ala Met Arg Ser Glu Thr Leu Gly Phe Tyr

210 215 220

Pro Trp Lys Pro Thr Ile Pro Thr Pro Trp Arg Tyr Tyr Phe Gln Trp

225 230 235 240

Asp Arg Thr Leu Ile Pro Ser His Thr Gly Thr Ser Gly Thr Pro Thr

245 250 255

Asn Val Tyr His Gly Thr Asp Pro Asp Asp Val Gln Phe Tyr Thr Ile

260 265 270

Glu Asn Ser Val Pro Val His Leu Leu Arg Thr Gly Asp Glu Phe Ala

275 280 285

Thr Gly Thr Phe Phe Phe Asp Cys Lys Pro Cys Arg Leu Thr His Thr

290 295 300

Trp Gln Thr Asn Arg Ala Leu Gly Leu Pro Pro Phe Leu Asn Ser Leu

305 310 315 320

Pro Gln Ser Glu Gly Ala Thr Asn Phe Gly Asp Ile Gly Val Gln Gln

325 330 335

Asp Lys Arg Arg Gly Val Thr Gln Met Gly Asn Thr Asp Tyr Ile Thr

340 345 350

Glu Ala Thr Ile Met Arg Pro Ala Glu Val Gly Tyr Ser Ala Pro Tyr

355 360 365

Tyr Ser Phe Glu Ala Ser Thr Gln Gly Pro Phe Lys Thr Pro Ile Ala

370 375 380

Ala Gly Arg Gly Gly Ala Gln Thr Asp Glu Asn Gln Ala Ala Asp Gly

385 390 395 400

Asp Pro Arg Tyr Ala Phe Gly Arg Gln His Gly Gln Lys Thr Thr Thr

405 410 415

Thr Gly Glu Thr Pro Glu Arg Phe Thr Tyr Ile Ala His Gln Asp Thr

420 425 430

Gly Arg Tyr Pro Glu Gly Asp Trp Ile Gln Asn Ile Asn Phe Asn Leu

435 440 445

Pro Val Thr Asn Asp Asn Val Leu Leu Pro Thr Asp Pro Ile Gly Gly

450 455 460

Lys Thr Gly Ile Asn Tyr Thr Asn Ile Phe Asn Thr Tyr Gly Pro Leu

465 470 475 480

Thr Ala Leu Asn Asn Val Pro Pro Val Tyr Pro Asn Gly Gln Ile Trp

485 490 495

Asp Lys Glu Phe Asp Thr Asp Leu Lys Pro Arg Leu His Val Asn Ala

500 505 510

Pro Phe Val Cys Gln Asn Asn Cys Pro Gly Gln Leu Phe Val Lys Val

515 520 525

Ala Pro Asn Leu Thr Asn Glu Tyr Asp Pro Asp Ala Ser Ala Asn Met

530 535 540

Ser Arg Ile Val Thr Tyr Ser Asp Phe Trp Trp Lys Gly Lys Leu Val

545 550 555 560

Phe Lys Ala Lys Leu Arg Ala Ser His Thr Trp Asn Pro Ile Gln Gln

565 570 575

Met Ser Ile Asn Val Asp Asn Gln Phe Asn Tyr Val Pro Asn Asn Ile

580 585 590

Gly Ala Met Lys Ile Val Tyr Glu Lys Ser Gln Leu Ala Pro Arg Lys

595 600 605

Leu Tyr Thr Gly His His His His His His

610 615

Claims

1.一种猫瘟热治疗性抗体，其特征在于以FPV灭活苗和FPV亚单位疫苗为免疫原，通过免疫马匹制得。

2.根据权利要求1所述的猫瘟热治疗性抗体，其特征在于以FPV灭活苗为基础免疫原，以FPV亚单位疫苗为加强免疫原，通过先后免疫马匹制得。

3.根据权利要求2所述的猫瘟热治疗性抗体，其特征在于：所述FPV灭活苗以FPV-GX01毒株为基础制备；所述FPV亚单位疫苗以N-端连接信号肽HBM并经昆虫细胞密码子偏好优化的FPV-VP2基因在杆状病毒/昆虫细胞表达***中形成的FPV病毒样粒子为基础制备。

4.权利要求3所述猫瘟热治疗性抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)分别利用FPV灭活苗和FPV亚单位疫苗对马匹进行免疫；

(2)当马匹血清中FPV血凝抑制效价≥1∶32时，采集高免血；

5.根据权利要求4所述的猫瘟热治疗性抗体的制备方法，其特征在于：所述FPV灭活苗是利用FPV-GX01毒株与白油佐剂充分乳化制得。

6.根据权利要求4所述的猫瘟热治疗性抗体的制备方法，其特征在于：所述FPV亚单位疫苗是以FPV-VLPs制备的；所述FPV-VLPs是由经昆虫细胞密码子偏好优化并融合信号肽HBM的FPV VP2基因所编码，在杆状病毒/昆虫细胞表达***中表达形成。

7.根据权利要求6所述的猫瘟热治疗性抗体的制备方法，其特征在于所述FPV亚单位疫苗按以下操作制备：

(5)将重组杆状病毒感染昆虫sf9细胞，表达VP2蛋白，获得FPV-VLPs；

(6)收集含FPV-VLPs细胞培养液上清，初步纯化浓缩后与ISA206佐剂按照体积比1∶1充分乳化制备FPV亚单位疫苗。

8.根据权利要求7所述的猫瘟热治疗性抗体的制备方法，其特征在于：所述优化型FPVVP2基因具有序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列，VP2蛋白具有序列表SEQ.ID.No.2的氨基酸序列。

9.根据权利要求4所述的猫瘟热治疗性抗体的制备方法，其特征在于步骤(1)按以下操作进行：每匹马颈部多点肌肉注射5mL FPV灭活苗进行第一次基础免疫，间隔14d后同样方式注射5mL FPV灭活苗进行第二次基础免疫；基础免疫结束后21d，每匹马肌肉注射6mL FPV亚单位疫苗进行第一次加强免疫，以后每间隔4d再进行下一次加强免疫，总共进行4次加强免疫，每次FPV VLPs疫苗免疫剂量增加1.5mL；若FPV血凝抑制效价低于1∶32时，进行第5次加强免疫。

10.根据权利要求4所述的猫瘟热治疗性抗体的制备方法，其特征在于步骤(3)按以下操作进行：