CN115010813B - 一种肠道病毒71型病毒样颗粒、其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种肠道病毒71型病毒样颗粒、其制备方法及应用，属于基因工程和生物医药技术领域。所述肠道病毒71型病毒样颗粒是由表达肠道病毒71型的P1衣壳蛋白基因和3CD蛋白酶基因的重组杆状病毒感染SF9昆虫细胞，培养至90％以上数量的所述SF9昆虫细胞感染病变后所得。本发明还公开了上述肠道病毒71型病毒样颗粒的制备方法及应用。与野生型肠道病毒71型病毒颗粒相比，本发明的肠道病毒71型病毒样颗粒具有完全相似的外观结构及大小，不包含病毒核酸，无复制和感染能力，具备激发宿主先天和适应性免疫反应功能，并且具有较高体外组装效率。

Description

一种肠道病毒71型病毒样颗粒、其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种肠道病毒71型病毒样颗粒、其制备方法及应用，属于基因工程和生物医药技术领域。
背景技术
手足口病(Hand-foot-and-mouth disease，HFMD)是由二十多种肠道病毒(Enterovirus，EV)感染引发的常见传染病，目前国内只有肠道病毒A组71型(EV-A71)单价灭活疫苗上市。EV-A71型单价灭活疫苗无法针对其它型肠道病毒产生交叉保护。近年来CV-A16、CV-A10等非EV-A71肠道病毒感染率逐年上升。现有技术有多种二价EV-A71/CV-A16灭活或VLP疫苗，这些多价疫苗多为不同抗原的简单混合，有较好的免疫原性，能诱导产生多种保护，但研制成功一种多价疫苗需要经过严谨且复杂的毒株筛选、毒株驯化、病毒培养等过程，不仅研发周期长、成本高，且生产过程存在生物安全风险，不能满足新突发传染病应急防控的需求。
肠道病毒A组71型(EV-A71)是一个二十面体球形颗粒，直径为24-30nm，病毒基因组包含约7.5kb个碱基，仅有一个开放阅读框、5'非翻译区和3'非翻译区，其中开放阅读框编码一个包含约2193个氨基酸的多聚蛋白，该多聚蛋白可被水解为3种前体蛋白：P1、P2和P3。其中衣壳蛋白前体P1可裂解成VP1、VP2、VP3和VP4，并在细胞中组装成病毒衣壳。由衣壳蛋白前体P3裂解成产生的3C和3D蛋白酶，在裂解衣壳蛋白前体P1过程中起主要作用。VP1包含能中和病毒的重要表位，具有抗原性，在病毒功能中起重要作用。研究表明，在细胞中同时表达P1和3CD，可以形成EV-A71病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs)，大小和形态与EV-A71野生型病毒类似，不包含病毒核酸，无复制和感染能力，并保持了EV-A71野生型病毒抗原蛋白的天然构象，具备激发宿主先天和适应性免疫反应功能。目前已有三种基于VLPs的人用疫苗被正式批准用于预防乙型肝炎病毒，人***状瘤病毒和戊型肝炎病毒。尚未有肠道病毒相关VLPs疫苗上市。
中和表位是病毒抗原蛋白表面特殊的小分子肽，能刺激机体产生有效和特异的中和免疫保护反应。已证明肠道病毒主要的抗原表位位于VP1上，目前研究已经报道了EV-A71VP1线性中和表位包括第163位至177位氨基酸表位肽、第208位至222位氨基酸表位肽、第253位至267位氨基酸表位肽等，CV-A16 VP1表位包括第109位至123位氨基酸表位肽、第163位至177位氨基酸表位肽、第187位至202位氨基酸表位肽、第271位至285位氨基酸表位肽等。CV-A10 VP1线性中和表位的表位肽，目前未有相关报道。
目前，尚未有将两条CV-A10表位与一条CV-A16表位同时取代野生型肠道病毒EV-A71 P1的相应位置，构建一种三价表位嵌合的EV-A71病毒样颗粒的报道。
发明内容
本发明的目的之一，是提供一种肠道病毒71型病毒样颗粒。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种肠道病毒71型病毒样颗粒，是由表达肠道病毒71型的P1衣壳蛋白基因和3CD蛋白酶基因的重组杆状病毒感染SF9昆虫细胞，培养至90％以上数量的所述SF9昆虫细胞感染病变后所得。
本发明的肠道病毒71型病毒样颗粒的有益效果是：
1、与野生型肠道病毒71型病毒颗粒相比，本发明的肠道病毒71型病毒样颗粒具有完全相似的外观结构及大小，不包含病毒核酸，无复制和感染能力，具备激发宿主先天和适应性免疫反应功能，并且具有较高体外组装效率。
2、本发明的肠道病毒71型病毒样颗粒保留了大部分野生型肠道病毒71型病毒颗粒抗原蛋白的天然构象，保留了针对肠道病毒71型的免疫原性和免疫保护性。
3、本发明的肠道病毒71型病毒样颗粒还增加了针对CV-A16和CV-A10的保护效率，保护效率分别是20％和40％，因此增加了疫苗的保护范围。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述表达肠道病毒71型的P1衣壳蛋白基因和3CD蛋白酶基因的重组杆状病毒的制备方法是：
将经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化的肠道病毒71型的P1衣壳蛋白基因EV-A71-P1CHI3和经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化的3CD蛋白酶基因，与昆虫杆状病毒的穿梭载体pOET5连接，得到重组质粒pOET5-EV-A71-P1CHI3-3CD；
然后将上述重组质粒pOET5-EV-A71-P1CHI3-3CD与昆虫杆状病毒基因组Flash-BACDNA共转染SF9昆虫细胞，培养至90％以上数量的所述SF9昆虫细胞感染病变后，获得表达肠道病毒71型的P1衣壳蛋白基因和3CD蛋白酶基因的重组杆状病毒；
其中，所述经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化的肠道病毒71型的P1衣壳蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化的3CD蛋白酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述方法，可以制备得到表达肠道病毒71型的P1衣壳蛋白基因和3CD蛋白酶基因的重组杆状病毒。
更进一步，所述经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化的肠道病毒71型的P1衣壳蛋白基因EV-A71-P1CHI3的制备方法是：
将第一个CV-A10的VP1线性中和表位、第二个CV-A10的VP1线性中和表位和CV-A16的VP1线性中和表位分别经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化，然后，分别在野生型肠道病毒71型的P1衣壳蛋白基因的第1969至第2016位、第2179至第2223位和第2314至第2367位进行取代，即得；
其中，所述经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化后的第一个CV-A10的VP1线性中和表位的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化后的第二个CV-A10的VP1线性中和表位的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化后的VP1线性中和表位的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述野生型肠道病毒71型的P1衣壳蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
采用上述更进一步的有益效果是：本发明的发明人前期研究并鉴定了CV-A10 VP1线性中和表位包括核苷酸为第1969至第2016位、第2179至第2223位。本发明选择CV-A10的两个中和抗原表位分别进行密码子优化。选择CV-A16的一个中和抗原表位肽，进行密码子优化。
本发明首次以野生型肠道病毒71型病毒样颗粒为骨架，嵌入了上述三个密码子优化后的中和抗原表位，构建三价病毒样颗粒，在保留针对肠道病毒71型的免疫原性和免疫保护性的同时，增强对CA16和CA10的保护效率。
本发明的目的之二，是提供上述肠道病毒71型病毒样颗粒的制备方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：上述肠道病毒71型病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：构建重组质粒pOET5-EV-A71-P1CHI3-3CD
将第一个CV-A10的VP1线性中和表位、第二个CV-A10的VP1线性中和表位和CV-A16的VP1线性中和表位分别进行SF9昆虫细胞偏好密码子优化，然后，分别在野生型肠道病毒71型的P1衣壳蛋白基因的第1969至第2016位、第2179至第2223位和第2314至第2367位进行取代，得到经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化的肠道病毒71型的P1衣壳蛋白基因EV-A71-P1CHI3；
将3CD蛋白酶基因，进行SF9昆虫细胞偏好密码子优化；
将经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化的肠道病毒71型的P1衣壳蛋白基因EV-A71-P1CHI3和经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化后的3CD蛋白酶基因分别克隆到昆虫杆状病毒的穿梭载体pOET5的P10启动子之后的EcoRⅠ/NotⅠ酶切位点以及polh启动子之后的BamHⅠ/XhoⅠ酶切位点，构建重组质粒pOET5-EV-A71-P1CHI3-3CD；
其中，所述经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化后的第一个CV-A10的VP1线性中和表位的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化后的第二个CV-A10的VP1线性中和表位的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化后的CV-A16的VP1线性中和表位的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述野生型肠道病毒71型的P1衣壳蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述经过密码子优化的肠道病毒71型的P1衣壳蛋白基因EV-A71-P1CHI3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化的3CD蛋白酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
步骤2：构建重组杆状病毒rBV-EV-A71-P1CHI3-3CD
将步骤1得到的重组质粒pOET5-EV-A71-P1CHI3-3CD与昆虫杆状病毒基因组Flash-BAC DNA共转染SF9昆虫细胞，将P1衣壳蛋白基因和3CD基因整合到昆虫杆状病毒基因组内，获得重组杆状病毒rBV-EV-A71-P1CHI3-3CD；
步骤3：制备和纯化病毒样颗粒
通过SF9昆虫细胞扩增步骤2得到的重组杆状病毒rBV-EV-A71-P1CHI3-3CD，再感染SF9昆虫细胞，培养至90％以上数量的所述SF9昆虫细胞感染病变后，收集上清液并对上清液进行纯化，即得到肠道病毒71型病毒样颗粒。
本发明的肠道病毒71型病毒样颗粒的制备方法的原理是：
本发明的步骤1中，昆虫杆状病毒的穿梭载体pOET5，购于Oxford ExpressionTechnologies。将经过密码子优化的肠道病毒71型的P1衣壳蛋白基因EV-A71-P1CHI3和经密码子优化后的3CD蛋白酶基因这两个目的基因通过化学合成，分别克隆到昆虫杆状病毒的穿梭载体pOET5的P10启动子之后的EcoRⅠ/NotⅠ酶切位点以及polh启动子之后的BamHⅠ/XhoⅠ酶切位点，构建重组质粒pOET5-EV-A71-P1CHI3-3CD，该步骤由华大基因完成。
本发明的步骤2中，取步骤1得到的重组质粒pOET5-EV-A71-P1CHI3-3CD，与昆虫杆状病毒基因组Flash-BAC DNA共同转染SF9昆虫细胞，这样，肠道病毒71型的P1蛋白基因和3CD蛋白酶基因就可以整合到昆虫杆状病毒基因组内，并产生活的重组昆虫杆状病毒。再感染新的SF9昆虫细胞,就可以获得扩大培养的、高滴度的活的重组昆虫杆状病毒。
昆虫杆状病毒基因组Flash-BAC DNA，可以市售购买，如可以购于英国OxfordExpression Technologies公司。
SF9昆虫细胞，属于昆虫杆状病毒的有效宿主细胞，可以市售购买，如可以购于美国Invitrogen公司。
本发明的步骤2中，转染采用昆虫细胞转染试剂，上述昆虫细胞转染试剂可以市售购买，如可以购于美国Invitrogen公司，名称为CellfectinⅡ。
综上，本发明以昆虫杆状病毒——昆虫细胞表达***为基础，构建出能同时表达嵌合了三个异源表位的EV-A71 P1CHI3蛋白基因和3CD蛋白酶基因的重组杆状病毒，在细胞内由3CD蛋白酶酶切P1CHI3蛋白，自发组装成带有异源表位的三价肠道病毒71型病毒空壳。该三价肠道病毒71型病毒空壳可以释放到培养上清中。
本发明的肠道病毒71型病毒样颗粒的制备方法的有益效果是：
1、本发明的生产工序简便，制备得到的肠道病毒71型病毒样颗粒不含病毒的遗传物质，故无需进行灭活处理。
2、本发明可以通过摇瓶培养和感染SF9昆虫细胞，从而可以大规模生产肠道病毒71型病毒样颗粒，进而生产肠道病毒71型病毒样颗粒疫苗。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，步骤3中，所述重组杆状病毒rBV-EV-A71-P1CHI3-3CD感染SF9昆虫细胞的感染复数MOI为3，所述SF9昆虫细胞密度均为2×106/mL。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述感染复数，可以高效地表达外源肠道病毒71型的P1CHI3蛋白基因和3CD蛋白酶基因，并将自动组装成的肠道病毒71型病毒样颗粒释放到细胞培养液中。
进一步，步骤3中，所述培养的温度为27℃，摇速为110转/min，时间为5d-6d。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述参数，经过培养后，可以得到表达P1 CHI3结构蛋白和3CD蛋白酶，在宿主细胞内自动组装成肠道病毒71型的空外壳，即三价肠道病毒71型病毒样颗粒(EV-A71-VLPCHI3)蛋白。
进一步，步骤3中，所述纯化的具体方法是：
步骤3.1：上清液浓缩
将上清液与质量百分浓度为20％的PEG8000、0.6M的NaCl溶液等体积混合，4℃搅拌过夜，再8000转/min离心30min，弃掉上清液，留蛋白沉淀，使用PBS缓冲液重悬上述蛋白沉淀，得到病毒浓缩液；所述PBS缓冲液中含有KH2PO42mM、Na2HPO48mM、NaCl 136mM和KCl2.6mM，pH值为7.2；
步骤3.2：蔗糖密度梯度超速离心
分别制备质量百分浓度为30％、45％及60％的蔗糖溶液，对步骤3.1得到的病毒浓缩液进行密度梯度超速离心，290,000转/min离心60min，收集位于30％与45％交界处，以及45％与60％交界处的乳白色物质，即为肠道病毒71型病毒样颗粒。
采用上述进一步的有益效果是：收集位于30％与45％交界处，以及45％与60％交界处的乳白色物质，其内含有纯化的EV-A71CHI3病毒样颗粒蛋白。可以采用BCA(bicinchonininc acid)蛋白浓度测定法，测定纯化后EV-A71CHI3病毒样颗粒蛋白的浓度，以便进行后续的免疫实验定量。
本发明的目的之三，是提供一种肠道病毒71型病毒样颗粒疫苗。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种肠道病毒71型病毒样颗粒疫苗，由上述肠道病毒71型病毒样颗粒为活性成分或活性成分之一。
本发明的肠道病毒71型病毒样颗粒疫苗的有益效果是：
1、现有技术中，无手足口病多价疫苗产品，仅有肠道病毒71型灭活疫苗，本发明提供了一种三价肠道病毒71型病毒样颗粒疫苗。
2、本发明的肠道病毒71型病毒样颗粒疫苗能引起机体免疫***产生强型应答，免疫力强，持续时间长，对肠道病毒71型能达到100％完全保护，并且可以针对CV-A16提供20％的保护，针对CV-A10提供40％的保护。
3、本发明的肠道病毒71型病毒样颗粒疫苗具有与野生型肠道病毒71型病毒相似的外壳结构，却不具病毒活性，无传染力，因而非常安全，有效。生产过程无需特殊环境控制(诸如生物安全水平2或水平3的车间)以防病毒外泄，无需进行灭活处理。
4、本发明的肠道病毒71型病毒样颗粒疫苗生产周期短，完全适应于肠道病毒的快速多突变性特性。从分离出突变株的结构蛋白基因到疫苗产品只需6-8周时间。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述肠道病毒71型病毒样颗粒疫苗的剂型为液体注射剂、注射粉剂和注射片剂中的任意一种或几种。
采用上述进一步的有益效果是：本发明的肠道病毒71型病毒样颗粒疫苗可以制成多种剂型，用于满足不同的使用需求，更加方便。
进一步，所述肠道病毒71型病毒样颗粒疫苗还包括佐剂，所述佐剂选自油佐剂、水包油佐剂、油包水佐剂、水包油包水佐剂、铝盐和多糖类佐剂中的任意一种或几种。
采用上述进一步的有益效果是：佐剂和本发明的肠道病毒71型病毒样颗粒一起，可以制成本发明的肠道病毒71型病毒样颗粒疫苗。
附图说明
图1为CV-A10的VP1线性中和表位第96位至104位氨基酸表位肽、第162位至176位氨基酸表位肽免疫小鼠后，其血清平均中和效价分别为1:4和1:17.96。
图2为本发明的实施例中，构建重组质粒pOET5-EV-A71-P1CHI3-3CD的流程图。
图3为本发明的实施例中，重组质粒pOET5-EV-A71-P1CHI3-3CD的示意图。
图4为本发明的实施例中，pOET5-EV-A71-P1CHI3-3CD质粒酶切结果图。其中，泳道M为15000bp分子量标准Marker；泳道1为线性化pOET5-EV-A71-P1CHI3-3CD质粒；泳道2为线性化pOET5质粒；泳道3为经EcoRⅠ、NotⅠ、BamHⅠ和xho I四种限制性内切酶切割后pOET5-EV-A71-P1CHI3-3CD。
图5为本发明的实施例中，rBV-EV-A71-P1CHI3-3CD重组杆状病毒PCR结果图。其中，泳道M为15000bp分子量标准Marker；泳道1为阳性对照pOET5-EV-A71-P1CHI3-3CD质粒；泳道2为rBV-EV-A71-P1CHI3-3CD重组杆状病毒。
图6为感染rBV-EV-A71-P1CHI3-3CD重组杆状病毒后，不同天数SF9昆虫细胞培养上清EV-A71-VLPCHI3病毒样颗粒表达情况。其中，泳道M为蛋白质分子量标准Marker；泳道PC为阳性对照EV-A71灭活病毒；泳道D1-D6分别为第1天至第6天SF9昆虫细胞培养上清EV-A71-VLPCHI3病毒样颗粒表达情况。
图7为纯化后EV-A71-VLPCHI3蛋白检测。其中，泳道PC为为阳性对照EV-A71灭活病毒；泳道1为纯化的EV-A71-VLPCHI3。
图8为纯化的EV-A71-VLPCHI3病毒粒子透射电镜图片，比例尺为200nm。
图9为免疫小鼠血清中针对EV-A71灭活病毒血清特异性IgG抗体水平。
图10为免疫小鼠血清中针对CA16灭活病毒血清特异性IgG抗体水平，数据采用双尾t检验(Student′s-two-tailed t test)分析。
图11为小鼠血清中针对CA10灭活病毒血清特异性IgG抗体水平。数据采用双尾t检验(Student′s-two-tailed t test)分析，*P<0.05。
图12为EV-A71-VLPCHI3病毒样颗粒疫苗及灭活EV-A71疫苗免疫小鼠后血清针对EV-A71病毒中和抗体效价。
图13为EV-A71-VLPCHI3病毒样颗粒疫苗及灭活EV-A71疫苗免疫小鼠后血清针对CA16病毒中和抗体效价。数据采用双尾t检验(Student′s-two-tailed t test)分析。
图14为EV-A71-VLPCHI3病毒样颗粒疫苗及灭活EV-A71疫苗免疫小鼠后血清针对CA10病毒中和抗体效价。数据采用双尾t检验(Student′s-two-tailed t test)分析，*p<0.05。
图15为EV-A71-VLPCHI3和灭活EV-A71疫苗针对EV-A71攻毒的保护效率，存活率为100％。
图16为EV-A71-VLPCHI3和灭活EV-A71疫苗针对CA16攻毒的保护效率，存活率为20％。
图17为EV-A71-VLPCHI3和灭活EV-A71疫苗针对CA10攻毒的保护效率，存活率为40％。
具体实施方式
以下结合具体附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本实施例的肠道病毒71型病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：通过PubMed网站检索并筛选确定CV-A16线性中和表位，选择第271位至285位氨基酸表位肽作为替换表位，其经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化后的核苷酸序列如SEQID NO.5所示。
本发明的发明人前期研究并鉴定的CV-A10的P1线性中和表位包括核苷酸为第1969至第2016位和第2179至第2223位两个表位，分别命名为第一个CV-A10的VP1线性中和表位和第二个CV-A10的VP1线性中和表位。以这两个表位肽分别免疫动物后获得血清，进行微量中和实验，证明能对CV-A10有中和能力，平均中和效价分别为1:4和1:17.96，如图1所示。
其中，经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化后的第一个CV-A10的VP1线性中和表位的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3所示，经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化后的第二个CV-A10的VP1线性中和表位的核苷酸序列，如SEQ ID NO.4所示。
步骤2：构建重组质粒pOET5-EV-A71-P1CHI3-3CD
如图2所示，将CV-A10的VP1第96位至104位氨基酸表位肽、第162位至176位氨基酸表位肽和CV-A16的VP1第271位至285位氨基酸表位肽分别进行SF9昆虫细胞偏好密码子优化，然后，分别在野生型肠道病毒71型的P1衣壳蛋白基因的第1969至第2016位、第2179至第2223位和第2314至第2367位进行取代，得到经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化的肠道病毒71型的P1衣壳蛋白基因EV-A71-P1CHI3。
将3CD蛋白酶基因，经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化。
将经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化的肠道病毒71型的P1衣壳蛋白基因EV-A71-P1CHI3和经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化后的3CD蛋白酶基因分别克隆到昆虫杆状病毒的穿梭载体pOET5的P10启动子之后的EcoRⅠ/NotⅠ酶切位点以及polh启动子之后的BamHⅠ/XhoⅠ酶切位点，构建重组质粒pOET5-EV-A71-P1CHI3-3CD。
其中，所述经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化后的第一个CV-A10的VP1线性中和表位的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化后的第二个CV-A10的VP1线性中和表位的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化后的VP1线性中和表位的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述野生型肠道病毒71型的P1衣壳蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述经过密码子优化的肠道病毒71型的P1衣壳蛋白基因EV-A71-P1CHI3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化的3CD蛋白酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
atgggttcccaggtgtccactcaacgttccggttcccacgagaactccaactccgctaccgagggttccaccatcaactacaccaccatcaactactacaaggactcctacgctgctaccgctggtaagcagtccctgaagcaggaccctgacaagttcgctaaccctgtgaaggacatcttcaccgagatggctgctcctctgaagtctccttccgctgaggcttgtggttactccgatcgcgtggctcaactgaccatcggtaactccaccatcaccacccaggaggctgctaacatcatcgtgggttacggtgagtggccttcctactgctccgactccgatgctaccgctgtggacaaacctactcgccctgacgtttccgttaaccgcttctacaccctggacaccaagctgtgggagaagtcctccaagggttggtactggaagttccctgacgtgctgaccgaaaccggtgtgttcggtcagaacgctcagttccactacctgtaccgctccggtttctgcattcacgtgcaatgcaacgcttccaagttccaccagggtgctctgctggtggctgttctgcctgagtacgtgatcggtaccgtggctggtggtactggtaccgaagacacccaccctccttacaagcagacccagcctggtgctgatggtttcgagctgcagcacccttatgtgctggacgctggtatccctatctcccagctgaccgtgtgtcctcaccagtggatcaacctgcgcaccaacaactgcgctaccatcatcgtgccttacatcaacgctctgcctttcgactccgctctgaaccactgtaacttcggtctgctggtggtgcctatttcccctctggactacgatcagggtgctacccctgtgatccctatcaccatcaccctggctcctatgtgctccgagttcgctggtttgcgtcaggctgtgacccaaggtttccctaccgagctgaagcctggtaccaaccagttcctgaccaccgatgacggtgtgtccgctcctatcctgcctaacttccaccctaccccttgcatccacatccctggtgaggtgcgcaatttgctggagctgtgccaagtggagactatcctggaggtgaacaacgtgcctaccaacgctacctccctgatggagcgtctgcgctttcctgtgtccgctcaggctggtaagggtgaactgtgcgctgtgtttcgtgctgaccctggtagaaacggtccttggcaatccaccctgctgggtcaactgtgcggttactacacccagtggtccggttctctggaggtgaccttcatgttcaccggttccttcatggctaccggtaagatgctgatcgcttacacccctcctggtggtcctctgcctaaagaccgtgctaccgctatgttgggtacccacgtgatttgggacctgggtctgcaatcctctgtgaccctggtgatcccttggatctccaacacccactaccgcgctcatgctcgtgatggtgtgttcgactactacaccaccggtctggtgtccatctggtaccagaccaactacgtggtgcctatcggtgctcctaacaccgcttacatcatcgctctggctgctgctcagaagaacttcaccatgaagctgtgcaaggacgcttccgacatcttgcagaccggtaccattcaaggtgaccgcgtggctgatgttatcgagtcctccatcggtgattccgtgtcccgcgctttgactcatgctctgcctgctcctactggtcagaacacccaggtgtcctcccatcgtctggataccggtaaagtgcctgctctgcaggctgctgagattggtgcttcctccaacgcttccgacgagtccatgatcgaaacccgctgcgtgctcaattctcactccaccgctgaaaccactctggactccttcttttcccgcgctggtctggttggtgtggtgaacctgaccgatggtggtactgacaccaccggttatgctacctgggacatcgacatcaccggttacgctcagatgcgccgcaaagtggagctgttcacctacatgcgcttcgacgctgagttcaccttcgtggcttgcactcctactggtgaggtggtgcctcaactgctgcagtacatgttcgtgcctcctggtgctcctaaacctactggtcgcgacgctttccaatggcagaccgctactaacccttccgtgttcgtgaagctgtccgaccctcctgctcaagtgtccgtgcctttcatgtcccctgcttccgcttaccagtggttctacgacggtacccctaccttcggtgagcacctgcaggctaacgacctggactacggtcagtgccctaacaacatgatgggtaccttctccgtgcgtactgtgggtacctccaagtccaagtaccctctggtggtgcgcatctacatgcgcatgaagcacgtgcgcgcttggattcctcgtcctatgcgcaaccagaactacctgttcaaggctaaccctaactacgctggtaactccatcaagcctaccggtgcttcccgtaccgctatcaccaccctgtaa(SEQ ID NO.1)。
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gtggtgaacctgaccgatggtggtactgacaccaccggttatgctacc(SEQ ID NO.3)。
cctactggtcgcgacgctttccaatggcagaccgctactaaccct(SEQ ID NO.4)。
acccctaccttcggtgagcacctgcaggctaacgacctggactacggtcagtgc(SEQ ID NO.5)。
atgggttcgcaagtgtctacacagcgctccggttctcacgaaaactcaaactcagccactgagggttctaccataaactacaccaccattaattactacaaagactcctatgctgccacagcaggcaaacagagtctcaagcaggatccagacaagtttgcaaatcctgttaaagacattttcactgaaatggcagcgccactgaaatccccatccgctgaggcatgtgggtacagtgatcgagtggcgcaattaactattggcaactccaccatcaccacgcaagaagcggctaacatcatagtcggttatggtgagtggccttcctactgctcagattctgacgctacagcagtggataaaccaacgcgcccggatgtttcagtgaacaggttttacacattggacaccaaattgtgggagaaatcgtccaaggggtggtactggaagttcccggatgtgttaactgaaactggggtttttgggcaaaatgcacaattccactacctctaccgatcagggttctgcatccacgtgcagtgcaatgccagtaaattccaccaaggagcactcctagtcgctgtcctaccagagtatgtcattgggacagtggcaggcggtacagggacggaagatacccaccccccttacaagcagactcaacccggcgccgatggcttcgagttgcaacacccgtacgtgcttgatgctggcatcccaatatcacagttaacagtgtgcccacaccagtggatcaacttgaggaccaacaattgtgctacaataatagtgccatacattaacgcactgccttttgattctgccttgaatcattgcaactttggcctgttggttgtgcctattagcccactagactacgaccaaggagcgacgccagtaatccctataactatcacattggccccaatgtgttctgaattcgcaggtcttaggcaggcagtcacgcaagggttccccaccgagctaaaacctggcacaaatcaatttttaaccaccgatgatggcgtttcagcacctattctaccaaacttccaccccaccccgtgtatccacatacctggtgaggttaggaacttgctagagttatgccaggtggaaaccattctggaggttaacaatgtgcccacgaatgccactagcttaatggagagactgcgcttcccggtctcagcacaagcagggaaaggtgagctgtgtgcggtgtttagagccgatcctgggcgaaatggaccatggcaatccaccttactgggtcagttgtgcgggtactacacccaatggtcaggatcattggaagtcaccttcatgtttactggatctttcatggctaccggcaagatgctcatagcctatacaccgccaggaggtcctctgcccaaggaccgggcgaccgccatgttgggcacgcacgtcatctgggatttggggctgcaatcgtctgttacccttgtaataccatggatcagcaacactcattacagagcacatgcccgagatggagtgtttgactactacaccacagggttagtcagtatatggtaccagacaaattacgtggttccaatcggtgcgcccaacacagcctatataatagcgctagcggcggcccaaaagaatttcactatgaaattgtgcaaggatgctagtgatatcctgcagacgggcaccatccagggagatagggtggcagatgtaattgaaagttccataggagatagcgtgagcagagccctcactcacgctctaccagcacccacaggccagaacacacaggtgagcagtcatcgactggatacaggtaaggttccagcactccaagctgctgaaattggagcatcatcaaatgctagtgacgagagcatgattgagacacgctgtgttcttaactcgcacagtacagctgagaccactcttgatagtttcttcagcagggcgggattagttggagagatagatctccctcttaagggcacaactaacccaaatggttatgccaactgggacatagatataacaggttacgcgcaaatgcgtagaaaggtagagctattcacctacatgcgctttgatgcagagttcacttttgttgcgtgcacacccaccggggaagttgtcccacaattgctccaatatatgtttgtgccacctggagcccctaagccagattctagggaatcccttgcatggcaaaccgccactaacccctcagtttttgtcaagctgtcagaccctccagcgcaggtttcagtgccgttcatgtcacctgcgagtgcttatcaatggttttatgacggatatcccacattcggagaacacaaacaggagaaagatcttgaatacggggcatgtcctaataacatgatgggcacgttctcagtgcggactgtggggacctccaagtccaagtaccctttagtggttaggatttacatgagaatgaagcacgtcagggcgtggatacctcgcccgatgcgtaaccagaactacctatttaaagccaacccaaattatgctggcaactccattaagccaactggcgccagtcgcacagcgatcaccactctttaa(SEQ ID NO.6)。
上述昆虫杆状病毒的穿梭载体pOET5，购于Oxford Expression Technologies。将经过密码子优化的肠道病毒71型的P1衣壳蛋白基因EV-A71-P1CHI3和经密码子优化后的3CD蛋白酶基因这两个目的基因通过化学合成，分别克隆到昆虫杆状病毒的穿梭载体pOET5的P10启动子之后的EcoRⅠ/NotⅠ酶切位点以及polh启动子之后的BamHⅠ/XhoⅠ酶切位点，构建重组质粒pOET5-EV-A71-P1CHI3-3CD，如图3所示，该步骤由华大基因完成。
如图4所示，pOET5-EV-A71-P1CHI3-3CD阳性质粒经EcoRⅠ、NotⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ四种核酸内切酶同时消化，产生了四个条带，由大到小分别是线性的pOET5载体，EV-A71-P1CHI3基因，3CD基因，以及P10启动子与polh启动子之间的短序列。
步骤3：构建重组杆状病毒rBV-EV-A71-P1CHI3-3CD
将步骤1得到的重组质粒pOET5-EV-A71-P1CHI3-3CD与昆虫杆状病毒基因组Flash-BAC DNA共转染SF9昆虫细胞，将P1衣壳蛋白基因和3CD基因整合到昆虫杆状病毒基因组内，获得重组杆状病毒rBV-EV-A71-P1CHI3-3CD。
上述昆虫杆状病毒基因组Flash-BAC DNA，可以市售购买，如可以购于英国OxfordExpression Technologies公司。
上述SF9昆虫细胞，属于昆虫杆状病毒的有效宿主细胞，可以市售购买，如可以购于美国Invitrogen公司。
上述重组杆状病毒rBV-EV-A71-P1CHI3-3CD可通过PCR方法鉴定其阳性，如图5所示。
应用昆虫细胞转染试剂Cellfectin Ⅱ(购于美国Invitrogen公司)，将重组质粒pOET5-EV-A71-P1CHI3-3CD与昆虫杆状病毒基因组Flash-BAC DNA共转染SF9昆虫细胞，经过27℃，5-6天的细胞培养，大量重组昆虫杆状病毒rBV-EV-A71-P1CHI3-3CD被释放入细胞培养液中，用收集的细胞培养上清液再一次感染新的SF9昆虫细胞，获得放大后高滴度的重组昆虫杆状病毒，以备后用。
步骤4：制备和纯化病毒样颗粒
通过SF9昆虫细胞扩增步骤2得到的重组杆状病毒rBV-EV-A71-P1CHI3-3CD以提高其病毒滴度。病毒滴度的测定，采用qPCR法，根据式1计算标准品PMV-rBV拷贝数。
标准品PMV-rBV拷贝数(copies/μL)＝6.02×1023×质粒浓度(ng/μL)×10-9/(质粒碱基数×660)式1。
将已知拷贝数PMV-rBV质粒以10倍倍比稀释8梯度，作为标准曲线样品。重组杆状病毒rBV-EV-A71-P1CHI3-3CD原液及10倍倍比稀释液，作为待测样品。
杆状病毒基因组通用引物：
BV-F：gacaatccagtcacggacgaacat(SEQ ID NO 7)；
BV-R：ggcaaaggtttcaatgccgg(SEQ ID NO 8)。
根据标准曲线和待测样品对应CQ值计算出rBV-EV-A71-P1CHI3-3CD滴度。
以感染复数MOI(Multiplicity of infection，MOI)为3，感染密度为2×106/mL的SF9昆虫细胞培养液，可以高效地表达外源肠道病毒71型的P1CHI3蛋白基因和3CD蛋白酶基因，并将自动组装成的肠道病毒71型病毒样颗粒释放到细胞培养液中。
再感染密度为2×106/mL的SF9昆虫细胞培养液，在温度为27℃，摇速为110转/min，培养5-6d，至90％以上数量的所述SF9昆虫细胞感染病变后，收集上清液，检测上清中的目的蛋白，并对上清液目的蛋白进行纯化，最后通过透射电镜检测，具体方法是：
步骤3.1：Western Blot检测上清中目的蛋白
上清样品与上样缓冲液混合，在99℃煮沸10分钟，在10％SDS-PAGE凝胶上分离，进一步电转移到PVDF膜上进行Western Blot分析。用稀释为1:500的小鼠EV-A71全病毒抗血清作为一抗，用稀释为1:5000羊抗小鼠HRP偶联IgG抗体作为二抗，采用ECL发光试剂盒进行化学发光。如图6所示，检测的是第1d-6d上清中蛋白表达情况，第5d和第6d能检测到VP1蛋白大量表达。
步骤3.2：上清液浓缩
将上清液与质量百分浓度为20％的PEG8000、0.6M的NaCl溶液等体积混合，4℃搅拌过夜，再8000转/min离心30min，弃掉上清液，留蛋白沉淀，使用PBS缓冲液重悬上述蛋白沉淀，得到病毒浓缩液；所述PBS缓冲液中含有KH2PO42mM、Na2HPO48mM、NaCl 136mM和KCl2.6mM，pH值为7.2。
步骤3.3：蔗糖密度梯度超速离心
分别制备质量百分浓度为30％、45％及60％的蔗糖溶液，对步骤3.1得到的病毒浓缩液进行密度梯度超速离心，290,000转/min离心60min，收集位于30％与45％交界处，以及45％与60％交界处的乳白色物质，即为肠道病毒71型病毒样颗粒。如图7所示，经WesternBlot可检测纯化后的样品中包含大量VP1蛋白。
步骤3.4：透射电镜检测
上述纯化后的样品，经2％磷钨酸负染后，在透射电子显微镜下进行观察，外观呈现出与真实病毒粒子相似的球形颗粒，直径约30nm，如图8所示。
实验例1：以肠道病毒71型病毒样颗粒免疫无特殊病原体污染的6周龄BALB/c小鼠，并对免疫后小鼠血清进行分析。
动物免疫及其血清抗体测定和病毒中和反应，是根据现行使用的肠道病毒动物免疫实验方式进行的。实验动物是选用的无特殊病原体污染的6周龄BALB/c雌性小鼠。具体操作如下：第0周、第2周及第4周给每只BALB/c小鼠皮下注射弗氏佐剂乳化的0.3mL肠道病毒71型病毒样颗粒(10μg总蛋白)，以相同剂量的肠道病毒71型灭活病毒作为阳性对照，以PBS组为阴性对照，于第0周、第2周、第4周、第6周以及第12周对小鼠进行断尾采血，取血清进行ELISA和微量中和实验。
ELISA实验具体步骤如下：
步骤(1)包被：用包被缓冲液将纯化的EV-A71或CV-A16或CV-A10灭活病毒稀释至1μg/mL，96孔板中每孔加入100μL，4℃包被过夜；
步骤(2)洗涤：次日用1×PBST(含0.1％Tween-20)洗涤3次。每孔200μL，每次1min；
步骤(3)封闭：用1％BSA封闭液封闭，每孔200μL，37℃封闭1h；
步骤(4)洗涤：1×PBST洗涤3次，每孔200μL，每次1min；
步骤(5)一抗孵育：加入用稀释液(0.1％BSA)梯度稀释待检血清后，每个稀释度100μL加入上述已包被的反应孔中，置37℃孵育1h(同时做空白、阴性及阳性孔对照)；
步骤(6)洗涤：用1×PBST洗涤3次，每孔200μL，每次1min；
步骤(7)二抗孵育：加入用稀释液(0.1％BSA)按1∶5000倍稀释的酶标二抗HRP-羊抗小鼠鼠IgG 100μL，37℃孵育1h；
步骤(8)洗涤：用1×PBST洗涤3次，每孔200μL，每次1min；
步骤(9)显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物显色液100μL，37℃反应10-20min；
步骤(10)终止：于各反应孔中加入1mol/L硫酸50μL以终止反应。读值：终止反应后马上在酶标仪上于450nm读板。
微量中和实验步骤如下：
步骤(1)待检血清56℃灭活30min；
步骤(2)EV-A71或CV-A16或CV-A10分离株稀释：根据EV-A71或CV-A16或CV-A10分离株滴度，将病毒稀释成每25μL含100TCI D50病毒量，稀释液为细胞维持液；
步骤(3)血清实验板：向96孔板中每孔加入25μL DMEM培养基，向第一孔中加入被检血清，混匀吸出25μL至第二孔，以此类推按照2倍倍比稀释，稀释度依次为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256，每稀释度设2孔；向每孔中加入100TCID50/25μL EV-A71或CV-A16或CV-A10病毒悬液，轻轻混匀；
步骤(4)设置阴性血清对照孔、细胞对照孔：阴性血清对照孔稀释方法同步骤(3)；在每个细胞对照孔中加入50μL细胞维持液，细胞对照设4孔；设置病毒回滴对照：96孔板中每孔加入25μL细胞维持液，再加入EV-A71或CV-A16或CV-A10100 TCID50/25μL、10TCID50/25μL、1TCID50/25μL、0.1TCID50/25μL，每个稀释度设8孔；
将血清实验板、血清对照、细胞对照、病毒回滴对照置5％CO2 37℃培养箱中和3h，期间每隔半小时取出96孔板混匀，以确保被检血清与病毒充分反应；
步骤(5)制备细胞悬液：覆盖95％25cm2培养瓶的单层细胞消化后加入细胞生长液，进行细胞计数，稀释细胞悬液密度为1.0×105个/mL。中和3h后，向96孔板各孔加入细胞悬液100μL，轻轻晃动混匀，置于5％CO2 37℃培养箱培养；每天观察记录，当100TCID50/25μL病毒对照孔出现完全CPE时，判断结果，以不产生CPE的最高血清稀释度的倒数作为待测血清的抗EV-A71或CV-A16或CV-A10中和抗体效价。细胞对照孔细胞生长良好，血清对照孔无毒性反应，病毒回滴对照在32-320TCID50/25μL范围内的实验结果视为有效。
实验例2：体内被动保护实验，以肠道病毒71型病毒样颗粒免疫无特殊病原体污染的6周龄ICR母鼠，对其产下的乳鼠攻毒，并记录乳鼠存活率。
本实验小鼠病毒攻毒实验，是根据现行使用的肠道病毒动物免疫实验及攻毒保护实验方式进行的。免疫接种选用的是无特殊病原体污染的六周龄ICR母鼠，分别对每只小鼠以10μg/0.1mL的剂量进行皮下接种EV-A71病毒样颗粒免疫，以相同剂量的EV-A71灭活病毒为阳性对照，PBS组为阴性对照，第0周、第2周及第4周分别免疫一次。于第三周使母鼠交配，约第6-7周时分娩，每只母鼠生产约10只乳鼠。乳鼠的攻毒保护实验：以10只1日龄乳鼠为一组；各组分别以50倍LD 50的EV-A71或CV-A16或CV-A10鼠适应株颅内感染，阳性对照组和阴性对照组接受与所免疫的实验组以相同剂量EV-A71或CV-A16或CV-A10颅内感染，每天记录乳鼠存活率以及临床症状，持续15天。
实验结果：
图9-图11是免疫小鼠后血清特异性IgG抗体滴度检测结果。选择6周龄雌性BALB/c小鼠为实验动物，分别用sf9细胞培养上清作为阴性对照，PBS作为空白对照，EV-A71灭活病毒为阳性对照，EV-A71-VLPCHI3为实验组，免疫小鼠并收集免疫后血清，通过间接ELISA法测定小鼠血清中针对EV-A71、CV-A16和CV-A10的特异性IgG抗体滴度。结果显示，如图9所示，EV-A71-VLPCHI3疫苗和EV-A71灭活疫苗均能诱导小鼠产生EV-A71特异性IgG抗体，且抗体滴度均随着免疫次数的增加而增强；如图10所示，EV-A71-VLPCHI3疫苗和EV-A71灭活疫苗均能诱导小鼠产生CV-A16特异性IgG抗体，且抗体滴度均随着免疫次数的增加而增强，且EV-A71-VLPCHI3诱导产生CV-A16特异性IgG抗体滴度高于EV-A71灭活疫苗；如图11所示，EV-A71-VLPCHI3能诱导产生CV-A10特异性抗体，与EV-A71灭活疫苗相比具有显著性差异。
图12-图14是免疫小鼠后血清中和抗体滴度测定。结果显示，如图12所示，EV-A71-VLPCHI3和EV-A71灭活疫苗诱导产生针对EV-A71的中和抗体的平均滴度分别为1:213和1:235；如图13所示，EV-A71-VLPCHI3和EV-A71灭活疫苗诱导产生针对CV-A16的中和抗体的平均滴度分别为1:19和1:11；如图14所示，EV-A71-VLPCHI3和灭活EV-A71疫苗诱导产生针对CV-A10的中和抗体的平均滴度分别为1:69和1:21。
图15-图17是动物攻毒保护实验。结果显示，如图15所示，EV-A71-VLPCHI3和EV-A71灭活疫苗均能100％保护EV-A71病毒攻毒；如图16所示，针对CV-A16攻毒，EV-A71-VLPCHI3能提供20％保护,而EV-A71灭活疫苗不能提供保护；如图17所示，针对CV-A10攻毒，EV-A71-VLPCHI3能提供40％保护,而EV-A71灭活疫苗不能提供保护。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 桂林医学院
<120> 一种肠道病毒71型病毒样颗粒、其制备方法及应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2586
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgggttccc aggtgtccac tcaacgttcc ggttcccacg agaactccaa ctccgctacc 60
gagggttcca ccatcaacta caccaccatc aactactaca aggactccta cgctgctacc 120
gctggtaagc agtccctgaa gcaggaccct gacaagttcg ctaaccctgt gaaggacatc 180
ttcaccgaga tggctgctcc tctgaagtct ccttccgctg aggcttgtgg ttactccgat 240
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atcgtgggtt acggtgagtg gccttcctac tgctccgact ccgatgctac cgctgtggac 360
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gagaagtcct ccaagggttg gtactggaag ttccctgacg tgctgaccga aaccggtgtg 480
ttcggtcaga acgctcagtt ccactacctg taccgctccg gtttctgcat tcacgtgcaa 540
tgcaacgctt ccaagttcca ccagggtgct ctgctggtgg ctgttctgcc tgagtacgtg 600
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atctcccagc tgaccgtgtg tcctcaccag tggatcaacc tgcgcaccaa caactgcgct 780
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ggtaagggtg aactgtgcgc tgtgtttcgt gctgaccctg gtagaaacgg tccttggcaa 1260
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cgcgctcatg ctcgtgatgg tgtgttcgac tactacacca ccggtctggt gtccatctgg 1560
taccagacca actacgtggt gcctatcggt gctcctaaca ccgcttacat catcgctctg 1620
gctgctgctc agaagaactt caccatgaag ctgtgcaagg acgcttccga catcttgcag 1680
accggtacca ttcaaggtga ccgcgtggct gatgttatcg agtcctccat cggtgattcc 1740
gtgtcccgcg ctttgactca tgctctgcct gctcctactg gtcagaacac ccaggtgtcc 1800
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cctcctggtg ctcctaaacc tactggtcgc gacgctttcc aatggcagac cgctactaac 2220
ccttccgtgt tcgtgaagct gtccgaccct cctgctcaag tgtccgtgcc tttcatgtcc 2280
cctgcttccg cttaccagtg gttctacgac ggtaccccta ccttcggtga gcacctgcag 2340
gctaacgacc tggactacgg tcagtgccct aacaacatga tgggtacctt ctccgtgcgt 2400
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cacgtgcgcg cttggattcc tcgtcctatg cgcaaccaga actacctgtt caaggctaac 2520
cctaactacg ctggtaactc catcaagcct accggtgctt cccgtaccgc tatcaccacc 2580
ctgtaa 2586
<210> 2
<211> 1941
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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gttgaattgg ttgacgaaca aggtgttaac ttggaattga ctttgatcac tttggacact 240
aacgaaaagt tcagagacat cactaagttc atcccagaaa acatctctac tgcttctgac 300
gctactttgg ttatcaacac tgaacacatg ccatctatgt tcgttccagt tggtgacgtt 360
gttcaatacg gtttcttgaa cttgtctggt aagccaactc acagaactat gatgtacaac 420
ttcccaacta aggctggtca atgtggtggt gttgttactt ctgttggtaa ggttgttggt 480
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<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctactggtc gcgacgcttt ccaatggcag accgctacta accct 45
<210> 5
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acccctacct tcggtgagca cctgcaggct aacgacctgg actacggtca gtgc 54
<210> 6
<211> 2589
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgggttcgc aagtgtctac acagcgctcc ggttctcacg aaaactcaaa ctcagccact 60
gagggttcta ccataaacta caccaccatt aattactaca aagactccta tgctgccaca 120
gcaggcaaac agagtctcaa gcaggatcca gacaagtttg caaatcctgt taaagacatt 180
ttcactgaaa tggcagcgcc actgaaatcc ccatccgctg aggcatgtgg gtacagtgat 240
cgagtggcgc aattaactat tggcaactcc accatcacca cgcaagaagc ggctaacatc 300
atagtcggtt atggtgagtg gccttcctac tgctcagatt ctgacgctac agcagtggat 360
aaaccaacgc gcccggatgt ttcagtgaac aggttttaca cattggacac caaattgtgg 420
gagaaatcgt ccaaggggtg gtactggaag ttcccggatg tgttaactga aactggggtt 480
tttgggcaaa atgcacaatt ccactacctc taccgatcag ggttctgcat ccacgtgcag 540
tgcaatgcca gtaaattcca ccaaggagca ctcctagtcg ctgtcctacc agagtatgtc 600
attgggacag tggcaggcgg tacagggacg gaagataccc acccccctta caagcagact 660
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acgggcacca tccagggaga tagggtggca gatgtaattg aaagttccat aggagatagc 1740
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tcacctgcga gtgcttatca atggttttat gacggatatc ccacattcgg agaacacaaa 2340
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggcaaaggtt tcaatgccgg 20

Claims (8)

1.一种肠道病毒71型病毒样颗粒，其特征在于，是由表达肠道病毒71型的P1衣壳蛋白基因和3CD蛋白酶基因的重组杆状病毒感染SF9昆虫细胞，培养至90%以上数量的所述SF9昆虫细胞感染病变后所得，所述表达肠道病毒71型的P1衣壳蛋白基因和3CD蛋白酶基因的重组杆状病毒的制备方法是：
将经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化的肠道病毒71型的P1衣壳蛋白基因EV-A71-P1CHI3和经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化的3CD蛋白酶基因，与昆虫杆状病毒的穿梭载体pOET5连接，得到重组质粒pOET5-EV-A71-P1CHI3-3CD；
然后将上述重组质粒pOET5-EV-A71-P1CHI3-3CD与昆虫杆状病毒基因组Flash-BAC DNA共转染SF9昆虫细胞，培养至90%以上数量的所述SF9昆虫细胞感染病变后，获得表达肠道病毒71型的P1衣壳蛋白基因和3CD蛋白酶基因的重组杆状病毒；
其中，所述经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化的肠道病毒71型的P1衣壳蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化的3CD蛋白酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种肠道病毒71型病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：构建重组质粒pOET5-EV-A71-P1CHI3-3CD
将第一个CV-A10的VP1线性中和表位、第二个CV-A10的VP1线性中和表位和CV-A16的VP1线性中和表位分别进行SF9昆虫细胞偏好密码子优化，然后，分别在野生型肠道病毒71型的P1衣壳蛋白基因的第1969至第2016位、第2179至第2223位和第2314至第2367位进行取代，得到经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化的肠道病毒71型的P1衣壳蛋白基因EV-A71-P1CHI3；
将3CD蛋白酶基因，进行SF9昆虫细胞偏好密码子优化；
将经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化的肠道病毒71型的P1衣壳蛋白基因EV-A71-P1CHI3和经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化后的3CD蛋白酶基因分别克隆到昆虫杆状病毒的穿梭载体pOET5的P10启动子之后的EcoRⅠ/NotⅠ酶切位点以及polh启动子之后的BamHⅠ/XhoⅠ酶切位点，构建重组质粒pOET5-EV-A71-P1CHI3-3CD；
其中，所述经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化后的第一个CV-A10的VP1线性中和表位的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化后的第二个CV-A10的VP1线性中和表位的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化后的CV-A16的VP1线性中和表位的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述野生型肠道病毒71型的P1衣壳蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述经过密码子优化的肠道病毒71型的P1衣壳蛋白基因EV-A71-P1CHI3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述经过SF9昆虫细胞偏好密码子优化的3CD蛋白酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
步骤2：构建重组杆状病毒rBV-EV-A71-P1CHI3-3CD
将步骤1得到的重组质粒pOET5-EV-A71-P1CHI3-3CD与昆虫杆状病毒基因组Flash-BACDNA共转染SF9昆虫细胞，将P1衣壳蛋白基因和3CD基因整合到昆虫杆状病毒基因组内，获得重组杆状病毒rBV-EV-A71-P1CHI3-3CD；
步骤3：制备和纯化病毒样颗粒
通过SF9昆虫细胞扩增步骤2得到的重组杆状病毒rBV-EV-A71-P1CHI3-3CD，再感染SF9昆虫细胞，培养至90%以上数量的所述SF9昆虫细胞感染病变后，收集上清液并对上清液进行纯化，即得到肠道病毒71型病毒样颗粒。
3.根据权利要求2所述的肠道病毒71型病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤3中，所述重组杆状病毒rBV-EV-A71-P1CHI3-3CD感染SF9昆虫细胞的感染复数MOI为3，所述SF9昆虫细胞密度为2×106/mL。
4.根据权利要求2所述的肠道病毒71型病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤3中，所述培养的温度为27℃，摇速为110转/min，时间为5d-6d。
5.根据权利要求2所述的肠道病毒71型病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤3中，所述纯化的具体方法是：
步骤3.1：上清液浓缩
将上清液与质量百分浓度为20%的PEG8000、0.6M的NaCl溶液等体积混合，4℃搅拌过夜，再8000转/min离心30min，弃掉上清液，留蛋白沉淀，使用PBS缓冲液重悬上述蛋白沉淀，得到病毒浓缩液；所述PBS缓冲液中含有KH2PO4 2mM、Na2HPO4 8mM、NaCl 136mM和KCl 2.6mM，pH值为7.2；
步骤3.2：蔗糖密度梯度超速离心
分别制备质量百分浓度为30%、45%及60%的蔗糖溶液，对步骤3.1得到的病毒浓缩液进行密度梯度超速离心，290,000转/min离心60min，收集位于30%与45%交界处，以及45%与60%交界处的乳白色物质，即为肠道病毒71型病毒样颗粒。
6.一种肠道病毒71型病毒样颗粒疫苗，其特征在于，由权利要求1所述的肠道病毒71型病毒样颗粒为活性成分或活性成分之一。
7.根据权利要求6所述的肠道病毒71型病毒样颗粒疫苗，其特征在于，所述肠道病毒71型病毒样颗粒疫苗的剂型为液体注射剂、注射粉剂和注射片剂中的任意一种或几种。
8.根据权利要求6所述的肠道病毒71型病毒样颗粒疫苗，其特征在于，所述肠道病毒71型病毒样颗粒疫苗还包括佐剂，所述佐剂选自油佐剂、水包油佐剂、油包水佐剂、水包油包水佐剂、铝盐和多糖类佐剂中的任意一种或几种。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024117783A1 (ko) * 2022-12-02 2024-06-06 충북대학교 산학협력단 외래 단백질 발현을 위한 재조합 벡터 및 이를 이용한 수족구 바이러스 유사입자 구조단백질의 생산 방법

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102154229A (zh) * 2010-12-13 2011-08-17 张定梅 一种ev71病毒样颗粒及以其制备的手足口病疫苗
CN103525855A (zh) * 2013-10-12 2014-01-22 上海博唯生物科技有限公司 一种制备重组肠道病毒ev71型病毒样颗粒的方法
CN105462937A (zh) * 2016-01-21 2016-04-06 武汉大学 一种肠道病毒嵌合病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用
CN107441484A (zh) * 2011-11-03 2017-12-08 森提耐斯特治疗公司 针对人肠道病毒的抗原及疫苗
WO2018067000A1 (en) * 2016-10-07 2018-04-12 Sentinext Therapeutics Sdn Bhd Expression cassettes and methods for obtaining enterovirus virus-like particles
CN112048004A (zh) * 2020-07-14 2020-12-08 桂林医学院 一种柯萨奇病毒b5型病毒样颗粒、其制备方法及应用
CN112480215A (zh) * 2020-12-04 2021-03-12 武汉生物制品研究所有限责任公司 一种柯萨奇病毒cv-a2的病毒样颗粒

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013142809A1 (en) * 2012-03-23 2013-09-26 Fred Hutchinson Cancer Research Center Baculovirus-based enterovirus 71 vlp as a vaccine
WO2018066999A2 (en) * 2016-10-07 2018-04-12 Sentinext Therapeutics Sdn Bhd Chimeric enterovirus virus-like particles
US11339387B2 (en) * 2018-05-22 2022-05-24 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of Homeland Security Modified foot-and-mouth disease virus 3C proteases and methods for processing FMDV P1 precursor polypeptide

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102154229A (zh) * 2010-12-13 2011-08-17 张定梅 一种ev71病毒样颗粒及以其制备的手足口病疫苗
CN107441484A (zh) * 2011-11-03 2017-12-08 森提耐斯特治疗公司 针对人肠道病毒的抗原及疫苗
CN103525855A (zh) * 2013-10-12 2014-01-22 上海博唯生物科技有限公司 一种制备重组肠道病毒ev71型病毒样颗粒的方法
CN105462937A (zh) * 2016-01-21 2016-04-06 武汉大学 一种肠道病毒嵌合病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用
WO2018067000A1 (en) * 2016-10-07 2018-04-12 Sentinext Therapeutics Sdn Bhd Expression cassettes and methods for obtaining enterovirus virus-like particles
CN112048004A (zh) * 2020-07-14 2020-12-08 桂林医学院 一种柯萨奇病毒b5型病毒样颗粒、其制备方法及应用
CN112480215A (zh) * 2020-12-04 2021-03-12 武汉生物制品研究所有限责任公司 一种柯萨奇病毒cv-a2的病毒样颗粒

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EV-A71感染导致的重症手足口病的机制及防控研究进展;李洁;张勇;许文波;;病毒学报(第02期);全文 *
Transcriptome analysis following EV-A71 and CV-A16 infection in respiratory epithelial cells;Jie Song et al;Medicine;20200113;全文 *
Virus-like particle-based vaccine against coxsackievirus A6 protects mice against lethal infections;Chaoyun Shen et al;Vaccine;第34卷(第34期);全文 *
Ziyan Wang et al.Preclinical evaluation of recombinant HFMD vaccine based on enterovirus 71 virus-like particles: Immunogenicity,efficacy and toxicology .Vaccine.2021,第39卷(第31期),全文. *
崔天国.全科医师手册.河南科学技术出版社,2021,(第8版),543-546. *
手足口病多价疫苗研究进展;孙一晟;朱函坪;杨章女;徐芳;卢杭景;姚苹苹;;中国公共卫生;20180212(第02期);全文 *
手足口病病毒样颗粒疫苗的研究进展;章宁;刘洪波;;华夏医学(第06期);全文 *
柯萨奇病毒A5病毒样颗粒的制备、纯化和鉴定;禹玉婷;靳卫平;罗志宇;卢佳;王泽鋆;孟胜利;申硕;;微生物学免疫学进展(第03期);全文 *

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