CN108333346B - dsDNA免疫磁性微球体系、其制备方法和应用以及保存液 - Google Patents
dsDNA免疫磁性微球体系、其制备方法和应用以及保存液 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108333346B CN108333346B CN201710040242.7A CN201710040242A CN108333346B CN 108333346 B CN108333346 B CN 108333346B CN 201710040242 A CN201710040242 A CN 201710040242A CN 108333346 B CN108333346 B CN 108333346B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dsdna
- magnetic
- immunomagnetic
- amino
- microsphere
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54326—Magnetic particles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54346—Nanoparticles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2446/00—Magnetic particle immunoreagent carriers
- G01N2446/80—Magnetic particle immunoreagent carriers characterised by the agent used to coat the magnetic particles, e.g. lipids
- G01N2446/90—Magnetic particle immunoreagent carriers characterised by the agent used to coat the magnetic particles, e.g. lipids characterised by small molecule linker used to couple immunoreagents to magnetic particles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
- G01N2800/101—Diffuse connective tissue disease, e.g. Sjögren, Wegener's granulomatosis
- G01N2800/104—Lupus erythematosus [SLE]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种dsDNA免疫磁性微球体系及其制备方法和保存液、抗dsDNA抗体检测试剂和试剂盒以及***。本发明dsDNA免疫磁性微球体系包括磁性微球本体和含氨基聚合物基团以及dsDNA抗原,所述含氨基聚合物基团修饰所述磁性微球本体,所述dsDNA抗原与所述含氨基聚合物基团偶联。保存液用于dsDNA免疫磁性微球体系的保存。抗dsDNA抗体检测试剂和试剂盒以及***包括dsDNA免疫磁性微球体系。本发明dsDNA免疫磁性微球体系结构稳定,dsDNA抗原的包被量高,空间位阻效应低,与抗体的结合效率和结合量高,提高了抗体检测灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于医疗试剂技术领域,具体涉及一种抗dsDNA抗体检测试剂及其制备方法、抗dsDNA抗体检测试剂盒、抗dsDNA抗体检测***和他们的应用。
背景技术
***性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus/SLE)是一种累及多器官、多***的小血管及***的***性自身免疫性疾病。在欧洲,SLE每年的新增发病率约为25/10万,而北美地区发病率更高。SLE易发于年轻女性,病程中往往复发与缓解交替出现。患者体内可产生针对核酸、核蛋白和组蛋白的抗核抗体及其他自身抗体,这些自身抗体与相应抗原结合形成免疫复合物,可沉积在心血管***、肾小球基底膜、浆膜、关节滑膜和多种脏器小血管壁上,免疫复合物在局部激活补体,吸引中性粒细胞浸润,造成局部组织的慢性炎性损伤。故SLE患者常患有多***、多器官的损害。根据损害的器官不同,患者可出现发热、皮疹、关节痛、肾损害,心血管病变、浆膜炎、贫血、精神症状等多种临床表现。美国风湿协会与1997年修订了关于SLE诊断的11项ARA标准(ARA,美国风湿病协会)。该11项标准分别为:1.蝶形红斑;2.身体其他部位出现红色、鳞屑状、局限的、***的皮肤疹;3.光敏现象;4.口腔粘膜疼痛或溃疡;5.关节疼痛或关节渗出;6.浆膜炎;7.肾脏疾病;8.神经***疾病;9.血液***症状如伴网状细胞增多、白细胞减少、淋巴细胞减少的出血性贫血;10.免疫学方法检出抗dsDNA抗体、Sm抗体、抗心磷脂抗体;11.间接免疫荧光法检出ANA。若11项标准中出现4项,诊断SLE的可能性超过80%。
抗dsDNA抗体是SLE患者的特征性标志抗体,该抗体阳性为SLE的重要诊断标准之一。抗dsDNA抗体效价与疾病的活动程度有相关性,抗体效价的动态测定为监控治疗提供了有效的实验室手段。抗dsDNA抗体在SLE的发病机制中起重要作用,SLE并发的狼疮性肾炎是由该抗体介导的免疫复合物,抗dsDNA抗体可形成多种冷沉淀而致血管炎,SLE肾炎及典型的蝶形红斑均与该抗体有关。
抗dsDNA抗体与细胞核的反应位点主要位于DNA(***区)脱氧核糖核苷酸框架上,抗dsDNA抗体诊断SLE的特异性高达95%以上。目前临床上检测抗dsDNA抗体常用的方法主要有间接免疫荧光法、酶联免疫吸附法、放射免疫分析法和化学发光法。其中,最为特异性和敏感性的方法是应用马疫锥虫或绿蝇短膜虫作为抗原进行间接免疫荧光检测。由于该类虫体的动基体由纯净的环状DNA构成,除此之外基本不含有其他细胞核抗原,能与动基体起反应的自身抗体只有抗dsDNA抗体,因而具有高度特异性。但该方法无法实现定量检测且操作繁琐复杂,需要配备昂贵的荧光显微镜,无法在基层医院推广。放射免疫分析法由于示踪物存在放射性,对环境和操作人员均存在污染风险。酶联免疫吸附法需要人工操作,耗时耗力,且准确度和精密度较差,难以获得可靠的结果。
在上述现有的检测方法存在缺陷的基础上,化学发光分析法具有灵敏度高,线性范围宽,特异性好,仪器设备操作简单等优点,已成功应用于生命科学、食品科学、临床医学以及环境检测等领域,成为现代分析领域中一种有效的微量及痕量分析技术。然而,化学发光免疫分析法为均相反应体系,dsDNA抗原包被磁球并悬浮于均相体系中,dsDNA抗原易受到交联工艺以及体系环境等诸多因素造成不稳定情况,严重影响试验结果的判断,从而限制该项目在化学发光免疫分析方法上的应用。
例如目前公开的一种以金磁微粒为载体,运用间接ELISA法、免疫荧光法或化学发光法检测抗双链DNA抗体的方法。该方法包括以下步骤:(1)将金磁微粒与双链DNA相混合,在一定条件下双链DNA固定在金磁微粒表面或运用金磁微粒从人全血、唾液、***或质粒中提取DNA并固定在金磁微粒表面;(2)运用间接ELISA法、免疫荧光法或化学发光法检测待测样品中存在的抗双链DNA抗体。其中该现有技术采用物理吸附的方法将双链DNA固定在金磁微粒表面。但在临床使用过程中发现,该方法中双链DNA固定金磁微粒表方式为物理吸附,即通过磁性微球表面与dsDNA抗原之间的静电力相结合,然而,dsDNA分子在均相体系中易受到酶等诸多不确定因素的影响而被破坏,因此通过物理吸附固定dsDNA的磁性微球的稳定性难以保障,固定后的产物在存储和运输过程中易脱落,对试剂灵敏度和稳定性造成影响。
在当前公开的另一相关现有技术中,其涉及以酶标板为固相载体,运用化学发光法检测抗双链DNA抗体的方法。该方法包括以下步骤:(1)将人工合成的双链DNA固定在固相载体的表面;(2)运用化学发光法检测待测样品中存在的抗双链DNA抗体。但是该方法依然是将dsDNA抗原通过物理吸附的方式固定在酶标板上,即通过磁性微球表面与dsDNA抗原之间的静电力相结合,但是由于酶标板固定dsDNA抗原的载量有限,在免疫学反应进行过程中,酶标板上固定的dsDNA抗原与样本中的目标抗体反应接触面积有限,易造成空间位阻,因此反应结合效率(抗原包被载体的结合效率、包被抗原与待测抗体反应结合的效率)会受到限制。
在现有相关技术中,由于磁球表面的功能基团数量有限,能有效结合dsDNA抗原的数量也同样有限,同时由于dsDNA抗原与磁球的刚性界面直接接触,会对抗原的活性造成一定的影响,且容易掩盖活性位点,导致在检测过程中无法有效结合待测抗体,因此反应结合效率(包被抗原与待测抗体反应结合的效率)会受到限制。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的上述不足,提供一种dsDNA免疫磁性微球体系及其制备方法,以克服现有将dsDNA抗原采用物理吸附即依靠静电力相结合在磁性微球上,而导致的dsDNA结合不稳定和存在空间位阻等不良现象的技术问题。
本发明的另一目的在于提供一种dsDNA免疫磁性微球保存液,以解决本申请dsDNA免疫磁性微球采用现有保存液保存不稳定的技术问题。
本发明的又一目的在于提供一种抗dsDNA抗体检测试剂、试剂盒和检测***,以解决现有相关制剂用于检测抗dsDNA抗体准确性不高的技术问题。
为了实现上述发明目的,本发明的一方面,提供了一种dsDNA免疫磁性微球体系。所述dsDNA免疫磁性微球体系包括磁性微球本体,还包括含氨基聚合物基团和dsDNA抗原,且所述含氨基聚合物基团修饰所述磁性微球本体,所述dsDNA抗原与所述含氨基聚合物基团化学键连接。
本发明的另一方面,提供了一种dsDNA免疫磁性微球体系的制备方法。所述制备方法包括如下步骤:
将经活化处理的磁性微球与氨基聚合物进行反应,然后将反应产物与封闭剂进行处理,获得含氨基聚合物基团修饰的磁性微球;
将所述含氨基聚合物基团修饰的磁性微球与dsDNA抗原在活化剂作用下进行反应。
本发明的又一方面,提供了一种dsDNA免疫磁性微球保存液。所述dsDNA免疫磁性微球保存液包含如下组分:
本发明的又一方面,提供了一种抗dsDNA抗体检测试剂。所述抗dsDNA抗体检测试剂包括dsDNA免疫磁性微球和所述dsDNA免疫磁性微球的保存液,所述dsDNA免疫磁性微球分散于所述保存液中;且所述dsDNA免疫磁性微球为本发明dsDNA免疫磁性微球或由本发明制备方法制备的dsDNA免疫磁性微球,所述保存液为本发明dsDNA免疫磁性微球保存液。
本发明的又一方面,提供了一种抗dsDNA抗体检测试剂盒。所述抗dsDNA抗体检测试剂盒包括本发明抗dsDNA抗体检测试剂。
本发明的又一方面,提供了一种抗dsDNA抗体检测***。所述抗dsDNA抗体检测***包括:
本发明抗dsDNA抗体检测试剂或本发明抗dsDNA抗体检测试剂盒;
磁分离模块,与所述dsDNA免疫磁性微球配合,用于自液体中分离磁性微球;
检测模块,与所述磁分离模块分离的磁性微球和发光底物配合,用于完成对抗dsDNA抗体的检测;
数据处理模块,用于计算所述抗dsDNA抗体的含量。
本发明的又一方面,提供了本发明dsDNA免疫磁性微球体系、本发明抗dsDNA抗体检测试剂、本发明抗dsDNA抗体检测试剂盒、本发明抗dsDNA抗体检测***任一种在分离检测抗dsDNA抗体中的应用。
与现有技术相比,本发明dsDNA免疫磁性微球体系通过含氨基聚合物基团偶联dsDNA抗原,这样,一方面实现了dsDNA抗原与磁性微球的化学键连接,有效提高了dsDNA抗原包被的稳定性;另一方面,由于含氨基聚合物基团的特性和dsDNA抗原通过化学键如偶联连接在含氨基聚合物基团这一结构,有效提高了dsDNA抗原的包被量,且降低了空间位阻效应,增强了本发明dsDNA免疫磁性微球体系在待测样本中结合目的抗体的结合效率和结合量,从而提高了检测灵敏度。
本发明dsDNA免疫磁性微球体系制备方法先采用含氨基聚合物修饰磁性微球,然后偶联dsDNA抗原,使得dsDNA抗原偶联在含氨基聚合物基团上,使得制备的dsDNA免疫磁性微球体系不仅结构稳定,而且空间位阻效应有效降低,保证了抗原的活性。另外,本发明制备方法工艺条件易控,有效保证了产物dsDNA免疫磁性微球体系的性能稳定。
本发明dsDNA免疫磁性微球保存液能够有效保护本发明dsDNA免疫磁性微球体系在均相体系中不被降解或破坏,从而提高了本发明dsDNA免疫磁性微球体系的稳定性。
本发明抗dsDNA抗体检测试剂、抗dsDNA抗体检测试剂盒和抗dsDNA抗体检测***以及其应用由于是以本发明dsDNA免疫磁性微球体系和保存液为基础,因此,有效保证了该抗dsDNA抗体检测试剂、抗dsDNA抗体检测试剂盒和抗dsDNA抗体检测***中相应试剂的稳定性和提高与目的抗体的结合效率,从而提高了检测灵敏度度和准确性。
附图说明
图1是本发明实施例dsDNA免疫磁性微球体系结构示意图;
图2是本发明实施例dsDNA免疫磁性微球体系制备方法流程图;
图3是本发明实施例抗dsDNA抗体检测方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白,以下结合实施例与附图,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
缩略语解释:
抗双链DNA抗体(Anti dsDNA)、脱氧核糖核苷酸DNA(Deoxyribose NucleicAcid)、***性红斑狼疮SLE(systemic lupus erythematosus)、DCC(二环己基碳二亚胺)、EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、CDC(N,N'-二异丙基碳二亚胺)、DMF(N,N-二甲基甲酰胺)、PEI(聚乙烯亚胺)、PA(聚酰胺)、PAM(聚丙烯酰胺)、PDI(聚邻苯二胺),Isoluminol(异鲁米诺)、ABEI(N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺)、AHEI(N-(6-氨基已基)-N-乙基异鲁米诺)、ITCI(异硫氰酸异鲁米诺)、ITCBEI(N-(4-异硫氰基丁基)-N-乙基异鲁米诺)。
一方面,本发明实施例提供了一种结构稳定,且空间位阻效应低的dsDNA免疫磁性微球体系。所述dsDNA免疫磁性微球体系的结构如图1所示,其包括如下部分:
磁性微球本体(下文统称简称磁性微球)1、含氨基聚合物基团2、dsDNA抗原3,且含氨基聚合物基团2与磁性微球1连接,起到修饰磁性微球1的作用,同时含氨基聚合物基团通过化学键连接dsDNA抗原3,形成磁性微球1-含氨基聚合物基团2-dsDNA抗原3结构。其中,磁性微球1与dsDNA抗原3并不直接连接,而是通过含氨基聚合物基团2的桥梁作用实现间接连接为一体。
其中,上述磁性微球1作为含氨基聚合物基团2、dsDNA抗原3的载体。在一实施例中,上述dsDNA免疫磁性微球体系所含的磁性微球1与含氨基聚合物基团2的质量比为1:(1-10)。控制磁性微球1表面连接的含氨基聚合物基团2的量,就间接控制dsDNA抗原3的量,从而提高dsDNA免疫磁性微球体系捕获抗dsDNA抗体的量。因此,在另一实施例中,上述dsDNA免疫磁性微球体系中含氨基聚合物基团2与dsDNA抗原3质量比为(50-2000):1。
在上述各实施例的基础上,上述磁性微球1可以选用本领域常用的磁性微球,具体的可以选用纳米磁性微球。只要是能够适用于本发明实施例技术方案的本领域所有的磁性微球均在本发明公开的范围。
在一实施例中,该磁性微球1为表面被活化处理的磁性微球。磁性微球表面活化处理可以按照下文dsDNA免疫磁性微球体系制备方法中磁性微球活化方法进行活化处理。
上述含氨基聚合物基团2有效连接磁性微球1和dsDNA抗原3,实现dsDNA抗原3与磁性微球1之间的化学键连接,从而有效提高了dsDNA抗原3包被的稳定性,也即是提高了上述dsDNA免疫磁性微球体系的结构稳定;而且通过含氨基聚合物基团2实现dsDNA抗原3与磁性微球1之间的化学键连接,且基于含氨基聚合物基团2本身特性,有效避免了空间位阻效应的产生或者有效降低了空间位阻效应,提高了dsDNA抗原3的包被量,而且保证了抗原的活性。
在一实施例中,该含氨基聚合物基团2与dsDNA抗原3是偶联连接,如在具体实施例中,含氨基聚合物基团2是通过磷酸氨基酯键连接所述dsDNA抗原3的,以实现dsDNA抗原3包被的稳定性。
在另一实施例中,提供所述含氨基聚合物基团2为由聚乙烯亚胺、聚酰胺、聚丙烯酰胺、聚邻苯二胺中的任一种氨基聚合物提供。该化合物提供的含氨基聚合物基团2能够有效偶联dsDNA抗原3,并提高dsDNA抗原3包被的稳定和提高dsDNA抗原3包被的量,同时降低或者避免空间位阻效应。
上述dsDNA抗原3能够与SLE患者的特征性标志抗体具体是抗dsDNA抗体特异结合。
因此,上述dsDNA免疫磁性微球体系实现了dsDNA抗原3与磁性微球1的化学键连接,有效提高了dsDNA抗原3包被的稳定性;另外由于含氨基聚合物基团2的特性和dsDNA抗原3通过化学键连接在含氨基聚合物基团2这一结构,有效提高了dsDNA抗原3的包被载量,且降低了空间位阻效应,增强了上述dsDNA免疫磁性微球体系在待测样本中结合目的抗体的结合效率和结合量,从而提高了检测灵敏度。
相应地,本发明实施例还提供了一种关于上文所述dsDNA免疫磁性微球体系的制备方法。该制备方法流程如图2所示,同时请参见图1,包括如下步骤:
S01.制备含氨基聚合物基团修饰的磁性微球:将经活化处理的磁性微球1与氨基聚合物进行反应,然后将反应产物与封闭剂进行处理,获得含氨基聚合物基团2修饰的磁性微球1;
S02.将含氨基聚合物基团修饰的磁性微球与dsDNA抗原反应:将所述含氨基聚合物基团2修饰的磁性微球1与dsDNA抗原3在活化剂存在条件下进行反应。
具体地,上述步骤S01中,用于活化处理磁性微球1的活化剂包括但不限于N,N'-二异丙基碳二亚胺(CDC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、二环己基碳二亚胺(DCC)中的任一种,当然,如果添加比例适当,可以是该些种类的活化剂中两种以上的混合物,也即是按照上述步骤,同时使用两种以上的活化剂也是本发明实施例公开的范围。活化磁性微球1的方法可以但不仅仅按照下文实施例1中活化方法。该磁性微球1如上文dsDNA免疫磁性微球体系中磁性微球1,为了节约篇幅,在此不再赘述。
一实施例中,该步骤S01的在磁性微球1的活化处理过程中,磁性微球1与活化剂的工作比例为(2-4):1(w/w);用于重悬磁性微球1的重悬液包括但不限于水、乙醇、N,N-二甲基甲酰胺(DMF);活化处理水浴反应的温度可以为37℃-40℃;反应时间为1h-4h。通过将该活化处理条件优化控制在该些范围,以提高磁性微球1活化效果。
该步骤S01中,经活化处理的磁性微球1与氨基聚合物进行反应后,该氨基聚合物与磁性微球1在被活化处理过程中所形成的基团反应,使得氨基聚合物以氨基聚合物基团通过化学键连接在磁性微球1的表面上。具体地,磁性微球1与氨基聚合物进行的化学反应如下述化学反应所示:
在该经活化处理的磁性微球1与氨基聚合物反应体系中,所述氨基聚合物的含量相对磁性微球1的含量足量,以使得磁性微球1表面结合足量的含氨基聚合物基团2。如在一实施例中,所述磁性微球与所述氨基聚合物的质量比为1:(1-10),控制两者的反应量在该比例范围,一方面使得在磁性微球1表面结合足量的含氨基聚合物基团,另一方面提高两者反应效率,并降低氨基聚合物浪费,节约成本。在另一实施例中,氨基聚合物可以但不限于选用聚乙烯亚胺(PEI)、聚酰胺(PA)、聚丙烯酰胺(PAM)、聚邻苯二胺(PDI)中的任一种或两种以上的混合物。该些氨基聚合物含有丰富的氨基基团,以提高偶联dsDNA抗原3的包被量。另外,被活化处理后的磁性微球1的工作浓度控制但不仅仅为10mg/mL–20mg/mL,两者反应的温度为优选控制25℃-30℃,反应时间应该是充分的,如2h-6h。
在将磁性微球1与氨基聚合物的反应产物与封闭剂进行反应之前,优选的将反应产物进行磁分离,洗涤,以提高封闭剂的作用效果。
采用封闭剂与该反应产物进行处理,是将磁球上未与氨基聚合物反应的位点基团进行结合,防止未与氨基聚合物反应的位点基团对后续反应造成干扰。当然,封闭剂与该反应产物的结合可能是物理结合也可能是化学结合,
在该反应产物与封闭剂的反应体系中,所述封闭剂的含量相对磁性微球1与氨基聚合物反应产物的含量足量,以使得反应产物充分被封闭剂反应。如在一实施例中,反应产物与所述封闭剂的质量控制在磁性微球1与所述封闭剂的质量比为(1-50):1。另一实施例中,该封闭剂选用但不限于酪蛋白、BSA、明胶中的至少一种。该封闭剂的工作浓度控制但不仅仅为10mg/mL,反应时间应该是充分的,如1h-4h。
上述步骤S02中,在活化剂的作用下,在步骤S01中获得的含氨基聚合物基团修饰的磁性微球与dsDNA抗原产生偶联反应生成磷酸氨基酯键,从而实现dsDNA抗原通过含氨基聚合物基团连接在磁性微球1上。具体地,含氨基聚合物基团修饰的磁性微球dsDNA抗原之间的化学反应式如下:
上述步骤S02的活化处理过程中,该活化剂相对于该含氨基聚合物基团修饰的磁性微球的量足量,如该含氨基聚合物基团修饰的磁性微球与该活化剂的质量比为(2-4):1。另一实施例中,活化处理的反应的温度为37℃-40℃;反应时间应该是充分的,如为1h-4h。在另一实施例中,所述活化剂选用N,N'-二异丙基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、二环己基碳二亚胺中的任一种或两种以上的混合物。另外,本步骤S02中的活化剂与步骤S01中的活化剂可以相同也可以不相同。用于重悬含氨基聚合物基团修饰的磁性微球的重悬液包括但不限于水、乙醇、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的至少一种。
在含氨基聚合物基团修饰的磁性微球与dsDNA抗原的反应体系中,dsDNA抗原的含量是足量的,如在一实施例中,所述含氨基聚合物基团修饰的磁性微球与所述dsDNA抗原的质量比为(50-200):1。而且两者的反应可以在室温下直接进行,如在25℃下反应,反应时间应该是充分的,如1h-4h。
待充分反应后,对反应物进行分离得到目标产物。如采用磁分离,获得反应产物,即是如图1所示的dsDNA免疫磁性微球体系。磁分离应该对反应产物洗涤处理。
上述dsDNA免疫磁性微球体系的制备方法制备的dsDNA免疫磁性微球体系中,含氨基聚合物基团2与磁性微球1连接,起到修饰磁性微球1的作用,同时含氨基聚合物基团通过化学键连接dsDNA抗原3,使得制备的dsDNA抗原3-含氨基聚合物基团2-磁性微球1结构的dsDNA免疫磁性微球体系结构稳定,而且空间位阻效应有效降低,保证了抗原的活性,提高了dsDNA抗原3的活性。另外,所示制备方法工艺条件易控,有效保证了产物dsDNA免疫磁性微球体系的性能稳定。
另一方面,本发明实施例提供了一种dsDNA免疫磁性微球保存液。所述dsDNA免疫磁性微球保存液包含如下组分:
具体地,上述dsDNA免疫磁性微球保存液所含的稀释液选用但不仅仅限于磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、碳酸盐缓冲液中的至少一种。其不仅起到溶剂载体的作用,还能够有效起到缓冲剂的作用,起到抵消、减轻外加强酸或强碱对溶液酸碱度的影响,从而保持溶液的pH值相对稳定。如在一实施例中,通过该稀释剂组分的作用,使得上述dsDNA免疫磁性微球保存液的pH值为7-9。
上述dsDNA免疫磁性微球保存液所含的DNA酶抑制剂选用但不仅仅限于胰脱氧核酸酶(DNaseⅠ)、DNA拓扑异构酶抑制剂、偏端霉素A中的至少一种。选用该些DNA酶抑制剂能够有效抑制脱氧核糖核酸酶的活性,防止上文dsDNA免疫磁性微球体系所含的dsDNA抗原被脱氧核糖核酸酶降解,从而保证了上文dsDNA免疫磁性微球体系的生物活性和稳定性能。
上述dsDNA免疫磁性微球保存液所含的金属螯合剂选用但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二胺四乙酸四钠(EDTA-4Na)、乙二胺四乙酸二钾(EDTA-2K)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)中的至少一种。该螯合剂能够有效螯合Mg2+、Ca2+等金属离子,抑制脱氧核糖核酸酶对dsDNA的降解作用;因此,该金属螯合剂与DNA酶抑制剂发挥协效作用,抑制脱氧核糖核酸酶对dsDNA的降解,保证了上文dsDNA免疫磁性微球体系的生物活性和稳定性能。
上述dsDNA免疫磁性微球保存液所含的多聚物保护剂选用但不限于海藻糖、蔗糖、果糖、乳糖中的至少一种。该选用的多聚物保护剂能够提供较多的羟基,可与上文所述的dsDNA免疫磁性微球体系吸附结合形成氢键,使dsDNA免疫磁性微球体系表面形成一层具有保护作用的水化层,以提高其保存的稳定性。
上述dsDNA免疫磁性微球保存液所含的表面活性剂选用但不限于聚乙二醇、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯-20、辛基苯基聚氧乙烯醚中的至少一种。该选用的表面活性剂能够有效降低上文所述的dsDNA免疫磁性微球体系之间的表面张力,提高上文所述的dsDNA免疫磁性微球体系在均相体系内的分散性。
上述dsDNA免疫磁性微球保存液所含的位点封闭剂选用但不限于牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、明胶中的至少一种。该选用的位点封闭剂能够有效封闭磁球上未与dsDNA结合的活性基团,避免了这些活性基团干扰所含的dsDNA抗原与待测抗体特异结合,从而提高上文dsDNA免疫磁性微球体系用于检测待测抗dsDNA抗体的准确性,同时提高上文dsDNA免疫磁性微球体系结构的稳定性。
上述dsDNA免疫磁性微球保存液所含的生物防腐剂选用但不限于异噻唑啉酮、ε-多聚赖氨酸、叠氮钠、硫柳汞、庆大霉素中的至少一种。选用的生物防腐剂能够抑制微生物的酶活力或对微生物的细胞遗传结构产生影响,从而抑制或杀灭如细菌等微生物,以提高上文dsDNA免疫磁性微球体系免受微生物干扰,提高其保存的稳定性,特别是生物活性的稳定性。
另外,上述dsDNA免疫磁性微球保存液的制备方法可以是将各组分制剂进行混合均匀即可。
因此,上述dsDNA免疫磁性微球保存液是针对上文所述的dsDNA免疫磁性微球体系的特性而研发,因此,其用于上文所述的dsDNA免疫磁性微球体系的保存,使得上文所述的dsDNA免疫磁性微球体系能够稳定分散在其中,并提高上文所述的dsDNA免疫磁性微球体系的结构稳定性、生物活性和分散性。当然,如果不考虑保存的最佳效果,上述dsDNA免疫磁性微球保存液还可以用于其他免疫磁性微球的保存。
在上述dsDNA免疫磁性微球体系及其制备方法和其保存液的基础上,本发明实施例提供了一种抗dsDNA抗体检测试剂。所述抗dsDNA抗体检测试剂包括上文所述的dsDNA免疫磁性微球体系和上文所述的dsDNA免疫磁性微球保存液。其中,所述dsDNA免疫磁性微球体系分散于所述dsDNA免疫磁性微球保存液中。这样,基于上文对dsDNA免疫磁性微球体系和dsDNA免疫磁性微球保存液的阐述,本实施例抗dsDNA抗体检测试剂能够有效提高上文所述的dsDNA免疫磁性微球体系的结构稳定性、生物活性和分散性。
在一实施例中,在抗dsDNA抗体检测试剂中,控制所含的dsDNA免疫磁性微球体系的工作浓度为0.5mg/mL-2.0mg/mL,以提高其分散稳定性,并能最佳的发挥上述dsDNA免疫磁性微球保存液的作用,提高dsDNA免疫磁性微球体系的结构稳定性和生物活性。
又一方面,本发明实施例提供了一种抗dsDNA抗体检测试剂盒。所述抗dsDNA抗体检测试剂盒包括的试剂有:上文所述的抗dsDNA抗体检测试剂。
一实施例中,如上文所述,试剂盒所含的抗dsDNA抗体检测试剂中,上文dsDNA免疫磁性微球体系的工作浓度为0.5mg/mL-2.0mg/mL。
为了方便该抗dsDNA抗体检测试剂盒使用,提高抗dsDNA抗体检测的效率和准确性。在一实施例中,该抗dsDNA抗体检测试剂盒还包括校准样品、示踪标记物标记的抗人IgG抗体、缓冲液中的至少一种。
其中,上述试剂盒所含的校准样品可以是Anti dsDNA企业校准品,如包括浓度为8.750IU/mL-16.250IU/mL的低浓度校准品和浓度为350.000IU/mL-520.000IU/mL高浓度校准品。
上述试剂盒所含的示踪标记物标记的抗人IgG抗体的示踪标记物包括但不限于金刚烷、鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯、碱性磷酸酶和辣根过氧化物中的至少一种,优选N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺。在具体实施例中,示踪标记物工作浓度:5ng/mL-500ng/mL,抗人IgG抗体的工作浓度:50ng/mL-5000ng/mL。一实施例中,该抗人IgG抗体可以是鼠抗人IgG、兔抗人IgG、羊抗人IgG等中的任一种。
上述试剂盒所含的缓冲液选用但不限于碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液中的至少一种。
另外,为了进一步配合上述试剂盒的使用,在上述试剂盒所配置的试剂基础上,还可以配置发光底物等试剂,以免在检查时需要临时配置。该发光底物可以是针对示踪标记物的常规发光底物,在具体实施例中,该发光底物可以但不限于氢氧化钠和过氧化氢。
因此,基于上文所述的本发明实施例抗dsDNA抗体检测试剂和抗dsDNA抗体检测试剂盒,抗dsDNA抗体分离检测方法如图3所示,包括如下步骤:
S03.利用dsDNA免疫磁性微球体系捕获抗dsDNA抗体:将待测样本与上文所述的本发明实施例抗dsDNA抗体检测试剂进行温育处理,后进行磁分离,获得捕获有待测样本抗dsDNA抗体的dsDNA免疫磁性微球体系;
S04.将示踪标记物标记的抗人IgG抗体与捕获有抗dsDNA抗体的dsDNA免疫磁性微球体系进行免疫反应:捕获有待测样本抗dsDNA抗体的所述dsDNA免疫磁性微球体系与示踪标记物标记的抗人IgG抗体进行温育处理,后进行磁分离,获得示踪标记物的dsDNA免疫磁性微球体系;
S05.检测发光信号,计算抗dsDNA抗体浓度:向所述示踪标记物的dsDNA免疫磁性微球体系中加入发光底物,获得发光信号,并检测所述发光信号强度和计算所述待测样本中的抗dsDNA抗浓度。
其中,上述步骤S04-S05中各试剂的均如上文抗dsDNA抗体检测试剂盒中所述。
因此,该抗dsDNA抗体检测方法以上文所述的本发明实施例抗dsDNA抗体检测试剂和抗dsDNA抗体检测试剂盒为基础,实现准确且定量对样品中抗dsDNA抗体的检测,且其灵敏度高。另外,该抗dsDNA抗体检测方法包括采用上文抗dsDNA抗体检测试剂或抗dsDNA抗体检测试剂盒对校准品进行检测,从而与待测样品检测结果对照,定量得出待测样品中抗dsDNA抗体的含量。
相应地,基于上述抗dsDNA抗体检测试剂和抗dsDNA抗体检测试剂盒以及抗dsDNA抗体检测方法,本发明实施例提供了一种抗dsDNA抗体检测***。所述抗dsDNA抗体检测***包括:
上文所述的本发明实施例抗dsDNA抗体检测试剂或上文所述的本发明实施例抗dsDNA抗体检测试剂盒、磁分离模块、检测模块和数据处理模块。
其中,磁分离模块,与上文所述的本发明实施例抗dsDNA抗体检测试剂或上文所述的本发明实施例抗dsDNA抗体检测试剂盒所含的dsDNA免疫磁性微球体系和示踪标记物标记的抗人IgG抗体配合,用于自液体中分离磁性微球,完成对抗dsDNA抗体的分离;具体的是dsDNA免疫磁性微球体系与待测样本混合反应后,采用磁分离模块对磁性微球进行分离,然后将分离的磁性微球再与示踪标记物标记的抗人IgG抗体混合进行反应,再次采用磁分离模块对磁性微球进行分离。
检测模块,与磁分离模块分离的磁性微球和发光底物配合,用于完成对抗dsDNA抗体的检测;具体的,该检测模块是将磁分离模块分离的磁性微球在发光底物的作用下获得光信号。
数据处理模块,用于计算抗dsDNA抗体的含量,可以显示抗dsDNA抗体的含量数据。具体是对检测模块中光信号进行数据处理,计算出抗dsDNA抗体的含量。因此,一实施例中数据处理模块还可以包括光信号读取装置。
另外,上述抗dsDNA抗体检测***还可以包括取样模块,用于取样至上述磁分离模块中。
由上述可知,上文所述的本发明实施例抗dsDNA抗体检测剂、抗dsDNA抗体检测试剂盒和抗dsDNA抗体检测***由于是以上文本发明实施例dsDNA免疫磁性微球体系为基础,并将其先捕获和分离待测样本中的抗dsDNA抗体,形成免疫复合物,然后将免疫复合物再与示踪标记物标记的抗人IgG抗体再次反应形成免疫复合物,后用发光底物激发示踪标记物进行发光。这样,由于本发明dsDNA免疫磁性微球体系具有上文所述的结构稳定,空间位阻小,dsDNA抗原活性高,因此,其能够与待测样本中的抗dsDNA抗体充分特异结合,提高了检测结果的灵敏度和准确性。
现结合具体实例,对本发明实施例dsDNA免疫磁性微球体系及其制备方法和抗dsDNA抗体检测试剂、抗dsDNA抗体检测试剂盒、抗dsDNA抗体检测方法进行进一步详细说明。下述各实施例所用到的材料来源如下:
磁性微球:新产业生物医学工程股份有限公司生产
聚乙烯亚胺:SIGMA公司,
聚酰胺:SIGMA公司,
ABEI:新产业生物医学工程股份有限公司生产
双链DNA抗原:Meridian公司,
双链DNA抗体:新产业生物医学工程股份有限公司生产
双链DNA抗体WHO国际标准品:NIBSC,WHO Wo/80
dsDNA免疫磁性微球体系及其制备方法实施例
实施例11
本实施例提供了一种dsDNA免疫磁性微球体系及其制备方法。其中,dsDNA免疫磁性微球体系结构如图1所述,其包括纳米磁性微球1、聚乙烯亚胺基团2和dsDNA抗原形成的纳米磁性微球1-聚乙烯亚胺基团2-dsDNA抗原3。
dsDNA免疫磁性微球体系制备方法包括如下步骤:
S11.氨基聚合物功能化磁性微球的制备:
1)取一定量的磁球,按每毫克磁球加入0.5mg的DCC,然后加入DMF溶液使磁球的浓度为20mg/mL,置于在38℃水浴锅中并振摇或者机械搅拌2小时;
2)活化好的纳米磁球溶液去除上清液,然后加入pH 9.5的碳酸盐缓冲液,使其浓度达到20mg/mL(以纳米磁球计);以每毫克磁球添加10毫克聚乙烯亚胺水溶液,超声10min,在室温下旋转混匀反应4h,磁分离后弃去上清;用0.01mol/L pH 7.5的PBS缓冲液洗涤3次,每次3min;用10mg/mL的BSA封闭反应2h;用0.01mol/L pH7.5的PBS缓冲液洗涤3次,磁分离后弃去上清,得到氨基功能化的磁性微球,备用;
S12.dsDNA交联氨基聚合物功能化磁球:
取一定量的步骤S11制备的氨基聚合物功能化的磁性微球,然后加入pH9.5的碳酸盐缓冲液,使其浓度达到20mg/mL(以纳米磁球计);再以每毫克磁球10μg的量添加dsDNA抗原,同时按每毫克磁球加入0.5mg的CDC,然后置于在38℃水浴锅中并振摇或者机械搅拌2小时。磁性分离,用洗液(0.5%BSA溶液)清洗固体三遍,得到包被好dsDNA抗原的磁球,即是dsDNA免疫磁性微球体系。
实施例12
本实施例提供了一种dsDNA免疫磁性微球体系及其制备方法。其中,dsDNA免疫磁性微球体系结构与实施例11相同。
dsDNA免疫磁性微球体系制备方法包括如下步骤:
S21.氨基聚合物功能化磁性微球的制备:参照实施例11的步骤S11,不同的是聚乙烯亚胺的用量改为5mg。
S22.dsDNA交联氨基聚合物功能化磁球:如同实施例11的步骤S12。
实施例13
本实施例提供了一种dsDNA免疫磁性微球体系及其制备方法。其中,dsDNA免疫磁性微球体系结构与实施例11相同,其中,聚乙烯亚胺基团用聚酰胺基团替代,其他的与实施例11相同。
dsDNA免疫磁性微球体系制备方法包括如下步骤:
S31.氨基聚合物功能化磁性微球的制备:参照实施例11的步骤S11,不同的是聚酰胺替代聚乙烯亚胺。
S32.dsDNA交联氨基聚合物功能化磁球:如同实施例11的步骤S12。
dsDNA免疫磁性微球保存液实施例
实施例21
本实施例21提供了一种dsDNA免疫磁性微球保存液,其包含如下组分:
1)稀释液:Tris-HCl缓冲液,工作浓度为0.02mol/L;
2)DNA酶抑制剂:胰脱氧核酸酶抑制剂(DNaseⅠ),工作浓度为0.01mg/mL;
3)金属螯合剂:乙二胺四乙酸(EDTA),工作浓度为0.1mg/mL;
4)多聚物保护剂:海藻糖,工作浓度为1g/mL;
5)表面活性剂:聚乙二醇,工作浓度为0.1mg/mL;
6)位点封闭剂:牛血清白蛋白(BSA),工作浓度为1mg/mL;
7)生物防腐剂:异噻唑啉酮,工作浓度为1.5mg/mL。
实施例22
本实施例22提供了一种dsDNA免疫磁性微球保存液,其包含如下组分:
1)稀释液:磷酸盐缓冲液,工作浓度为0.02mol/L;
2)DNA酶抑制剂:偏端霉素A,工作浓度为0.01mg/mL;
3)金属螯合剂:乙二胺四乙酸二钾(EDTA-2K),工作浓度为0.1mg/mL;
4)多聚物保护剂:蔗糖,工作浓度为1g/mL;
5)表面活性剂组分:聚乙二醇,工作浓度为0.1mg/mL;
6)位点封闭剂组分:牛血清白蛋白(BSA),工作浓度为1g/mL;
7)生物防腐剂组分,叠氮钠,工作浓度为1.5mg/mL。
抗dsDNA抗体检测试剂实施例
实施例31
本实施例31提供了一种抗dsDNA抗体检测试剂。所述dsDNA抗体检测试剂包含上述实施例11提供的dsDNA免疫磁性微球体系和上述实施例21提供的dsDNA免疫磁性微球保存液;其中,dsDNA免疫磁性微球体系是分散在dsDNA免疫磁性微球保存液中,且dsDNA免疫磁性微球体系在抗dsDNA抗体检测试剂中的浓度为1mg/mL。
实施例32
本实施例32提供了一种抗dsDNA抗体检测试剂。所述dsDNA抗体检测试剂包含上述实施例12提供的dsDNA免疫磁性微球体系和述实施例21提供的dsDNA免疫磁性微球保存液;其中,dsDNA免疫磁性微球体系是分散在dsDNA免疫磁性微球保存液中,且dsDNA免疫磁性微球体系在抗dsDNA抗体检测试剂中的浓度为1mg/mL。
实施例33
本实施例33提供了一种抗dsDNA抗体检测试剂。所述dsDNA抗体检测试剂包含上述实施例13提供的dsDNA免疫磁性微球体系和上述实施例21提供的dsDNA免疫磁性微球保存液;其中,dsDNA免疫磁性微球体系是分散在dsDNA免疫磁性微球保存液中,且dsDNA免疫磁性微球体系在抗dsDNA抗体检测试剂中的浓度为1mg/mL。
实施例34
本实施例34提供了一种抗dsDNA抗体检测试剂。所述dsDNA抗体检测试剂包含上述实施例11提供的dsDNA免疫磁性微球体系和上述实施例22提供的dsDNA免疫磁性微球保存液;其中,dsDNA免疫磁性微球体系是分散在dsDNA免疫磁性微球保存液中,且dsDNA免疫磁性微球体系在抗dsDNA抗体检测试剂中的浓度为1mg/mL。
抗dsDNA抗体检测试剂盒实施例
实施例41
本实施例41提供了一种抗dsDNA抗体检测试剂盒。所述dsDNA抗体检测试剂盒包括如下制剂:
a.实施例31提供的抗dsDNA抗体检测试剂:dsDNA抗原的工作浓度10μg/mL,磁性微球工作浓度1mg/mL,dsDNA免疫磁性微球体系的工作浓度1mg/mL;
b.低浓度校准品,浓度12.500IU/mL;
c.高浓度校准品,浓度400.000IU/mL;
d.ABEI标记的鼠抗人IgG抗体:ABEI工作浓度250ng/mL,鼠抗人IgG抗体的工作浓度5000ng/mL;其中,ABEI标记的鼠抗人IgG抗体按照如下方法制备:取1mg鼠抗人IgG抗体,用0.1mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.5)将其体积调至1mL,然后放入透析袋中,并置于pH9.5碳酸盐缓冲液中透析1小时。取出透析好的小鼠抗人IgG抗体,加入100μg ABEI-半琥珀酰胺酸-NHS,室温震摇1.5小时;安装好G-25凝胶柱,用纯化水洗脱干净后,再用pH值7.4的PBS缓冲液进行平衡洗脱;G-25凝胶柱平衡洗脱完毕后,将标记好ABEI的鼠抗人IgG抗体过柱纯化,然后收集出现峰值的蛋白溶液;将收集好的蛋白溶液,加入等体积的含5%的BSA的保护液,加入稀释液稀释至0.15μg/mL。
e.Buffer缓冲液:Tris-HCl缓冲液。
实施例42
本实施例42提供了一种抗dsDNA抗体检测试剂盒。所述dsDNA抗体检测试剂盒包括的组分如下制剂:
a.实施例32提供的抗dsDNA抗体检测试剂:dsDNA抗原的工作浓度10μg/mL,磁性微球工作浓度1mg/mL,dsDNA免疫磁性微球体系的工作浓度1mg/mL;
b.低浓度校准品:如同实施例41;
c.高浓度校准品:如同实施例41;
d.ABEI标记的抗人IgG抗体:如同实施例41;
e.Buffer缓冲液:Tris-HCl缓冲液。
实施例43
本实施例43提供了一种抗dsDNA抗体检测试剂盒。所述dsDNA抗体检测试剂盒包括如下制剂:
a.实施例33提供的抗dsDNA抗体检测试剂:dsDNA抗原的工作浓度10μg/mL,磁性微球工作浓度1mg/mL,dsDNA免疫磁性微球体系的工作浓度1mg/mL;
b.低浓度校准品:如同实施例41;
c.高浓度校准品:如同实施例41;
d.ABEI标记的抗人IgG抗体:如同实施例41;
e.Buffer缓冲液:Tris-HCl缓冲液。
实施例44
本实施例44提供了一种抗dsDNA抗体检测试剂盒。所述dsDNA抗体检测试剂盒包括如下制剂:
a.实施例34提供的抗dsDNA抗体检测试剂:dsDNA抗原的工作浓度10μg/mL,磁性微球工作浓度1mg/mL,dsDNA免疫磁性微球体系的工作浓度1mg/mL;
b.低浓度校准品:如同实施例41;
c.高浓度校准品:如同实施例41;
d.ABEI标记的抗人IgG抗体:如同实施例41;
e.Buffer缓冲液:如同实施例41。
对比例1
本对比例1提供了一种抗dsDNA抗体检测试剂和试剂盒。
所述dsDNA抗体检测试剂包含上述实施例11提供的dsDNA免疫磁性微球体系和保存液;其中,dsDNA免疫磁性微球体系是分散在保存液中,且dsDNA免疫磁性微球体系在抗dsDNA抗体检测试剂中的浓度为1mg/mL,保存液为Tris-HCl缓冲液。
抗dsDNA抗体检测试剂盒包括如下制剂:
a.本对比例1提供了一种抗dsDNA抗体检测试剂:dsDNA抗原的工作浓度10μg/mL,磁性微球工作浓度1mg/mL;
b.低浓度校准品:如同实施例41;
c.高浓度校准品:如同实施例41;
d.ABEI标记的抗人IgG抗体:如同实施例41;
e.Buffer缓冲液:如同实施例41。
对比例2
本对比例2提供了一种抗dsDNA抗体检测试剂和试剂盒。
所述dsDNA抗体检测试剂包括现有dsDNA免疫磁性微球和上述实施例21提供的dsDNA免疫磁性微球保存液;其中,现有dsDNA免疫磁性微球是分散在dsDNA免疫磁性微球保存液中,且现有的dsDNA免疫磁性微球在抗dsDNA抗体检测试剂中的浓度为1mg/mL。
其中,现有dsDNA免疫磁性微球按照如下方法制备获得:
1)取一定量的磁球,按每毫克磁球加入0.5mg的DCC,然后加入DMF溶液使磁球的浓度为20mg/mL,置于在38℃水浴锅中并振摇或者机械搅拌2小时;
2)活化好的纳米磁球溶液去除上清液,然后加入pH9.5的碳酸盐缓冲液,使其浓度达到20mg/mL(以纳米磁球计);再以每毫克磁球10μg的量添加dsDNA抗原,然后置于室温震摇反应2小时。磁性分离,用洗液(0.5%BSA溶液)清洗固体三遍,得到包被好dsDNA抗原的磁球。
本对比2提供的抗dsDNA抗体检测试剂盒包括如下制剂:
a.本对比例2提供了一种抗dsDNA抗体检测试剂:dsDNA抗原的工作浓度10μg/mL,磁性微球工作浓度1mg/mL;
b.低浓度校准品:如同实施例41;
c.高浓度校准品:如同实施例41;
d.ABEI标记的抗人IgG抗体:如同实施例41;
e.Buffer缓冲液:如同实施例41。
对比例3
本对比例3提供了一种抗dsDNA抗体检测试剂和试剂盒。
所述dsDNA抗体检测试剂包括现有dsDNA免疫磁性微球和保存液。现有dsDNA免疫磁性微球是分散在保存液中,且现有的dsDNA免疫磁性微球在抗dsDNA抗体检测试剂中的浓度为1mg/mL。
其中,现有dsDNA免疫磁性微球按照对比例2中现有dsDNA免疫磁性微球制备方法获得,保存液为碳酸盐缓冲液。
本对比3提供的抗dsDNA抗体检测试剂盒包括如下制剂:
a.本对比例3提供了一种抗dsDNA抗体检测试剂:dsDNA抗原的工作浓度10μg/mL,磁性微球工作浓度1mg/mL;
b.低浓度校准品:如同实施例41;
c.高浓度校准品:如同实施例41;
d.ABEI标记的抗人IgG抗体:如同实施例41;
e.Buffer缓冲液:如同实施例41。
实验方法、数据和结果分析
以上述实施例41-44提供的抗dsDNA抗体检测试剂盒和对比例1-3提供的抗dsDNA抗体检测试剂盒为基础,按照上文具体实施方式部分中所述的抗dsDNA抗体检测***,按照如下检测方法利用深圳市新产业生物医学工程股份有限公司生产的全自动化学发光免疫分析仪Maglumi 2000Plus进行性能评估,对样本中抗dsDNA抗体进行分离检测。采用Anti-dsDNA企业参考品中的灵敏度参考品进行灵敏度的评估,同时将上述检测试剂置于37℃恒温恒湿箱中进行加速稳定性试验。
1.实施例41-44提供的抗dsDNA抗体检测试剂盒和对比例1-3提供的抗dsDNA抗体检测试剂盒为基础的抗dsDNA抗体检测方法如下:
1)十点标准曲线的配制
用0.02M PBS缓冲液稀将Anti dsDNA企业校准品按一定比例稀释至十个浓度点,并通过2点定标校正曲线计算得到工作曲线。
2)Anti dsDNA化学发光免疫分析试剂盒的使用
利用该方法生产Anti dsDNA检测试剂盒,在本司研发生产的Maglumi 2000Plus仪器上检测,检测步骤包括:
a.将20μL待测样本、高低浓度校准品加入到反应杯中;
b.加入20μL抗dsDNA抗体的检测试剂;
c.加入100μL Buffer缓冲液;
d.37℃温育10min,置于磁环境下清洗3次;
e.加入200μL ABEI标记的抗人IgG抗体;
f.37℃温育10min,置于磁环境下清洗3次;
g.加入发光底物,检测光信号强度;
h.通过校准品修正后的工作曲线可根据样本检测光强度自动计算得出待测样本的Anti dsDNA浓度。
3)检测结果和分析
按照上述方法检测结果如下表1、2所示。其中,灵敏度检测结果如下述表1所示,稳定性如表2所示。
从表1中可知,本发明实施例41-44和对比例1方案中的灵敏度明显要优于对比例3的灵敏度,说明由于氨基聚合物的特性,提高了双链DNA抗原的包被载量,同时降低了空间位阻效应,增强了本实施例dsDNA免疫磁性微球体系在待测样本中结合目的抗体的结合效率,从而提高了检测灵敏度;并且从实施例41与实施例42的结果可知,磁性微球与氨基聚合物的偶联比例会影响磁球上氨基的修饰容量,导致双链DNA抗原的偶联效率受到影响,从而本实施例dsDNA免疫磁性微球体系在待测样本中结合目的抗体的结合效率,对灵敏度会造成一定的影响;从实施例41与实施例43的结果可知,聚乙烯亚胺作为氨基聚合物修饰到磁性微球表面,其能够偶联抗原的载量和偶联效率要高于聚酰胺;而从实施例41-44和对比例1-3结果综合对比表明,免疫磁性微球稳定保护液对试剂的检测灵敏度同样具有促进作用。
表1不同实施例检测灵敏度对比
从表2可知,本发明实施例41-44、对比例2的试剂稳定性均比对比例1、2的试剂稳定性好,特别是实施例41中的试剂稳定性明显高于对比例3的结果,7天的下降幅度在5%以内,说明本发明实施例dsDNA免疫磁性微球保存液所含的酶抑制剂,金属离子螯合剂,多聚物保护剂,表面活性剂等有效组分,能够较好地稳定保护dsDNA免疫磁性微球体系在均相体系中不被降解或破坏,从而提高了dsDNA免疫磁性微球体系的稳定性。而从实施例41-44与对比例1-3的对比结果综合表明,采用本发明实施例dsDNA免疫磁性微球体系的结构对其稳定性起到一定的促进作用,原因在于磁球与双链DNA抗原通过氨基聚合物偶联后使得抗原远离刚性的磁球界面,降低了空间位阻效应,并且在一定程度上保证了抗原的活性,从而也对抗原起到了保护作用。
表2不同实施例高温加速热稳定性对比
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种抗dsDNA抗体检测试剂,由dsDNA免疫磁性微球和所述dsDNA免疫磁性微球的保存液组成,所述dsDNA免疫磁性微球分散于所述保存液中;且所述dsDNA免疫磁性微球包括磁性微球本体,还包括含氨基聚合物基团和dsDNA抗原;所述磁性微球本体为表面被活化处理的磁性微球本体,且所述含氨基聚合物基团化学连接所述被活化处理的磁性微球本体,所述dsDNA抗原通过磷酸氨基酯键与所述含氨基聚合物基团化学键连接后,通过含氨基聚合物基团与所述磁性微球本体连接;
所述含氨基聚合物基团由聚酰胺、聚丙烯酰胺、聚邻苯二胺中的至少任一种提供,且所述含氨基聚合物基团与所述dsDNA抗原质量比为(50-2000):1;
所述保存液为dsDNA免疫磁性微球保存液由如下组分组成:
稀释液:Tris-HCl缓冲液,工作浓度为0.02mol/L;
DNA酶抑制剂:胰脱氧核酸酶抑制剂,工作浓度为0.01mg/mL;
金属螯合剂:乙二胺四乙酸,工作浓度为0.1mg/mL;
多聚物保护剂:海藻糖,工作浓度为1g/mL;
表面活性剂:聚乙二醇,工作浓度为0.1mg/mL;
位点封闭剂:牛血清白蛋白,工作浓度为1mg/mL;
生物防腐剂:异噻唑啉酮,工作浓度为1.5mg/mL;
或
稀释液:磷酸盐缓冲液,工作浓度为0.02mol/L;
DNA酶抑制剂:偏端霉素A,工作浓度为0.01mg/mL;
金属螯合剂:乙二胺四乙酸二钾,工作浓度为0.1mg/mL;
多聚物保护剂:蔗糖,工作浓度为1g/mL;
表面活性剂组分:聚乙二醇,工作浓度为0.1mg/mL;
位点封闭剂组分:牛血清白蛋白,工作浓度为1g/mL;
生物防腐剂组分,叠氮钠,工作浓度为1.5mg/mL。
2.根据权利要求1所述的抗dsDNA抗体检测试剂,其特征在于:所述含氨基聚合物基团偶联所述dsDNA抗原。
3.根据权利要求1或2所述的抗dsDNA抗体检测试剂,其特征在于:所述磁性微球本体与含氨基聚合物基团的质量比为1:(1-10)。
4.根据权利要求1所述的抗dsDNA抗体检测试剂,其特征在于:所述dsDNA免疫磁性微球的制备方法包括如下步骤:
将经活化处理的磁性微球与氨基聚合物进行反应,然后将反应产物与封闭剂进行处理,获得含氨基聚合物基团修饰的磁性微球;
将所述含氨基聚合物基团修饰的磁性微球和dsDNA抗原在活化剂作用下进行反应;
所述氨基聚合物为聚酰胺、聚丙烯酰胺、聚邻苯二胺中的至少一种;
所述磁性微球与所述dsDNA抗原的质量比为(50-200):1。
5.根据权利要求4所述的抗dsDNA抗体检测试剂,其特征在于:在所述磁性微球与氨基聚合物反应体系中,
所述磁性微球与所述氨基聚合物的质量比为1:(1-10);和/或
所述磁性微球与所述封闭剂的质量比为(1-50):1;和/或
所述磁性微球的浓度为10mg/mL-20mg/mL;和/或
所述封闭剂为酪蛋白、BSA、明胶中的至少一种。
6.根据权利要求4或5所述的抗dsDNA抗体检测试剂,其特征在于:在所述磁性微球与所述dsDNA抗原反应体系中,
所述磁性微球与所述活化剂的质量比为(2-4):1;和/或
所述活化剂选用N,N'-二异丙基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、二环己基碳二亚胺中的任一种。
7.根据权利要求1所述的抗dsDNA抗体检测试剂,其特征在于:在所述检测试剂中,所述dsDNA免疫磁性微球的工作浓度为0.5mg/mL-2.0mg/mL。
8.一种抗dsDNA抗体检测试剂盒,包括权利要求1-7任一所述的抗dsDNA抗体检测试剂。
9.根据权利要求8所述的试剂盒,其特征在于:还包括校准样品、示踪标记物标记的抗人IgG抗体、缓冲液中的至少一种。
10.根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于:所述示踪标记物选自金刚烷、鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯、碱性磷酸酶和辣根过氧化物中的至少一种。
11.根据权利要求10所述的试剂盒,其特征在于:所述示踪标记物为N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺。
12.一种抗dsDNA抗体检测***,其特征在于,包括:
权利要求1-7任一项所述的抗dsDNA抗体检测试剂或权利要求8-11任一所述的试剂盒;
磁分离模块,与所述dsDNA免疫磁性微球配合,用于自液体中分离磁性微球;
检测模块,与所述磁分离模块分离的磁性微球和发光底物配合,用于完成对抗dsDNA抗体的检测;
数据处理模块,用于计算所述抗dsDNA抗体的含量。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710040242.7A CN108333346B (zh) | 2017-01-19 | 2017-01-19 | dsDNA免疫磁性微球体系、其制备方法和应用以及保存液 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710040242.7A CN108333346B (zh) | 2017-01-19 | 2017-01-19 | dsDNA免疫磁性微球体系、其制备方法和应用以及保存液 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN108333346A CN108333346A (zh) | 2018-07-27 |
CN108333346B true CN108333346B (zh) | 2021-07-06 |
Family
ID=62922777
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201710040242.7A Active CN108333346B (zh) | 2017-01-19 | 2017-01-19 | dsDNA免疫磁性微球体系、其制备方法和应用以及保存液 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN108333346B (zh) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109521193B (zh) * | 2018-11-05 | 2021-03-19 | 暨南大学 | DNA免疫吸附剂在制备抗dsDNA抗体检测试剂中的应用 |
CN109521194B (zh) * | 2018-11-30 | 2023-03-31 | 暨南大学 | DNA免疫吸附剂在制备抗ds-DNA抗体检测试剂中的应用 |
CN109355287A (zh) * | 2018-12-14 | 2019-02-19 | 长春市志昂生物科技有限公司 | 一种免前处理自动化提取大体积全血dna的方法 |
CN110609134B (zh) * | 2019-10-14 | 2022-10-04 | 珠海丽珠试剂股份有限公司 | 磁微粒保存液及其制备方法和使用方法、免疫反应试剂及其用途 |
CN110850076A (zh) * | 2019-11-28 | 2020-02-28 | 南京迪安医学检验所有限公司 | 一种抗双链DNA抗体IgG化学发光免疫测定试剂盒及其制备方法和应用 |
CN112881680B (zh) * | 2021-01-19 | 2022-11-15 | 深圳市卓润生物科技有限公司 | 连接有dsDNA的磁性微粒的制备方法 |
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5183735A (en) * | 1989-02-27 | 1993-02-02 | Reaads Medical Products, Inc. | Method and diagnostic test kit for detection of anti-dsDNA antibodies |
CN1503910A (zh) * | 2000-11-08 | 2004-06-09 | ���˶ٵϿ�ɭ��˾ | 收集和稳定生物样品的方法和装置 |
WO2004060320A2 (en) * | 2002-12-27 | 2004-07-22 | La Jolla Pharmaceutical Company | Methods of improving health-related quality of life in individuals with systemic lupus erythematosus |
US20060177855A1 (en) * | 2005-01-21 | 2006-08-10 | Utermohlen Joseph G | Nanoparticles for manipulation of biopolymers and methods of thereof |
CN101165491A (zh) * | 2006-10-19 | 2008-04-23 | 陕西西大北美基因股份有限公司 | 以金磁微粒为载体检测抗双链dna抗体的方法 |
CN101341203A (zh) * | 2005-12-09 | 2009-01-07 | 恰根有限公司 | 磁性聚合物颗粒 |
CN105929156A (zh) * | 2016-04-20 | 2016-09-07 | 北京中航赛维生物科技有限公司 | 一种抗双链DNA抗体IgG的磁微粒化学发光定量测定试剂盒及制备和检测方法 |
CN106065400A (zh) * | 2015-04-24 | 2016-11-02 | 上海润腾生物科技有限公司 | 一种核糖核酸保护剂、试剂盒、应用及保存方法 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101717780B (zh) * | 2009-12-22 | 2012-11-07 | 陕西北美基因股份有限公司 | 一种用于细胞转染的pei修饰的金磁微粒的制备方法 |
CN102408288B (zh) * | 2011-08-10 | 2013-12-18 | 天津市天地创智科技发展有限公司 | 应用蛋白质功能化磁性纳米颗粒拆分手性药物的方法 |
-
2017
- 2017-01-19 CN CN201710040242.7A patent/CN108333346B/zh active Active
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5183735A (en) * | 1989-02-27 | 1993-02-02 | Reaads Medical Products, Inc. | Method and diagnostic test kit for detection of anti-dsDNA antibodies |
CN1503910A (zh) * | 2000-11-08 | 2004-06-09 | ���˶ٵϿ�ɭ��˾ | 收集和稳定生物样品的方法和装置 |
WO2004060320A2 (en) * | 2002-12-27 | 2004-07-22 | La Jolla Pharmaceutical Company | Methods of improving health-related quality of life in individuals with systemic lupus erythematosus |
US20060177855A1 (en) * | 2005-01-21 | 2006-08-10 | Utermohlen Joseph G | Nanoparticles for manipulation of biopolymers and methods of thereof |
CN101341203A (zh) * | 2005-12-09 | 2009-01-07 | 恰根有限公司 | 磁性聚合物颗粒 |
CN101165491A (zh) * | 2006-10-19 | 2008-04-23 | 陕西西大北美基因股份有限公司 | 以金磁微粒为载体检测抗双链dna抗体的方法 |
CN106065400A (zh) * | 2015-04-24 | 2016-11-02 | 上海润腾生物科技有限公司 | 一种核糖核酸保护剂、试剂盒、应用及保存方法 |
CN105929156A (zh) * | 2016-04-20 | 2016-09-07 | 北京中航赛维生物科技有限公司 | 一种抗双链DNA抗体IgG的磁微粒化学发光定量测定试剂盒及制备和检测方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Development of a Microfluidic Platform with an Optical Imaging Microarray Capable of Attomolar Target DNA Detection;Michaela Bowden,et al;《Anal.Chem》;20050901;第77卷(第17期);第5583-5588页 * |
化学发光免疫测定抗dsDNA抗体的实验条件分析和初步应用;曾常茜 等;《中国免疫学杂志》;19950131;第11卷(第1期);摘要,第1.1-1.2节 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN108333346A (zh) | 2018-07-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN108333346B (zh) | dsDNA免疫磁性微球体系、其制备方法和应用以及保存液 | |
CN102759631B (zh) | 一种定量检测降钙素原pct的胶乳增强免疫比浊试剂盒 | |
CN105548565A (zh) | 一种用于检测克氏锥虫抗体的试剂盒及其制备和应用 | |
CN110702906B (zh) | 一种检测抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体的试剂盒 | |
CN112730839B (zh) | 一种磁微粒化学发光法测定细胞角蛋白19片段含量的试剂盒 | |
CN107942069A (zh) | 一种ngal胶乳免疫比浊法检测试剂盒及其制备方法 | |
CN112014575B (zh) | 一种cyfra21-1测定试剂盒及其制备方法 | |
CN112433048A (zh) | 一种用于化学发光免疫法的试剂盒及其制备方法和应用 | |
CN202916286U (zh) | 一种定量检测降钙素原pct的胶乳增强免疫比浊试剂盒 | |
JP5323328B2 (ja) | 検体に含まれる被測定物質の測定方法および該測定方法に用いられる試薬キット | |
CN117434276A (zh) | 一种thsd7a抗体检测试剂盒及其用途 | |
JP4879067B2 (ja) | 免疫測定用検体前処理液、免疫測定用試薬キット及び免疫測定方法 | |
CN111273033A (zh) | 一种高尔基体蛋白73的测定试剂盒及其化学发光测定方法 | |
KR20010025027A (ko) | 면역측정시약 및 면역측정법 | |
CN108267576B (zh) | 经修饰的ccp抗原及其用途和抗ccp抗体检测试剂盒及其制造方法 | |
WO2022050418A1 (ja) | バイオチップ、その製造方法及びその使用 | |
CN108303543B (zh) | 一种猪瘟e2蛋白抗体检测试剂盒及其检测方法 | |
CN109738644A (zh) | 一种抗穆勒氏管激素免疫比浊定量检测试剂 | |
CN112255404B (zh) | 一种稳定的血清胃蛋白酶原ii测定试剂盒及其制备方法和应用 | |
CN114910650A (zh) | 检测抗膜突蛋白-IgG抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用 | |
CN114910649A (zh) | 检测抗α-烯醇化酶-IgG抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用 | |
JPH02298866A (ja) | 酵素検定キット及び完全細胞に適用可能な方法 | |
CN113777326A (zh) | 一种高特异检测肝素结合蛋白的试剂盒及其应用 | |
CN113295862A (zh) | 基于抗原标记物检测新型冠状病毒SARS-CoV-2抗体的试剂盒及方法 | |
CN110938147A (zh) | 一种玻璃毛细管表面抗体固定方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |