CN109521193B - DNA免疫吸附剂在制备抗dsDNA抗体检测试剂中的应用 - Google Patents

DNA免疫吸附剂在制备抗dsDNA抗体检测试剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了DNA免疫吸附剂在制备抗dsDNA抗体检测试剂中的应用。本发明DNA免疫吸附剂在制备抗dsDNA抗体检测试剂中的应用，是基于本发明发明人发现将DNA免疫吸附剂用于免疫荧光，可定性分析肾组织中沉积的抗dsDNA抗体，同时可特异性确认抗dsDNA抗体在肾组织中的沉积和分布，且方法简单易操作，适于制备检测和分析狼疮肾和红斑狼疮的试剂。

Description

DNA免疫吸附剂在制备抗dsDNA抗体检测试剂中的应用
技术领域
本发明属于DNA免疫吸附剂的应用，特别涉及DNA免疫吸附剂在制备抗dsDNA抗体检测试剂中的应用。
背景技术
***性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种多***损害的慢性自身性免疫性疾病，确切病因不明，常引起多器官***的不可逆性损害，可累及皮肤、浆膜、关节、肾及中枢神经***等，病理表现为自身抗体及免疫复合物沉积，影响患者的寿命和生活质量。SLE的患病率因人群而异，我国患病以女性多见，尤其是育龄女性。患者血清中出现以抗核抗体(ANA)、抗双链DNA抗体(抗dsDNA抗体)为代表的多种抗体，其中抗dsDNA抗体是参与SLE发病的主要抗体，其特异性可达90％，是SLE特异性抗体，与疾病的活动性明显相关。
抗dsDNA抗体，结合临床症状和其它实验检查结果，可辅助诊断***性红斑狼疮(SLE)以及狼疮肾的分型。在多种***疾病中，都可以检测到抗核抗体(ANA)，抗核抗体的筛查是一种灵敏的***疾病检测方法。尽管这种筛查方法对于SLE是一种非常好的检测方法(阴性结果可以排除活动性SLE)，但是这种方法不是一种特异性的检查方法。在SLE患者中，抗dsDNA抗体几乎可以排除其他疾病的可能性，因此该抗体被认为是该疾病的标志。抗dsDNA抗体阳性足以证明SLE；但是，这些抗体的检测阴性并不能在所有的病例当中完全排除SLE。
目前，临床上检测肾组织的病变和分型最常使用的为苏木精—伊红(H&E)染色方法，免疫荧光的方法也被用来检测肾组织中的多种抗体沉积。但是H&E染色和普通的免疫荧光并不能特异性确认抗dsDNA抗体在肾组织中的沉积和分布。因此，提供一种简单快捷，既能诊断肾脏病变又能分析肾切片中抗dsDNA抗体的检测方法对于狼疮肾炎和红斑狼疮的诊断和治疗非常重要。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供DNA免疫吸附剂在制备抗dsDNA抗体检测试剂中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：DNA免疫吸附剂在制备抗dsDNA抗体检测试剂中的应用，是基于本发明发明人发现将DNA免疫吸附剂用于免疫荧光，可定性分析肾组织中沉积的抗dsDNA抗体，特异性确认抗dsDNA抗体在肾组织中的沉积和分布，方法简单易操作。
所述的DNA免疫吸附剂优选为DNA-SeNPs。
所述的DNA-SeNPs是通过纳米硒负载用于与抗dsDNA抗体结合的DNA得到的DNA-SeNPs，优选通过如下步骤制备得到：将用于与抗dsDNA抗体结合的DNA溶液和纳米硒溶液混合，反应，纯化，得到DNA-SeNPs。
所述的纳米硒是通过氧化还原法制备得到的纳米硒，优选为通过如下步骤制备得到：将无机硒和还原剂混合，反应，得到纳米硒。
所述的混合的方式优选为：将无机硒溶液和还原剂溶液混合；更优选通过如下方式混合：将无机硒溶液滴加到还原剂溶液中，或是将还原剂溶液滴加入无机硒溶液中。
所述的反应的温度优选为0～10℃；更优选为3～5℃；最优选为4℃。
所述的无机硒优选为***、***盐和二氧化硒中的一种或至少两种。
所述的***盐为***钠(Na2SeO3)、***钾(K2SeO3)和***锌(ZnSeO3)中的一种或至少两种。
所述的无机硒溶液的浓度优选为5～15mM；更优选为10mM。
所述的还原剂优选为维生素C、硼氢化钠、巯基乙醇、还原型谷胱甘肽、葡萄糖和五水硫代硫酸钠中的一种或至少两种。
所述的还原剂溶液的浓度优选为30～50mM；更优选为40mM。
所述的无机硒和所述的还原剂的用量按还原剂过量为宜，从而能将无机硒充分还原；更优选为按摩尔比1:3～10配比计算。
所述的纳米硒溶液的浓度优选为1～10mM；更优选为2～5mM。
所述的用于与抗dsDNA抗体结合的DNA优选为双链DNA。
所述的用于与抗dsDNA抗体结合的DNA溶液的浓度优选为1～10mg/mL；更优选为1～5mg/mL。
所述的用于与抗dsDNA抗体结合的DNA溶液中的溶剂优选为pH值为7～9的缓冲液；更优选为pH值为7.2～8.2的缓冲液。
所述的缓冲液优选为Tris-HCl缓冲液。
所述的Tris-HCl缓冲液的浓度优选为0.01～0.1M；更优选为0.01～0.05M。
所述的用于与抗dsDNA抗体结合的DNA和所述的纳米硒的用量优选为0.1～5mg:1μmol，更优选为0.5～2mg:1μmol。
所述的反应的温度优选为0～10℃；更优选为3～5℃；最优选为4℃。
所述的反应的时间为0.5～24h。
所述的纯化的方式优选为使用透析袋透析。
所述的透析袋的规格优选为6000～8000kDa。
所述的透析的时间为12～48h。
所述的抗dsDNA抗体检测试剂优选为用于荧光免疫染色的抗dsDNA抗体检测试剂。
一种用于荧光免疫染色的抗dsDNA抗体检测试剂，是在DNA免疫吸附剂上标记荧光显示剂得到。
所述的DNA免疫吸附剂为DNA-SeNPs。
所述的DNA-SeNPs是通过纳米硒负载用于与抗dsDNA抗体结合的DNA得到的DNA-SeNPs。
所述的荧光显示剂优选为香豆素-6。
所述的用于荧光免疫染色的抗dsDNA抗体检测试剂，优选通过如下步骤制备得到：
(1)将无机硒溶液和荧光显示剂溶液混合，得到混合液A；
(2)将混合液A和还原剂混合，反应，得到反应物A；
(3)将用于与抗dsDNA抗体结合的DNA溶液和反应物A混合，反应，纯化，得到用于荧光免疫染色的抗dsDNA抗体检测试剂。
步骤(1)中所述的无机硒优选为***、***盐和二氧化硒中的一种或至少两种。
所述的***盐为***钠(Na2SeO3)、***钾(K2SeO3)和***锌(ZnSeO3)中的一种或至少两种。
步骤(1)中所述的无机硒溶液的浓度优选为5～15mM；更优选为10mM。
步骤(1)中所述的荧光显示剂的用量按荧光显示剂过量为宜，尽可能标记上荧光显示剂，优选按其与无机硒中硒的量＝5～15mg：1mmol配比计算；更优选按其与无机硒中硒的量＝10mg：1mmol配比计算。
步骤(2)中所述的还原剂优选为维生素C、硼氢化钠、巯基乙醇、还原型谷胱甘肽、葡萄糖和五水硫代硫酸钠中的一种或至少两种。
步骤(2)中所述的还原剂的溶液浓度优选为30～50mM；更优选为40mM。
步骤(2)中所述的还原剂和所述的无机硒的用量按还原剂过量为宜，从而能将无机硒充分还原；更优选为按摩尔比3～10:1配比计算。
步骤(3)中所述的用于与抗dsDNA抗体结合的DNA优选为双链DNA。
步骤(3)中所述的用于与抗dsDNA抗体结合的DNA溶液的浓度优选为1～10mg/mL；更优选为1～5mg/mL。
步骤(3)中所述的用于与抗dsDNA抗体结合的DNA溶液中的溶剂优选为pH值为7～9的缓冲液；更优选为pH值为7.2～8.2的缓冲液。
所述的缓冲液优选为Tris-HCl缓冲液。
所述的Tris-HCl缓冲液的浓度优选为0.01～0.1M；更优选为0.01～0.05M。
步骤(3)中所述的用于与抗dsDNA抗体结合的DNA的用量按其与所述的反应物A中硒的量＝0.1-5mg:1μmol配比计算，更优选按其与所述的反应物A中硒的量＝0.5～2mg:1μmol配比计算。
步骤(3)中所述的反应的温度优选为0～10℃；更优选为3～5℃；最优选为4℃。
步骤(3)中所述的纯化的方式优选为使用透析袋透析。
所述的透析袋的规格优选为6000～8000kDa。
所述的透析的时间为12～48h。
所述的用于荧光免疫染色的抗dsDNA抗体检测试剂在非诊断目的的肾切片检测中的应用，优选包括如下步骤：
(1)脱蜡至水：将肾石蜡切片依次浸入脱水：二甲苯I 10min，二甲苯II 5min，无水乙醇I 10min，无水乙醇II 5min，95％乙醇I 5min，95％乙醇II 5min，90％乙醇I 5min，90％乙醇II 5min，80％乙醇5min；蒸馏水洗2min；
(2)抗原修复：取12mL 50×EDTA抗原修复液，用超纯水稀释至600mL，95～110℃预热1min，放入切片，95～100℃加热1min，60～70℃加热2min(4～5次)，冷却，PBS缓冲液洗涤；
(3)封闭：去除多余液体，加入浓度为质量百分比为5％的牛血清蛋白溶液，封闭30min；
(4)孵育：滴加100μL上述用于荧光免疫染色的抗dsDNA抗体检测试剂，孵育2h，倾去液体；
(5)观察：荧光显微镜下观察染色情况。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1.本发明发明人发现将DNA免疫吸附剂用于检测肾切片中抗dsDNA抗体，DNA-SeNPs可以与肾脏切片中的抗dsDNA抗体特异性结合，因此能定性的分析肾组织中沉积的抗体种类，同时可确认抗dsDNA抗体在肾组织中的沉积和分布，因此，DNA免疫吸附剂可用于制备检测和分析狼疮肾和红斑狼疮的试剂。
2.本发明与临床上检测肾组织的病变和分型常用的苏木精—伊红(H&E)法相比，能特异性显示肾组织抗dsDNA抗体的沉积和分布，且更加简单快捷。
附图说明
图1是DNA-SeNPs吸附病人血浆中抗dsDNA抗体前后的表征图；其中，图a是吸附前后的纳米粒径大小分布图，图b是吸附前后的电位图，图a和b中1～4分别为吸附61号、28号、70号和23号病例血浆后的DNA-SeNPs；图c是吸附前后的紫外光谱图，曲线1为DNA-SeNPs，曲线2～4分别为吸附19号、69号、109号病例血浆后的DNA-SeNPs；图d是吸附前后的红外光谱图，曲线1为DNA-SeNPs，曲线2～4分别为吸附14号、30号、34号病例血浆后的DNA-SeNPs。
图2是DNA-SeNPs吸附病人血浆中抗dsDNA抗体前后的透射电子显微镜图；其中，图a是DNA-SeNPs的TEM图，图b是吸附17号病例血浆后的DNA-SeNPs的TEM，图c是吸附31号病例血浆后的DNA-SeNPs的TEM图，图d是吸附58号病例血浆后的DNA-SeNPs的TEM图。
图3是DNA-SeNPs吸附病人血浆中抗dsDNA抗体前后的原子力显微镜和相应的厚度分析图；其中，图a是DNA-SeNPs的AFM图(上)及相应的厚度分析图(下)，图b是吸附32号病例血浆后的DNA-SeNPs的AFM图(上)及相应的厚度分析图(下)，图c是吸附33号病例血浆后的DNA-SeNPs的AFM图(上)及相应的厚度分析图(下)。
图4是DNA-SeNPs和苏木精—伊红染色法(H&E)对肾切片的染色比较图。
具体实施例
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1 DNA-SeNPs纳米粒子的制备
4℃下，将1mL浓度为10mM的Na2SeO3溶液放入小烧杯中，为了将DNA-SeNPs纳米粒子进行标记，放入Na2SeO3溶液的同时加入50μL浓度为2mg/mL的香豆素6溶液，得到混合液A；将混合液A缓慢滴加到1mL浓度为40mM的维生素C(Vc，阿拉丁公司)溶液，滴加完后加入1mL浓度为5mg/mL的DNA(D4522，Sigma公司)Tris-HCl溶液(0.05M，pH＝7.2)，再用超纯水定容到5mL，4℃反应12h，用透析袋(6000～8000kDa)在超纯水中透析24h，得到DNA-SeNPs纳米粒子。
实施例2 DNA-SeNPs吸附抗dsDNA抗体前后的表征
分别将150μL实施例1制备的DNA免疫吸附剂加入300μL血浆中(分别来源于128个SLE病例)，室温混匀(20rpm，试管旋转混匀器，TZL-5010，苏州珀西瓦尔实验设备有限公司)吸附2h。通过粒度和电位(马尔文粒度仪)、紫外分光光度计、红外分光光度计、透射电子显微镜(TEM)以及原子力显微镜(AFM)对吸附抗dsDNA抗体前后的DNA-SeNPs进行表征，结果见图1-3。吸附前DNA-SeNPs的水合粒径大约为126nm，吸附4位病人血浆(由中山三院提供)后，将其离心(12000rpm，10min)，去上清，重悬，检测吸附后DNA-SeNPs的水合粒径分别增加到189nm(病例1：吸附前抗dsDNA抗体的滴度为563)、254nm(病例2：吸附前抗dsDNA抗体的滴度为353)、405nm(病例3：吸附前抗dsDNA抗体的滴度为600)和259nm(病例4：吸附前抗dsDNA抗体的滴度为336)(图1a)。但是，由于抗dsDNA抗体和DNA-SeNPs的表面电位相近，吸附前后DNA-SeNPs的表面电位没有明显的变化(图1b)。吸附前后DNA-SeNPs的紫外可见和红外光谱相一致(图1c和d)。吸附前DNA-SeNPs的TEM图像表现为单分散的、大小约为107nm的球状纳米粒子，且表面可以清晰地看见一层DNA的修饰(图2a)。吸附病人血浆之后，DNA-SeNPs的大小基本没变，但是纳米粒子表面的DNA层变厚了(图2b-d，分别对应病例17、病例31和病例58)。AFM的结果显示吸附后DNA-SeNPs的高度明显的增加了(图3)。以上结果都说明抗dsDNA抗体被吸附至纳米粒子表面。
实施例3 DNA-SeNPs检测肾切片中抗dsDNA抗体沉积的性能评价
(1)将肾石蜡切片浸入以下溶液依次脱蜡至水：二甲苯I 10min，二甲苯II 5min，无水乙醇I 10min，无水乙醇II 5min，95％乙醇I 5min，95％乙醇II 5min，90％乙醇I5min，90％乙醇II 5min，80％乙醇5min，经蒸馏水洗2min。
(2)抗原修复：取12mL 50×EDTA抗原修复液(主要由EDTA、Tris等组成，pH＝8.0，市购得到)用超纯水稀释到600mL，在微波炉(格兰仕，P70D20P-TD(W0))高火下预热1min，放入切片，高火加热1min，中火加热2min(4-5次)，冷却，PBS缓冲液(0.01M，pH＝7.4)洗一次。
(3)封闭：甩干多余液体，加入浓度为质量百分比5％的牛血清蛋白溶液(溶质为BSA，溶剂为0.01M，pH＝7.4的PBS)，封闭30min。
(4)孵育：滴加100μL香豆素6标记的DNA-SeNPs(实施例1制备得到)孵育2h，倾去液体。
(5)观察：在荧光显微镜(Life Technologies，EVOS FL auto)下观察染色情况，拍照。
对比例1苏木精—伊红染色法(H&E)
(1)将肾石蜡切片放入以下溶液依次脱蜡至水：二甲苯I 10min，二甲苯II 5min，无水乙醇I 10min，无水乙醇II 5min，95％乙醇I 5min，95％乙醇II 5min，90％乙醇I5min，90％乙醇II 5min，80％乙醇5min，经蒸馏水洗2min。
(2)苏木素染色10min，水洗2min，1％盐酸乙醇(75％乙醇配制)分化3-5s，流水冲洗10min。
(3)伊红染色2min，蒸馏水洗数秒。
(4)切片脱水脱蜡：80％酒精3-5s，90％酒精I 3-5s，90％酒精II 5min，95％酒精I5min，95％酒精II 5min，100％酒精I 5min，100％酒精II 10min，二甲苯I 5min，二甲苯II10min。
(5)中性树胶封片。
(6)荧光显微镜(Life Technologies,EVOS FL auto)下观察染色情况，拍照，并将结果与实施例3的结果进行比较。
比较实施例
本发明发明人共检测了53例肾切片，包括正常人、狼疮肾以及其他肾脏疾病患者的肾组织切片(检测方法同实施例3)，然后与H&E染色法(检测方法同对比例1)的检测结果相比较，判断狼疮肾的分型，其正确率为100％，准确率统计结果见表1。H&E染色法和抗dsDNA抗体检测试剂的检测结果如图4所示。
正常肾小球：H&E染色：光镜下的正常的肾小球血管袢薄而清晰，内皮细胞和系膜细胞数目正常，周围的肾小管也正常；DNA-SeNPs：肾小球及肾小管区域未见明显荧光。
LN-I分型：H&E染色：肾小球几乎正常，系膜轻度节段性增生；DNA-SeNPs：肾小球系膜区域见少量荧光。
LN-II分型：H&E染色：系膜中度增生；DNA-SeNPs：肾小球系膜区域见DNA-SeNPs沉积。
LN-III分型：H&E染色：节段性毛细血管内细胞增生伴实质管腔较少，光镜下节段性内皮下沉积物；DNA-SeNPs：在肾小球毛细血管壁节段分布和伴随系膜沉积的DNA-SeNPs免疫沉积。
LN-IV分型：H&E染色：病变在活检组织检查中呈弥漫性，具有节段性内皮毛细血管增生；DNA-SeNPs：肾小球毛细血管壁节段分布和伴随系膜沉积的DNA-SeNPs免疫沉积呈弥漫性。
LN-V分型：H&E染色：肾小球毛细血管基底膜弥漫性“钉突”形成或增厚，毛细血管袢显著增厚，但细胞数目不增加；DNA-SeNPs：毛细血管壁中弥漫上皮下DNA-SeNPs免疫沉积。
其他肾病：HE染色，狼疮肾炎的HE染色时出现的光镜下表现在其他肾病患者中也可以出现类似的情况，此时结合Se-DNA染色结果，可以明确有无狼疮的特异性抗体抗dsDNA抗体的沉积，从而明确光镜下的改变是否由于抗dsDNA抗体引起，帮助诊断狼疮性肾炎。DNA-SeNPs：在其他肾病患者中，未见Se-DNA的沉积。
综上所述，H&E染色的肾切片可以看出肾小球中组织结构的改变，而DNA-SeNPs可以检测到肾小球中沉积的抗dsDNA抗体，明确抗dsDNA抗体在肾组织中的沉积和分布，且检测的方法比H&E染色的方法更加简单易操作。因此，可以将DNA免疫吸附剂DNA-SeNPs用于制备检测和分析肾切片中抗dsDNA抗体沉积的试剂。
表1
Figure BDA0001853600760000081
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种用于荧光免疫染色的抗 dsDNA 抗体检测试剂，其特征在于：是在 DNA 免疫吸附剂上标记荧光显示剂得到；
所述的 DNA 免疫吸附剂为 DNA-SeNPs；
所述的 DNA-SeNPs 是通过纳米硒负载用于与抗 dsDNA 抗体结合的 DNA 得到的
DNA-SeNPs；
所述的用于荧光免疫染色的抗 dsDNA 抗体检测试剂通过如下步骤制备得到：
（1）将无机硒溶液和荧光显示剂溶液混合，得到混合液 A；
（2）将混合液 A 和还原剂混合，反应，得到反应物 A；
（3）将用于与抗 dsDNA 抗体结合的 DNA 溶液和反应物 A 混合，反应，纯化，得到用于荧光免疫染色的抗 dsDNA 抗体检测试剂；
步骤（1）中所述的无机硒为***、***盐和二氧化硒中的一种或至少两种；
步骤（1）中所述的荧光显示剂的用量按其与无机硒中硒的量=5～15 mg：1 mmol 配比计 算；
步骤（2）中所述的还原剂为维生素 C、硼氢化钠、巯基乙醇、还原型谷胱甘肽、葡萄糖和五水硫代硫酸钠中的一种或至少两种；
步骤（2）中所述的还原剂和所述的无机硒的用量按摩尔比 3～10:1 配比计算；
步骤（3）中所述的用于与抗 dsDNA 抗体结合的 DNA 的用量按其与所述的反应物 A中
硒的量=0.1-5 mg:1 μmol 配比计算。
2.根据权利要求 1 所述的用于荧光免疫染色的抗 dsDNA 抗体检测试剂，其特征在于： 所述的荧光显示剂为香豆素-6。
3.根据权利要求 1 或 2 所述的用于荧光免疫染色的抗 dsDNA 抗体检测试剂，其特征在
于：
步骤（3）中所述的用于与抗 dsDNA 抗体结合的 DNA 为双链 DNA；
步骤（3）中所述的反应的温度为 0～10℃；
步骤（3）中所述的纯化的方式为使用透析袋透析；
所述的透析袋的规格为 6000～8000 kDa；
所述的透析的时间为 12～48 h。
4.权利要求 1～3 任一项所述的用于荧光免疫染色的抗 ds-NA 抗体检测试剂在非诊断目 的的肾切片检测中的应用，其特征在于包括如下步骤：
（1）脱蜡至水：将肾石蜡切片依次浸入脱水：二甲苯 I 10 min，二甲苯 II 5 min，无水
乙醇 I 10 min，无水乙醇 II 5 min，95%乙醇 I 5 min，95%乙醇 II 5 min，90%乙醇I 5 min，
90%乙醇 II 5 min，80%乙醇 5 min；蒸馏水洗 2 min；
（2）抗原修复：取 12 mL 50 × EDTA 抗原修复液，用超纯水稀释至 600 mL，95～
110℃预热 1 min，放入切片，95～100℃加热1 min，60～70℃加热 2 min 4～5 次，冷却， PBS缓冲液；洗涤；
（3）封闭：去除多余液体，加入浓度为质量百分比为 5%的牛血清蛋白溶液，封闭 30min；
（4）孵育：滴加 100 权利要求 1～3所述用于荧光免疫染色的抗 dsDNA 抗体检测试剂，孵育 2 h，倾去液体；
（5）观察：荧光显微镜下观察染色情况。
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