CN108314745A - 一种制备桦褐孔菌多糖的方法 - Google Patents

一种制备桦褐孔菌多糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种制备桦褐孔菌多糖的方法，该方法包括如下步骤：(1)桦褐孔菌子实体粉碎后用乙醇超声脱脂，过滤，滤渣挥干酒精后，沸水提取3次，合并滤液后，减压浓缩至料液比为1g：12mL的提取液；(2)提取液中加入硫酸铵溶解，然后加入0.5‑3倍体积的叔丁醇，恒温30℃反应15‑90min，离心分层；(3)将下层水相使用截留分子量为8000‑10000的透析袋流水透析，透析袋内溶液浓缩后干燥，可得到纯化的桦褐孔菌多糖。本发明制备得到的多糖具有很强的抗氧化能力和体外免疫活性。

Description

一种制备桦褐孔菌多糖的方法
技术领域
本发明涉及食用菌提取领域，具体的说涉及一种制备特定分子量桦褐孔菌多糖的方法。
技术背景
桦褐孔菌属于担子菌亚门、层菌纲、非褐菌目、多孔菌科，是一种传统的药用真菌。主要分布于北纬45～50°之间的俄罗斯、北欧、波兰、日本北海道以及中国黑龙江大小兴安岭和吉林长白山等高寒地区，由于其特殊的生长环境，被冠以“森林中的黑钻石”、“奇幻的蘑菇”美称。自十六世纪以来，在世界多个国家，桦褐孔菌广泛用于治疗多种消化道癌症(如胃癌、肝癌和肠癌等)，心脏病和糖尿病等疑难杂症。多糖是桦褐孔菌最重要的活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、抗突变、抗哮喘、增强免疫力等多种生物活性。近年来，随着药品和保健食品的兴起，桦褐孔菌在医药和保健品等领域表现出的广阔应用前景及开发价值引起了人们的兴趣。
目前国内外学者们对食用菌多糖的提取进行了很多研究，主要的提取方法包括浸渍提取法、超声波提取法、微波辅助提取方法、高压脉冲电场辅助提取法等，但是这些提取方法复杂，溶剂消耗量大、高温高压和较长处理时间等，且需要后续多个分离纯化步骤，难以大规模地应用。
三相法作为一种新的蛋白质分离纯化技术，是一种安全有效的绿色分离技术，该方法包括盐析、等电点沉淀及溶剂沉淀技术，将有机溶剂(一般为叔丁醇)和盐与提取液反应，搅拌离心后，混合物分为三相，其中上相为有机溶剂相(即叔丁醇相)，下相为水相，中间相为蛋白相。三相分离技术可以选择性的将需要的蛋白分离到中间相，而其余的成分分配到其它相中。大多研究者，主要将研究目标放在蛋白相中，使用三相法从食药用菌中分离提取纯化多糖尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备桦褐孔菌多糖的方法，该方法包括如下步骤：
(1)桦褐孔菌子实体粉碎后用乙醇超声脱脂，过滤，滤渣挥干乙醇后，沸水提取3次，合并滤液后，减压浓缩至料液比为1g:12mL(桦褐孔菌子实体粉质量：水的体积)的提取液；
(2)提取液中加入硫酸铵(硫酸铵在溶液中的质量百分比为10％-60％)溶解，然后加入0.5-3倍体积的叔丁醇，恒温30℃反应15-90min，离心分层；
(3)将下层水相使用截留分子量为8000-10000的透析袋流水透析，透析袋内溶液浓缩后干燥，可得到纯化的桦褐孔菌多糖。
三相分离法是一种用于分离纯化蛋白质的方法，对含有多糖的水相研究至今未见报道，本发明利用三相法获得桦褐孔菌多糖，可以快速高效简便地获得约为4-5万分子量的桦褐孔菌多糖。
本发明提供一种新的从桦褐孔菌中获得特定分子量活性多糖的方法，该方法设备简单，操作简便，由该方法制得的桦褐孔菌多糖分子量约为4-5万，提取率可达2.20％以上，并且有较高的抗氧化活性和体外免疫活性。
附图说明
图1桦褐孔菌多糖分子量液相图谱
图2本发明实例中桦褐孔菌多糖对DPPH·自由基的清除率的影响
图3本发明实例中桦褐孔菌多糖等价抗氧化能力的测定
图4本发明实例中桦褐孔菌多糖对巨释细胞RAW 264.7释放NO的影响
具体实施方式
为了对本发明的技术内容，功效特点有更加具体和深入的了解，现结合实例对本发明的内容进行详述：
材料：桦褐孔菌子实体采自西藏林芝色拉山地区，经北京林业大学和西藏农牧学院高原生态研究所鉴定。
材料预处理：将桦褐孔菌子实体清洗干净后，烘箱50℃干燥至恒重。将样品粉碎过10目筛，得到桦褐孔菌子实体粗粉。
实施例一
乙醇脱脂：50g桦褐孔菌用500mL乙醇超声1h，过滤后，滤渣重复两次提取，滤渣挥干乙醇后备用；
粗多糖提取：上述桦褐孔菌子实体滤渣沸水(100℃)提取1h，过滤后，重复提取2次，合并提取液后减压浓缩至600mL的料液比。
取10mL的桦褐孔菌粗多糖提取液在常温下加入硫酸铵1g在涡旋振荡仪震荡溶解30s，加入10mL的叔丁醇，将萃取管放置于30℃的恒温震荡仪以400rpm的速度振荡30min，混合物离心(2700g，15min)形成三个澄清的相。
将下层水相使用截留分子量为8000-10000的透析袋(sigma公司)流水透析以除去小分子盐类，浓缩后冷冻干燥，可得到30.30mg纯化的桦褐孔菌多糖。
多糖的提取率为1.80±0.05％，分子量为5.05×104(±9.08％)Da。
高效液相(HPLC)检测桦褐孔菌多糖分子量：2695Waters高效液相色谱***2695HPLC Pump,On-line Degasser,2414Refractive Index Detector、Waters 2487UVDual Wavelength Absorbance Detector、multiple angle laser light scatteringdetector和differential pressure viscometer detector平行检测，TSK PWXL 6000和4000柱串联，流动相为0.15M NaNO3and 0.05M NaH2PO4，0.02％叠氮钠，pH＝7，流速为0.5mL/min，待测桦褐孔菌多糖样品在临用前配成5mg/mL的溶液，12000rpm离心10分钟，上清进样，进样量为100μl，液相图谱呈现单一对称峰，使用Astra数据分析软件对光散射数据进行采集和分析其分子量为5.05×104(±9.08％)Da。
实施例二
乙醇脱脂：50g桦褐孔菌用500mL乙醇超声提取1h，过滤后，滤渣重复提取两次，滤渣挥干乙醇后备用；
粗多糖提取：桦褐孔菌子实体残渣沸水(100℃)提，过滤后，重复提取2次，合并提取液后减压浓缩至600mL的料液比。
取10mL的粗多糖提取液在常温下加入硫酸铵2g在涡旋振荡仪震荡溶解30s，然后加入25ml的叔丁醇，将萃取管放置于30℃的恒温震荡仪中400rpm的速度振荡30min。混合物离心(2700g，15min)形成三个澄清的相。
将获得的下层水相使用截留分子量为8000-10000的透析袋流水透析以除去小分子盐，浓缩后冻干干燥，可得到30.25mg纯化的桦褐孔菌多糖。
多糖的提取率最高为1.84±0.06％，分子量为3.84×104(±12.06％)Da。
实施例三
乙醇脱脂：50g桦褐孔菌用500mL乙醇超声提取1h，过滤后，滤渣重复提取两次，滤渣挥干乙醇后备用；
粗多糖提取：桦褐孔菌子实体的残渣用沸水(100℃)提取，过滤后，滤渣重复提取2次，合并滤液后减压浓缩至600mL的料液比。
取10mL的粗多糖提取液在常温下加入2g硫酸铵在涡旋振荡仪震荡溶解30s，然后加入10mL的叔丁醇。将萃取管以400rpm的速度放置于30℃的恒温震荡仪中放置30min。混合物离心(2700g，15min)形成三个澄清的相。将获得的下层水相进行流水透析以除去小分子盐，浓缩后冻干干燥，可得到31.21mg纯化的桦褐孔菌多糖。
多糖的提取率最高为2.20±0.02％，分子量为4.08×104(±6.08％)Da。
实施例四桦褐孔菌多糖单糖比例
由实施例三制备得到的桦褐孔菌多糖，经高效阴离子色谱法检测，其单糖组成为半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖，四种单糖的摩尔浓度比为2：3.5：1：1.5。
高效阴离子色谱法检测单糖组成的主要步骤如下：
取2mg多糖样品放入薄壁长试管中，加入2mol/L三氟乙酸(TFA)4mL，在110℃下水解4h，减压蒸干(低于40℃)后，加入3mL甲醇再蒸干，重复以上步骤4～5次，以完全除去TFA。用超纯水溶解定容至100mL容量瓶，稀释100倍后上样测定。
标准品：半乳糖(D-Gal)、葡萄糖(D-Glc)、***糖(D-Ara)、岩藻糖(L-Fuc)、鼠李糖(L-Rha)、甘露糖(D-Man)、木糖(D-Xyl)、果糖(D-Fru)、葡萄糖醛酸(D-GluA)和半乳糖醛酸(D-GalA)混标。
色谱条件：分离柱采用Dionex公司CarboPacTMPA20预处理柱、CarboPacTMPA20检测柱；脉冲安培检测器工作参数：E1为100mv，400ms；E2为-2000mv，20ms；E3为600mV，10ms；E4为-100mV，70ms。流动相：分别采用浓度为2.5mmol/L的NaOH作淋洗液；淋洗方法采用单一浓度淋洗。流速：0.45mL/min；上样量：25μL；温度30℃[Zhang et al.2010]。
实施例五桦褐孔菌的体外抗氧化能力
配制2mg/mL实施例三中制备得到的桦褐孔菌多糖水溶液，作为待测液。
(一)桦褐孔菌多糖清除DPPH·自由基清除率的能力测定：取2mL待测液加入2mL的2×10-4mol/L的2，2-二苯基-1-苦肼基(DPPH，Sigma公司)乙醇(50％)溶液混匀避光放置30min，在波长为517nm处检测吸光度记为A。
对照组：2mg/mL维生素C溶液，分别配置成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL不同浓度加入DPPH反应液与样品对照清除率，DPPH的清除率的计算如下所示：
式中：A1为待测液的吸光度；A2为乙醇溶液替换DPPH溶液的吸光度；A3为乙醇溶液替换样液的吸光度。
图2显示，与Vc相比，实施例三的桦褐孔菌多糖对DPPH具有很好的清除活性。结果表明，纯化的桦褐孔菌多糖在0-0.5mg/ml浓度范围内具有较好的自由基清除能力，且具有剂量依赖性，在0.5mg/mL时，DPPH的清除活性为78％。
(二)铁还原抗氧化能力测定(FRAP法)：
取待测液100μL，将溶液与新鲜的900μL FRAP试剂(10mmol/L TPTZ溶液、20mmol/L三氯化铁溶液、300mmol/L醋酸盐缓冲液的体积比1：1：10，试剂均来自Sigma公司)在37℃下混合，孵育两个小时。待孵育结束后，将紫外分光光度计的吸收波长设定为593nm，测定样品的吸光度值。然后用硫酸亚铁绘制标准曲线，将吸光度值转化对应的为FRAP值，即μmol Fe2 +/g样品。
(三)Trolox等价抗氧化能力测定(TEAC法)：
以水溶性维生素E(Trolox，Sigma公司)为参照物，考察桦褐孔菌多糖自由基清除能力。步骤如下：
(1)配制1mmol/L的Trolox标准溶液；
(2)配制7.4mmol/L的2-2-联氮-二(3-已基-苯并噻唑-6-磺酸)二胺(ABTS，Sigma公司)溶液；
(3)称取13.2mg过硫酸钾溶于20mLABTS溶液中，暗处搅拌14个小时；
(4)将紫外分光光度计的吸收波长设定为734nm，用磷酸缓冲液(PBS，GIBCO)来稀释获得吸光度值为0.7的对应溶液；
(5)将0.1mL待测液加入3.9mL(4)获得的稀释溶液，室温下混匀20min，在紫外吸收波长为743nm下测吸光度值。
(6)取已知不同浓度Trolox溶液，绘制关于Trolox浓度与吸光度值的标准曲线，以TEAC值表示，即μmol Trolox/g样品。
图3说明，通过FRAP和TEAC法测定三相萃取后桦褐孔菌多糖的抗氧化能力，对Fe2+还原及清除ABTS·+自由基的能力分别为1040.5μmol Fe2+/g样品和251.2μmol Trolox/g，说明实施例三中制备得到的桦褐孔菌多糖在体外显示出明显的抗氧化能力。
实施例六桦褐孔菌多糖对巨释细胞RAW 264.7释放NO的影响
用RPMI 1640培养基将实施例三种制备的桦褐孔菌多糖样品稀释至50、100、200、500μg/mL，测定巨释细胞RAW 264.7(中科院细胞所)释放NO的量，阳性对照为细菌脂多糖(LPS，Sigma公司)(终浓度为1μg/mL)，阴性对照为磷酸缓冲液(PBS)，CO2培养箱37℃恒温48小时。取100μL上清于96孔板，加入50μL Griess试剂(GIBCO公司)，CO2培养箱37℃恒温孵育10分钟，测定543nm吸光度值，根据标曲计算巨噬细胞释放NO的量。
图4显示，体外刺激巨噬细胞产生的NO的活性试验结果可以看出，实施例三制备得到的桦褐孔菌多糖有较好的免疫活性，有一定的梯度依赖性。

Claims (1)

1.一种制备桦褐孔菌多糖的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
(1)桦褐孔菌子实体粉碎后用乙醇超声脱脂，过滤，滤渣挥干酒精后，沸水提取3次，合并滤液后，减压浓缩至料液比为1g：12mL的提取液；
(2)提取液中加入硫酸铵溶解，然后加入0.5-3倍体积的叔丁醇，恒温30℃反应15-90min，离心分层；
(3)将下层水相使用截留分子量为8000-10000的透析袋流水透析，透析袋内溶液浓缩后干燥，可得到纯化的桦褐孔菌多糖。
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