CN106946998A - 一种天然抗氧化剂灰喇叭菌多糖ccpp‑1及其制备方法和用途 - Google Patents
一种天然抗氧化剂灰喇叭菌多糖ccpp‑1及其制备方法和用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种天然抗氧化剂灰喇叭菌多糖CCPP‑1及其制备方法和用途，其中灰喇叭菌多糖CCPP‑1的分子量为1.85×106Da，其单糖组成按摩尔比构成为葡萄糖：鼠李糖：甘露糖：木糖：葡萄糖醛酸＝0.47：0.05：1：0.86：0.006。本发明提取获得的CCPP‑1对DPPH、羟基自由基都有明显的清除作用，当浓度为400ug/ml时，清除率都达到与VC相当，可作为天然高效抗氧化剂，应用于食品、药品和化妆品等领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种天然抗氧化剂灰喇叭菌多糖CCPP-1及其制备方法和用途，属于食品加工领域。
背景技术
真菌多糖是通过对其子实体或者经过发酵产生的菌丝体、发酵液中分离得到的一种活性多糖。近年来，真菌多糖因其广泛的生物活性和天然无副作用的功效受到越来越多的关注和研究。多糖在免疫调节、抗氧化、抗肿瘤方面具有重要的生物或活性。大量的研究表明多糖具有抗氧化活性，如平菇多糖，灵芝多糖等。因此，多糖在食品、医药方面具有巨大的开发价值广泛应用于生物医学、食品营养健康等领域。
灰喇叭菌是一种菌体灰黑色的大型真菌，是蘑菇目、鸡油菌科、喇叭菌属的一个成员。灰喇叭菌产于四川及云南的深山老林中，可食用，是一种非常受欢迎的野生食用菌。目前这种食用菌深受欧洲的喜爱，被他们称为“美味佳肴”。
灰喇叭菌营养丰富，据文献报道，每百克干品中总脂肪占4.88％，粗蛋白占69.45％，灰分占12.22％，碳水化合物占13.44％，主要含有甘露糖，海藻糖等，具有很高的营养价值。目前研究大多集中于灰喇叭粗提取的抗菌活性、免疫活性、对癌细胞的抗癌活性和营养方面，对灰喇叭菌多糖的提取分离及生物活性的研究未见有文献报道。
发明内容
本发明旨在提供一种天然抗氧化剂灰喇叭菌多糖CCPP-1及其制备方法和用途，目的是从灰喇叭菌中分离纯化一种高抗氧化性的活性多糖，命名为CCPP-1，可作为一种天然的抗氧化剂，广泛应用于食品、医药和化妆品等领域。
本发明是从灰喇叭菌多糖中分离纯化抗氧化性的活性多糖组分，结果发现，灰喇叭菌多糖CCPP-1在400ug/ml对DPPH和羟基的清除能力几乎与VC相当，具有很高的研究价值和开发应用前景。
经过HPLC测定，本发明CCPP-1的分子量为1.85×106Da，其单糖组成按摩尔比构成为葡萄糖：鼠李糖：甘露糖：木糖：葡萄糖醛酸＝0.47：0.05：1：0.86：0.006。
本发明天然抗氧化剂灰喇叭菌多糖CCPP-1的制备方法，包括提取和分离纯化各单元过程：
所述提取过程包括如下步骤：
1、称取100g灰喇叭菌子实体烘干粉碎并过80目筛得到粉料；
2、将步骤1得到的粉料加入双蒸水中，75-85℃下浸提4h，料液比1g：30mL，提取三次，合并提取液并浓缩至100mL，浓缩液经4000r/min离心10分钟，取上清液；
3、将步骤2得到的上清液加入95％的乙醇中，4℃静置8-12h，4000r/min下离心20min，收集沉淀物；
4、将步骤3得到的沉淀物用双蒸水溶解，旋转蒸发仪旋蒸除去残留的乙醇，得到粗多糖溶液；向粗多糖溶液中加入Sevage试剂，体积比为3:1，磁力搅拌1小时，4000r/min离心10分钟，保留上清液；Sevage试剂重复除蛋白5次，合并上清液，浓缩后于-80℃冷冻2h，冷冻后放入冻干机中于-56℃、0.10mbar下冻干2天，得到灰喇叭菌粗多糖；
所述分离纯化过程包括如下步骤：
1、将灰喇叭菌粗多糖用双蒸水配成10％的溶液，用DEAE-Sephorase F.F凝胶柱分离，上样量为10ml，0-1.5mol/L NaCl溶液梯度洗脱，流速为1ml/min，用AKTA仪器实时监测，经过3500Da的透析袋透析后，浓缩，-80℃冷冻2h，随后放入冻干机中于-56℃、0.10mbar下冻干2天，得到组分1；
2、将所得组分1用双蒸水配成0.1％的溶液，过0.22μm的过滤膜，用Superdex-75柱层析分离，双蒸水洗脱，流速1ml/min，用AKTA仪器实时监测，收集得到均一的灰喇叭菌多糖CCPP-1。
对分离纯化得到的CCPP-1进行体外抗氧化活性实验，结果表明：本发明提取的CCPP-1对DPPH、羟基自由基具有很高的自由基清除作用。
经HPLC分析测定，CCPP-1的分子量为1.85×106Da，单糖组成按摩尔比构成为葡萄糖：鼠李糖：甘露糖：木糖：葡萄糖醛酸＝0.47：0.05：1：0.86：0.006。
本发明灰喇叭菌多糖CCPP-1的用途，是在食品、药品或化妆品领域作为抗氧化剂使用，对DPPH、羟基自由基具有显著的清除作用。
本发明的有益效果体现在：
本发明灰喇叭菌CCPP-1提取、分离纯化简便，是一种天然的高抗氧化剂，提取获得的CCPP-1对DPPH、羟基自由基都有明显的清除作用，当浓度为400ug/ml时，清除率都达到与VC相当，可作为天然高效抗氧化剂，应用于食品、药品和化妆品等领域。
附图说明
图1是CCPP-1分子量测定HPLC色谱图。从图1B中可以看出，灰喇叭菌多糖CCPP-1为纯品，CCPP-1的保留时间为4.518min；从图1A标准曲线计算出CCPP-1的分子量为1.85×106Da。
图2是处理次数对蛋白去除率和多糖损失率的影响。从图2中可以看出，随着处理次数的增加，蛋白质去除率和多糖损失率都随之增加。前5次蛋白质去除率和多糖损失率都增加的很快，5次以后增加速度变缓慢。综合考虑选择处理次数为5次，此时蛋白去除率为72％，多糖损失率为36％。
图3是样液比对蛋白去除率和多糖损失率的影响。从图3中可以看出，随着样液比的增大，蛋白质去除率和多糖损失率都逐渐降低。蛋白去除率在5∶1时最小，在3∶1到4∶1过程中，去除率降低的最多，在3∶1到5∶1时多糖损失率的减少比较缓慢，在3∶1时为30.2％。综上所述选择3∶1的样液比最为适合。
图4是CCPP-1水解物的HPLC色谱图(1溶剂峰；2GlcA；3Rha；4Man；5Xyl)。从图4中可以定性定量分析出CCPP-1的单糖组成和单糖比例。可以看到从左到右，1代表溶剂峰，CCPP-1共有五种单糖，其摩尔比分别为葡萄糖：鼠李糖：甘露糖：木糖：葡萄糖醛酸＝0.47：0.05：1：0.86：0.006。
图5是灰喇叭菌多糖CCPP-1对DPPH的清除能力。从图5中可以看出灰喇叭菌多糖CCPP-1从25μg/ml至400μg/ml范围内，DPPH自由基的清除能力随着浓度的增大而增强，呈现一定的浓度依赖性。在400μg/ml时清除率高达81.2％，与VC的清除率86.32％非常接近，由此可以看出CCPP-1对DPPH的清除能力显著，与VC相当。
图6是灰喇叭菌多糖CCPP-1对羟基自由基清除能力。从图6中可以看出，在25μg/ml至500μg/ml对·OH的清除能力均呈现上升趋势，存在一定的浓度依赖性。在500μg/ml时CCPP-1以及VC的清除率分别为73.74％和84.4％，表现出CCPP-1对·OH具有很高的清除能力。
图7是灰喇叭菌多糖CCPP-1红外光谱图。经红外光谱(FT-IR)图可以看出灰喇叭菌多糖CCPP-1有五个典型的吸收峰在3396、2923、1643、1043cm-1附近位置。其中，在3396cm-1电话的强而宽的吸收峰，为O-H伸缩振动引起的，另一弱吸收峰2923cm-1处，是C-H伸缩振动引起的。在1643的吸收峰是由于O-H的变角振动引起的，1043处表明有吡喃环，说明CCPP-1是吡喃糖。在854cm-1和891cm-1处的吸收峰表明CCPP-1既有α构型也有β构型。
具体实施方式
实施例1：Sevage法除蛋白最佳去除工艺
(一)Sevage试剂萃取次数
1、称取灰喇叭菌子实体100g烘干粉碎并过80目筛得到粉料；
2、将步骤1得到的粉料加入双蒸水中，75-85℃下浸提4h，料液比1g：30mL，提取三次，合并提取液并浓缩到100ml，浓缩液经4000r/min离心10分钟，取上清液；
3、将步骤2得到的上清液后加入三倍体积的95％的乙醇，4℃静置8-12h，4000r/min下离心20min，收集沉淀物；
4、将步骤3得到的沉淀物用双蒸水溶解，旋转蒸发仪旋蒸除去残留的乙醇，得到粗多糖溶液；向粗多糖溶液中加入Sevage试剂，体积比为3:1磁力搅拌1小时，用Sevage试剂萃取7次，记录蛋白质去除率和多糖损失率见图2。
由图2可知，随着处理次数的增加，蛋白质去除率和多糖损失率都随之增加。前5次蛋白质去除率和多糖损失率都增加的很快，5次以后增加速度变缓慢。综合考虑选择处理次数为5次，此时蛋白去除率为72％，多糖损失率为36％。
(二)样液比对蛋白去除率和多糖损失率的影响
样品与Sevage试剂的体积比即为样液比。分别采用1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1的样液比，用Sevage试剂处理多糖溶液5次，记录5次的蛋白去除率和多糖损失率，见图3。
由图3可知，随着样液比的增大，蛋白质去除率和多糖损失率都逐渐降低。蛋白去除率在5∶1时最小，在3∶1到4∶1过程中，去除率降低的最多，在3∶1到5∶1时多糖损失率的减少比较缓慢，在3∶1时为30.2％。综上所述选择3∶1的样液比最为适合。
实施例2：分离纯化
1、将实施例1制备的灰喇叭菌粗多糖配成10％(w/w)溶液，进行阴离子交换柱层析，凝胶柱为DEAE-Sephorase F.F，上样量为10ml，0-1.5mol/L NaCl溶液梯度洗脱，流速为1ml/min，用AKTA仪器实时监测，经过3500Da的透析袋透析后，浓缩，-80℃下冷冻2h，冷冻后放入冻干机中于-56℃、0.10mbar下冻干2天，得到灰喇叭组分1。
2、将上述所得组分1用双蒸水配成0.1％的溶液，过0.22um的过滤膜，用Superdex75柱层析分离，双蒸水洗脱，流速1ml/min，用AKTA仪器实时监测，收集得到灰喇叭多糖CCPP-1。
实施例3：体外抗氧化活性测定
1、DPPH自由基清除率的测定
精密称取DPPH 10mg，用甲醇溶解并定容至200ml棕色容量瓶中，得浓度为0.3mmol/L的DPPH溶液，避光保存，备用。
分别取不同浓度的CCPP-1溶液(25、50、100、200、300、400ug/ml)2ml，置15ml离心管中，加入2ml DPPH，室温避光反应30min，于517nm波长处测定吸光值。按下列公式计算DPPH自由基清除率。
DPPH自由基清除率(％)＝A0-(AS-AC)/A0×100％
公式中，A0—2ml DPPH溶液+2ml蒸馏水的吸光值
As—2ml样品溶液+2ml DPPH溶液的吸光值
Ac—2ml样品溶液+2ml甲醇溶液的吸光值
将实验重复三次，求得清除率的平均值。结果见图5。从图5中可以看出灰喇叭菌多糖CCPP-1从25μg/ml至400μg/ml范围内，DPPH自由基的清除能力随着浓度的增大而增强，呈现一定的浓度依赖性。在400μg/ml时清除率高达81.2％，与VC的清除率86.32％非常接近，由此可以看出CCPP-1对DPPH的清除能力显著，与VC相当。
2、羟自由基清除率的测定
Fenton反应是生物体内存在的OH体外模式反应。参照Fenton反应的方法建立反应体系模型，利用H2O2与Fe2+混合产生OH(反应式H2O2+Fe2+→Fe3++OH+OH-)。Fe2+与1，10-菲罗啉在pH 2-9的范围内可形成稳定的橙红色络合物，在510nm处有最大吸收。当加入灰喇叭菌多糖CCPP-1时，CCPP-1能清除溶液中游离的OH，因而可以通过测量A值间接计算出样品灰喇叭菌多糖CCPP-1对OH的清除率。
清除率(％)＝(A2-A1)/(A0-A1)×100％
公式中：A0—不加H2O2，而加入样品时的A值。
A1—加入H2O2，但不加样品时的A值。
A2—加入H2O2和样品时的A值。
采用Fenton反应产生羟自由基，在10mL具比色管中依次加入0.2mL1，10-菲罗啉(5mmol/L)，1mL Tris-HCl缓冲溶液(50mmol/L，PH 6.0)，0.2mL硫酸亚铁(7.5mmol/L)，0.2mL H2O2(1％)和不同体积的灰喇叭菌多糖CCPP-1，无水乙醇定容至10mL，然后于37℃超级恒温水浴中反应60min，在510nm处测量A值，平行3次，结果见图6。从图6中可以看出，在25μg/ml至500μg/ml对·OH的清除能力均呈现上升趋势，存在一定的浓度依赖性。在500μg/ml时CCPP-1以及VC的清除率分别为73.74％和84.4％，表现出CCPP-1对·OH具有很高的清除能力。
Claims (8)
1.一种天然抗氧化剂灰喇叭菌多糖CCPP-1，其特征在于：所述灰喇叭菌多糖CCPP-1的分子量为1.85×106Da，其单糖组成按摩尔比构成为葡萄糖：鼠李糖：甘露糖：木糖：葡萄糖醛酸＝0.47：0.05：1：0.86：0.006。
2.一种权利要求1所述的天然抗氧化剂灰喇叭菌多糖CCPP-1的制备方法，包括提取和分离纯化各单元过程，其特征在于所述提取过程包括如下步骤：
(1)称取100g灰喇叭菌子实体烘干粉碎并过80目筛得到粉料；
(2)将步骤(1)得到的粉料加入双蒸水中，75-85℃下浸提4h，提取三次，合并提取液并浓缩，离心后留取上清液；
(3)将步骤(2)得到的上清液加入95％的乙醇中，4℃静置8-12h，离心并收集沉淀物；
(4)将步骤(3)得到的沉淀物用双蒸水溶解，旋转蒸发仪旋蒸除去残留的乙醇，得到粗多糖溶液；向粗多糖溶液中加入Sevage试剂，体积比为3:1，磁力搅拌1小时，离心后保留上清液；Sevage试剂重复除蛋白5次，合并上清液，浓缩后于-80℃冷冻2h，冷冻后放入冻干机冻干，得到灰喇叭菌粗多糖。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中，将步骤(1)得到的粉料加入双蒸水中时控制料液比为比1g：30mL。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
步骤(4)中，冻干机冻干参数为：温度-56℃，气压0.10mbar，时间2天。
5.一种权利要求1所述的天然抗氧化剂灰喇叭菌多糖CCPP-1的制备方法，包括提取和分离纯化各单元过程，其特征在于所述分离纯化过程包括如下步骤：
(1)将灰喇叭菌粗多糖用双蒸水配成10％的溶液，用DEAE-Sephorase F.F凝胶柱分离，上样量为10ml，0-1.5mol/L NaCl溶液梯度洗脱，流速为1ml/min，用AKTA仪器实时监测，透析后浓缩，-80℃冷冻2h，随后放入冻干机中冻干，得到组分1；
(2)将所得组分1用双蒸水配成0.1％的溶液，过0.22μm的过滤膜，用Superdex-75柱层析分离，双蒸水洗脱，流速1ml/min，用AKTA仪器实时监测，收集得到均一的灰喇叭菌多糖CCPP-1。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中，透析时使用3500Da的透析袋。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中，冻干机冻干参数为：温度-56℃，气压0.10mbar，时间2天。
8.一种权利要求1所述的天然抗氧化剂灰喇叭菌多糖CCPP-1的用途，其特征在于：所述灰喇叭菌多糖CCPP-1在食品、药品或化妆品领域作为抗氧化剂使用，对DPPH、羟基自由基具有显著的清除作用。
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