CN105147717A - 桦褐孔菌多糖组分在防治慢性胰腺炎中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了桦褐孔菌多糖组分在防治慢性胰腺炎中的应用，属于医药技术领域。本发明的桦褐孔菌多糖组分，可以用于防治慢性胰腺炎，0.4g/kg小鼠体重的桦褐孔菌多糖组分可有效增加慢性胰腺炎小鼠胰腺中超氧化物歧化酶的含量，减少丙二醛的累积。同时，可以减少血清中IL-1β和IFN-γ的产生。有效降低淀粉酶以及乳酸脱氢酶的含量，减少羟脯氨酸的合成。本发明的方法从免疫代谢调节的角度减缓病情，与传统中医的调理积热、食滞，以及西医药物止痛和手术等方法相比，具有无毒副作用、避免手术痛苦，治疗周期短、安全方便，对小鼠慢性胰腺炎的预防和治疗具有显著效果等优点。

Description

桦褐孔菌多糖组分在防治慢性胰腺炎中的应用

技术领域

本发明涉及一种天然食药用真菌多糖组分，具体涉及桦褐孔菌多糖组分在防治慢性胰腺炎中的应用，属于医药技术领域。

背景技术

慢性胰腺炎是一种可以改变组织正常结构及内外分泌功能的长期存在的胰腺炎症。慢性胰腺炎的特征是炎性细胞浸润，腺泡萎缩，肉芽组织形成，不规则纤维化和导管异常等(Inui,K.,Yoshino,J.,Miyoshi,H.,Yamamoto,S.,Kobayashi,T.,2013.Newdevelopmentsindiagnosisandnon-surgicaltreatmentofchronicpancreatitis.JournalofGastroenterologyandHepatology.28,108–112.)。胰腺纤维化是胰腺的一种典型的组织病理学特征(PhillipsP.,2012.Pancreaticstellatecellsandfibrosis,in:Grippo,P.J.,Munshi,H.G.(Eds.),PancreaticCancerandTumorMicroenvironment.E-PublishingInc.,Trivandrum,pp.Chapter3.)。它有发展为胰腺癌的危险，研究表明5-10年的累积发病率为1.1％-1.7％(Malka,D.,Hammel,P.,Maire,F.,Rufat,P.,Madeira,I.,Pessione,F.,Lévy,P.,Ruszniewski,P.,2002.Riskofpancreaticadenocarcinomainchronicpancreatitis.Gut.51,849-852；Karlson,B.M.,Ekbom,A.,Josefsson,S.,McLaughlin,J.K.,Fraumeni,J.F.J.,Nyrén,O.,1997.Theriskofpancreaticcancerfollowingpancreatitis:anassociationduetoconfoundingGastroenterology.113(2),587-592.)。大量的饮酒，遗传以及环境因素都可以引起慢性胰腺炎(Braganza,J.M.,Lee,S.H.,Mccloy,R.F.,Mcmahon,M.J.,2011.Chronicpancreatitis.Lancet.377(9772),1184-1197.)。在一些国家慢性胰腺炎的发病率大约是每十万人中有3.5到10人左右(Witt,H.,Apte,M.V.,Keim,V.,Wilson,J.S.,2007.Chronicpancreatitis:Challengesandadvancesinpathogenesis,genetics,diagnosis,andtherapy.Gastroenterology.132(4),1557–1573.)。然而，快节奏的生活以及饮酒等不健康的生活方式导致发病率逐渐增加。如今慢性胰腺炎在中国的发病率约为1％，是二十世纪五十年代的20倍。

由于慢性胰腺炎的病理学机制不是完全清楚，还没有有效的药物用于彻底治疗由慢性胰腺炎引起的炎症、纤维化以及疼痛。西医治疗胰腺炎的方法主要有利用阿片生物碱类药物止痛，内窥镜清除坏死组织甚至切除胰腺等，中医则主要针对肠胃积热、肝胆湿热及脾虚食滞等进行调理。近年来，人们意识到氧自由基衍生物在胰腺炎引起的腹痛中扮演主要的角色，推断清除氧自由基提高抗氧化能力可以减缓和治疗慢性胰腺炎(Szuster,C.A.,Daniluk,J.,Kandefer,S.M.,2001.Oxidativestressinbloodofpatientswithalcohol-relatedpancreatitis.Pancreas.22(3),261–266；Bhardwaj,P.,Garg,P.K.,Maulik,S.K.,Saraya,A.,Tandon,R.K.,Acharya,S.K.,2009.Arandomizedcontrolledtrialofantioxidantsupplementationforpainreliefinpatientswithchronicpancreatitis.Gastroenterology.136(1),149–159.)。灵芝和香菇等食用菌的多糖提取物已经被证实具有抗氧化能力和对炎症的减缓作用。YosukeNishitani等人的研究结果表明香菇多糖通过抑制IL-8mRNA的表达调节炎症，并且结肠炎小鼠口服多糖可以减缓其炎症的发生(Nishitani,Y.,Zhang,L.,Yoshida,M.,Azuma,T.,Kanazawa,K.,Hashimoto,T.,Mizuno,M.,2013.Intestinalanti-inflammatoryactivityofLentinan:influenceonIL-8andTNFR1expressioninintestinalepithelialcells.PLoSOne.8(4),e62441.)。YanZhou等发现灵芝可以通过维持NO和iNOS在正常水平上产生和表达来实现抗炎作用(Zhou,Y.,Chen,S.,Ding,R.,Yao,W.B.,Gao,X.D.,2014.InflammatorymodulationeffectofglycopeptidefromGanodermacapense(Lloyd)Teng.Mediatorsofinflammation.2014,691285.)。

桦褐孔菌，又名白桦茸，是担子菌亚门的一种白腐菌，它可以生长在亚洲，欧洲和北美洲的部分地区的白桦，银桦，榆树和赤杨等树的树干上。在俄罗斯，日本和东欧等地区桦褐孔菌已经当做偏方使用超过四个世纪(Chen,H.,Yan,M.C.,Zhu,J.W.,Xu,X.Q.,2011.Enhancementofexo-polysaccharideproductionandantioxidantactivityinsubmergedculturesofInonotusobliquusbylignocellulosedecomposition.Journalofindustrialmicrobiology&biotechnology.38(2),291-298.)。在俄罗斯桦褐孔菌药酒被用于预防和治疗胃部疾病甚至癌症(Mishra,S.K.,Kang,J.H.,Kim,D.K.,Oh,S.H.,Kim,M.K.,2012.OrallyadministeredaqueousextractofInonotusobliquusamelioratesacuteinflammationindextransulfatesodium(DSS)-inducedcolitisinmice.JournalofEthnopharmacology.143(2),524–532.)。在日本和韩国，桦褐孔菌也被用于减缓疼痛，心脏病，肺结核，胃部疾病和清洁剂。动物和临床试验表明桦褐孔菌可以作为药物预防和治疗癌症，心脏病，糖尿病，艾滋病等(Song,Y.,Hui,J.,Kou,W.,Xin,R.,Jia,F.,Wang,N.,Hu,F.,Zhang,H.,Liu,H.,2008.IdentificationofInonotusobliquusandanalysisofantioxidationandantitumoractivitiesofpolysaccharides.CurrentMicrobiology.57(5),454–462.)。化学分析表明，野生桦褐孔菌菌核中含有超过200多种活性物质，其中最重要的多糖成分具有抗氧化(Ma,L.S.,Chen,H.X.,Zhang,Y.,Zhang,N.,Fu,L.L.,2012.ChemicalmodificationandantioxidantactivitiesofpolysaccharidefrommushroomInonotusobliquus.CarbohydratePolymers.89(2),371–378.)，抗肿瘤(KimYO,ParkHW,KimJH,LeeJY,MoonSH,ShinCS.Anti-cancereffectandstructuralcharacterizationofendo-polysaccharidefromcultivatedmyceliaofInonotusobliquus.LifeSci,2006,79:72–80.)，抗炎(Choi,S.Y.,Hur,S.J.,An,C.S.,Jeon,Y.H.,Jeoung,Y.J.,Bak,J.P.,Lim,B.O.,2010.Anti-inflammatoryeffectsofInonotusobliquusincolitisinducedbydextransodiumsulfate.JournalofBiomedicineandBiotechnology.2010,943516.)和抗病毒(ZjawionyJK.BiologicallyactivecompoundsfromAphyllophorales(polypore)Fungi.NaturalProducts.2004,67:300-310.)。Du等人发现水溶性多糖组分在体外具有很强的还原和清除DPPH自由基，羟自由基，超氧阴离子基团和过氧化氢等自由基的抗氧化能力(Du,X.J.,Mu,H.M.,Zhou,S.,Zhang,Y.,Zhu,X.L.,2013.ChemicalanalysisandantioxidantactivityofpolysaccharidesextractedfromInonotusobliquussclerotia.InternationalJournalofBiologicalMacromolecules.62,691-696.)。目前，还没有关于桦褐孔菌多糖减缓慢性胰腺炎研究的报道。本发明的目的是利用桦褐孔菌多糖组分预防和/或治疗慢性胰腺炎及胰腺组织损伤相关疾病。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有减缓胰腺损伤、用于防治慢性胰腺炎的桦褐孔菌多糖有效组分，并使用该组分对慢性胰腺炎进行防治.

本发明提供了桦褐孔菌多糖组分的一种新的用途，即桦褐孔菌多糖组分在防治慢性胰腺炎中的应用。

在本发明中，优选的，所述桦褐孔菌多糖组分包括鼠李糖、***糖、木糖、甘露糖、葡萄糖以及半乳糖。

在本发明中，优选的，所述桦褐孔菌多糖组分中各组分的质量比为：鼠李糖：***糖：木糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖＝13.0-14.0：5.1-5.5：21.2-21.8：9.5-10.0：28.9-29.3：20.1-20.5。

更优选的，所述桦褐孔菌多糖组分中各组分的质量比为：鼠李糖：***糖：木糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖＝13.6：5.4：21.6：9.8：29.1：20.5。

在本发明中，优选的，所述桦褐孔菌多糖组分的最低有效浓度为0.4g/kg。

在本发明中，优选的，所述桦褐孔菌多糖组分的制备方法为：

(1)桦褐孔菌菌核在70℃的烘箱中烘干至恒重后磨成粉末，加入体积百分比为70％～80％的乙醇，室温下静置提取24-72h以去除粉末中的杂质，对提取液离心，收集残渣；

(2)使用超声波辅助提取法提取残渣中的多糖，对超声提取液过滤离心，收集上清液；上清液使用旋转蒸发仪浓缩，浓缩液使用sevage试剂去除蛋白，离心，收集上清液；上清液中加入4倍于上清液体积的无水乙醇，4℃醇沉1～3次，每次12h，离心，沉淀冷冻干燥，获得桦褐孔菌组分粗多糖；

(3)向步骤(2)所得的桦褐孔菌粗多糖加蒸馏水溶解，离心除去沉淀，取上清液；上清液过阴离子交换层析柱，使用0.03-0.08M氯化钠进行洗脱，洗脱速度0.4mL/min，洗脱1-4倍柱体积，收集洗脱液；洗脱液放进葡聚糖凝胶中，4℃条件下在蒸馏水中透析72h。透析液使用旋转蒸发仪浓缩。浓缩液冷冻干燥，获得桦褐孔菌多糖组分。

在本发明中，优选的，所述使用旋转蒸发仪浓缩为在50℃条件下使用旋转蒸发仪浓缩。

在本发明中，优选的，步骤(2)中所述超声波辅助提取法的条件为：在80℃下超声120min，功率为80W，残渣与蒸馏水的质量比为1:10；所述对超声提取液过滤离心为对超声提取液过滤后，7500rpm室温下离心30min；所述sevage试剂为氯仿与正丁醇按照体积比5:1混合后的溶液；所述sevage试剂与浓缩液的体积比为1:5。

在本发明中，优选的，步骤(3)中所述氯化钠的浓度为0.05M；所述柱体积为2倍柱体积。

在本发明中，优选的，步骤(3)中桦褐孔菌粗多糖与蒸馏水的质量比为1:40；所述离心除去沉淀为4500rpm离心15min除去沉淀；

本发明采用糖腈乙酸酯衍生物气相色谱法对纯化的桦褐孔菌多糖组分进行分析，具体步骤为：取纯化的桦褐孔菌多糖组分10mg于加入2.0mol/L的三氟乙酸2.0mL的水解管中，真空封管121℃水解1.5h，冷却后使用玻璃棉过滤，再减压蒸干三氟乙酸。依次加入10mg盐酸羟胺、肌醇适量和0.50mL无水吡啶，90℃温度下反应30min，然后冷却至室温，加入0.50mL无水醋酸酐，90℃水浴反应30min。所得产物直接使用气相色谱分析。

同时，本发明采用柱前衍生高效液相色谱法对纯化的桦褐孔菌多糖组分进行分析，具体步骤为：取纯化的桦褐孔菌多糖组分3mg溶于3mL纯水中，加入4mol/L的三氟乙酸1.0mL于水解管中，充N₂后封管，110℃水解2h，冷却后，减压蒸干，加入500μL甲醇再次蒸干，重复3次，除去三氟乙酸，用1mL纯水复溶。取200μL上述水解液于5mL具塞试管中，加入0.3mol/LNaOH溶液120μL，0.5mol/L衍生化试剂1－苯基－3－甲基－吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液120μL，70℃水浴2h，冷却后加入120μL0.3mol/L的HCl溶液，再加入2mL氯仿振荡后静置，弃下层液体，重复3次。所得产物直接使用LC-20ADXR型高效液相色谱仪分析。色谱条件：采用Agilent1200色谱***，单元泵，紫外检测器，色谱柱：HypersilBDS-C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH6.7)-乙腈(体积比为82∶18)；流速：1mL/min；检测波长：250nm；柱温：30℃；进样量：10μL；等梯度洗脱。

分析结果表明，桦褐孔菌多糖组分包括鼠李糖，***糖，木糖，甘露糖，葡萄糖以及半乳糖，桦褐孔菌多糖组分中各组分的质量比为：鼠李糖：***糖：木糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖＝13.6：5.4：21.6：9.8：29.1：20.5。

对本发明制备得到的桦褐孔菌多糖组分进行药理活性评价，小鼠利用二乙基二硫代氨基甲酸钠造模后随机分组，然后对慢性胰腺炎患病小鼠进行桦褐孔菌多糖组分喂养五周，给药剂量分别为低、中、高剂量组(0.1,0.2和0.4g/kg小鼠体重)。5周后观察小鼠的形态特征、胰腺病理学特征、胰腺组织氧化压力、小鼠血清中细胞因子含量、血清中淀粉酶和乳酸脱氢酶含量以及血清中羟脯氨酸含量等指标的变化，动物实验结果表明，实验过程中小鼠体重持续增加，精神状态正常，食欲较好且皮毛光泽。小鼠胰腺组织中超氧化物歧化酶和丙二醛的含量处于正常范围。血清中IL-1β和IFN-γ的含量显著降低。淀粉酶、乳酸脱氢酶和羟脯氨酸也趋于正常值。说明本发明桦褐孔菌多糖组分对小鼠慢性胰腺炎的预防和治疗具有显著效果。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

本发明的桦褐孔菌多糖组分，可以用于治疗或预防慢性胰腺炎，0.4g/kg小鼠体重的桦褐孔菌多糖组分可有效增加慢性胰腺炎小鼠胰腺中超氧化物歧化酶的含量，减少丙二醛的累积。同时，可以减少血清中IL-1β和IFN-γ的产生。有效降低淀粉酶以及乳酸脱氢酶的含量，减少羟脯氨酸的合成。与传统中医的调理积热、食滞，以及西医药物止痛和手术等方法相比，可有效避免手术的痛苦，并从免疫代谢的角度减缓病情。此方法安全方便，对小鼠慢性胰腺炎的预防和治疗具有显著效果。

附图说明

图1为桦褐孔菌多糖组分的液相色谱图；

图2为本发明给药五周后每组小鼠的平均体重图；

图3为本发明给药五周后每组小鼠胰腺组织中超氧化物歧化酶和丙二醛的含量图；

图4为本发明给药五周后每组小鼠血清中IL-1β含量图；

图5为本发明给药五周后每组小鼠血清中的IFN-γ水平图；

图6为本发明给药五周后每组小鼠血清淀粉酶含量图；

图7为本发明给药五周后每组小鼠血清中乳酸脱氢酶含量图；

图8为本发明给药五周后每组小鼠血清中羟脯氨酸的含量图。

具体实施方式

下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

实施例1桦褐孔菌多糖组分的提取、纯化和分析

桦褐孔菌菌核由中国哈尔滨贝加尔泰生物工程公司提供。葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)、鼠李糖(Rha)、***糖(Ara)、木糖(Xyl)、半乳糖醛酸(GalUA)，购于sigma公司；衍生化试剂：1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)，纯度99％购于AcrossOrganics公司。

高效液相色谱仪(Agilent1200型)，安捷伦科技有限公司；色谱柱：HypersilBDS-C18(250mm×4.6mm，5μm)，大连依利特分析仪器有限公司。

(1)桦褐孔菌多糖组分的提取

桦褐孔菌菌核需在70℃的烘箱中烘干至恒重，然后磨成粉末，加入体积百分比为70％～80％的乙醇，室温下静置提取24-72h以去除粉末中的杂质，对提取液离心收集残渣；使用超声波辅助提取法提取残渣中的多糖，超声波辅助提取法条件为：在80℃下超声120min，功率为80W，残渣与蒸馏水的质量比为1:10，然后对超声提取液过滤，7500rpm室温下离心30min，收集上清液；所得的上清液使用旋转蒸发仪在50℃条件下浓缩，浓缩液使用sevage试剂(v/v，氯仿：正丁醇＝5:1)去除蛋白，sevage试剂与浓缩液的体积比为1:5，收集上清液；最后，上清液中加入4倍于上清液体积的无水乙醇，4℃醇沉1～3次，每次12h，离心，沉淀冷冻干燥，获得桦褐孔菌组分粗多糖。

(2)桦褐孔菌多糖组分的纯化

将1g桦褐孔菌组分粗多糖溶解在40mL蒸馏水中，4500rpm离心15min。上清液在阴离子交换层析柱(1.6×40cm)中使用蒸馏水平衡后，上清液进行上样，层析柱依次使用0.05M氯化钠，0.1M氯化钠和0.2M氯化钠进行梯度洗脱获得IOP-1，IOP-2和IOP-3，0.4mL/min洗脱速度下下收集洗脱液，10分钟收集1管，每个梯度洗脱液收集20管。每个梯度洗脱液再分别放进葡聚糖凝胶中，4℃条件下在蒸馏水中透析72h，透析液使用旋转蒸发仪在50℃条件下浓缩纯化的组分，浓缩液最后冷冻干燥，获得桦褐孔菌多糖组分。苯酚硫酸法测定每管洗脱液中的多糖浓度。取多糖含量最高的IOP-1中的第10管，即IOP-1(10)进行组分分析。

(3)桦褐孔菌多糖组分分析

本发明采用柱前衍生高效液相色谱法和糖腈乙酸酯衍生物气相色谱法对纯化的桦褐孔菌多糖组分IOP-1(10)进行分析，其中，采用柱前衍生高效液相色谱法的具体步骤如下：

①多糖水解

取多糖样品IOP-1(10)3mg溶于3mL纯水中，得到多糖水溶液，分别过0.45μm滤膜，取1mL过膜的多糖水溶液置于安瓿瓶中，再加入4mol/L三氟乙酸1mL，充N₂后封管，110℃条件下反应2h，放至室温，打开安瓿瓶，减压蒸干，向安瓿瓶中加入500μL甲醇再次蒸干，重复3次，带走残余的三氟乙酸，用1mL纯水复溶，过0.45μm滤膜，备用。

②标准溶液配制

标准储备液由葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、***糖、半乳糖醛酸、甘露糖这6种单糖标准品组成，配各单糖的浓度均为1mmol/L的标准储备液，4℃条件下保存，工作液由储备液进一步稀释得到，过0.45μm滤膜后进行HPLC分析。

③单糖衍生过程

取200μL混合标准品溶液或多糖水解液，置于5mL具塞试管中，加入0.3mol/LNaOH溶液120μL，0.5mol/LPMP甲醇溶液120μL，使用漩涡混匀器混匀，70℃水浴条件下反应2h，并不时振荡，反应结束后取出试管，冷却至室温，加入120μL0.3mol/LHCl中和反应体系，加入2mL氯仿充分振荡，静置，弃下层有机相，重复萃取3次，去除反应体系中未反应的PMP，上层水相过0.45μm膜后进行液相色谱分析。

④色谱条件

采用Agilent1200色谱***，单元泵，紫外检测器，色谱柱：HypersilBDS-C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH6.7)-乙腈(体积比为82∶18)；流速：1mL/min；检测波长：250nm；柱温：30℃；进样量：10μL；等梯度洗脱。液相色谱结果见图1。

采用糖腈乙酸酯衍生物气相色谱法对纯化的桦褐孔菌多糖组分IOP-1(10)进行分析，具体步骤如下：

取纯化的桦褐孔菌多糖组分10mg于加入2.0mol/L的三氟乙酸2.0mL的水解管中，真空封管121℃水解1.5h，冷却后使用玻璃棉过滤，再减压蒸干三氟乙酸。依次加入10mg盐酸羟胺、肌醇适量和0.50mL无水吡啶，90℃温度下反应30min，然后冷却至室温，加入0.50mL无水醋酸酐，90℃水浴反应30min。所得产物直接使用气相色谱(VarianInc.,PaloALto,CA,USA)分析。

分析结果表明：桦褐孔菌多糖组分包括鼠李糖，***糖，木糖，甘露糖，葡萄糖以及半乳糖，桦褐孔菌多糖组分中各组分的质量比为：鼠李糖：***糖：木糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖＝13.6：5.4：21.6：9.8：29.1：20.5。

实施例2桦褐孔菌多糖组分的药理活性评价

(1)试验材料：

试验所用小鼠是从黑龙江中医药大学药物安全性评价中心购买的五周龄昆明白小鼠。二乙基二硫代氨基甲酸钠购自济宁汇德化工有限公司，清胰利胆冲剂购自长春银诺克药业有限公司，细胞因子ELISA试剂盒，淀粉酶和乳酸脱氢酶试剂盒及羟脯氨酸试剂盒购自南京建成科技有限公司，桦褐孔菌多糖组分为按照实施例1的方法制备得到的IOP-1中的第10管，即IOP-1(10)。

(2)试验方法：

①慢性胰腺炎小鼠造模及给药：使用二乙基二硫代氨基甲酸钠对小鼠进行造模。六十只小鼠随机分成6组：三组桦褐孔菌多糖组分处理组(低、中、高剂量)，清胰利胆冲剂组，二乙基二硫代氨基甲酸钠组，空白对照组。除了空白对照组小鼠，其它组小鼠每周腹腔注射两次二乙基二硫代氨基甲酸钠，二乙基二硫代氨基甲酸钠须配成10％浓度的溶液，现用现配，每次注射的量为0.5g/kg小鼠体重，共注射四周。桦褐孔菌多糖组分处理组小鼠从第二周开始每天分别喂0.1,0.2和0.4g/kg小鼠体重的桦褐孔菌多糖组分，共五周。清胰利胆冲剂组小鼠每天喂3.7g/kg小鼠体重的清胰利胆冲剂。空白对照组小鼠每天喂0.5mL生理盐水。所有小鼠都在25℃恒温恒湿的12h黑白交替的房间中饲养。实验过程中没有小鼠死亡。在第五周实验结束时，记录小鼠的体重后，颈椎脱臼法处理小鼠。

②胰腺病理学特征观察：取小鼠胰腺，去除脂肪并把胰腺放在冰的磷酸盐缓冲液中几分钟，再将其放入10％中性甲醛缓冲液中固定一夜。胰腺中的水分通过使用浓度逐渐增加的乙醇处理去除，再使用二甲苯替代残留在胰腺中的乙醇。用固体石蜡包埋胰腺，切片，再用苏木精—伊红染色法进行染色，显微镜下观察胰腺内部结构。

③桦褐孔菌多糖组分对小鼠胰腺组织氧化压力影响的分析方法：通过超氧化物歧化酶和丙二醛的水平分析组织氧化压力情况。胰腺使用声波降解法在生理盐水中制成匀浆,超氧化物歧化酶的量通过使用黄嘌呤氧化酶技术衍化而成的羟胺实验进行测量。超氧化物歧化酶的量用U/mg胰腺湿重表示。丙二醛的水平通过使用硫代巴比妥酸比色法测定。丙二醛的浓度使用nmol/mg胰腺组织湿重表示。

④慢性胰腺炎小鼠血清中细胞因子含量的分析方法：取造模小鼠眼球获得血样，收集血样后在4℃条件下3000rpm离心10分钟。血清中IL-1β和IFN-γ的含量通过使用细胞因子ELISA试剂盒测定。

⑤慢性胰腺炎小鼠血清中淀粉酶和乳酸脱氢酶含量的分析方法：收集血清后，血清淀粉酶和乳酸脱氢酶的含量使用淀粉酶和乳酸脱氢酶试剂盒测定，试剂盒的使用参照制造商的说明书。

⑥慢性胰腺炎小鼠血清中羟脯氨酸的含量分析方法：小鼠羟脯氨酸含量使用羟脯氨酸试剂盒测定。羟脯氨酸浓度用μg/mL表示。

(3)试验结果

①造模后各组小鼠的形态特征

小鼠主要特征有体重，精神状态，食欲和皮毛光泽度。图2中展示了试验结束时每组小鼠的平均体重，从图中可以看出在实验结束时所有小鼠的体重都增加了。与对照组相比，二乙基二硫代氨基甲酸钠引诱的慢性胰腺炎小鼠体重显著减小(P<0.01)。然而，与二乙基二硫代氨基甲酸钠组小鼠相比，桦褐孔菌多糖组分处理组小鼠体重显著增加(P<0.05)，并且低、中、高剂量桦褐孔菌多糖组分处理组小鼠体重逐渐增加。清胰利胆冲剂组小鼠体重与中、高剂量桦褐孔菌多糖组分处理中小鼠体重相似(P>0.05)。

对照组小鼠精神状态，食欲和皮毛光泽度都无异常。而桦褐孔菌多糖组分处理组和清胰利胆冲剂组小鼠的精神状态都比对照组差，但比烦躁不安的二乙基二硫代氨基甲酸钠引诱组小鼠好。低、中、高剂量桦褐孔菌多糖组分处理组食欲逐渐改善，比二乙基二硫代氨基甲酸钠引诱组食量高，但比对照组低。对照组小鼠毛色及光亮度自然，而二乙基二硫代氨基甲酸钠引诱组小鼠毛蓬松无光泽，而多糖组分处理组和清胰利胆冲剂组小鼠皮毛状况比二乙基二硫代氨基甲酸钠组好。

②胰腺病理学特征结果

对照组胰腺的结构没有任何异常，但是其它组胰腺结构与它不同，它们都肿胀且二乙基二硫代氨基甲酸钠处理组更加严重。二乙基二硫代氨基甲酸钠处理组胰腺出现大量的腺泡萎缩，腺泡坏死，水肿，出血，神经异常，脂肪变性，管状复合体形成，免疫细胞浸润和胶原沉积。并且胰腺纤维化在这些特征中是最显著的。

低剂量桦褐孔菌多糖组分处理组小鼠的胰腺出现萎缩，水肿，出血，炎症细胞浸润，管状复合体形成和大量胶原沉积现象。它比二乙基二硫代氨基甲酸钠处理组更缓和，但比对照组严重。桦褐孔菌多糖组分中，高剂量处理组和清胰利胆冲剂组病理特征与对照组相比它们都轻度的胰腺损伤和纤维化。与二乙基二硫代氨基甲酸钠处理组相比，它们都发生炎症，胰腺萎缩，水肿和出血，但它们都有些缓和。然而与对照组相比，它们明显发生炎症，胰腺萎缩，水肿和出血，且胰管和血管附近明显发生胶原沉积。

③桦褐孔菌多糖组分对小鼠胰腺组织氧化压力的影响

图3是胰腺组织中超氧化物歧化酶和丙二醛的含量图。从图3中可以看出桦褐孔菌多糖组分可以增加胰腺组织中超氧化物歧化酶的含量并减少丙二醛的含量。与二乙基二硫代氨基甲酸钠处理组对比桦褐孔菌多糖组分高剂量组的超氧化物歧化酶含量显著增加(P<0.01)，但与清胰利胆冲剂组对比差异不显著(P>0.05)。桦褐孔菌多糖组分低、中、高剂量处理组的丙二醛水平逐渐减少(P<0.05)，与二乙基二硫代氨基甲酸钠处理组比较它们都显著减少(P<0.05)。

④桦褐孔菌多糖组分对慢性胰腺炎小鼠血清中细胞因子含量的影响

实验五周后小鼠血清中IL-1β含量如图4所示。桦褐孔菌多糖组分低，中、高剂量处理组小鼠血清IL-1β水平逐渐减小。低，中剂量组差异显著(P<0.01)，但是中、高剂量组差异不显著(P>0.05)。并且中、高剂量组比清胰利胆冲剂组低。它们都显著低于二乙基二硫代氨基甲酸钠处理组(P<0.01)。总之，0.2和0.4g/kg剂量的桦褐孔菌多糖组分处理组对慢性胰腺炎的效果比清胰利胆冲剂组好。实验五周后小鼠血清中的IFN-γ水平如图5所示。桦褐孔菌多糖组分低、中、高剂量处理中含量分别为58.11±2.66、42.32±1.77和41.42±2.27。它们都稍高于对照组，低于二乙基二硫代氨基甲酸钠处理组，但是中、高剂量组与清胰利胆冲剂组相似(P>0.05)。

⑤桦褐孔菌多糖组分对慢性胰腺炎小鼠血清中淀粉酶和乳酸脱氢酶含量的影响

图6是实验五周后小鼠血清淀粉酶含量图。二乙基二硫代氨基甲酸钠处理组淀粉酶含量最高，对照组含量最低。桦褐孔菌多糖组分低、中、高剂量处理组分别是4600.7±125.4、3370.9±148.0和3320.7±137.1，它们逐渐减小。且清胰利胆冲剂组与中、高剂量处理组相似(P>0.05)。如图7所示，与对照组相比实验五周后其它组小鼠血清中乳酸脱氢酶含量大幅度上升，尤其是二乙基二硫代氨基甲酸钠处理组非常显著(P<0.01)。但是与二乙基二硫代氨基甲酸钠处理组相比，桦褐孔菌多糖组分处理组和清胰利胆冲剂组可以减少乳酸脱氢酶水平(P<0.01)，且减少的程度与多糖组分和冲剂的给药量密切相关。0.4g/kg剂量的桦褐孔菌多糖多糖组分的效果最明显，且0.2和0.4g/kg效果好于清胰利胆冲剂组。

⑥桦褐孔菌多糖组分对慢性胰腺炎小鼠血清中羟脯氨酸含量的影响

图8显示的是实验五周后小鼠血清中羟脯氨酸的含量图。与对照组比较，注射二乙基二硫代氨基甲酸钠后羟脯氨酸含量显著增加(P<0.01)。多糖组分处理组和清胰利胆冲剂组羟脯氨酸水平显著低于二乙基二硫代氨基甲酸钠组，但是稍高于对照组(P<0.01)。结果表明桦褐孔菌多糖组分可以减少羟脯氨酸的产生。

综上，对慢性胰腺炎患病小鼠(体重约25g)，连续五周每天灌胃10mg(0.4g/kg小鼠体重)的桦褐孔菌多糖组分IOP-1(10)，实验过程中小鼠体重持续增加，精神状态正常，食欲较好且皮毛光泽。小鼠胰腺组织中超氧化物歧化酶和丙二醛的含量处于正常范围。血清中IL-1β和IFN-γ的含量显著降低。淀粉酶、乳酸脱氢酶和羟脯氨酸也趋于正常值。说明本发明桦褐孔菌多糖组分对小鼠慢性胰腺炎的预防和治疗具有显著效果。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.桦褐孔菌多糖组分在防治慢性胰腺炎中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述桦褐孔菌多糖组分包括鼠李糖、***糖、木糖、甘露糖、葡萄糖以及半乳糖。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述桦褐孔菌多糖组分中各组分的质量比为：鼠李糖：***糖：木糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖＝13.0-14.0：5.1-5.5：21.2-21.8：9.5-10.0：28.9-29.3：20.1-20.5。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述桦褐孔菌多糖组分中各组分的质量比为：鼠李糖：***糖：木糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖＝13.6：5.4：21.6：9.8：29.1：20.5。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述桦褐孔菌多糖组分的最低有效浓度为0.4g/kg。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述桦褐孔菌多糖组分的制备方法为：

(1)桦褐孔菌菌核在70℃的烘箱中烘干至恒重后磨成粉末，加入体积百分比为70％～80％的乙醇，室温下静置提取24-72h以去除粉末中的杂质，对提取液离心，收集残渣；

(2)使用超声波辅助提取法提取残渣中的多糖，对超声提取液过滤离心，收集上清液；上清液使用旋转蒸发仪浓缩，浓缩液使用sevage试剂去除蛋白，离心，收集上清液；上清液中加入4倍于上清液体积的无水乙醇，4℃醇沉1～3次，每次12h，离心，沉淀冷冻干燥，获得桦褐孔菌组分粗多糖；

(3)向步骤(2)所得的桦褐孔菌粗多糖加蒸馏水溶解，离心除去沉淀，取上清液；上清液过阴离子交换层析柱，使用0.03-0.08M氯化钠进行洗脱，洗脱速度0.4mL/min，洗脱1-4倍柱体积，收集洗脱液；洗脱液放进葡聚糖凝胶中，4℃条件下在蒸馏水中透析72h。透析液使用旋转蒸发仪浓缩。浓缩液冷冻干燥，获得桦褐孔菌多糖组分。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述使用旋转蒸发仪浓缩为在50℃条件下使用旋转蒸发仪浓缩。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(2)中所述超声波辅助提取法的条件为：在80℃下超声120min，功率为80W，残渣与蒸馏水的质量比为1:10；所述对超声提取液过滤离心为对超声提取液过滤后，7500rpm室温下离心30min；所述sevage试剂为氯仿与正丁醇按照体积比5:1混合后的溶液；所述sevage试剂与浓缩液的体积比为1:5。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(3)中所述氯化钠的浓度为0.05M；所述柱体积为2倍柱体积。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(3)中桦褐孔菌粗多糖与蒸馏水的质量比为1:40；所述离心除去沉淀为4500rpm离心15min除去沉淀。