CN111289666A - 一种香菇多糖多元定量指纹图谱的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种香菇多糖多元定量指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：构建香菇多糖标准指纹图谱；构建香菇多糖分子量分布标准指纹图谱；通过香菇多糖标准指纹图谱和香菇多糖分子量分布标准指纹图谱共同组成香菇多糖多元指纹图谱，通过香菇多糖多元指纹图谱确定香菇多糖的单糖种类，再进行离子色谱测定香菇多糖含量，得到香菇多糖多元定量指纹图谱。本发明通过多糖定量指纹图谱结合香菇多糖多元指纹图谱，赋予指纹图谱大量的定性、定量信息，共同应用于产品质量控制，对指纹图谱中的多个目标成分进行准确定量，具有很好的紧密度、准确度、重复性和稳定性，使得质量控制更加准确、产品的质量和稳定性更加可靠。
Description
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，更具体地，涉及一种香菇多糖多元定量指纹图谱的构建方法。
背景技术
多糖是由10个或以上单糖通过缩合而形成的链状结构物质。多糖广泛分布于动物、植物和微生物中，对维持生命活动起着至关重要的作用，与蛋白质、核酸、脂类并称为生命四大基础物质。大量研究证实，多糖特别是水溶性多糖常具有良好的生物活性，如抗肿瘤、免疫促进、抗氧化、抗炎、抗病毒、降血糖、降血脂等，其研究开发具有重要意义。多糖分子的构象与多糖分子上支链的位置和数目会影响多糖分子量，同时影响多糖物理化学性质。香菇多糖的极性一般较强，结构相近，均呈多分散性，故不可能像小分子那样可以高分辨、高选择性地直接进行色谱分析。而单一的化学方法或者仪器分析方法难以从多个方面对香菇多糖的生产质量进行快速全面控制。
目前关于多糖的指纹图谱质量控制已有报道，但多采用单一指纹图谱，将多糖水解成单糖，根据单糖种类，利用相对保留时间进行判断，但在水解过程中会破坏多糖的结构，难以对多糖质量进行直观的分析。且因为多糖分子量分布从几千到几十万道尔顿不等，而不同分子量的香菇多糖，在功能性质上也会有所差异，因此对多糖的分子量分布进行分析也极为必要。现有的指纹图谱主要是对多糖水解后的单糖共有峰的指认，确认的是多糖一级结构的信息，缺少多糖分子量分布的信息，而多糖分子量分布会影响多糖的多种活性功能性质，因此难以从这一方面对多糖质量生产进行有效监控。
CN102645504A公开了一种灵芝孢子粉多糖离子色谱指纹图谱的构建方法，主要通过对灵芝孢子粉多糖的酸-酶部分水解，然后分离水解产物中的单-寡糖组分的离子色谱指纹，得到指纹特征，获得灵芝孢子粉多糖离子色谱指纹图谱。其多糖离子色谱指纹图谱的构建只是考虑了多糖水解产物的特征峰，对于多糖的分子量及其分布缺乏相应的分析，因而构建的指纹图谱也不能实现对多糖准确和稳定的质量控制。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中构建的多糖指纹图谱不能够准确且稳定有效的控制香菇多糖的生产质量的缺陷和不足，提供一种香菇多糖多元定量指纹图谱的构建方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种香菇多糖多元定量指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：
S1.构建香菇多糖标准指纹图谱：通过离子色谱和/或PMP-HPLC高效液相进行香菇多糖水解单糖的组成检测，构建香菇多糖离子色谱标准指纹图谱和/或香菇多糖PMP-HPLC标准指纹图谱；
S2.构建香菇多糖分子量分布标准指纹图谱：采用高效体积排阻色谱法测定香菇多糖的分子量，利用标准品进行较正，对多糖的分子量进行分段切割，构建香菇多糖分子量分布标准指纹图谱；
S3.通过上述S1的香菇多糖标准指纹图谱和S2的香菇多糖分子量分布标准指纹图谱共同组成香菇多糖多元指纹图谱，通过香菇多糖多元指纹图谱确定香菇多糖的单糖种类，再进行离子色谱测定香菇多糖含量，得到香菇多糖多元定量指纹图谱。
本发明提供的香菇多糖多元定量指纹图谱的构建方法可以从两个方面对香菇多糖质量控制进行表征：
第一，由于多糖的活性与其一级结构即单糖组成及其糖苷键连接方式有关，而在一定条件下，多糖完全水解，其产物单糖的种类及相对量均随一级结构的不同而有所差异。且对于同一来源的多糖，其单糖组成成分具有相对稳定性，故通过香菇多糖水解产物的色谱指纹图谱分析即可从一侧面表征其一级结构特征。
为达到较高的检测灵敏度和分离选择性，可以优选分别采用离子色谱法(HPAEC)和PMP柱前衍生化反相高效液相色谱法(PMP-HPLC)对香菇多糖的水解产物进行分离分析的研究，并由此分别构建香菇多糖单糖组成的HPAEC指纹图谱和PMP-HPLC指纹图谱。
第二，多糖的活性还与其分子量大小有关，而不同的生产工艺对香菇多糖的成分影响不同，且无法通过多糖一级结构进行分子，因此本发明采用高效体积排阻色谱法测定香菇多糖的分子量分布，从另一侧面表征其结构特征，由此构建香菇多糖的体积排阻色谱指纹图谱。根据香菇多糖的大分子特性，结合国内外公认的鉴别中药品种和评价中药质量的有效手段，将多元标准指纹图谱应用于香菇多糖的质量控制。
第三，本发明通过多元图谱共有峰的指认可以确定香菇多糖的单糖种类，同时还采用离子色谱(高效阴离子交换色谱法)对多糖含量进行分离分析的研究，并由此建立多糖的单糖组成的离子色谱标准指纹图谱，通过共有特征峰的指认及其含量测定，构建香菇多糖定量指纹图谱。
定量指纹图谱结合香菇多糖多元指纹图谱，赋予指纹图谱大量的定性、定量信息，共同应用于产品质量控制，对指纹图谱中的多个目标成分进行准确定量，使得质量控制更加准确、产品的质量和稳定性更加可靠。
优选地，S1中香菇多糖水解单糖的制备方法如下：
取多糖样品加入三氟乙酸微波水解，其中：三氟乙酸浓度为2.0～3.0mol/L，微波酸水解的料液比：20mg多糖样品/5～7mL三氟乙酸溶液，微波酸水解的水解温度120～130℃，水解时间25～30min，水解功率为1000～1400W。
进一步优选地，S1中香菇多糖水解单糖的制备方法如下：取多糖样品加入三氟乙酸微波水解，其中：三氟乙酸浓度为3.0mol/L，微波酸水解的料液比：20mg多糖样品/7mL三氟乙酸溶液，微波酸水解的水解温度130℃，水解时间30min，水解功率为1000W。
其中，在本发明的香菇多糖水解过程中，在一定范围内，改变三氟乙酸的浓度，水解液中单糖总量随着三氟乙酸的浓度增加而增加，当三氟乙酸的浓度为3.0mol/L时，单糖总量达到最大值，此刻，再增加三氟乙酸的浓度反而会导致单糖总量的下降。本发明的三氟乙酸浓度优选为3.0mol/L。
在香菇多糖水解过程中，在一定范围内，改变微波温度，水解液中单糖总量先是随着温度提高而增加，当温度达到130℃时，单糖总量达到最大值，再提高温度反而会导致单糖总量的下降，同时过高的温度也会造成成本上的提高，另外在设置爬升温度时，也会造成爬升时间的延长，降低水解效率。本发明的水解温度优选为130℃。
同样，在一定范围内，改变水解液中单糖总量先是随着时间的延长而增加，当时间达到30min时，单糖总量达到最大值，继续延长时间则单糖总量趋于平缓，甚至会出现下降，本发明的水解时间优选为30min。
香菇多糖水解过程中，水解液中单糖总量先是随着三氟乙酸体积的增加而增加，当三氟乙酸的体积达到7mL时，单糖总量达到最大值，继续增加体积不会带来进一步的单糖含量提升，反而出现一定的下降，并未呈现出明显的变化规律。本发明优选物料比为20mg多糖样品/7mL三氟乙酸溶液。
优选地，S1中所述离子色谱和/或PMP-HPLC高效液相的单糖标样中的单糖包括岩藻糖(Fuc)、氨基葡萄糖(GlcN)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)和木糖(Xyl)。
优选地，S1中离子色谱仪检测的条件为：色谱柱为Thermo CarboPacPA20或PA10高效阴离子交换色谱柱，柱温为25～35℃，流动相为3～5mmol/L氢氧化钠溶液，流动相流速为0.5～1.0mL/min，以脉冲安培检测器检测，检测器电位波形采用糖标准四电位波形。
优选地，S1中离子色谱仪检测的条件为：色谱柱为Thermo CarboPacPA20高效阴离子交换色谱柱，包括分析柱(150mm×3mm id)和保护柱(30mm×3mm id)，柱温为30℃，进样体积：20μL，流动相为3.75mmol/L氢氧化钠溶液，流动相流速为0.5mL/min，以脉冲安培检测器检测，检测器电位波形采用糖标准四电位波形。
关于本发明的离子色谱条件具体说明如下：
用于分离单糖和小分子低聚糖的阴离子交换色谱柱一般包括3种柱型：CarboPacPAl、PA10和PA20，甘露糖和木糖在色谱柱PA1和PA10上得不到较好分离，而在PA20上可以达到基线分离。虽然PA10和PA20色谱柱的填料相似，但PA20色谱柱树脂基核及覆盖在树脂表面的键合季胺基团的乳胶比PA10小，因此分析速度快，柱效高，相比而言，CarboPac PA20色谱柱具有更大的优势，故发明优选CarboPac PA20柱进行相关测定。
柱温是离子色谱分析法的一个重要的操作参数，直接会影响到所分析物质的分离度和组分的保留时间。色谱柱温度对各种糖保留的影响，尤其是对难分离物质氨基葡萄糖和半乳糖以及甘露糖和木糖的分离影响，在柱温为25℃时，糖的保留时间均增长，氨基葡萄糖和半乳糖不能分离，在柱温为35℃时，糖的保留时间均减小，甘露糖和木糖不能分离，而在柱温为30℃时，这些糖组分都能够达到基线分离，色谱柱温度优选为30℃。
当NaOH浓度为5.00mmol/L和6.25mmol/L时，甘露糖和木糖不能分离，只有当NaOH浓度为3.75mmol/L时，各种糖之间能有较好的分离效果，分析时间在20min以内。
优选地，S1中PMP-HPLC高效液相检测的条件为：
色谱条件：色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18；
流动相：磷酸盐缓冲液-乙睛溶液，其中磷酸盐缓冲液和乙睛的体积比为80:20，磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH为6；
柱温：30℃；检测器：紫外检测器；检测波长：245nm；流速：0.8mL/min；
进样体积：10μL。
优选地，S2中高效体积排阻色谱法的色谱条件为：
色谱柱：Waters Ultrahydrogel 500+Waters Ultrahydrogel 2000；流动相：0.1MNaNO3；流速：0.8mL/min；柱温：45℃。
优选地，S2中所述构建香菇多糖分子量分布标准指纹图谱的香菇多糖分子量标准曲线的标准品为5种不同分子量的右旋糖苷，其分子量分别为：MW135350、MW 36800、MW9750、MW 2700、MW 180。
优选地，S3中所述香菇多糖含量为各单糖含量除以相应单糖回收系数的总和，其中单糖回收系数通过如下方法确定：
称取20mg岩藻糖、氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖微波水解后，按S1中离子色谱条件进行分析，采用外标法计算水解后各单糖的含量，确定各单糖在水解过程中的回收系数。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种香菇多糖多元定量指纹图谱的构建方法，通过香菇多糖水解产物的色谱指纹图谱分析表征其一级结构特征从，同时通过菇多糖的分子量分布检测另一侧面标准多糖的活性结构特征，将多元标准指纹图谱应用于香菇多糖的质量控制，进一步结合多糖含量定量检测通过多糖定量指纹图谱结合香菇多糖多元指纹图谱，赋予指纹图谱大量的定性、定量信息，共同应用于产品质量控制，对指纹图谱中的多个目标成分进行准确定量，使得质量控制更加准确、产品的质量和稳定性更加可靠。
本发明的香菇多糖多元指纹图谱的精密度、重复性和稳定性试验的RSD值均小于5.0％，表明其整体***精密度良好，分析结果稳定、可信，重复性好。
本发明的指纹图谱中共有峰的定量检测方法学分析显示，6种单糖的峰面积与其质量浓度在0.05～80mg/L范围内具有很好的线性关系，线性系数均大于0.9985，检出限(20μL进样，S/N＝3)为2.0～9.0μg/L，说明该方法检测线性很好，线性范围较宽，检测灵敏度很高，RSD值均小于5.0％表明多糖定量检测具有很好的紧密度、准确度、重复性和稳定性。
附图说明
图1三氟乙酸浓度对XG多糖水解的影响。
图2微波温度对XG多糖水解的影响。
图3微波时间对XG多糖水解的影响。
图4物料比对XG多糖水解的影响。
图5不同温度下各种糖的离子色谱图。
图6不同洗脱条件下各种糖的离子色谱图。
图7香菇多糖的离子色谱图谱。
图8香菇多糖的离子色谱标准指纹图谱。
图9香菇多糖的PMP-HPLC图谱。
图10香菇多糖的PMP-HPLC标准指纹图谱。
图11香菇多糖的分子量分布图谱。
图12香菇多糖的分子量分布标准指纹图谱。
图13A：单糖的标样的离子色谱图；B：香菇多糖样品的离子色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非另有说明，本发明实施例采用的原料试剂为常规购买的原料试剂。
实施例1
一种香菇多糖多元定量指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：
S1.构建香菇多糖标准指纹图谱：通过离子色谱和PMP-HPLC高效液相进行香菇多糖水解单糖的组成检测，构建香菇多糖离子色谱标准指纹图谱和香菇多糖PMP-HPLC标准指纹图谱；
S2.构建香菇多糖分子量分布标准指纹图谱：采用高效体积排阻色谱法测定香菇多糖的分子量，利用标准品进行较正，对多糖的分子量进行分段切割，构建香菇多糖分子量分布标准指纹图谱；
S3.通过上述S1的香菇多糖标准指纹图谱和S2的香菇多糖分子量分布标准指纹图谱共同组成香菇多糖多元指纹图谱，再结合离子色谱测定香菇多糖含量，综合得到香菇多糖多元定量指纹图谱。
其中，S1中香菇多糖的水解-离子色谱分析如下：
取20mg多糖样品放入微波消解管中，加入7mL 3.0moL/L的三氟乙酸，放入微波消解仪中，设定微波功率1000W，130℃温度下水解30min，水解液稀释1000倍后，进行离子色谱分析。各单糖标样的浓度均为5.00mg/L。
各条件影响的实验探究如下：
其中，保持其他条件不变的情况下，改变三氟乙酸的浓度，由图1可知水解液中单糖总量随着三氟乙酸的浓度增加而增加，当三氟乙酸的浓度为3.0mol/L时，单糖总量达到最大值，此刻，再增加三氟乙酸的浓度反而会导致单糖总量的下降。
保持其他条件不变的情况下，改变微波温度，由图2可知水解液中单糖总量先是随着温度提高而增加，当温度达到130℃时，单糖总量达到最大值，此刻，再提高温度反而会导致单糖总量的下降，同时过高的温度也会造成成本上的提高。在设置爬升温度时，也会造成爬升时间的延长。
保持其他条件不变的情况下，改变微波水解时间，由图3可知水解液中单糖总量先是随着时间的延长而增加，当时间达到30min时，单糖总量达到最大值，此刻，再延长时间则会导致单糖总量的下降和趋于平缓。
考虑到CEM Mars6高通量密闭微波消解仪的使用情况，设置了5mL、6mL、7mL、8mL、9mL共5个三氟乙酸的体积，保持其他条件不变的情况下，改变物料比，由图4可知水解液中单糖总量先是随着三氟乙酸体积的增加而增加，当三氟乙酸的体积达到7mL时，单糖总量达到最大值，此刻，增加体积则会导致单糖总量的下降。
分析仪器为Thermo Fisher公司ISC 5000离子色谱仪，色谱条件为：色谱柱：Thermo CarboPac PA20阴离子交换柱，包括分析柱(150mm×3mm id)和保护柱(30mm×3mmid)；柱温：30℃；进样体积：20μL。以3.75mmol/L氢氧化钠溶液为淋洗液进行等度洗脱，流速0.5mL/min，脉冲安培检测器采用糖标准四电位波形。
离子色谱条件具体探究如下：
用于分离单糖和小分子低聚糖的阴离子交换色谱柱一般包括3种柱型：CarboPacPAl、PA10和PA20。通过实验比较了这3种色谱柱对样品中可能存在的7种糖类的分离效果。实验发现，甘露糖和木糖在色谱柱PA1和PA10上得不到较好分离，而在PA20上可以达到基线分离。虽然PA10和PA20色谱柱的填料相似，但PA20色谱柱树脂基核及覆盖在树脂表面的键合季胺基团的乳胶比PA10小，因此分析速度快，柱效高。相比而言，CarboPac PA20色谱柱具有更大的优势。
柱温是离子色谱分析法的一个重要的操作参数，直接会影响到所分析物质的分离度和组分的保留时间。将色谱柱温度分别设定为25℃、30℃和35℃，考察色谱柱温度对各种糖保留的影响，尤其是对难分离物质氨基葡萄糖和半乳糖以及甘露糖和木糖的分离影响。由图5可知，在柱温为25℃时，糖的保留时间均增长，氨基葡萄糖和半乳糖不能分离。在柱温为35℃时，糖的保留时间均减小，甘露糖和木糖不能分离。而在柱温为30℃时，这些糖组分都能够达到基线分离。因此，选定色谱柱温度为30℃。
实验分别考察3.75、5.00和6.25mmol/L NaOH淋洗液对9种糖的分离效果。由图6可知，当NaOH浓度为5.00mmol/L和6.25mmol/L时，甘露糖和木糖不能分离。只有当NaOH浓度为3.75mmol/L时，各种糖之间能有较好的分离效果，分析时间在20min以内。
离子色谱指纹图谱的建立如下：
将香菇多糖样品的离子色谱图谱数据转换成CDF格式，导入指纹图谱专用软件“中药色谱指纹图谱相似度评价***”，见图7。经多点校正、峰匹配等软件处理生成香菇多糖离子色谱标准指纹图谱，见图8。
S1中香菇多糖PMP-HPLC标准指纹图谱的建立如下：
取水解后的香菇多糖样品溶液(或混合单糖标液)100μL，与100μL 0.6mol/L的NaOH溶液混匀。加入0.5mol/L的PMP甲醇溶液200μL，混匀。于70℃反应100min后，冷至室温。加250μL 0.3mol/L的HCl中和，然后加水至1mL，再加等体积的氯仿，振摇混匀，静置分层，然后弃去氯仿相，如此萃取至少3次，用0.45μm微孔滤膜过滤得到水相，供HPLC进样分析。
色谱条件：色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18(250mm×4.6mm i.d.，5μm)；流动相：磷酸盐缓冲液(0.1mol/L,pH 6.7)-乙睛(体积比为80:20)；柱温：30℃；检测器：紫外检测器；检测波长：245nm；流速：0.8mL/min；进样体积：10μL。得到的香菇多糖单糖组分的PMP-HPLC图(图9)，使用中药色谱指纹图谱相似度评价软件进行处理。
比较106个两种工艺生产的香菇多糖样品的色谱图谱数据，经过多点校正、峰匹配等软件处理得到香菇多糖PMP-HPLC标准指纹图谱(图10)。
S2中香菇多糖分子量分布标准指纹图谱的建立如下：
香菇多糖分子量标准曲线的建立：选取5种不同分子量的右旋糖苷作为标准品，分子量分别为MW 135350、MW 36800、MW 9750、MW 2700、MW 180。将不同分子量的右旋糖苷标准品配置成约5mg/mL的水溶液，进行液相色谱分析。高效体积排阻色谱的色谱条件：色谱柱：Waters UltrahydrogelTM500(300mm×7.8mm i.d.)+Waters UltrahydrogelTM2000(300mm×7.8mm i.d.)；流动相：0.1M NaNO3；流速：0.8mL/min；柱温：45℃。
根据每个标样的保留时间和对应分子量的对数值，由GPC软件作出分子量校正曲线。分子量校正曲线所用标准品：右旋糖苷(MW 135350、MW 36800、MW 9750、MW 2700、MW180)。
取20mg香菇多糖固体样品放入5mL离心管中，加入4mL水放入40℃烘箱中加热溶解，用微孔过滤膜过滤后供进样，得到的香菇多糖分子量分布色谱图(图11)，再使用中药色谱指纹图谱相似度评价软件处理图谱，经过多点校正、峰匹配等软件处理得到香菇多糖分子量分布标准指纹图谱(图12)。
实施例2离子色谱指纹图谱精密度、重复性、稳定性考察
指纹图谱分析方法的精密度、重复性及稳定性的建立方法与常规分析测定相似。但在中药指纹图谱的应用中，这三者认定分为整体和部分两个方面，前者包括测定图谱之间的整体相似性考察；后者为指标成分或共有峰的相对保留时间与相对积分面积的考察。首先我们对离子色谱指纹图谱精密度、重复性、稳定性进行了考察。
1)离子色谱指纹图谱的精密度考察
取同一批香菇多糖样品，微波水解后按离子色谱条件连续进样6次，记录各共有色谱峰的保留时间和峰面积。结果各共有峰相对保留时间的RSD为0.57-1.20％，相对峰面积的RSD为0.85-1.90％。相对保留时间和相对峰面积RSD值均小于5.0％，表明方法采用的离子色谱仪器及整体***精密度良好，分析结果稳定、可信。
2)离子色谱指纹图谱的重复性考察
取同一批香菇多糖样品6份，微波水解后按离子色谱条件分别检测，记录各共有色谱峰的保留时间和峰面积。结果各共有峰相对保留时间的RSD为1.42-1.80％，各特征峰相对峰面积的RSD为1.81-2.40％，相对保留时间和相对峰面积RSD值均小于5.0％，表明该方法重复性良好。
3)离子色谱指纹图谱的稳定性试验
取同一批香菇多糖样品，微波水解后分别在0、2、4、6、8、10、12、24h按离子色谱条件检测，记录各共有色谱峰的保留时间和积分面积。结果各共有峰相对保留时间的RSD为0.45-0.70％，各特征峰相对峰面积的RSD为1.50-2.45％，相对保留时间和相对峰面积RSD值均小于5.0％。表明多糖水解样品在常温实验条件下稳定性较好，在24h内稳定性良好。
实施例3离子色谱标准指纹图谱中共有峰的指认
对照上述同样离子色谱条件下分析得到的9个单糖混合标样的色谱图(图13A)中各峰的相对保留时间，可以确定香菇多糖指纹共有特征峰中有六个是单糖峰，依次为岩藻糖、氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖(图13B)。
实施例4离子色谱标准指纹图谱中共有峰的定量分析方法学考察
1)标准曲线、检出限考察
精密称取各单糖标样适量，用水配置成系列标准溶液，采用以上离子色谱条件分析，以峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程、相关系数和线性范围。结果表明，单糖的峰面积y(nC·min)与其质量浓度x(mg/L)在0.05-80mg/L范围内具有很好的线性关系，线性系数均大于0.9985，检出限(20μL进样，S/N＝3)为2.0-9.0μg/L。说明该方法检测线性很好，线性范围较宽，检测灵敏度很高(表1)。
表1不同单糖的检出限及线性关系
2)方法精密度
取微波水解法水解多糖样品溶液，采用以上离子色谱条件分析，平行测定6次，记录色谱图，以考察方法精密度，结果表明各单糖峰面积的RSD％值在1.32％-3.96％之间，表明精密度结果较好。
3)方法稳定性试验
取水解多糖品，稀释到合适的浓度，分别在0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h，采用以上色谱条件分析，计算样品中各单糖峰面积的平均值及RSD(％)。结果如表2所示，各单糖峰面积的RSD％值在1.45％～4.99％之间，表明样品溶液在24h内稳定性良好。
表2稳定性考察
| 0h | 2h | 4h | 6h | 8h | 10h | 12h | 24h | 平均值 | RSD/％ | |
| 岩藻糖 | 1.08 | 1.07 | 1.04 | 1.06 | 1.07 | 1.05 | 1.04 | 1.09 | 1.06 | 1.69 |
| 氨基葡萄糖 | 0.35 | 0.36 | 0.38 | 0.36 | 0.35 | 0.35 | 0.36 | 0.39 | 0.36 | 4.10 |
| 半乳糖 | 4.98 | 4.94 | 5.03 | 5.18 | 5.06 | 5.09 | 5.19 | 5.02 | 5.06 | 1.75 |
| 葡萄糖 | 45.67 | 45.98 | 46.12 | 45.23 | 46.86 | 45.76 | 46.98 | 45.21 | 45.98 | 1.45 |
| 甘露糖 | 0.12 | 0.11 | 0.12 | 0.12 | 0.12 | 0.12 | 0.11 | 0.12 | 0.12 | 4.99 |
| 木糖 | 2.24 | 2.20 | 2.33 | 2.42 | 2.22 | 2.34 | 2.31 | 2.42 | 2.31 | 3.68 |
4)方法重复性试验
采用微波水解法水解多糖样品溶液6份，采用以上离子色谱条件分别分析，结果如表3所示，6个样品中各单糖峰面积的RSD％值在1.31％-4.04％之间。重复性实验RSD数据均满足《GB/T27417-2017化学分析方法确认和验证指南》附录B要求，方法重复性良好。
表3多糖水解样品重复性
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均值 | RSD/％ | |
| 岩藻糖 | 1.07 | 1.07 | 1.02 | 1.07 | 1.07 | 1.08 | 1.06 | 2.10 |
| 氨基葡萄糖 | 0.34 | 0.36 | 0.38 | 0.36 | 0.34 | 0.35 | 0.36 | 4.04 |
| 半乳糖 | 4.82 | 4.94 | 5.01 | 5.14 | 5.06 | 5.02 | 5.00 | 2.21 |
| 葡萄糖 | 44.40 | 45.64 | 45.49 | 45.92 | 46.07 | 45.76 | 45.55 | 1.31 |
| 甘露糖 | 0.12 | 0.11 | 0.12 | 0.12 | 0.12 | 0.12 | 0.12 | 5.07 |
| 木糖 | 2.20 | 2.23 | 2.31 | 2.39 | 2.29 | 2.34 | 2.29 | 2.94 |
5)方法准确度试验
取已知单糖组成含量的多糖样品9份，分别加入高、中、低3个浓度的混合单糖对照品溶液，微波水解法水解，采用以上离子色谱条件分析，测定其回收率。实验结果表明各单糖在不同浓度下的回收率均在80％-95％之间，RSD％小于5.0％，说明本方法测定单糖含量回收率良好，准确度高(表4)。
表4加标回收率和相对标准偏差
| 单糖 | 回收率(％) | RSD(％)(n＝3) |
| 岩藻糖 | 80.4 | 2.36 |
| 氨基葡萄糖 | 88.6 | 4.57 |
| 半乳糖 | 89.5 | 4.24 |
| 葡萄糖 | 83.1 | 3.52 |
| 甘露糖 | 95.0 | 2.59 |
| 木糖 | 84.4 | 3.59 |
实施例5各单糖回收系数的确立
称取20mg岩藻糖、氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖微波水解后，按离子色谱条件进行分析，采用外标法计算水解后各单糖的含量，确定各单糖在水解过程中的回收系数(表5)。
表5各单糖的回收系数结果
实施例6香菇多糖含量测定如下：
随机称取样品中的26个批次的香菇多糖进行微波水解，按离子色谱条件进行分析，采用外标法计算各单糖的含量，利用回收系数修正各单糖的含量，各单糖的总和即香菇多糖样品中多糖的含量。
表6采用离子色谱法检测香菇多糖含量结果
| 样品号 | 多糖含量(mg/mL) | 样品号 | 多糖含量(mg/mL) |
| 1 | 96.61 | 9 | 53.16 |
| 2 | 95.91 | 10 | 53.08 |
| 3 | 105.16 | 11 | 102.95 |
| 4 | 100.08 | 12 | 89.58 |
| 5 | 91.45 | 13 | 101.48 |
| 6 | 69.88 | 14 | 88.27 |
| 7 | 55.67 | 15 | 95.27 |
| 8 | 57.01 | 16 | 63.45 |
| 17 | 95.27 | 18 | 72.17 |
| 19 | 100.51 | 20 | 67.19 |
| 21 | 72.49 | 22 | 88.27 |
| 23 | 95.17 | 24 | 78.05 |
| 25 | 94.26 | 26 | 108.24 |
实施例7不同方法测定多糖含量结果比较
采用以上述离子色谱法检测香菇多糖，并与现有常用的苯酚硫酸法对不同批次的XG多糖样品进行了含量测定结果比较，从表8，表9的结果可以发现，两种方法测定的结果非常接近，相对偏差均小于10％。
表7不同方法测定多糖含量
实施例8两种方法测定多糖含量验证
以香菇多糖注射液(纯度98％)为对照，采用以上建立的2种方法对其中多糖含量进行测定，比较2种方法的平均相对误差。结果以葡萄糖为标准品的苯酚硫酸法的平均相对误差为4.6％，离子色谱定量指纹图谱法的平均相对误差为2.5％，说明从相对误差角度来看，采用以离子色谱定量指纹图谱法的多糖含量测定方法偏差更小，更稳定。
表8苯酚硫酸法测定多糖含量验证
表9离子色谱法测定多糖含量验证
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种香菇多糖多元定量指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.构建香菇多糖标准指纹图谱：通过离子色谱和/或PMP-HPLC高效液相进行香菇多糖水解单糖的组成检测，构建香菇多糖离子色谱标准指纹图谱和/或香菇多糖PMP-HPLC标准指纹图谱；
S2.构建香菇多糖分子量分布标准指纹图谱：采用高效体积排阻色谱法测定香菇多糖的分子量，利用标准品进行较正，对多糖的分子量进行分段切割，构建香菇多糖分子量分布标准指纹图谱；
S3.通过上述S1的香菇多糖标准指纹图谱和S2的香菇多糖分子量分布标准指纹图谱共同组成香菇多糖多元指纹图谱，通过香菇多糖多元指纹图谱确定香菇多糖的单糖种类，再进行离子色谱测定香菇多糖含量，得到香菇多糖多元定量指纹图谱。
2.如权利要求1所述香菇多糖多元定量指纹图谱的构建方法，其特征在于，S1中香菇多糖水解单糖的制备方法如下：
取多糖样品加入三氟乙酸微波水解，其中：三氟乙酸浓度为2.0～3.0mol/L，微波酸水解的料液比：20mg多糖样品/5～7mL三氟乙酸溶液，微波酸水解的水解温度120～130℃，水解时间25～30min，水解功率为1000～1400W。
3.如权利要求2所述香菇多糖多元定量指纹图谱的构建方法，其特征在于，S1中香菇多糖水解单糖的制备方法如下：取多糖样品加入三氟乙酸微波水解，其中：三氟乙酸浓度为3.0mol/L，微波酸水解的料液比：20mg多糖样品/7mL三氟乙酸溶液，微波酸水解的水解温度130℃，水解时间30min，水解功率为1000W。
4.如权利要求2或3所述香菇多糖多元定量指纹图谱的构建方法，其特征在于，S1中所述离子色谱和/或PMP-HPLC高效液相的单糖标样中的单糖包括岩藻糖、氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖。
5.如权利要求4所述香菇多糖多元定量指纹图谱的构建方法，其特征在于，S1中离子色谱仪检测的条件为：色谱柱为Thermo CarboPacPA20或PA10高效阴离子交换色谱柱，柱温为25～35℃，流动相为3～5mmol/L氢氧化钠溶液，流动相流速为0.5～1.0mL/min，以脉冲安培检测器检测，检测器电位波形采用糖标准四电位波形。
6.如权利要求5所述香菇多糖多元定量指纹图谱的构建方法，其特征在于，S1中离子色谱仪检测的条件为：色谱柱为Thermo CarboPacPA20高效阴离子交换色谱柱，包括分析柱(150mm×3mm id)和保护柱(30mm×3mm id)，柱温为30℃，进样体积：20μL，流动相为3.75mmol/L氢氧化钠溶液，流动相流速为0.5mL/min，以脉冲安培检测器检测，检测器电位波形采用糖标准四电位波形。
7.如权利要求4所述香菇多糖多元定量指纹图谱的构建方法，其特征在于，S1中PMP-HPLC高效液相检测的条件为：
色谱条件：色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18；
流动相：磷酸盐缓冲液-乙睛溶液，其中磷酸盐缓冲液和乙睛的体积比为80:20，磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH为6；
柱温：30℃；检测器：紫外检测器；检测波长：245nm；流速：0.8mL/min；
进样体积：10μL。
8.如权利要求1所述香菇多糖多元定量指纹图谱的构建方法，其特征在于，S2中高效体积排阻色谱法的色谱条件为：
色谱柱：Waters Ultrahydrogel 500+Waters Ultrahydrogel 2000；流动相：0.1MNaNO3；流速：0.8mL/min；柱温：45℃。
9.如权利要求7所述香菇多糖多元定量指纹图谱的构建方法，其特征在于，S2中所述构建香菇多糖分子量分布标准指纹图谱的香菇多糖分子量标准曲线的标准品为5种不同分子量的右旋糖苷，其分子量分别为：MW 135350、MW 36800、MW 9750、MW 2700、MW 180。
10.如权利要求4所述香菇多糖多元定量指纹图谱的构建方法，其特征在于，S3中所述香菇多糖含量为各单糖含量除以相应单糖回收系数的总和，其中单糖回收系数通过如下方法确定：
称取20mg岩藻糖、氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖微波水解后，按S1中离子色谱条件进行分析，采用外标法计算水解后各单糖的含量，确定各单糖在水解过程中的回收系数。
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