CN108271391A

CN108271391A - 重组宿主中的甜菊醇糖苷的产生

Info

Publication number: CN108271391A
Application number: CN201680046159.4A
Authority: CN
Inventors: 韦罗尼克·杜尚; 米凯尔·达尔高·米克尔森; 艾本·默勒-汉森
Original assignee: Evolva AG
Current assignee: Evolva Holding SA
Priority date: 2015-08-07
Filing date: 2016-07-29
Publication date: 2018-07-10
Also published as: EP3332018A1; AU2016307066A1; US20180282776A1; BR112018002564A2; MX2018001620A; CA2995067A1; EP3332018B1; WO2017025362A1; US10837041B2; US20210198711A1; JP2018522569A

Abstract

本发明涉及用于产生甜菊醇糖苷和甜菊醇糖苷前体的重组微生物和方法。

Description

重组宿主中的甜菊醇糖苷的产生

发明背景

发明领域

本公开大体上涉及由重组宿主诸如重组微生物重组产生甜菊醇糖苷诸如莱苞迪苷A(RebA)、莱苞迪苷B(RebB)、莱苞迪苷D(RebD)和莱苞迪苷M(RebM)以及其分离方法。具体地，本公开涉及对重组宿主中的转运***的修饰，以增加此类甜菊醇糖苷的产生和/或此类甜菊醇糖苷到重组宿主的培养基中的分泌。

相关技术描述

已熟知甜味剂为食品、饮料或糖果工业中最常使用的成分。甜味剂可在生产期间并入最终食物产品中，或者当适当稀释时作为餐桌用甜味剂或烘焙时糖的家用替代物单独使用。甜味剂包括天然甜味剂(诸如蔗糖、高果糖玉米糖浆、糖蜜、枫糖浆以及蜂蜜)和人造甜味剂(诸如阿斯巴甜、糖精和三氯蔗糖)。甜叶菊提取物为可从多年生灌木甜叶菊中分离和提取的天然甜味剂。甜叶菊通常在南美和亚洲生长以用于商业生产甜叶菊提取物。纯化至各种程度的甜叶菊提取物在商业上用作食品和共混物中的高强度甜味剂或单独用作餐桌用甜味剂。

若干种甜菊醇糖苷的化学结构示出在图1中，包括二萜甜菊醇和各种甜菊醇糖苷。甜叶菊植物的提取物通常包含带来甜味的甜菊醇糖苷，尽管每种甜菊醇糖苷的量经常是不同的，在不同生产批次中尤其如此。

由于已证实从甜叶菊植物中回收和纯化甜菊醇糖苷是劳动密集型且低效的，仍需要一种可产生高产量的所需甜菊醇糖苷诸如RebD和RebM的重组生产***。还需要在重组宿主中改进的甜菊醇糖苷的产生以用于商业用途。

发明概述

针对以上背景，本发明提供了相对于现有技术的某些优点和改进。

具体地，本发明提供一种能够产生至少一种甜菊醇糖苷的重组宿主细胞，其中所述宿主包含：

(a)编码糖流出转运蛋白(SET)多肽的基因；和/或

(b)编码糖转运蛋白SWEET(SWEET)多肽的基因；

其中所述基因中的至少一种为重组基因。

在本文所公开的重组宿主细胞的一个方面，SET多肽与SEQ ID NO：18中所列出的大肠杆菌糖流出转运蛋白A(SetA)多肽、SEQ ID NO：20中所列出的大肠杆菌糖流出转运蛋白B(SetB)多肽或SEQ ID NO：22中所列出的大肠杆菌糖流出转运蛋白C(SetC)多肽具有至少50％同一性。

在本文所公开的重组宿主细胞的一个方面，SWEET多肽与SEQ ID NO：24中所列出的芜菁(Brassica rapa)SWEET多肽、SEQ ID NO：26中所列出的矮牵牛(Petunia x hybrid)SWEET多肽或SEQ ID NO：28中所列出的图小麦(Triticum urartu)SWEET多肽具有至少50％同一性。

本发明还提供一种能够产生至少一种甜菊醇糖苷的重组宿主细胞，其中所述宿主包含编码运输衔接子多肽的基因的缺失。

在本文所公开的重组宿主细胞的一个方面，在缺失之前，所缺失的基因编码与以下任一种具有至少50％同一性的运输衔接子多肽：SEQ ID NO：30中所列出的衔接子蛋白Art10、SEQ ID NO：32中所列出的衔接子蛋白Art1、SEQ ID NO：34中所列出的衔接子蛋白Art2、SEQ ID NO：36中所列出的衔接子蛋白Art3、SEQ ID NO：38中所列出的衔接子蛋白Art4、SEQ ID NO：40中所列出的衔接子蛋白Art6、SEQ ID NO：42中所列出的衔接子蛋白Art7、SEQ ID NO：44中所列出的衔接子蛋白Art8、SEQ ID NO：166中所列出的衔接子蛋白衔接子蛋白Art9、SEQ ID NO：46中所列出的衔接子蛋白Bu11、SEQ ID NO：48中所列出的衔接子蛋白Bul2、SEQ ID NO：168中所列出的衔接子蛋白Bsd2、SEQ ID NO：170中所列出的衔接子蛋白Ear1、SEQ ID NO：172中所列出的衔接子蛋白Ssh4或SEQ ID NO：174中所列出的衔接子蛋白Tre1。

在本文所公开的重组宿主细胞的一个方面，SEQ ID NO：36中所列出的衔接子蛋白Art3、SEQ ID NO：42中所列出的衔接子蛋白Art7、SEQ ID NO：166中所列出的衔接子蛋白Art9、SEQ ID NO：30中所列出的衔接子蛋白Art10或SEQ ID NO：46中所列出的衔接子蛋白Bull的缺失增加了RebD的分泌。

在本文所公开的重组宿主细胞的一个方面，SEQ ID NO：32中所列出的衔接子蛋白Art1、SEQ ID NO：34中所列出的衔接子蛋白Art2、SEQ ID NO：36中所列出的衔接子蛋白Art3、SEQ ID NO：38中所列出的衔接子蛋白Art4、SEQ ID NO：40中所列出的衔接子蛋白Art6、SEQ ID NO：42中所列出的衔接子蛋白Art7、SEQ ID NO：44中所列出的衔接子蛋白Art8、SEQ ID NO：166中所列出的衔接子蛋白Art9、SEQ ID NO：30中所列出的衔接子蛋白衔接子蛋白Art10、SEQ ID NO：46中所列出的衔接子蛋白Bul1、SEQ ID NO：48中所列出的衔接子蛋白Bul2、SEQ ID NO：174中所列出的衔接子蛋白Tre1、SEQ ID NO：170中所列出的衔接子蛋白Earl或SEQ ID NO：172中所列出的衔接子蛋白Ssh4的缺失增加了RebM的分泌。

本发明还提供一种能够产生至少一种甜菊醇糖苷的重组宿主细胞，其中所述宿主包含编码转运蛋白多肽的基因的缺失，其中所述转运蛋白多肽为SEQ ID NO：2中所列出的YOR087W、SEQ ID NO：4中所列出的YML038C、SEQ ID NO：6中所列出的YJR135W-A、SEQ IDNO：8中所列出的YDR406W、SEQ ID NO：10中所列出的YIR028W、SEQ ID NO：12中所列出的YGR138C、SEQ ID NO：14中所列出的YJL214W、SEQ ID NO：16中所列出的YDR345C或其功能性同源物。

本发明还提供一种能够产生至少一种甜菊醇糖苷的重组宿主细胞，其中所述宿主包含编码转运蛋白多肽的基因的缺失，其中所述转运蛋白多肽为SEQ ID NO：64中所列出的YBR068C、SEQ ID NO：66中所列出的YBR220C、SEQ ID NO：68中所列出的YBR235W、SEQ IDNO：70中所列出的YBR293W、SEQ ID NO：72中所列出的YBR298C、SEQ ID NO：74中所列出的YCR011C、SEQ ID NO：76中所列出的YCR023C、SEQ ID NO：78中所列出的YDL100C、SEQ IDNO：80中所列出的YDL119C、SEQ ID NO：82中所列出的YDL138W、SEQ ID NO：84中所列出的YDL199C、SEQ ID NO：86中所列出的YDL210W、SEQ ID NO：88中所列出的YDL245C、SEQ IDNO：90中所列出的YDR061W、SEQ ID NO：92中所列出的YDR135C、SEQ ID NO：94中所列出的YDR508C、SEQ ID NO：96中所列出的YEL006W、SEQ ID NO：98中所列出的YFL028C、SEQ IDNO：100中所列出的YGL006W、SEQ ID NO：102中所列出的YGL114W、SEQ ID NO：104中所列出的YGR125W、SEQ ID NO：106中所列出的YGR181W、SEQ ID NO：108中所列出的YIL088C、SEQID NO：110中所列出的YJR124C、SEQ ID NO：112中所列出的YPL134C、SEQ ID NO：114中所列出的YPR192W、SEQ ID NO：116中所列出的YPR194C、SEQ ID NO：118中所列出的YPR198W、SEQID NO：120中所列出的YPR201W、SEQ ID NO：122中所列出的YAL067C、SEQ ID NO：124中所列出的YBL089W、SEQ ID NO：126中所列出的YCR028C、SEQ ID NO：128中所列出的YDR438W、SEQID NO：130中所列出的YFL011W、SEQ ID NO：132中所列出的YGL084C、SEQ ID NO：134中所列出的YGL104C、SEQ ID NO：136中所列出的YGR224W、SEQ ID NO：138中所列出的YHR032W、SEQID NO：54中所列出的YJL093C、SEQ ID NO：140中所列出的YMR034C、SEQ ID NO：142中所列出的YNR055C、SEQ ID NO：144中所列出的YOL020W、SEQ ID NO：146中所列出的YOL075C或其功能性同源物。

在本文所公开的重组宿主细胞的一个方面，基因的缺失通过同源重组进行。

在一个方面，本文所公开的重组宿主细胞还包含以下一种或多种：

(a)编码香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPPS)多肽的基因；

(b)编码对映-柯巴基二磷酸合酶(CDPS)多肽的基因；

(c)编码贝壳杉烯氧化酶(KO)多肽的基因；

(d)编码贝壳杉烯合酶(KS)多肽的基因；

(e)编码甜菊醇合酶(KAH)多肽的基因；

(f)编码细胞色素P450还原酶(CPR)多肽的基因；或者

(g)编码UGT85C2多肽的基因；

(h)编码UGT76G1多肽的基因；

(i)编码UGT74G1多肽的基因；

(j)编码UGT91D2功能性同源物的基因；和/或

(k)编码EUGT11多肽的基因；

其中所述基因中的至少一种为重组基因。

在本文所公开的重组宿主细胞的一个方面：

(a)所述GGPPS多肽包括与SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：210、SEQID NO：212、SEQ ID NO：214、SEQ ID NO：216、SEQ ID NO：218或SEQ ID NO：220中所列出的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；

(b)所述CDPS多肽包括与SEQ ID NO：184、SEQ ID NO：222、SEQ ID NO：224、SEQ IDNO：226、SEQ ID NO：228或SEQ ID NO：230中所列出的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；

(c)所述KO多肽包括与SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：246、SEQ IDNO：249、SEQ ID NO：251、SEQ ID NO：253、SEQ ID NO：255、SEQ ID NO：257、SEQ ID NO：259或SEQ ID NO：261中所列出的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；

(d)所述KS多肽包括与SEQ ID NO：186、SEQ ID NO：232、SEQ ID NO：234、SEQ IDNO：236、SEQ ID NO：238中所列出的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；

(e)所述KAH多肽包括与SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：266、SEQ ID NO：269、SEQ IDNO：270、SEQ ID NO：271、SEQ ID NO：272、SEQ ID NO：273、SEQ ID NO：275、SEQ ID NO：277、SEQ ID NO：279、SEQ ID NO：281或SEQ ID NO：283中所列出的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；

(f)所述CPR多肽包括与SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：263、SEQ IDNO：265、SEQ ID NO：287、SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：291或SEQ ID NO：293中所列出的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；

(g)所述UGT85C2多肽包括与SEQ ID NO：196中所列出的氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽；

(h)所述UGT76G1多肽包括与SEQ ID NO：200中所列出的氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽；

(i)所述UGT74G1多肽包括与SEQ ID NO：198中所列出的氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽；

(j)所述UGT91D2功能性同源物包括与SEQ ID NO：202中所列出的氨基酸序列具有至少90％同一性的UGT91D2e-b多肽；和/或

(k)所述EUGT11多肽包括与SEQ ID NO：204中所列出的氨基酸序列具有至少65％同一性的多肽。

在一个方面，本文所公开的重组宿主细胞包括植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞或细菌细胞。

在本文所公开的重组宿主细胞的一个方面，细菌细胞包括埃希氏菌属细菌细胞、乳杆菌属细菌细胞、乳球菌属细菌细胞、棒状杆菌属细菌细胞、醋杆菌属细菌细胞、不动杆菌属细菌细胞或假单胞菌属细菌细胞。

在本文所公开的重组宿主细胞的一个方面，真菌细胞包括酵母细胞。

在本文所公开的重组宿主细胞的一个方面，酵母细胞为来自以下的细胞：酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、解脂耶氏酵母、光滑假丝酵母、棉阿舒囊霉、产版假丝酵母(Cyberlindnerajadinii)、巴斯德毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母、多形汉逊酵母、博伊丁假丝酵母、解腺嘌呤阿氏酵母(Arxula adeninivorans)、红法夫酵母(Xanthophyllomycesdendrorhous)或白假丝酵母种类。

在本文所公开的重组宿主细胞的一个方面，酵母细胞为酵母菌。

在本文所公开的重组宿主细胞的一个方面，酵母细胞为来自酿酒酵母种类的细胞。

在本文所公开的重组宿主细胞的一个方面，所述重组宿主细胞相对于不具有修饰的转运蛋白基因表达的产甜菊醇糖苷宿主分泌降低的量的甜菊醇-13-O-葡糖苷(13-SMG)。

在本文所公开的重组宿主细胞的一个方面，所述重组宿主细胞相对于不具有修饰的转运蛋白基因表达的产甜菊醇糖苷宿主分泌增加的量的RebA、RebB、RebD和/或RebM。

在本文所公开的重组宿主细胞的一个方面，所述重组宿主细胞相对于不具有修饰的转运蛋白基因表达的产甜菊醇糖苷宿主产生增加的量的RebA、RebB、RebD和/或RebM。

本发明还提供一种增加重组宿主细胞中的甜菊醇糖苷产生或者增加甜菊醇糖苷到培养基中的分泌的方法，其包括在基因得到表达的条件下使如权利要求1-21中任一项所述的重组宿主细胞在细胞培养物发酵液中生长；

其中所述甜菊醇糖苷由所述重组宿主细胞产生。

在本文所公开的方法的一个方面，甜菊醇糖苷为RebA、RebB、RebD和/或RebM。

本发明还提供一种增加RebA、RebB、RebD和/或RebM的产生的方法，其包括：

使本文所公开的重组宿主细胞在细胞培养物发酵液中生长；

其中13-SMG从所述重组宿主细胞到所述细胞培养物发酵液的分泌降低；

其中RebA、RebB、RebD和/或RebM由所述重组宿主细胞产生。

在本文所公开的方法的一个方面，所述方法还包括分离单独或组合的RebA、RebB、RebD和/或RebM。

在本文所公开的方法的一个方面，分离步骤包括：

(a)提供包含RebA、RebB、RebD和/或RebM的所述细胞培养物发酵液；

(b)将所述细胞培养物发酵液的液相与所述细胞培养物发酵液的固相分开，以获得包含RebA、RebB、RebD和/或RebM的上清液；

(c)提供一种或多种吸附剂树脂，包括在填充柱中提供所述吸附剂树脂；以及

(d)使步骤(b)的所述上清液与所述一种或多种吸附剂树脂接触，以便获得RebA、RebB、RebD和/或RebM的至少一部分，从而分离RebA、RebB、RebD和/或RebM。

在本文所公开的方法的一个方面，分离步骤包括：

(c)提供一种或多种离子交换或离子交换或反相色谱柱；以及

(d)使步骤(b)的所述上清液与所述一种或多种离子交换或离子交换或反相色谱柱接触，以便获得RebA、RebB、RebD和/或RebM的至少一部分。

在本文所公开的方法的一个方面，分离步骤包括：

(b)将所述细胞培养物发酵液的液相与所述细胞培养物发酵液的固相分开，以获得包含RebA、RebB、RebD和/或RebM的上清液；以及

(c)使RebA、RebB、RebD和/或RebM结晶或提取它们，从而分离RebA、RebB、RebD和/或RebM。

在本文所公开的方法的一个方面，所述方法还包括回收单独的RebA、RebB、RebD和/或RebM或者包含RebA、RebB、RebD和/或RebM的组合物。

在本文所公开的方法的一个方面，所回收的组合物相对于甜叶菊植物的糖苷组合物富含RebA、RebB、RebD和/或RebM，并且相对于植物来源的甜叶菊提取物具有减少的水平的非糖苷甜叶菊植物来源的组分。

在本文所公开的方法的一个方面，所回收的组合物相对于植物来源的甜叶菊提取物具有减少的水平的非糖苷甜叶菊植物来源的组分。

在本文所公开的方法的一个方面，所述细胞培养物发酵液包含：

(a)由本文所公开的重组宿主细胞产生的一种或多种RebA、RebB、RebD和/或RebM，

(b)葡萄糖、果糖和/或蔗糖；和/或

(c)补充营养素，包括痕量金属类、维生素类、盐类、酵母氮源(YNB)和/或氨基酸类。

本发明还提供一种培养物发酵液，其包含：

(a)本文所公开的重组宿主细胞；以及

(b)一种或多种RebA、RebB、RebD和/或RebM；

其中一种或多种RebA、RebB、RebD和/或RebM以至少0.1mg/l所述培养物发酵液的浓度存在。

本发明还提供一种培养物发酵液，其包含：

(a)本文所公开的重组宿主细胞；以及

(b)由本文所公开的重组宿主细胞产生的一种或多种RebA、RebB、RebD和/或RebM，

其中一种或多种RebA、RebB、RebD和/或RebM以至少0.1mg/l所述培养物发酵液的浓度存在并且所述细胞培养物发酵液还包含葡萄糖、UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖、N-乙酰基-葡糖胺和/或YNB。

本发明还提供一种培养物发酵液，其包含：

(a)本文所公开的重组宿主细胞；以及

其中一种或多种RebA、RebB、RebD和/或RebM以至少0.1mg/1所述培养物发酵液的浓度存在并且所述细胞培养物发酵液还包含葡萄糖、UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖、N-乙酰基-葡糖胺和/或YNB；

其中所述细胞培养物发酵液相对于植物来源的甜叶菊提取物具有减少的水平的非甜菊醇糖苷甜叶菊植物来源的组分。

本发明还提供一种培养物发酵液，其包含：

(a)本文所公开的重组宿主细胞；以及

其中所述细胞培养物发酵液相对于甜叶菊植物的甜菊醇糖苷提取物富含RebD和/或RebM，并且相对于植物来源的甜叶菊提取物具有减少的水平的非甜菊醇糖苷甜叶菊植物来源的组分。

本发明还提供一种细胞裂解物，其包含由本文所公开的重组宿主细胞产生的一种或多种RebA、RebB、RebD和/或RebM，并且所述细胞裂解物还包含葡萄糖、UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖、N-乙酰基-葡糖胺和/或YNB。

本发明还提供由本文所公开的重组宿主细胞产生的RebA、RebB、RebD和/或RebM。

本发明还提供通过本文所公开的方法产生的RebA、RebB、RebD和/或RebM。

本发明还提供一种甜味剂组合物，其包含本文中产生的RebA、RebB、RebD和/或RebM。

本发明还提供一种食物产品，其包含本文所公开的甜味剂组合物。

本发明还提供一种饮料或饮料浓缩物，其包含本文所公开的甜味剂组合物。

本发明的这些和其他特性和优点将通过本发明的以下详细描述结合所附权利要求书而得到更充分地理解。应注意，权利要求书的范围由其中的表述限定，而非由本描述中列出的特性和优点的特定讨论限定。

附图描述

当结合以下附图阅读时，可以最好地理解本发明的实施方案的以下详细描述，其中类似结构用类似参考数字指示，并且其中：

图1示出通过适合的UGT酶催化的代表性主要甜菊醇糖苷糖基化反应和若干甜菊醇糖苷化合物的化学结构。

图2A和图2F示出RebA的水平(总体水平和上清液水平；μM/OD₆₀₀)，图2B和图2G示出RebB的水平(总体水平和上清液水平；μM/OD₆₀₀)，图2C和图2H示出RebD的水平(总体水平和上清液水平；μM/OD₆₀₀)，图2D和图2I示出RebM的水平(总体水平和上清液水平；μM/OD₆₀₀)，并且图2E示出甜菊醇-13-O-葡糖苷(13-SMG)的水平(总体水平和上清液水平；μM/OD₆₀₀)，所述糖苷由用质粒转化的产甜菊醇糖苷酿酒酵母菌株产生，所述质粒携带来自大肠杆菌的糖流出转运蛋白A(SetA)多肽(SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18)、来自大肠杆菌的糖流出转运蛋白B(SetB)多肽(SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20)、来自大肠杆菌的糖流出转运蛋白C(SetC)多肽(SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22)、来自芜菁的糖转运蛋白SWEET(SWEET)多肽(SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24)、来自矮牵牛的SWEET多肽(SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26)或来自图小麦的SWEET(SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28)。图2中的产甜菊醇糖苷酿酒酵母菌株包含编码聚球藻属某种GGPPS7多肽的重组基因(SEQ ID NO：181，SEQ ID NO：182)、编码截短的玉米CDPS多肽的重组基因(SEQ ID NO：183，SEQ ID NO：184)、编码拟南芥KS5多肽的重组基因(SEQ ID NO：185，SEQ ID NO：186)、编码重组甜叶菊KO1多肽的重组基因(SEQ ID NO：187，SEQ ID NO：188)、编码拟南芥ATR2多肽的重组基因(SEQ ID NO：189，SEQ ID NO：190)、编码SrKAHe1多肽的重组基因(SEQ ID NO：191，SEQ ID NO：192)、编码甜叶菊CPR8多肽的重组基因(SEQ ID NO：193，SEQ ID NO：194)、编码甜叶菊UGT85C2多肽的重组基因(SEQ ID NO：195，SEQ ID NO：196)、编码甜叶菊UGT74G1多肽的重组基因(SEQ ID NO：197，SEQ ID NO：198)、编码甜叶菊UGT76G1多肽的重组基因(SEQ ID NO：199，SEQ ID NO：200)、编码甜叶菊UGT91D2e-b多肽的重组基因(SEQ ID NO：201，SEQ ID NO：202)以及编码稻EUGT11多肽的重组基因(SEQ ID NO：203，SEQ ID NO：204)，但是基因拷贝数目不同。与图2A-2E中的菌株相比，图2F-2I中的产甜菊醇糖苷酿酒酵母菌株包含更高拷贝数目的上述基因。参见实施例2。

图3A示出13-SMG的水平(总体水平和上清液水平；μM/OD₆₀₀)，图3B示出RebA的水平(总体水平和上清液水平；μM/OD₆₀₀)，图3C示出RebB的水平(总体水平和上清液水平；μM/OD₆₀₀)，图3D示出RebD的水平(总体水平和上清液水平；μM/OD₆₀₀)，并且图3E示出RebM的水平(总体水平和上清液水平；μM/OD₆₀₀)，这是在缺失以下衔接子蛋白的产甜菊醇糖苷酿酒酵母菌株中：Art1(SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32)、Art2(SEQ ID NO：34)、Art3(SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36)、Art4(SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：38)、Art6(SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40)、Art7(SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42)、Art8(SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：44)、Art9(SEQID NO：165，SEQ ID NO：166)、Art10(SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30)、Bul1(SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46)、Bul2(SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48)、Tre1(SEQ ID NO：173，SEQ ID NO：174)、Earl(SEQ ID NO：169，SEQ ID NO：170)、Ssh4(SEQ ID NO：171，SEQ ID NO：172)或Bsd2(SEQ ID NO：167，SEQ ID NO：168)。参见实施例3。

技术人员将了解的是，附图中的元件出于简洁和清楚目的而示出，并且不一定要按比例绘制。例如，附图中一些元件的尺寸可相对于其他元件被夸大，以便有助于提高对本发明的实施方案的理解。

详细描述

本文引用的所有公布、专利和专利申请出于所有目的以引用的方式整体明确并入本文。

在详细描述本发明之前，将定义许多术语。除非上下文另外明确指出，否则如本文所用的单数形式“一个(种)(a/an)”和“所述(the)”包括复数对象。例如，提及“一个核酸”意指一个或多个核酸。

应注意，术语如“优选地”、“通常地”和“一般地”在本文中不用于限制要求保护的发明的范围或暗示某些特性对于要求保护的发明的结构或功能是关键的、必要的或甚至重要的。相反，这些术语仅仅意图突出可以或不可以用于本发明的特定实施方案中的替代的或另外的特性。

出于描述和限定本发明的目的，应注意，术语“基本上”在本文中用于表示可归因于任何定量比较、值、测量或其他表示的固有不确定程度。术语“基本上”在本文中还用于表示定量表示可以与规定的参考不同的程度，而不导致讨论中的主题的基本功能发生变化。

本领域技术人员已熟知的方法可用于根据本发明构建遗传表达构建体和重组细胞。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术、体内重组技术以及聚合酶链反应(PCR)技术。参见，例如，如Green&Sambrook，2012，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第四版，Cold Spring Harbor Laboratory，New York；Ausubel等，1989，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，NewYork，以及PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Innis等，1990，Academic Press，San Diego，CA)所述的技术。

如本文所用，术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“寡核苷酸”以及“核酸”可以互换使用，是指包括DNA、RNA、其衍生物或其组合在内的核酸。

如本文所用，术语“微生物”、“微生物宿主”、“微生物宿主细胞”、“宿主细胞”、“重组宿主”、“重组微生物宿主”以及“重组宿主细胞”可以互换使用。如本文所用，术语“重组宿主”旨在是指其基因组已被至少一个DNA序列扩充的宿主。此类DNA序列包括但不限于非天然存在的基因、未正常转录成RNA或翻译成蛋白质(“表达”)的DNA序列以及希望引入到非重组宿主中的其他基因或DNA序列。将了解的是，通常本文所述的重组宿主的基因组通过稳定引入一种或多种重组基因来扩充。通常，引入的DNA最初并未驻留在作为DNA受体的宿主中，但在本公开的范围内从给定宿主中分离DNA区段并且随后将该DNA的一个或多个另外的拷贝引入相同宿主中，例如以增强基因产物的产生或者改变基因的表达模式。在一些情况下，引入的DNA将通过例如同源重组或定点诱变来修饰或甚至替代内源基因或DNA序列。适合的重组宿主包括微生物。

如本文所用，术语“重组基因”是指引入到受体宿主中的基因或DNA序列，无论相同或相似基因或DNA序列是否已经存在于此宿主中。在此上下文中“引入”或“扩充”在本领域中已知意指通过人工手动引入或扩充。因此，重组基因可以是来自另一种类的DNA序列或者可以是来源于或存在于相同种类但已通过重组方法并入宿主中以形成重组宿主的DNA序列。将了解的是，引入到宿主中的重组基因可以是与通常存在于正在转化的宿主中的DNA序列相同的并且被引入以提供DNA的一个或多个另外的拷贝，从而允许该DNA的基因产物过度表达或修饰的表达。所述重组基因具体地由cDNA编码。

如本文所用，术语“工程化生物合成途径”是指重组宿主中出现的生物合成途径，如本文所述的。在一些方面，生物合成途径的一个或多个步骤并不天然存在于未修饰的宿主中。在一些实施方案中，异源版本的基因引入到包含内源版本的基因的宿主中。

如本文所用，术语“内源”基因是指来源于特定生物体、组织或细胞或者在所述特定生物体、组织或细胞内产生或合成的基因。在一些实施方案中，内源基因为酵母转运蛋白。在一些实施方案中，转运蛋白为酿酒酵母内源的，包括但不限于酿酒酵母菌株S288C。在一些实施方案中，内源性酵母转运蛋白基因是过度表达的。如本文所用，术语“过度表达”用于是指基因在生物体中的表达水平高于基因在野生型生物体中的表达水平。例如，参见Prelich，2012，Genetics 190：841-54。在一些实施方案中，内源性酵母转运蛋白基因是缺失的。参见，例如，Giaever&Nislow，2014，Genetics 197(2)：451-65。如本文所用，术语“缺失”、“缺失的”、“敲除”以及“敲除的”可以互换使用，是指已***纵以不再在生物体中表达的内源基因，所述生物体包括但不限于酿酒酵母。在一些实施方案中，缺失/敲除的基因为转运蛋白基因或调节转运蛋白基因的表达的转录因子基因。

如本文所用，术语“异源序列”和“异源编码序列”用于描述来源于除重组宿主之外的种类的序列。在一些实施方案中，重组宿主为酿酒酵母细胞，并且异源序列来源于除酿酒酵母之外的生物体。异源编码序列例如可以来自原核微生物、真核微生物、植物、动物、昆虫或不同于表达异源序列的重组宿主的真菌。在一些实施方案中，编码序列为宿主原生序列。

“可选择标记”可以是补充宿主细胞营养缺陷、提供抗生素抗性或引起颜色变化的任何数目的基因之一。然后基因替代载体的线性DNA片段使用本领域已熟知的方法(参见下文)引入到细胞中。线性片段整合到基因组中和基因的破坏可以基于选择性标记来确定并且可以通过例如PCR或DNA印迹分析来验证。继在选择中使用之后，可选择标记可通过例如Cre-LoxP***从宿主细胞基因组中去除(参见，例如Gossen等，2002，Ann.Rev.Genetics36：153-173以及U.S.2006/0014264)。可替代地，基因替代载体可以一种方式构建以便包含待破坏的基因的一部分，其中所述部分没有任何内源基因启动子序列并且没有编码基因编码序列或编码所述序列的无活性片段。

如本文所用，术语“变体”和“突变体”用于描述与特定蛋白质的野生型序列相比已在一个或多个氨基酸处修饰的蛋白质序列。

如本文所用，术语“无活性片段”为编码具有例如由基因全长编码序列产生的蛋白质的小于约10％(例如，小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％或0％)的活性的蛋白质的基因片段。基因的此部分以一种方式***在载体中，使得没有已知的启动子序列可操作地连接至基因序列，但是终止密码子和转录终止序列可操作地连接至基因序列的所述部分。此载体随后在基因序列的部分中可以是呈线性的并转化到细胞中。作为单个同源重组的实例，此线性载体然后在其灭活的情况下整合在基因的内源对应物中。

如本文所用，“甜菊醇糖苷”是指莱苞迪苷A(RebA)(目录号58543-16-1)、莱苞迪苷B(RebB)(目录号58543-17-2)、莱苞迪苷C(RebC)(目录号63550-99-2)、莱苞迪苷D(RebD)(目录号63279-13-0)、莱苞迪苷E(RebE)(目录号63279-14-1)、莱苞迪苷F(RebF)(目录号438045-89-7)、莱苞迪苷M(RebM)(目录号1220616-44-3)、甜茶苷(目录号63849-39-4)、杜尔可苷A(目录号64432-06-0)、莱苞迪苷I(RebI)(MassBank Record：FU000332)、莱苞迪苷Q(RebQ)、1，2-甜菊苷(目录号57817-89-7)、1，3-甜菊苷(RebG)、1，2-二糖苷(MassBankRecord：FU000299)、1，3-二糖苷、甜菊醇-13-O-糖苷(13-SMG)、甜菊醇-19-O-葡糖苷(19-SMG)、三糖基化甜菊醇糖苷、四糖基化甜菊醇糖苷、五糖基化甜菊醇糖苷、六糖基化甜菊醇糖苷、七糖基化甜菊醇糖苷以及其异构体。参见图1。

如本文所用，术语“甜菊醇糖苷前体”和“甜菊醇糖苷前体化合物”用于是指甜菊醇糖苷生物合成途径中的中间体化合物。甜菊醇糖苷前体包括但不限于香叶基香叶基二磷酸(GGPP)、对映-柯巴基二磷酸、对映-贝壳杉烯、对映-贝壳杉稀醇、对映-贝壳杉烯醛、对映-贝壳杉烯酸以及甜菊醇。在一些实施方案中，甜菊醇糖苷前体本身为甜菊醇糖苷化合物。例如，19-SMG、甜茶苷、甜菊苷以及RebE为RebM的甜菊醇糖苷前体。参见图1。甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体可在体内(即，重组宿主)、在体外(即，酶促)或通过全细胞生物转化来产生。如本文所用，术语“产生”和“累积”可以互换使用以描述在体内、在体外或通过全细胞生物转化进行的甜菊醇糖苷和甜菊醇糖苷前体的合成。

重组产甜菊醇糖苷酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae/S.cerevisiae)描述于WO 2011/153378、WO 2013/022989、WO 2014/122227以及WO 2014/122328，所述专利各自以引用的方式整体并入。通过全细胞生物转化在重组宿主中以及在体外产生甜菊醇糖苷的方法也描述于WO 2011/153378、WO 2013/022989、WO 2014/122227以及WO 2014/122328中。

在一些实施方案中，甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体在重组宿主体内通过表达参与甜菊醇糖苷生物合成途径的一种或多种酶来产生。例如，表达以下一种或多种的产甜菊醇重组宿主可以在体内产生甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体：编码香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPPS)多肽的基因、编码对映-柯巴基二磷酸合酶(CDPS)多肽的基因、编码贝壳杉烯合酶(KS)多肽的基因、编码贝壳杉烯氧化酶多肽(KO)的基因、编码甜菊醇合酶(KAH)多肽的基因、编码细胞色素P450还原酶(CPR)多肽的基因以及编码UGT多肽的基因。参见实施例1-4。

在另一个实例中，表达以下各项的重组宿主可在体内产生甜菊醇：编码GGPPS多肽的基因、编码CDPS多肽的基因、编码KS多肽的基因、编码KO多肽的基因、编码KAH多肽的基因以及编码CPR多肽的基因。技术人员将了解的是，这些基因中的一种或多种可以是宿主内源的，只要这些基因中的至少一种(并且在一些实施方案中为所有)为引入到重组宿主中的重组基因。

在另一个实例中，表达以下各项的重组宿主可在体内产生甜菊醇糖苷：编码GGPPS多肽的基因、编码CDPS多肽的基因、编码KS多肽的基因、编码KO多肽的基因、编码KAH多肽的基因、编码CPR多肽的基因以及编码UGT多肽的一种或多种基因。技术人员将了解的是，这些基因中的一种或多种可以是宿主内源的，只要这些基因中的至少一种(并且在一些实施方案中为所有)为引入到重组宿主中的重组基因。

在一些方面，GGPPS多肽包含具有SEQ ID NO：208(可由SEQ ID NO：207中所列出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：210(由SEQ ID NO：209中所列出的核苷酸序列编码)、SEQ IDNO：212(由SEQ ID NO：211中所列出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：214(由SEQ ID NO：213中所列出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：216(由SEQ ID NO：215中所列出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：218(由SEQ ID NO：217中所列出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：182(由SEQ ID NO：181中所列出的核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：220(由SEQ ID NO：219中所列出的核苷酸序列编码)中所列出的氨基酸序列的多肽。

在一些方面，CDPS多肽包含具有SEQ ID NO：222(由SEQ ID NO：221中所列出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：224(由SEQ ID NO：223中所列出的核苷酸序列编码)、SEQ IDNO：226(由SEQ ID NO：225中所列出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：228(由SEQ ID NO：227中所列出的核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：230(由SEQ ID NO：229中所列出的核苷酸序列编码)中所列出的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，CDPS多肽缺乏叶绿体转运肽。例如，缺乏叶绿体转运肽的CDPS多肽可以包括具有SEQ D NO：184中所列出的氨基酸序列的多肽(由SEQ ID NO：183中所列出的核苷酸序列编码)。

在一些方面，KS多肽包含具有SEQ ID NO：232(由SEQ ID NO：231中所列出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：234(由SEQ ID NO：233中所列出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：236(由SEQ ID NO：235中所列出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：238(由SEQ ID NO：237中所列出的核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：186(由SEQ ID NO：185中所列出的核苷酸序列编码)中所列出的氨基酸序列的多肽。

在一些实施方案中，重组宿主包含编码CDPS-KS多肽的基因。在一些方面，CDPS-KS多肽包含具有SEQ ID NO：240(由SEQ ID NO：239中所列出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：242(由SEQ ID NO：241中所列出的核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：244(由SEQ ID NO：243中所列出的核苷酸序列编码)中所列出的氨基酸序列的多肽。

在一些方面，KO多肽包含具有SEQ ID NO：188(可由SEQ ID NO：187中所列出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：246(由SEQ ID NO：245中所列出的核苷酸序列编码)、SEQ IDNO：249(由SEQ ID NO：247或SEQ ID NO：248中所列出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：251(由SEQ ID NO：250中所列出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：253(由SEQ ID NO：252中所列出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：255(由SEQ ID NO：254中所列出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：257(由SEQ ID NO：256中所列出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：259(由SEQ IDNO：258中所列出的核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：261(由SEQ ID NO：260中所列出的核苷酸序列编码)中所列出的氨基酸序列的多肽。

在一些方面，CPR多肽包含具有SEQ ID NO：263(可由SEQ ID NO：262中所列出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：265(由SEQ ID NO：264中所列出的核苷酸序列编码)、SEQ IDNO：287(由SEQ ID NO：286中所列出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：289(由SEQ ID NO：288中所列出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：194(由SEQ ID NO：193中所列出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：291(由SEQ ID NO：290中所列出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：293(由SEQ ID NO：292中所列出的核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：190(由SEQ ID NO：189中所列出的核苷酸序列编码)中所列出的氨基酸序列的多肽。

在一些方面，KAH多肽包含具有SEQ ID NO：192(可由SEQ ID NO：191中所列出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：266(由SEQ ID NO：294或SEQ ID NO：295中所列出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：269(由SEQ ID NO：267或SEQ ID NO：268中所列出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：270、SEQ ID NO：271、SEQ ID NO：272、SEQ ID NO：273、SEQ ID NO：275(由SEQ ID NO：274中所列出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：277(由SEQ ID NO：276中所列出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：279(由SEQ ID NO：278中所列出的核苷酸序列编码)、SEQID NO：281(由SEQ ID NO：280中所列出的核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：283(由SEQ IDNO：282中所列出的核苷酸序列编码)中所列出的氨基酸序列的多肽。

在一些实施方案中，重组宿主包含编码UGT85C2多肽的核酸(SEQ ID NO：195，SEQID NO：196)、编码UGT76G1多肽的核酸(SEQ ID NO：199，SEQ ID NO：200)、编码UGT74G1多肽的核酸(SEQ ID NO：197，SEQ ID NO：198)、编码UGT91D2多肽的核酸(即，SEQ ID NO：284，SEQ ID NO：285的UGT91D2e或SEQ ID NO：201，SEQ ID NO：202的UGT91D2e-b)和/或编码EUGT11多肽的核酸(SEQ ID NO：203，SEQ ID NO：204)。技术人员将了解的是，这些基因的表达可能是产生特定甜菊醇糖苷所必需的，但是这些基因中的一种或多种可以是宿主内源的，只要这些基因中的至少一种(并且在一些实施方案中为所有)为引入到微生物中的重组基因。在一个具体实施方案中，产甜菊醇重组微生物包含编码UGT85C2、UGT76G1或UGT91D2多肽的外源核酸。在另一个具体实施方案中，产甜菊醇重组微生物包含编，码UGT85C2、UGT76G1、UGT74G1和UGT91D2多肽的外源核酸。在又一个具体实施方案中，产甜菊醇重组微生物包含编码UGT85C2、UGT76G1、UGT74G1和EUGT11多肽的外源核酸。在又一个具体实施方案中，产甜菊醇重组微生物包含编码UGT85C2、UGT76G1、UGT74G1、UGT91D2(尤其包括91D2e、91D2m、91D2e-b以及其功能性同源物)以及EUGT11多肽的外源核酸。参见实施例1-4。

在某些实施方案中，甜菊醇糖苷为RebA、RebB、RebD和/或RebM。RebA可以在表达UGT85C2、UGT76G1、UGT74G1和UGT91D2的产甜菊醇重组微生物中合成。RebB可以在表达UGT85C2、UGT76G1和UGT91D2的产甜菊醇重组微生物中合成。RebD可以在表达UGT85C2、UGT76G1、UGT74G1和UGT91D2和/或EUGT11的产甜菊醇重组微生物中合成。RebM可以在表达UGT85C2、UGT76G1、UGT74G1和UGT91D2和/或EUGT11的产甜菊醇重组微生物中合成(参见图1)。

在一些实施方案中，甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体通过在体外使甜菊醇糖苷前体与参与甜菊醇糖苷途径的一种或多种酶接触来产生。例如，使甜菊醇与UGT多肽接触可导致甜菊醇糖苷在体外产生。在一些实施方案中，甜菊醇糖苷前体通过在体外使上游甜菊醇糖苷前体与参与甜菊醇糖苷途径的一种或多种酶接触来产生。例如，使对映-贝壳杉烯酸与KAH酶接触可导致甜菊醇在体外产生。

在一些实施方案中，甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体通过全细胞生物转化来产生。对于发生的全细胞生物转化而言，表达参与甜菊醇糖苷途径的一种或多种酶的宿主细胞消耗并修饰细胞内的甜菊醇糖苷；在体内修饰之后，甜菊醇糖苷保留在细胞内和/或分泌到培养基中。例如，表达编码UGT多肽的基因的宿主细胞可以消耗细胞内的甜菊醇和糖基化甜菊醇；在体内进行糖基化之后，甜菊醇糖苷可以分泌到培养基中。在一些实施方案中，细胞被透化处理以消耗待修饰的底物或者分泌修饰的产物。

在一些实施方案中，在体内、在体外或通过全细胞生物转化产生的甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体组合物不会包含与尤其来自甜叶菊植物的甜叶菊提取物相比减少的量的植物来源的组分。植物来源的组分可产生异味并且包括颜料、脂质、蛋白质、酚类、糖类、斯巴醇和其他倍半萜烯、半日花烷型二萜类、单萜类、癸酸、8，11，14-二十碳三烯酸、2-甲基十八烷、二十五烷、二十八烷、二十四烷、十八醇、豆甾醇、β-谷甾醇、α-和β-香树脂醇、羽扇豆醇、β-香树脂醇乙酸酯、五环三萜类、矢车菊黄素(centauredin)、槲皮苷、表-α-杜松醇、石竹烯(carophyllene)和衍生物、β-蒎烯、β-谷甾醇以及赤霉素。在一些实施方案中，在本文中提及的植物来源的组分为非糖苷化合物。

如本文所用，术语“可检测量”、“可检测浓度”、“可测量量”和“可测量浓度”是指以AUC、μM/OD₆₀₀、mg/L、μM或mM测量的甜菊醇糖苷的水平。通过本领域技术人员通常可用的技术可以检测和/或分析甜菊醇糖苷产生(即，总体、上清液和/或细胞内甜菊醇糖苷水平)，所述技术例如但不限于液相色谱-质谱法(LC-MS)、薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、紫外可见光光谱法/分光光度法(UV-Vis)、质谱法(MS)以及核磁共振光谱法(NMR)。

如本文所用，术语“不可检测浓度”是指太低不能通过技术诸如TLC、HPLC、UV-Vis、MS或NMR测量和/或分析的化合物水平。在一些实施方案中，“不可检测浓度”的化合物不存在于甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体组合物中。

如本文所用，术语“或”和“和/或”用于描述组合的或不包含彼此的多种组分。例如，“x、y和/或z”可以是指单独的“x”、单独的“y”、单独的“z”、“x、y和z”、“(x和y)或z”、“x或(y和z)”或“x或y或z”。在一些实施方案中，“和/或”用于是指重组细胞所包含的外源核酸，其中重组细胞包含选自一个组的一种或多种外源核酸。在一些实施方案中，“和/或”用于是指甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体的产生。在一些实施方案中，“和/或”用于是指甜菊醇糖苷的产生，其中一种或多种甜菊醇糖苷得以产生。在一些实施方案中，“和/或”用于是指甜菊醇糖苷的产生，其中一种或多种甜菊醇糖苷通过以下步骤中的一个或多个来产生：培养重组微生物、在重组微生物中合成一种或多种甜菊醇糖苷和/或分离一种或多种甜菊醇糖苷。

功能性同源物

以上所述的多肽的功能性同源物也适用于在重组宿主中产生甜菊醇糖苷。功能性同源物为与参考序列具有序列相似性并且执行参考多肽的一种或多种生物化学或生理学功能的多肽。功能性同源物和参考多肽可以是天然存在的多肽，并且序列相似性可以是由于会聚型或分叉型进化事件。这样，功能性同源物有时在文献中被指示为同源物、直向同源物或旁系同源物。天然存在的功能性同源物的变体(诸如由野生型编码序列的突变体编码的多肽)本身可以是功能性同源物。功能性同源物也可以通过定向诱变多肽的编码序列或者通过将来自不同天然存在的多肽的编码序列的结构域组合(“结构域交换”)来形成。用于修饰编码本文所述的功能性多肽的基因的技术为已知的并且尤其包括定向进化技术、定点诱变技术和随机诱变技术，并且可以适用于增加多肽的比活性、改变底物特异性、改变表达水平、改变亚细胞位置或者以所需方式修改多肽-多肽相互作用。此类修饰的多肽被认为是功能性同源物。术语“功能性同源物”有时适用于编码功能同源性多肽的核酸。

功能性同源物可以通过分析核苷酸和多肽序列比对来鉴定。例如，在核苷酸或多肽序列的数据库上进行查询可以鉴定甜菊醇糖苷生物合成多肽的同源物。序列分析可以涉及使用UGT氨基酸序列作为参考序列对非冗余数据库进行的BLAST、交互BLAST或PSI-BLAST分析。在一些情况下，氨基酸序列从核苷酸序列推导得到。数据库中具有大于40％序列同一性的那些多肽为进一步评价作为甜菊醇糖苷生物合成多肽的适合性的候选物。氨基酸序列相似性允许进行保守性氨基酸取代，诸如一个疏水性残基被另一个残基取代或一个极性残基被另一个残基取代。如果需要，可以进行此类候选物的手动检查，以便缩窄待进行进一步评价的候选物数目。可以通过选择似乎具有存在于甜菊醇糖苷生物合成多肽中的结构域(例如，保守性功能结构域)的那些候选物来进行手动检查。在一些实施方案中，核酸和多肽基于表达水平而非通过使用BLAST分析来从转录组数据中鉴定。

保守性区域可以通过在甜菊醇糖苷生物合成多肽的主要氨基酸序列内定位一个区域来鉴定，所述区域为重复序列，形成一些二级结构(例如，螺旋和β折叠)，建立带正电荷或负电荷的结构域，或者表示蛋白质基序或结构域。参见，例如，在万维网上描述各种蛋白质基序和结构域的保守性序列的Pfam网站sanger.ac.uk/Software/Pfam/andpfam.janelia.org/。Pfam数据库处包含的信息描述于Sonnhammer等，Nucl.AcidsRes.，26：320-322(1998)；Sonnhammer等，Proteins，28：405-420(1997)；以及Bateman等，Nucl.Acids Res.，27：260-262(1999)。保守性区域也可以通过比对来自紧密相关种类的相同或相关多肽的序列来确定。紧密相关种类优选地来自相同家族。在一些实施方案中，来自两种不同种类的序列的比对适于鉴定此类同源物。

通常，表现出至少约40％氨基酸序列同一性的多肽适用于鉴定保守性区域。相关多肽的保守性区域表现出至少45％氨基酸序列同一性(例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％氨基酸序列同一性)。在一些实施方案中，保守性区域表现出至少92％、94％、96％、98％或99％氨基酸序列同一性。

例如，适用于在重组宿主中产生甜菊醇的多肽包括UGT的功能性同源物。

修饰例如UGT的底物特异性的方法为本领域技术人员已知的并且包括但不限于定点/合理诱变方法、随机定向进行方法以及在酶活性位点附近进行随机诱变/饱和技术的组合。例如，参见Osmani等，2009，Phytochemistry 70：325-347。

候选序列通常具有的长度为参考序列的长度的80％至250％，例如参考序列长度的82％、85％、87％、89％、90％、93％、95％、97％、99％、100％、105％、110％、115％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％或250％。功能性同源物多肽通常具有的长度为参考序列的长度的95％至105％，例如参考序列的长度的90％、93％、95％、97％、99％、100％、105％、110％、115％或120％或其间的任何范围。任何候选核酸或多肽相对于参考核酸或多肽的同一性％可如下确定。使用计算机程序Clustal Omega(版本1.2.1，默认参数)将参考序列(例如，本文所述的核酸或氨基酸序列)与一种或多种候选序列比对，所述计算机程序使得能够穿过其整个长度进行核酸或多肽序列的比对(全局比对)。Chenna等，2003，Nucleic Acids Res.31(13)：3497-500。

Clustal Omega计算参考序列与一种或多种候选序列之间的最佳匹配，并且将它们比对，以使得可测定同一性、相似性和差异。一个或多个残基的空位可以***到参考序列、候选序列或二者中，以使序列比对最大化。对于核酸序列的快速成对比对，使用以下默认参数：字号：2；窗口大小：4；评分方法：年龄％；顶部对角线数目：4；以及空位罚分：5。对于核酸序列的多重比对，使用以下参数：空位开口罚分：10.0；空位延伸罚分：5.0；以及权重转变：是。对于蛋白质序列的快速成对比对，使用以下参数：字号：1；窗口大小：5；评分方法：年龄％；顶部对角线数目：5；空位罚分：3。对于蛋白质序列的多重比对，使用以下参数：权重矩阵：blosum；空位开口罚分：10.0；空位延伸罚分：0.05；亲水性空位：开启；亲水性残基：Gly、Pro、Ser、Asn、Asp、Gln、Glu、Arg以及Lys；残基特异性空位罚分：开启。Clustal Omega输出为反映序列之间的关系的序列比对。Clustal Omega可以例如在万维网上的贝勒医学院搜索发射台(Baylor College of Medicine Search Launcher)网站(searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html)和欧洲生物信息学研究所网站http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/上运行。

为了测定候选核酸或氨基酸序列与参考序列的同一性％，使用Clustal Omega比对所述序列，比对中的相同匹配的数目除以参考序列的长度，并且结果乘以100。应注意，将同一性％值舍入至最接近的十分位。例如，将78.11、78.12、78.13和78.14向下舍入至78.1，而将78.15、78.16、78.17、78.18和78.19向上舍入至78.2。

将了解的是，功能性UGT蛋白可以包含不参与由所述酶进行的酶促活性的另外的氨基酸。在一些实施方案中，UGT蛋白质为融合蛋白。术语“嵌合体”、“融合多肽”、“融合蛋白”、“融合酶”、“融合构建体”、“嵌合蛋白”、“嵌合多肽”、“嵌合构建体”以及“嵌合酶”可在本文中互换使用，是指通过将编码不同蛋白质的两种或更多种基因连接在一起进行工程化的蛋白质。

在一些实施方案中，编码UGT多肽的核酸序列可以包含编码被设计来促进对编码的多肽进行后续操纵(例如，促进纯化或检测)、溶解、分泌或定位的“标签”的标签序列。标签序列可以***在编码多肽的核酸序列中，以使得所编码的标签定位在多肽的羧基端或氨基端。所编码的标签的非限制性实例包括绿色荧光蛋白(GFP)、人类流感病毒血凝素(HA)、谷胱甘肽S转移酶(GST)、聚组氨酸-标签(HIS标签)、二硫键氧化还原酶(DsbA)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、N-利用物质(NusA)、小泛素样修饰剂(SUMO)以及Flag^TM标签(Kodak，New Haven，CT)。标签的其他实例包括叶绿体转运肽、线粒体转运肽、造粉体肽、信号肽或分泌标签。

在一些实施方案中，融合蛋白为通过结构域交换改变的蛋白质。如本文所用，术语“结构域交换”用于描述使用第二蛋白质的结构域替代第一蛋白质的结构域的过程。在一些实施方案中，第一蛋白质的结构域和第二蛋白质的结构域为功能上相同的或功能上类似的。在一些实施方案中，第二蛋白质的结构域的结构和/或序列不同于第一蛋白质的结构域的结构和/或序列。在一些实施方案中，UGT多肽通过结构域交换进行改变。

转运蛋白表达

本文件描述了可用于有效产生甜菊醇糖苷组合物的试剂和方法。在重组宿主中参与甜菊醇糖苷到培养基中的转运的转运***的修饰可以允许在重组宿主中更有效地产生甜菊醇糖苷。

如本文所列出的，具有细胞转运修饰的重组细胞能够产生甜菊醇。本文所述的重组宿主可以产生甜菊醇并且具有至少一种内源转运蛋白基因的改变的表达。本文所述的重组宿主可以产生甜菊醇并且具有调节至少一种内源转运蛋白基因的表达的转录因子的改变的表达。改变内源转运蛋白基因的表达可以适用于增加甜菊醇的产生和/或甜菊醇到培养基中的分泌。

如本文所列出，具有细胞转运修饰的重组细胞能够产生至少一种甜菊醇糖苷，包括但不限于RebA、RebB、RebD和/或RebM。本文所述的重组宿主可以产生至少一种甜菊醇糖苷诸如RebA、RebB、RebD和/或RebM并且具有至少一种内源转运蛋白基因的改变的表达。本文所述的重组宿主可以产生至少一种甜菊醇糖苷诸如RebA、RebB、RebD和/或RebM并且具有调节至少一种内源转运蛋白基因的稳定性的运输衔接子基因的改变的表达。本文所述的重组宿主可以产生至少一种甜菊醇糖苷诸如RebA、RebB、RebD和/或RebM并且具有多个内源转运蛋白基因和/或调节多个内源转运蛋白基因的稳定性的多个运输衔接子基因的改变的表达。改变内源转运蛋白基因和/或运输衔接子基因的表达可以适用于增加甜菊醇糖苷的产生和/或甜菊醇糖苷到培养基中的分泌。

本文所公开的重组宿主可包含一种或多种生物合成基因，诸如编码蔗糖转运蛋白和蔗糖合酶的一种或多种基因；编码香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPPS)多肽的基因；编码对映-柯巴基二磷酸合酶(CDPS)多肽的基因；编码贝壳杉烯合酶(KS)多肽的基因；编码贝壳杉烯氧化酶(KO)多肽的基因；编码甜菊醇合酶(KAH)多肽的基因；编码细胞色素P450还原酶(CPR)多肽的基因；编码UGT85C2多肽的基因；编码UGT76G1多肽的基因；编码UGT74G1多肽的基因；编码UGT91D2功能性同源物的基因；和/或编码EUGT11多肽的基因；其中一种或多种这些基因的表达引起甜菊醇甜菊醇糖苷诸如RebA、RebB、RebD和/或RebM产生。

如本文所用，术语“甜菊醇糖苷的转运”、“甜菊醇糖苷转运”、“甜菊醇糖苷的分泌”和“甜菊醇糖苷分泌”可以互换使用。

如本文所用，术语“转运蛋白”(也称为膜转运蛋白)是指参与小分子、大分子(诸如碳水化合物)和离子穿过生物膜移动的膜蛋白。转运蛋白跨越它们所定位的膜并且它们穿过所述膜转运物质。转运蛋白可以有助于物质从细胞内空间移动(即，转运或分泌)到培养基中。已知转运蛋白充当被动转运***，携带分子朝向其浓度梯度下方，或者作为主动转运***，使用能量携带分子朝向其浓度梯度上方。主动转运通过将转运与来源于ATP分子水解的能量的使用联接在一起的载体或通过利用预先确立的驱动营养素分子和共转运离子共同转运的电化学离子梯度的载体来介导。后一种类别包括同向转运蛋白和逆向转运蛋白，其分别在与所转运底物相同或相反的方向中携带离子。

转运蛋白已根据各种标准在转运蛋白分类数据库(在万维网tcdb.org上)处分类。参见，Saier Jr.等，Nucl.Acids Res.，42(1)：D251-258(2014)。其非限制性实例除其他之外包括被认为在活生物体中普遍存在的多药物抗性(MDR)质膜转运蛋白。MDR转运蛋白超家族可以根据操作模式进一步细分，底物通过所述操作模式从膜一侧转运至另一侧。转运蛋白可以运行来响应于化学渗透性离子梯度或通过主动转运移动物质穿过膜。ATP-结合盒转运蛋白(ABC转运蛋白)为利用三磷酸腺苷(ATP)水解的能量来进行各种底物穿过膜的易位的跨膜蛋白。它们可转运各种各样的底物穿过质膜和细胞内膜，包括代谢性产物、脂质和甾醇以及药物。内源性ABC转运蛋白基因的特定非限制性实例包括PDR5、YDR061W、PDR15、SNQ2、YOR1、YOL075C、MDL2、ADP1、CAF16、VMR1以及STE6(或其功能性同源物)。在一些方面，ABC转运蛋白转运甜菊醇糖苷。

第二组MDR基于有助于转运的化学身体性梯度的性质来进一步细分。Saier，Jr.等，J.Mol.Microbiol.Biotechnol.1：257-279(1999)。在一些方面，MDR转运蛋白转运甜菊醇糖苷。

另一种转运蛋白家族主要易化超家族(MFS)转运蛋白为可响应于质子梯度而转运小溶质的单体多肽。MFS转运蛋白家族有时称为单转运体-同向转运蛋白-逆向转运蛋白家族。MFS转运蛋白尤其在糖摄取和药物流出***中起作用。MFS转运蛋白通常包含保守性MFS-特异性基序。内源性MFS转运蛋白基因的非限制性实例包括DTR1、SEO1、YBR241C、VBA3、FEN2、SNF3、STL1、HXT10、AZR1、MPH3、VBA5、GEX2、SNQ1、AQR1、MCH1、MCH5、ATG22、HXT15、MPH2、ITR1、SIT1、VPS73、HXT5、QDR1、QDR2、QDR3、SOA1、HXT9、YMR279C、YIL166C、HOL1、ENB1、TPO4以及FLR1(或其功能性同源物)。在一些方面，MFS转运蛋白转运甜菊醇糖苷。在一些实施方案中，PDR5、PDR15、SNQ2或YOR1转运贝壳杉烯酸、甜菊醇和/或甜菊醇单苷。

其他转运蛋白家族包括SMR(小多药物抗性)家族、RND(抗性成节细胞***)家族和MATE(多药物和毒性化合物排出)家族。SMR家族成员为特征在于四个α-螺旋跨膜链的整合膜蛋白，所述跨膜链赋予对广泛范围的防腐剂、亲脂性季铵化合物(QAC)的抗性和细菌氨基糖苷抗性。参见Bay&Turner，2009，BMC Evol Biol.，9：140。在一些方面，SMR转运蛋白转运甜菊醇糖苷。

MATE家族成员包含12个跨膜(TM)结构域。MATE家族成员已在原核生物、酵母(诸如酿酒酵母和粟酒裂殖酵母)和植物中得到鉴定。参见Diener等，2001，Plant Cell.13(7)：1625-8。MATE家族成员为钠或质子逆向转运蛋白。在一些方面，MATE转运蛋白转运甜菊醇糖苷。

另外的转运蛋白家族包括氨基酸/植物生长素通透酶(AAAP)家族(例如，YKL146W/AVT3、YBL089W/AVT5、YER119C/AVT6和YIL088C/AVT7)、ATP酶家族(例如，YBL099W/ATP1、YDL185W/VMA1、YLR447C/VMA6、YOL077W/ATP19、YPL078C/ATP4、YEL027W/VMA3、YKL016C/ATP7以及YOR332W/VMA4)、硫酸通透酶(SulP)家族(例如，YBR294W/SUL1、YGR125W和YPR003C)、溶酶体半氨酸转运蛋白(LCT)家族(例如，YCR075C/ERS1)、Ca2+：阳离子逆向转运蛋白(CaCA)家族(例如，YDL128W/VCX1和YJR106W/ECM27)、氨基酸-聚胺-有机阳离子(APC)超家族(例如，YDL210W/UGA4、YOL020W/TAT2、YPL274W/SAM3、YNL268W/LYP1、YHL036W/MUP3、YKR039W/GAP1以及YOR348C/PUT4)、多药物/寡糖基-脂质/多糖(MOP)(例如，YDR338C)、ZRT/IRT-样蛋白质(ZIP)金属转运蛋白家族(例如，YGL225W/ZRT1和YOR079C/ATX2)、the线粒体蛋白质易位酶(MPT)家族(例如，YGR181W/TIM13、YNL070W/TOM7、YNL121C/TOM70、电压门控离子通道(VIC)家族(例如，YGR217W/CCH1和YJL093C/TOK1)、单价阳离子：质子逆向转运蛋白-2(CPA2)家族(例如，YJL094C/KHA1)、推定的跨膜氨基酸流出转运蛋白的ThrE家族(例如，YJL108C/PRM10)、寡肽转运蛋白(OPT)家族(例如，YJL212C/OPT1和YGL114W)、K⁺转运蛋白(Trk)家族(例如，TKR050W/TRK2)、胆汁酸：Na同向转运蛋白(BASS)家族(例如，YMR034C)、药物/代谢物转运蛋白(DMT)超家族(例如，YMR253C、YML038C/YMD8和YOR307C/SLY41)、线粒体载体(MC)家族(例如，YMR056C/AAC1、YNL083W/SAL1、YOR130C/ORT1、YOR222W/ODC2、YPR011C、YPR058W/YMC1、YPR128C/ANT1、YEL006W/YEA6、YER053C/PIC2、YFR045W、YGR257C/MTM1、YHR002W/LEU5、YIL006W/YIA6、YJL133W/MRS3、YKL120W/OAC1、YMR166C、YNL003C/PET8以及YOR100C/CRC1)、植物生长素流出载体(AEC)家族(例如，YNL095C、YOR092W/ECM3andYBR287W)、氨通道转运蛋白(Amt)家族(例如，YNL142W/MEP2)、金属离子(Mn²⁺-铁)转运蛋白(Nramp)家族(例如，YOL122C/SMF1)、瞬时型感受器电位Ca²⁺通道(TRP-CC)家族(例如，YOR087W/YVC1)、砷抗性-3(ACR3)家族(例如，YPR201W/ARR3)、核碱基：阳离子同向转运蛋白-1(NCS1)家族(例如，YBR021W/FUR4)、无机磷酸转运蛋白(PiT)家族(例如，YBR296C/PHO89)、亚砷酸-亚锑酸(ArsAB)流出家族(例如，YDL100C/GET3)、转运蛋白的IISP家族、甘油摄取(GUP)家族(例如，YGL084C/GUP1)、金属离子转运(MIT)家族(例如，YKL064W/MNR2、YKL050C和YOR334W/MRS2)、铜转运(Ctr)家族(例如，YLR411W/CTR3)以及阳离子扩散促进剂(CDF)家族(例如，YOR316C/COT1)。任何这些转运蛋白家族的具体成员包括在所公开的发明的范围，其程度为能够产生甜菊醇糖苷的细胞中的改变的表达增加了所述甜菊醇糖苷的产生和/或分泌。

本文公开了用于鉴定影响甜菊醇糖苷和甜菊醇糖苷途径中间体的产生或转运的基因的方法。此类方法可涉及灭活至少一种内源性转运蛋白基因或修饰至少一种转运蛋白基因的表达。通常，制备突变体微生物文库，在文库中的每个突变体具有不同的灭活的内源性转运蛋白基因。灭活基因并确定其在微生物中的作用的方法为本领域普通技术人员已知的；另外的方法公开于WO 2014/122328中，所述专利的公开内容以引用的方式整体并入。在其中合成甜菊醇或甜菊醇糖苷的条件下在培养基中培养包含一种或多种甜菊醇糖苷途径基因的突变体微生物，并且如本文所述测量(例如，使用LC-MS)由微生物产生的总体、上清液和/或细胞内甜菊醇糖苷的量。

本公开涉及其中内源性转运蛋白基因或运输衔接子基因的表达得到修饰的重组宿主细胞。在一些实施方案中，转运蛋白或运输衔接子基因为酿酒酵母内源的，包括但不限于酿酒酵母菌株S288C。在一些实施方案中，内源性转运蛋白或运输衔接子的表达可通过用引起转运蛋白的表达增加(例如，至少5％表达增加，诸如至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％、100％、200％或更多表达增加)的不同启动子替代内源性启动子来修饰。例如，内源性启动子可以用引起转运蛋白的表达增加的组成型或诱导型启动子替代。参见，例如，Partow等，2010，Yeast 27：955-64。可以使用同源重组，以用引起转运蛋白的表达增加的不同启动子替代内源基因的启动子。在其他实施方案中，诱导型或组成型启动子和内源性转运蛋白或运输衔接子可以使用同源重组整合到基因组的另一个基因座中。在其他实施方案中，转运蛋白或运输衔接子基因可以使用具有引起转运蛋白或运输衔接子在微生物中过度表达的启动子的外源质粒引入到微生物中。在另一个实施方案中，外源质粒也可包含转运蛋白或运输衔接子基因的多个拷贝。在另一个实施方案中，内源性转运蛋白或运输衔接子可以使用重组微生物的天然机制(例如，热休克、应激、重金属或抗生素暴露)诱导来过度表达。在另一个实施方案中，内源基因产物的活性得到增强或增加(例如，通过突变)。在另一个实施方案中，内源性酵母转运蛋白或运输衔接因子基因的同源或直向同源基因过度表达。

如本文所用，术语“修饰的转运蛋白基因表达”是指编码转运蛋白多肽的内源基因的缺失、编码糖流出转运蛋白(SET)转运蛋白多肽的基因的表达或过度表达、编码SWEET转运蛋白多肽的基因的表达或过度表达、编码运输衔接子多肽的基因的缺失或过度表达、编码转运蛋白多肽的内源基因的表达或过度表达或者编码转运蛋白多肽的异源基因的表达或过度表达。

在一些实施方案中，产甜菊醇糖苷宿主用SET(糖流出转运蛋白)或SWEET转运蛋白转化。参见例如Chen等，“Sugar transporters for intercellular exchange andnutrition of pathogens，”Nature 468(7323)：527-32(2010)以及Sun&Vanderpool，“Regulation and Function of Escherichia coliSugar Efflux Transporter A(SetA)during Glucose-Phosphate Stress，”Journal of Bacteriology 193(1)：143-53(2011)。在一些实施方案中，SET转运蛋白为来自大肠杆菌的SetA(SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18)(其中第一个SEQ ID NO列出了基因的核酸序列并且第二个列出了编码的多肽的推导的氨基酸序列)、来自大肠杆菌的SetB(SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20)或来自大肠杆菌的SetC(SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22)。在一些实施方案中，SWEET转运蛋白为来自芜菁的SWEET(SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24)、来自矮牵牛的SWEET(SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26)或来自图小麦的SWEET(SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28)。在一些实施方案中，产甜菊醇糖苷宿主中SET或SWEET转运蛋白的表达引起甜菊醇糖苷诸如RebA、RebB、RebD或RebM的分泌得到改进。参见实施例2。

在一些实施方案中，转运蛋白基因从产甜菊醇糖苷宿主中敲除以降低13-SMG分泌。在一些实施方案中，13-SMG分泌的降低引起甜菊醇糖苷诸如RebD和RebM的产生增加。在一些实施方案中，敲除的转运蛋白基因为YOR087W(SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2)、YML038C(SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4)、YJR135W-A(SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6)、YDR406W(SEQ IDNO：7，SEQ ID NO：8)、YIR028W(SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10)、YGR138C(SEQ ID NO：11，SEQID NO：12)、YJL214W(SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14)或YDR345C(SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16)。在一些实施方案中，YOR087W(SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2)、YML038C(SEQ ID NO：3，SEQID NO：4)、YJR135W-A(SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6)、YDR406W(SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8)、YIR028W(SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10)、YGR138C(SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12)、YJL214W(SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14)或YDR345C(SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16)之一的缺失引起13-SMG分泌减少高达70％。参见实施例1。

在一些实施方案中，运输衔接子蛋白(在本文中也称为“衔接子蛋白”)从产甜菊醇糖苷宿主中敲除。衔接子蛋白参与调节蛋白质运输、蛋白质易位、基因表达和内吞作用。参见例如Lin等，2008，Cell135(4)：714-25；Nikko&Pelham，2009，Traffic 10(12)：1856-67；以及Nikko等，2008，EMBORep.9(12)：1216-21。在一些方面，编码衔接子蛋白的基因的缺失引起转运蛋白稳定或者预防或减慢了转运蛋白的降解。在一些方面，编码一种或多种衔接子蛋白的一种或多种基因是缺失的。在一些实施方案中，衔接子蛋白为Art1(SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32)、Art2(SEQ ID NO：34)、Art3(SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36)、Art4(SEQID NO：37，SEQ ID NO：38)、Art6(SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40)、Art7(SEQ ID NO：41，SEQID NO：42)、Art8(SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：44)、Art9(SEQ ID NO：165，SEQ ID NO：166)、Art10(SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30)、Bul1(SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46)、Bul2(SEQ IDNO：47，SEQ ID NO：48)、Tre1(SEQ ID NO：173，SEQ ID NO：174)、Ear1(SEQ ID NO：169，SEQID NO：170)、Ssh4(SEQ ID NO：171，SEQ ID NO：172)或Bsd2(SEQ ID NO：167，SEQ ID NO：168)。参见实施例3。

在一些实施方案中，Art1(SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32)、Art2(SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34)、Art3(SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36)、Art6(SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40)、Art7(SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42)、Art8(SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：44)、Art9(SEQID NO：165，SEQ ID NO：166)、Art10(SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30)、Bul1(SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46)、Trel(SEQ ID NO：173，SEQ ID NO：174)、Earl(SEQ ID NO：169，SEQ ID NO：170)、Ssh4(SEQ ID NO：171，SEQ ID NO：172)或Bsd2(SEQ ID NO：167，SEQ ID NO：168)的缺失增加了13-SMG的分泌。参见实施例3。

在一些实施方案中，Artl(SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32)、Art2(SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34)、Art3(SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36)、Art4(SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：38)、Art6(SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40)、Art7(SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42)、Art8(SEQID NO：43，SEQ ID NO：44)、Art9(SEQ ID NO：165，SEQ ID NO：166)、Art10(SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30)、Bul1(SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46)、Bul2(SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48)、Tre1(SEQ ID NO：173，SEQ ID NO：174)、Ear1(SEQ ID NO：169，SEQ ID NO：170)或Ssh4(SEQ ID NO：171，SEQ ID NO：172)的缺失增加了RebA的分泌。参见实施例3。

在一些实施方案中，Artl(SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32)、Art2(SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34)、Art3(SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36)、Art4(SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：38)、Art6(SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40)、Art7(SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42)、Art8(SEQID NO：43，SEQ ID NO：44)、Art9(SEQ ID NO：165，SEQ ID NO：166)、Art10(SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30)、Bu11(SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46)、Bul2(SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48)、Trel(SEQ ID NO：173，SEQ ID NO：174)、Earl(SEQ ID NO：169，SEQ ID NO：170)、Ssh4(SEQ ID NO：171，SEQ ID NO：172)或Bsd2(SEQ ID NO：167，SEQ ID NO：168)的缺失增加了RebB的分泌。参见实施例3。

在一些实施方案中，Art3(SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36)、Art7(SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42)、Art9(SEQ ID NO：165，SEQ ID NO：166)、Art10(SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30)或Bul1(SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46)的缺失增加了RebD的分泌。参见实施例3。

在一些实施方案中，Art1(SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32)、Art2(SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34)、Art3(SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36)、Art4(SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：38)、Art6(SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40)、Art7(SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42)、Art8(SEQID NO：43，SEQ ID NO：44)、Art9(SEQ ID NO：165，SEQ ID NO：166)、Art10(SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30)、Bul1(SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46)、Bul2(SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48)、Trel(SEQ ID NO：173，SEQ ID NO：174、Ear1(SEQ ID NO：169，SEQ ID NO：170)或Ssh4(SEQ ID NO：171，SEQ ID NO：172)的缺失增加了RebA的分泌。参见实施例3。

在一些实施方案中，Art1(SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32)、Art2(SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34)、Art3(SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36)、Art6(SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40)、Art7(SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42)、Art8(SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：44)、Art9(SEQID NO：165，SEQ ID NO：166)、Art10(SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30)、Bul1(SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46)、Tre1(SEQ ID NO：173，SEQ ID NO：174)、Earl(SEQ ID NO：169，SEQ ID NO：170)、Ssh4(SEQ ID NO：171，SEQ ID NO：172)或Bsd2(SEQ ID NO：167，SEQ ID NO：168)的过度表达或者Art4(SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：38)或Bul2(SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48)的缺失降低了13-SMG的分泌。在一些实施方案中，Art1(SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32)、Art2(SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34)、Art3(SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36)、Art6(SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40)、Art7(SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42)、Art8(SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：44)、Art9(SEQ ID NO：165，SEQ ID NO：166)、Art10(SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30)、Bul1(SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46)、Tre1(SEQ ID NO：173，SEQ ID NO：174)、Ear1(SEQ ID NO：169，SEQ ID NO：170)、Ssh4(SEQ ID NO：171，SEQ ID NO：172)或Bsd2(SEQ ID NO：167，SEQID NO：168)的过度表达或者Art4(SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：38)或Bul2(SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48)的缺失增加了RebA、RebB、RebD和/或RebM的产生。

在其他实施方案中，衔接子蛋白为Art5(SEQ ID NO：163SEQ ID NO：164)或Tre2(SEQ ID NO：175，SEQ ID NO：176)。

在一些实施方案中，产甜菊醇糖苷宿主中的转运蛋白基因的缺失引起甜菊醇糖苷的产生得到改进。在一些实施方案中，转运蛋白缺失不会改变甜菊醇糖苷分泌活性。在一些实施方案中，改进甜菊醇糖苷产生的缺失的转运蛋白基因为YBR068C(SEQ ID NO：63，SEQID NO：64)、YBR220C(SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：66)、YBR235W(SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：68)、YBR293W(SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：70)、YBR298C(SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：72)、YCR011C(SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：74)、YCR023C(SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：76)、YDL100C(SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：78)、YDL119C(SEQ ID NO：79，SEQ ID NO：80)、YDL138W(SEQ IDNO：81，SEQ ID NO：82)、YDL199C(SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：84)、YDL210W(SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：86)、YDL245C(SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：88)、YDR061W(SEQ ID NO：89，SEQ IDNO：90)、YDR135C(SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：92)、YDR508C(SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：94)、YEL006W(SEQ ID NO：95，SEQ ID NO：96)、YFL028C(SEQ ID NO：97，SEQ ID NO：98)、YGL006W(SEQ ID NO：99，SEQ ID NO：100)、YGL114W(SEQ ID NO：101，SEQ ID NO：102)、YGR125W(SEQID NO：103，SEQ ID NO：104)、YGR181W(SEQ ID NO：105，SEQ ID NO：106)、YIL088C(SEQ IDNO：107，SEQ ID NO：108)、YJR124C(SEQ ID NO：109，SEQ ID NO：110)、YPL134C(SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：112)、YPR192W(SEQ ID NO：113，SEQ ID NO：114)、YPR194C(SEQ ID NO：115，SEQ ID NO：116)、YPR198W(SEQ ID NO：117，SEQ ID NO：118)、YPR201W(SEQ ID NO：119，SEQ ID NO：120)、YAL067C(SEQ ID NO：121，SEQ ID NO：122)、YBL089W(SEQ ID NO：123，SEQ ID NO：124)、YCR028C(SEQ ID NO：125，SEQ ID NO：126)、YDR438W(SEQ ID NO：127，SEQ ID NO：128)、YFL011W(SEQ ID NO：129，SEQ ID NO：130)、YGL084C(SEQ ID NO：131，SEQ ID NO：132)、YGL104C(SEQ ID NO：133，SEQ ID NO：134)、YGR224W(SEQ ID NO：135，SEQ ID NO：136)、YHR032W(SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：138)、YJL093C(SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：54)、YMR034C(SEQ ID NO：139，SEQ ID NO：140)、YNR055C(SEQ ID NO：141，SEQID NO：142)、YOL020W(SEQ ID NO：143，SEQ ID NO：144)或YOL075C(SEQ ID NO：145，SEQ IDNO：146)。在一些实施方案中，RebA、RebB、RebD和/或RebM产生有所增加。参见实施例4。

甜菊醇和甜菊醇糖苷生物合成核酸

编码本文所述的多肽的重组基因包含该多肽的编码序列，其在有义方向中可操作地连接至适用于表达所述多肽的一个或多个调节区域。因为许多微生物能够由多顺反子mRNA表达多种基因产物，所以多种多肽在需要时可在那些微生物的单个调节区域控制下表达。当调节区域和编码序列被定位成使得调节区域有效于调节序列的转录和翻译时，编码序列和调节区域被认为是可操作地连接的。通常，编码序列的翻译阅读框的翻译起始位点被定位在单顺反子基因的调节区域下游的一个与约五十个核苷酸之间。

在许多情况下，本文所述的多肽的编码序列中除重组宿主之外的种类中鉴定，即为异源核酸。因此，如果重组宿主为微生物，则编码序列可以是来自其他原核或真核微生物、来自植物或来自动物。然而，在一些情况下，编码序列为宿主原生序列并且被再次引入到该生物体中。原生序列可通过重组核酸构建体中连接至外源核酸的非天然序列(例如，侧接原生序列的非原生调节序列)的存在来与天然存在的序列区分。另外，稳定转化的外源核酸通常整合在除可见原生序列的位置之外的位置处。“调节区域”是指具有影响转录或翻译产物的转录或翻译起始和速率以及稳定性和/或活动性的核苷酸序列的核酸。调节区域包括但不限于启动子序列、增强子序列、反应元件、蛋白质识别位点、诱导型元件、蛋白质结合序列、5′和3′非反应区(UTR)、转录起始位点、末端序列、聚腺苷酸化序列、内含子以及其组合。调节区域通常包含至少一个核心(基础)启动子。调节区域也可包括至少一种控制元件，诸如增强子序列、上游元件或上游活化区域(UAR)。调节区域通过定位调节区域和编码序列以使得调节区域有效于调节序列的转录或翻译来可操作地连接至编码序列。例如，为了可操作地连接编码序列和启动子序列，将编码序列的翻译阅读框的翻译起始位点定位在启动子下游的一个与约五十个核苷酸之间。然而，调节区域可定位多至翻译起始位点上游多达约5,000个核苷酸或者转录起始位点上游约2,000个核苷酸。

待包含的调节序列的选择取决于若干因素，包括但不限于在某些培养阶段期间的效率、可选择性、可诱导性、所需表达水平和优选表达。本领域技术人员的常规主题为通过适当选择调节区域并相对于编码序列定位所述调节区域来调节编码序列的表达。将理解的是，可以存在超过一个调节区域，例如，内含子、增强子、上游活化区域、转录终止子以及诱导性元件。

一种或多种基因可以在重组核酸构建体的适用于甜菊醇和/或甜菊醇糖苷产生的离散方面的“模块”中组合。将模块(具体地为多顺反子模块)中的多个基因组合有助于使用多种种类中的模块。例如，甜菊醇生物合成基因簇或UGT基因簇可以在多顺反子模块中组合，以使得在***适合的调节区域之后，所述模块可以引入到各种各样的种类中。作为另一个实例，UGT基因簇可以组合，以使得每个UGT编码序列可操作地连接至单独的调节区域，以形成UGT模块。此模块可用于需要或希望单顺反子表达的那些种类中。除适用于甜菊醇或甜菊醇糖苷产生的基因之外，重组构建体通常还含有复制起点和用于维持适当种类中的构建体的一种或多种可选择标记。

将了解的是，由于遗传密码子的简并性，许多核酸可以编码特定多肽，即许多氨基酸，存在用作氨基酸密码子的超过一个核苷酸三联体。因此，给定多肽的编码序列的密码子可以被修饰成使得使用特定宿主中的适当密码子偏好性表获得该宿主(例如，微生物)中的最佳表达。作为分离的核酸，这些修饰的序列可以作为纯化的分子存在并且可以并入载体或病毒中以用于构建用于重组核酸构建体的模块。

在一些情况下，希望抑制内源性多肽的一种或多种功能，以便使代谢中间体转向甜菊醇或甜菊醇糖苷生物合成。例如，可能希望下调酵母菌株中的甜菊醇合成，以便例如通过下调角鲨烯环氧酶来进一步增加甜菊醇或甜菊醇糖苷产生。作为另一个实例，可能希望抑制某些内源基因产物的降解功能，例如从二级代谢物去除葡萄糖部分的糖水解酶或如本文所讨论的磷酸酶。作为另一个实例，可以活化参与转运甜菊醇糖苷的膜转运蛋白的表达，以使得糖基化甜菊苷的运输得到增加。此调节可有利的方面在于，甜菊醇糖苷的运输可以在微生物培养期间持续所需时间段增加，从而增加收获时糖苷产物的产量。在此类情况下，过度表达多肽或基因产物的核酸可包含在转化到菌株中的重组构建体中。可替代地，可以使用诱变来生成希望增加或增强功能的基因突变体。

宿主微生物

重组宿主可以用于表达多肽，以用于产生甜菊醇糖苷，包括哺乳动物、昆虫、植物和藻类细胞。许多原核生物和真核生物也适用于构建本文所述的重组微生物，例如格兰阴性细菌、酵母和真菌。首先分析选择用作甜菊醇糖苷产生菌株的种类和菌株，以确定哪些生产基因为菌株内源的并且哪些基因是不存在的。内源性对应物不存在于菌株中的基因有利地组装在一种或多种重组构建体中，所述重组构建体然后转化到菌株中，以便供应丢失的功能。

通常，重组微生物在发酵罐中在预定温度下生长所需时间段。由本发明提供的构建的和遗传工程化的微生物使用常规发酵方法来培养，所述发酵方法尤其包括恒化培养、分批培养、分批补料发酵、半连续发酵(诸如添加和提取)、连续灌注发酵以及连续灌注细胞培养。根据所述方法中所用的特定微生物，其他重组基因诸如异戊烯基生物合成基因和萜烯合酶与环化酶基因也可以存在并表达。底物和中间体(例如，异戊烯基二磷酸、二甲基烯丙基二磷酸、GGPP、贝壳杉烯、贝壳杉烯酸)的水平可通过从培养基中提取样品以用于根据公布的方法进行分析来测定。

在本发明方法中使用的碳源包括可由重组宿主细胞代谢以促进甜菊醇糖苷的生长和/或产生的任何分子。适合碳源的实例包括但不限于蔗糖(例如，如糖蜜中可见的)、果糖、木糖、乙醇、甘油、葡萄糖、纤维素、淀粉、纤维二糖或其他含葡萄糖聚合物。在采用酵母作为宿主的实施方案中，例如，碳源诸如蔗糖、果糖、木糖、乙醇、甘油以及葡萄糖为适合的。在整个培养时间段期间可以向宿主生物体提供碳源，或者可替代地，可以在另一种能量源例如蛋白质存在下使生物体生长一个时间段，并且然后仅在分批补料阶段期间提供碳源。

在重组微生物已在培养物中生长所需时间段之后，然后可使用本领域已知的各种技术从培养物中回收甜菊醇和/或一种或多种甜菊醇糖苷。在一些实施方案中，可以添加透化剂来帮助原料进入宿主并帮助产物排出。例如，可以将培养的微生物的粗裂解物离心，以获得上清液。然后可将所得上清液应用于色谱柱，例如C-18柱，并且用水洗涤以去除亲水性化合物，接着用溶剂诸如甲醇洗脱感兴趣的化合物。然后可通过制备型HPLC进一步纯化所述化合物。还参见，WO 2009/140394。

将了解的是，本文所讨论的各种基因和模块可以存在于除单个宿主之外的两种或更多种重组宿主中。当使用多个重组宿主时，它们可在混合培养物中生长，以产生甜菊醇和/或甜菊醇糖苷。

可替代地，两种或更多种宿主各自可在单独的培养基中生长并且第一培养基的产物(例如，甜菊醇)可以引入到第二培养基中，以转化成后续中间体，或者转化成最终产物例如像RebA。然后回收由第二或最终宿主产生的产物。还将了解的是，在一些实施方案中，使用除培养基之外的营养素源并利用除发酵罐之外的***来生长重组宿主。

以下更详细地描述示例性原核和真核种类。然而，应理解，其他种类可以是适合的。例如，适合的种类可以是诸如以下各项的属：伞草属(Agaricus)、曲霉属(Aspergillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假丝酵母属(Candida)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、假囊酵母属(Eremothecium)、埃希氏菌属(Escherichia)、镰刀菌属/赤霉菌属(Fusarium/Gibberella)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、硫磺菌属(Laetiporus)、香菇属(Lentinus)、法夫酵母属(Phaffia)、显革菌属(Phanerochaete)、毕赤酵母属(Pichia)、小立碗藓属(Physcomitrella)、红酵母属(Rhodoturula)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、痂圆孢属(Sphaceloma)、红酵母属(Xanthophyllomyces)或亚罗酵母属(Yarrowia)。来自此类属的示例性种类包括虎皮香菇(Lentinus tigrinus)、硫色绚孔菌(Laetiporus sulphureus)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、Cyberlindnerajadinii、小立碗藓(Physcomitrella patens)、粘红酵母(Rhodoturula glutinis)、胶红酵母(Rhodoturula mucilaginosa)、发夫酵母(Phaffia rhodozyma)、红发夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)、水稻恶苗病菌/藤仓赤霉(Fusarium fujikuroi/Gibberella fujikuroi)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、光滑假丝酵母(Candidaglabrata)、白假丝酵母(Candida albicans)以及解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。

在一些实施方案中，微生物可以是原核生物，诸如大肠杆菌。

在一些实施方案中，微生物可以是子囊菌，诸如藤仓赤霉、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、粟酒裂殖酵母、黑曲霉(Aspergillus niger)、解脂耶氏酵母、棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)或酿酒酵母。

在一些实施方案中，微生物可以是藻类细胞，诸如三孢布拉霉(Blakesleatrispora)、杜氏盐藻(Dunaliella salina)、雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)、小球藻属某种(Chlorella sp.)、裙带菜(Undaria pinnatifida)、马尾藻(Sargassum)、海带(Laminaria japonica)、养栅藻(Scenedesmus almeriensis)种类。

在一些实施方案中，微生物可以是蓝藻细胞，诸如三孢布拉霉、杜氏盐藻、雨生红球藻、小球藻属某种、裙带菜、马尾藻、海带、养栅藻。

酵母属某些种。

酵母属为合成生物学中广泛使用的基础生物体，并且可用作重组微生物平台。例如，存在对于酿酒酵母可用的突变体文库、质粒、详细计算机代谢模型和其他信息，从而允许合理设计各种模块以增强产物产量。已知用于制备重组微生物的方法。

曲霉属某些种。

曲霉属种类诸如米曲霉、黑曲霉和酱油曲霉未食品生产中广泛使用的微生物并且也可以用作重组微生物平台。核苷酸序列可用于构巢曲霉、烟曲霉、米曲霉、棒曲霉、黄曲霉、黑曲霉以及土曲霉的基因组中，从而允许对内源性途径进行合理设计和修饰，以增强通量并增加产物产量。已开发用于曲霉属的代谢模型以及转录组学研究和蛋白质组学研究。培养黑曲霉以用于工业生产许多食品成分诸如柠檬酸和葡糖酸，并且因此诸如黑曲霉的种类通常适用于生产甜菊醇糖苷。

大肠杆菌

大肠杆菌为合成生物学中广泛使用的平台生物体，并且也可用作重组微生物平台。与酵母属类似，存在对于大肠杆菌可用的突变体文库、质粒、详细计算机代谢模型和其他信息，从而允许合理设计各种模块以增强产物产量。可以使用与上文对于酵母属所述的那些方法类似的方法来制备重组大肠杆菌微生物。

伞草属、赤霉菌属和原毛平革菌属某些种。

伞草属、赤霉菌属和原毛平革菌属某些种也可以是有用的，因为已知它们在培养物中产生大量的类异戊二烯。因此，用于产生大量甜菊醇糖苷的萜烯前体已经由内源基因产生。因此，包含甜菊醇糖苷生物合成多肽的重组基因的模块可以引入到来自此类属的种类，而不需要引入甲羟戊酸或MEP途径基因。

解腺嘌呤阿氏酵母(食腺嘌呤节孢酵母(Blastobotrys adeninivorans))

解腺嘌呤阿氏酵母为具有独特生物化学特征的二态酵母(其作为出芽酵母如面包酵母中高达42℃的温度下生长，其在超过此阈值时以丝状形式生长)。它可在广泛范围的底物上生长并且可以吸收硝酸盐。它已成功应用于生成可产生天然塑料的菌株或开发用于环境样品中的***的生物传感器。

解脂耶氏酵母

解脂耶氏酵母为二态酵母(参见解腺嘌呤阿氏酵母)并且属于半子囊菌类家族。解脂耶氏酵母的整个基因组为已知的。耶氏酵母属种类为有氧的并且被认为是非病原性的。耶氏酵母属有效于使用疏水性底物(例如，烷烃、脂肪酸、油)并且可以在糖上生长。它具有用于工业应用的高可能性并且为含油微生物。解脂耶氏酵母可以累积脂质含量至其干燥细胞重量的大约40％并且为用于脂质累积和再活化的模型生物体。参见例如Nicaud，2012，Yeast 29(10)：409-18；Beopoulos等，2009，Biochimie 91(6)：692-6；Bankar等，2009，ApplMicrobiol Biotechnol.84(5)：847-65。

红酵母属某种。

红酵母属为单细胞的有色酵母。含油红色酵母胶粘红酵母已显示由粗甘油产生脂质和类胡萝卜素(Saenge等，2011，Process Biochemistry46(1)：210-8)。圆红冬孢红酵母(Rhodotorula toruloides)菌株已显示为用于改进的生物质和脂质生产量的有效分批补料发酵***(Li等，2007，Enzyme and Microbial Technology 41：312-7)。

圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)

圆红冬孢酵母为产油酵母并且适用于将脂质产生途径工程化(参见例如Zhu等，2013，Nature Commun.3：1112；Ageitos等，2011，Applied Microbiology andBiotechnology 90(4)：1219-27)。

博伊丁假丝酵母

博伊丁假丝酵母为甲基营养性酵母(其可在甲醇上生长)。像其他甲基营养性种类诸如多形汉逊酵母和巴斯德毕赤酵母一样，其提供用于产生异源蛋白的优异平台。已报道多克范围的分泌的外来蛋白质的产量。计算方法IPRO最新预测了以下突变：在实验上将博伊丁假丝酵母木糖还原酶的辅因子特异性从NADPH转换成NADH。参见例如Mattanovich等，2012，Methods Mol Biol.824：329-58；Khoury等，2009，Protein Sci.18(10)：2125-38。

多形汉逊酵母(安格斯毕赤酵母(Pichia angusta))

多形汉逊酵母为甲基营养性酵母(参见博伊丁假丝酵母)。它可另外在广泛范围的其他底物上生长，它是耐热的并且可以吸收硝酸盐(还参见乳酸克鲁维酵母)。它已应用于产生乙型肝炎疫苗、胰岛素和干扰素α-2a以用于治疗丙型肝炎，另外产生一系列技术性酶。参见例如Xu等，2014，Virol Sin.29(6)：403-9。

乳酸克鲁维酵母

乳酸克鲁维酵母为规律地应用于生产克非尔(kefir)的酵母。它可在若干种糖上，最重要地是在乳和乳清中存在的乳糖上生长。除其他之外，它已成功应用于生产凝乳酶(通常存在于牛胃部的酶)，以用于生产奶酪。在40,000 L规模的发酵罐中进行生产。参见，例如van Ooyen等，2006，FEMS Yeast Res.6(3)：381-92。

巴斯德毕赤酵母

巴斯德毕赤酵母为甲基营养性酵母(参见博伊丁假丝酵母和多形汉逊酵母)。它提供了用于生产外来蛋白质的有效平台。平台元件可用作试剂盒并且它在学术界广泛用于生产蛋白质。已工程化可产生复杂人类N-聚糖(酵母聚糖类似于人类中可见的那些聚糖但并不相同)的菌株。参见例如，Piirainen等，2014，N Biotechnol.31(6)：532-7。

小立碗藓属某些种。

小立碗藓当在悬浮培养物中生长时具有类似于酵母或其他真菌培养物的特征。此属类可用于产生植物次要代谢物，所述代谢物可能难以在其他类型的细胞中产生。

甜菊醇糖苷组合物

甜菊醇糖苷在不同食物***中不一定具有等效性能。因此希望具有引导所选甜菊醇糖苷组合物合成的能力。本文所述的重组宿主可产生选择性富含特定甜菊醇糖苷(例如，RebD或RebM)并具有一致性味道特性的组合物。因此，本文所述的重组宿主可有利于产生定制来满足给定食物产品所需甜味特性并具有一定比例的批次与批次之间一致的每种甜菊醇糖苷的组合物。本文所述的宿主不会产生甜菊醇提取物中可见的不希望的植物副产物。因此，由本文所述的重组宿主产生的甜菊醇糖苷组合物可与来源于甜菊醇植物的组合物区分。

所产生的单个甜菊醇糖苷(例如，RebA、RebB、RebD或RebM)的量可以是约1mg/L至约7,000mg/L，例如约1至约10mg/L、约3至约10mg/L、约5至约20mg/L、约10至约50mg/L、约10至约100mg/L、约25至约500mg/L、约100至约1,500mg/L或约200至约1,000mg/L、至少约1,000mg/L、至少约1,200mg/L、至少约至少1,400mg/L、至少约1,600mg/L、至少约1,800mg/L、至少约2,800mg/L或至少约7,000mg/L。在一些方面，单个甜菊醇糖苷的量可以超过7,000mg/L。所产生的甜菊醇糖苷(例如，RebA、RebB、RebD或RebM)的组合的量可以是约1mg/L至约7,000mg/L，例如约200至约1,500、至少约2,000mg/L、至少约3,000mg/L、至少约4,000mg/L、至少约5,000mg/L、至少约6,000mg/L或至少约7,000mg/L。在一些方面，甜菊醇糖苷的组合的量可以超过7,000mg/L。通常，较长培养时间将产生较大量的产物。因此，重组微生物可以培养1天至7天、1天至5天、3天至5天、约3天、约4天或约5天。

将了解的是，本文所讨论的各种基因和模块可以存在于除单个微生物之外的两种或更多种重组微生物中。当使用多个重组微生物时，它们可在混合培养物中生长，以产生甜菊醇和/或甜菊醇糖苷。例如，第一微生物可以包含用于产生甜菊醇的一种或多种生物合成基因和第一组内源转运蛋白中的无效突变，而第二微生物包含甜菊醇糖苷生物合成基因和第二组内源转运蛋白中的无效突变。然后回收由第二或最终微生物产生的产物。还将了解的是，在一些实施方案中，使用除培养基之外的营养素源并利用除发酵罐之外的***来生长重组微生物。

可替代地，两种或更多种微生物各自可在单独的培养基中生长并且第一培养基的产物(例如，甜菊醇)可以引入到第二培养基中，以转化成后续中间体，或者转化成最终产物诸如RebA。然后回收由第二或最终微生物产生的产物。微生物可以具有内源转运蛋白中的相同或不同组的突变。还将了解的是，在一些实施方案中，使用除培养基之外的营养素源并利用除发酵罐之外的***来生长重组微生物。

甜菊醇糖苷在不同食物***中不一定具有等效性能。因此希望具有引导所选甜菊醇糖苷组合物合成的能力。本文所述的重组宿主可产生选择性富含特定甜菊醇糖苷(例如，RebD)并具有一致性味道特性的组合物。因此，本文所述的重组微生物可有利于产生定制来满足给定食物产品所需甜味特性并具有一定比例的批次与批次之间一致的每种甜菊醇糖苷的组合物。本文所述的微生物不会产生甜菊醇提取物中可见的不希望的植物副产物。因此，由本文所述的重组微生物产生的甜菊醇糖苷组合物可与来源于甜菊醇植物的组合物区分。

通过本文所公开的方法获得的甜菊醇糖苷和组合物可以用于制备食物产品、膳食补充剂和甜味剂组合物。参见例如，WO 2011/153378、WO 2013/022989、WO 2014/122227和WO 2014/122328，每份专利各自以引用的方式整体并入。

例如，在食物产品诸如冰淇淋、碳酸饮料、果汁、乳酸、烘焙食品、口香糖、硬糖果和软糖果以及调味汁中可以包含基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷诸如RebM或RebD。在非食物产品诸如药物产品、医用产品、膳食补充剂和营养补充剂中也可以包含基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷。在用于农业工业和伴侣动物工业的动物饲料产品中也可以包含基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷。可替代地，甜菊醇和/或甜菊醇糖苷的混合物可以通过单独培养重组微生物(每种微生物产生特定甜菊醇或甜菊醇糖苷)、从每种微生物回收基本上纯的形式的甜菊醇或甜菊醇糖苷并且然后将所述化合物合并以获得包含所需比例的每种化合物的混合物来制备。本文所述的重组微生物允许获得与当前甜叶菊产物相比更精确且一致的混合。例如，本文所述的重组微生物可以表达对于将特定甜菊醇糖苷转运到培养基中有特异性的转运蛋白。当转运蛋白对特定甜菊醇糖苷有特异性时，所述微生物将在发酵液中富含该化合物的浓度，从而防止其与不同化合物进一步反应，并且通过将甜菊醇糖苷选择性转运到发酵液中，将使其更容易从其他甜菊醇糖苷中回收并且因此使得所述过程更有效。

在另一个替代方案中，基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷可以连同其他甜味剂(例如，糖精、右旋糖、蔗糖、果糖、赤藓醇、天冬甜素、三氯蔗糖、莫那甜或丁磺氨钾)一起并入食物产品中。甜菊醇或甜菊醇糖苷相对于其他甜味剂的重量比可以根据需要来改变，以实现最终食物产品中令人满意的味道。参见例如U.S.2007/0128311。在一些实施方案中，甜菊醇或甜菊醇糖苷可以作为风味调节剂提供风味(例如，柑橘类)。

由本文所述的重组微生物产生的组合物可以并入食物产品中。例如，由重组微生物产生的甜菊醇糖苷组合物可以一定量并入食物产品，所述量的范围根据甜菊醇糖苷和食物产品的类型为基于干重约20mg甜菊醇糖苷/kg食物产品至约1800mg甜菊醇糖苷/kg食物产品。例如，由重组微生物产生的甜菊醇糖苷组合物可以并入甜品、冷糖果(例如，冰淇淋)、乳制品(例如，酸乳)或饮料(例如，碳酸饮料)中，以使得食物产品具有基于干重500mg甜菊醇糖苷/kg食物的最大值。由重组微生物产生的甜菊醇糖苷组合物可以并入烘焙食品(例如，饼干)中，以使得食物产品具有基于干重300mg甜菊醇糖苷/kg食物的最大值。由重组微生物产生的甜菊醇糖苷组合物可以并入调味汁(例如，巧克力酱)或蔬菜产品(例如，咸菜)中，以使得食物产品具有基于干重1000mg甜菊醇糖苷/kg食物的最大值。由重组微生物产生的甜菊醇糖苷组合物可以并入面包中，以使得食物产品具有基于干重160mg甜菊醇糖苷/kg食物的最大值。由重组微生物、植物或植物细胞产生的甜菊醇糖苷组合物可以并入硬糖果或软糖果中，以使得食物产品具有基于干重1600mg甜菊醇糖苷/kg食物的最大值。由重组微生物、植物或植物细胞产生的甜菊醇糖苷组合物可以并入加工的水果产品(例如，果汁、水果馅、果酱和果胶)中，以使得食物产品具有基于干重1000mg甜菊醇糖苷/kg食物的最大值。

例如，此甜菊醇糖苷组合物具有90-99％RebA和不可检测量的甜叶菊植物来源的组分，并且以基于干重25-1600mg/kg，例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg并入食物产品中。

此甜菊醇糖苷组合物可以是具有大于3％RebB的富含RebB的组合物并且并入食物产品中，以使得产品中的RebB的量为基于干重25-1600mg/kg，例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。通常，富含RebB的组合物具有不可检测量的甜叶菊植物来源的组分。

此甜菊醇糖苷组合物可以是具有大于3％RebD的富含RebD的组合物并且并入食物产品中，以使得产品中的RebD的量为基于干重25-1600mg/kg，例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。通常，富含RebD的组合物具有不可检测量的甜叶菊植物来源的组分。

此甜菊醇糖苷组合物可以是具有大于3％RebE的富含RebE的组合物并且并入食物产品中，以使得产品中的RebE的量为基于干重25-1600mg/kg，例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。通常，富含RebE的组合物具有不可检测量的甜叶菊植物来源的组分。

此甜菊醇糖苷组合物可以是具有大于3％RebM的富含RebM的组合物并且并入食物产品中，以使得产品中的RebM的量为基于干重25-1600mg/kg，例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。通常，富含RebM的组合物具有不可检测量的甜叶菊植物来源的组分。

在一些实施方案中，基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷并入餐桌用甜味剂或“杯内(cup-for-cup)”产品中。此类产品通常使用本领域技术人员已知的一种或多种增量剂(例如，麦芽糖糊精)稀释至适当的甜味水平。富含RebA、RebB、RebD、RebE或RebM的甜菊醇糖苷组合物可以基于干重10,000至30,000mg甜菊醇糖苷/kg产品包装在小囊中。

本发明将在以下实施例中进一步描述，这些实施例不限制权利要求书中所述的本发明范围。

实施例

以下实施例说明了本发明的特定实施方案以及其各种用途。它们仅出于解释性目的列出并且不应理解为限制本发明。

实施例1.鉴定13-SMG转运蛋白候选物

通过分析转运蛋白敲除的酿酒酵母菌株的上清液和完全(总体)提取物中的13-SMG水平来确定13-SMG从产RebD/RebM菌株中分泌的机制。产RebD/RebM菌株包含编码聚球藻属某种GGPPS7多肽的重组基因(SEQ ID NO：181，SEQ ID NO：182)、编码截短的玉米CDPS多肽的重组基因(SEQ ID NO：183，SEQ ID NO：184)、编码拟南芥KS5多肽的重组基因(SEQID NO：185，SEQ ID NO：186)、编码重组甜叶菊KO1多肽的重组基因(SEQ ID NO：187，SEQ IDNO：188)、编码拟南芥ATR2多肽的重组基因(SEQ ID NO：189，SEQ ID NO：190)、编码SrKAHe1多肽的重组基因(SEQ ID NO：191，SEQ ID NO：192)、编码甜叶菊CPR8多肽的重组基因(SEQID NO：193，SEQ ID NO：194)、编码甜叶菊UGT85C2多肽的重组基因(SEQ ID NO：195，SEQ IDNO：196)、编码甜叶菊UGT74G1多肽的重组基因(SEQ ID NO：197，SEQ ID NO：198)、编码甜叶菊UGT76G1多肽的重组基因(SEQ ID NO：199，SEQ ID NO：200)、编码甜叶菊UGT91D2e-b多肽的重组基因(SEQ ID NO：201，SEQ ID NO：202)以及编码稻EUGT11多肽的重组基因(SEQ IDNO：203，SEQ ID NO：204)。

通过RNA-seq(Illumina HiSeq)在整个发酵循环中测量产RebD/M菌株的转运蛋白RNA水平并且将其归一化至对照菌株的RNA水平，所述对照菌株不产生甜菊醇糖苷，在类似条件下测量，以基于转运蛋白基于的表达特性来鉴定13-SMG转运蛋白候选物。参见例如Wang等，2010，Nat Rev Genet.19(1)：57-63；Nagalakshmi等，2008，Science 320(5881)：1344-9；Garber等，2011，Nat Methods 8(6)：469-77；以及Robinson&Oshlack等，2010，Genome Bio1.11(3)：R25，每份文献各自以引用的方式整体并入本文。如Wilhelm等，2010，Nature Protocols 5：255-66所述进行RNA制备，所述文献以引用的方式整体并入本文。

在产RebD/M菌株中基于以下所述RNA-seq结果来单独敲除转运蛋白基因，并且在每种转运蛋白敲除菌株和不具有任何缺失的转运蛋白基因的产RebD/M背景菌株中通过LC-MS测量13-SMG的总体和上清液水平。将相对分泌计算为每种转运蛋白敲除菌株的13-SMG上清液/总体比率除以产RebD/M对照菌株的13-SMG上清液/总体比率。小于1的相对分泌值对应于转运蛋白敲除菌株的13-SMG分泌与产RebD/M对照菌株的13-SMG分泌相比的降低(即，小于对照菌株的100％13-SMG分泌)。1的相对分泌值对应于转运蛋白敲除菌株的13-SMG分泌等于产RebD/M对照菌株的13-SMG分泌(即，对照菌株的100％13-SMG分泌)。大于1的相对分泌值对应于转运蛋白敲除菌株的13-SMG分泌与产RebD/M对照菌株的13-SMG分泌相比的增加(即，大于对照菌株的100％13-SMG分泌)。

使用装备有waters acquityBEH shield RP18柱(2.1x50mm，1.7μm颗粒，孔径)的Ultimate 3000UPLC***(Dionex)进行LC-MS分析，除非另外指示，否则所述柱连接至具有加热的电喷雾离子(HESI)源的TSQQuantum Access(ThermoFisherScientific)三段四极质谱仪。使用洗脱剂B(具有0.1％甲酸的MeCN)和洗脱剂A(具有0.1％甲酸的水)的流动相通过从0.0至4.0min将梯度从25％增加至47％B、从4.0至5.0min将梯度从47％增加至100％B、从5.0至6.5min将梯度保持为100％B进行预先平衡来进行洗脱。流速为0.4mL/min，并且柱温为35℃。使用具有表1所示的m/z-痕量的SIM(单离子监测)检测甜菊醇糖苷。通过与使用来自LGC标准的可信标准获得的校准曲线进行比较来定量甜菊醇糖苷的水平。

表1.甜菊醇糖苷的LC-MS分析信息。

根据所测量的13-SMG上清液/总体水平比率和过度表达的功效测定如本文所述的13-SMG特异性。为了将潜在13-SMG转运蛋白候选物分类，将计算的相对13-SMG上清液/总体比率针对每种转运蛋白的相对表达水平来绘图。鉴定转运蛋白的三个类别。第一类转运蛋白(YOR087W、YML038C、YJR135W-A、YDR406W)证实了与产甜菊醇糖苷对照菌株相比更高13-SMG特异性，但是第一类转运蛋白与不产生甜菊醇糖苷的对照菌株相比未过度表达。第二类转运蛋白(YIR028W、YGR138C、YJL214W和YDR345C)证实了与产甜菊醇糖苷对照菌株相比的低13-SMG特异性，但是与不产生甜菊醇糖苷的对照菌株相比的高表达水平。测试的第三类转运蛋白证实了与产甜菊醇糖苷对照菌株相比的低13-SMG特异性，并且与不产生甜菊醇糖苷的对照菌株相比未过度表达。据信第一类和第二类转运蛋白均能够分泌比第三类转运蛋白多的13-SMG。

表2示出了YOR087W、YML038C、YJR135W-A、YDR406W、YIR028W、YGR138C、YJL214W以及YDR345C的表达水平和相对13-SMG分泌。例如，在发酵的19h时间点，YOR087W(SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2)在产RebD/M菌株中的表达水平为YOR087W在对照菌株中的表达水平的86.93％。在产RebD/M菌株中的YOR087W缺失时，13-SMG上清液/总体比率为产RebD/M的对照菌株的13-SMG上清液/总体比率的31％。在另一个实例中，在发酵的19h时间点，YDR345C(SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16)的表达水平为YDR345C在对照菌株中的表达水平的1,512.89％。在产RebD/M菌株中的YDR345C缺失时，13-SMG上清液/总体比率为产RebD/M的对照菌株的13-SMG上清液/总体比率的75.10％。

表2. 13-SMG转运蛋白候选物表达和特异性。

实施例2.RebD和RebM转运蛋白的异源表达

使用标LiAc方法(参见例如Kawai等，2010，Bioeng Bugs.1(6)：395-403)单独转化实施例1中所公开的产RebD/M菌株，所述方法使用携带SET(糖流出转运蛋白)和SWEET家族的转运蛋白基因的表达质粒。使用实施例1所述的LC-MS程序测量甜菊醇糖苷水平，并且使用Perkin Elmer 2104Multilabel读取器测量OD₆₀₀。图2A、2B、2C、2D和2E分别示出了在表达来自大肠杆菌的SetA(SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18)、来自大肠杆菌的SetB(SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20)、来自大肠杆菌的SetC(SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22)、来自芜菁的SWEET(SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24)、来自矮牵牛的SWEET(SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26)户来自图小麦的SWEET(SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28)时RebA、RebB、RebD、RebM和13-SMG的总体和上清液水平的变化。SET和SWEET家族基因单独地在包含较高拷贝数的以下各项的产甜菊醇糖苷菌株中表达：SrKAHe1(SEQ ID NO：191，SEQ ID NO：192)、CPR8(SEQ ID NO：193，SEQ ID NO：194)、KO1(SEQ ID NO：187，SEQ ID NO：188)、UGT76G1(SEQ ID NO：199，SEQ IDNO：200)、EUGT11 SEQ ID NO：203，SEQ ID NO：204)以及UGT91D2e-b(SEQ ID NO：201，SEQID NO：202)多肽。参见图2E、2F、2G和2H。在两种菌株中尤其在表达来自大肠杆菌的SetA(SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18)、来自芜菁的SWEET(SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24)或来自图小麦的SWEET(SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28)时观察到RebA、RebB、RebD和RebM的改进的分泌。参见图2A-2I。

实施例3.运输衔接子基因的缺失

一系列衔接子蛋白质参与转运蛋白的次要修饰。在包含以下各项的产甜菊醇糖苷菌株中单独缺失Art10(SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30)、Art1(SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32)、Art2(SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34)、Art3(SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36)、Art4(SEQID NO：37，SEQ ID NO：38)、Art6(SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40)、Art7(SEQ ID NO：41，SEQID NO：42)、Art8(SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：44)、Bul1(SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46)以及Bul2(SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48)：编码聚球藻属某种GGPPS7多肽的重组基因(SEQ IDNO：181，SEQ ID NO：182)、编码截短的玉米CDPS多肽的重组基因(SEQ ID NO：183，SEQ IDNO：184)、编码拟南芥KS5多肽的重组基因(SEQ ID NO：185，SEQ ID NO：186)、编码重组甜叶菊KO1多肽的重组基因(SEQ ID NO：187，SEQ ID NO：188)、编码KO多肽的重组基因(SEQ IDNO：205，SEQ ID NO：206)、编码拟南芥ATR2多肽的重组基因(SEQ ID NO：189，SEQ ID NO：190)、编码SrKAHe1多肽的重组基因(SEQ ID NO：191，SEQ ID NO：192)、编码甜叶菊CPR8多肽的重组基因(SEQ ID NO：193，SEQ ID NO：194)、编码甜叶菊UGT85C2多肽的重组基因(SEQID NO：195，SEQ ID NO：196)、编码甜叶菊UGT74G1多肽的重组，基因(SEQ ID NO：197，SEQID NO：198)、编码甜叶菊UGT76G1多肽的重组基因(SEQ ID NO：199，SEQ ID NO：200)、编码甜叶菊UGT91D2e-b多肽的重组基因(SEO ID NO：201，SEQ ID NO：202)以及编码稻EUGT11多肽的重组基因(SEQ ID NO：203，SEQ ID NO：204)。

通过设计用于PCR的引物来进行衔接子的缺失，所述引物包含待缺失的基因上游或下游的同源区和能够结合至含有选择标记的质粒的序列。对包含选择标记的质粒进行PCR，从而产生包含由待被选择标记替代的基因上游和下游同源区侧接的选择标记的杂种DNA序列。通过在酵母中进行来用选择标记替代内源基因的标准LiAc方法和同源重组，将所生成的PCR片段引入到产RebD/M菌株中。使用选择标记选择克隆产生感兴趣基因缺失的菌株。

使用实施例1的LC-MS方法，并且使用Perkin Elmer 2104Multilabel读取器测量OD₆₀₀以将甜菊醇糖苷水平计算为μM/OD₆₀₀。将衔接子蛋白敲除菌株的上清液/总体比率与对照产甜菊醇糖苷菌株的上清液/总体比率相比较。计算每种转运蛋白敲除菌株的甜菊醇糖苷分泌与对照产甜菊醇糖苷菌株的甜菊醇糖苷分泌相比的倍数变化。更确切地说，低于1的值对应于甜菊醇糖苷分泌与产甜菊醇糖苷对照菌株相比的倍数降低，等于1的值对应于甜菊醇糖苷分泌与产甜菊醇糖苷对照菌株相比没有倍数变化，并且大于1的值对应于甜菊醇糖苷分泌与产甜菊醇糖苷对照菌株相比的倍数增加。

若干转运蛋白缺失改进了产甜菊醇糖苷菌株中的13-SMG、RebA、RebB、RebD和/或RebM的分泌。参见图3A、3B、3C、3D和3E。增加的13-SMG分泌由Art1(SEQ ID NO：31，SEQ IDNO：32)(1.03)、Art2(SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34)(1.03)、Art3(SEQ ID NO：35，SEQ IDNO：36)(1.14)、Art6(SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40)(1.13)、Art7(SEQ ID NO：41，SEQ IDNO：42)(1.24)、Art8(SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：44)(1.01)、Art9(SEQ ID NO：165，SEQ IDNO：166)(1.19)、Art10(SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30)(1.23)、Bul1(SEQ ID NO：45，SEQ IDNO：46)(1.32)、Trel(SEQ ID NO：173，SEQ ID NO：174)(1.27)、Ear1(SEQ ID NO：169，SEQID NO：170)(1.31)、Ssh4(SEQ ID NO：171，SEQ ID NO：172)(1.26)或Bsd2(SEQ ID NO：167，SEQ ID NO：168)(1.36)的缺失导致，其中每个SEQ ID NO之后的圆括号中的数字表示分泌的13-SMG的倍数增加。增加的RebA分泌由Art1(SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32)(1.26)、Art2(SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34)(1.18)、Art3(SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36)(1.30)、Art4(SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：38)(1.12)、Art6(SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40)(1.14)、Art7(SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42)(1.38)、Art8(SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：44)(1.04)、Art9(SEQ ID NO：165，SEQ ID NO：166)(1.22)、Art10(SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30)(1.38)、Bul1(SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46)(1.63)、Bul2(SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48)(1.08)、Tre1(SEQ ID NO：173，SEQ ID NO：174)(1.20)、Ear1(SEQ ID NO：169，SEQ ID NO：170)(1.36)或Ssh4(SEQ ID NO：171，SEQ ID NO：172)(1.19)的缺失导致，其中每个SEQ ID NO之后的圆括号中的数字表示分泌的RebA的倍数增加。增加的RebB分泌由Art1(SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32)(1.29)、Art2(SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34)(1.22)、Art3(SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36)(1.42)、Art4(SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：38)(1.15)、Art6(SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40)(1.26)、Art7(SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42)(1.39)、Art8(SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：44)(1.19)、Art9(SEQ ID NO：165，SEQ ID NO：166)(1.41)、Art10(SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30)(1.47)、Bul1(SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46)(1.67)、Bul2(SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48)(1.17)、Trel(SEQ ID NO：173，SEQ ID NO：174)(1.30)、Ear1(SEQ IDNO：169，SEQ ID NO：170)(1.35)、Ssh4(SEQ ID NO：171，SEQ ID NO：172)(1.28)或Bsd2(SEQID NO：167，SEQ ID NO：168)(1.12)的缺失导致，其中每个SEQ ID NO之后的圆括号中的数字表示分泌的RebB的倍数增加。增加的RebD分泌由Art3(SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36)(1.05)、Art7(SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42)(1.05)、Art9(SEQ ID NO：165，SEQ ID NO：166)(1.06)、Art10(SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30)(1.05)或Bul1(SEQ ID NO：45，SEQ IDNO：46)(1.25)的缺失导致，其中每个SEQ ID NO之后的圆括号中的数字表示分泌的RebD的倍数增加。增加的RebM分泌由Art1(SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32)(1.50)、Art2(SEQ IDNO：33，SEQ ID NO：34)(1.48)、Art3(SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36)(1.66)、Art4(SEQ IDNO：37，SEQ ID NO：38)(1.54)、Art6(SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40)(1.40)、Art7(SEQ IDNO：41，SEQ ID NO：42)(1.64)、Art8(SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：44)(1.21)、Art9(SEQ IDNO：165，SEQ ID NO：166)(1.66)、Art10(SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30)(1.75)、Bul1(SEQID NO：45，SEQ ID NO：46)(1.81)、Bul2(SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48)(1.51)、Tre1(SEQID NO：173，SEQ ID NO：174)(1.43)、Earl(SEQ ID NO：169，SEQ ID NO：170)(1.50)或Ssh4(SEQ ID NO：171，SEQ ID NO：172)(1.28)的缺失导致，其中每个SEQ ID NO之后的圆括号中的数字表示分泌的RebM的倍数增加。

实施例4.用于甜菊醇糖苷的改进生产的转运蛋白基因的缺失

如实施例3所述，在一种或两种产甜菊醇糖苷酿酒酵母菌株中进行单个转运蛋白基因的缺失。每种菌株包含编码聚球藻属某种GGPPS7多肽的重组基因(SEQ ID NO：181，SEQID NO：182)、编码截短的玉米CDPS多肽的重组基因(SEQ ID NO：183，SEQ ID NO：184)、编码拟南芥KS5多肽的重组基因(SEQ ID NO：185，SEQ ID NO：186)、编码重组甜叶菊KO1多肽的重组基因(SEQ ID NO：187，SEQ ID NO：188)、编码拟南芥ATR2多肽的重组基因(SEQ ID NO：189，SEQ ID NO：190)、编码SrKAHe1多肽的重组基因(SEQ ID NO：191，SEQ ID NO：192)、编码甜叶菊CPR8多肽的重组基因(SEQ ID NO：193，SEQ ID NO：194)、编码甜叶菊UGT85C2多肽的重组基因(SEQ ID NO：195，SEQ ID NO：196)、编码甜叶菊UGT74G1多肽的重组基因(SEQID NO：197，SEQ ID NO：198)、编码甜叶菊UGT76G1多肽的重组基因(SEQ ID NO：199，SEQ IDNO：200)、编码甜叶菊UGT91D2e-b多肽的重组基因(SEQ ID NO：201，SEQ ID NO：202)以及编码稻EUGT11多肽但基因拷贝数目不同的重组基因(SEQ ID NO：203，SEQ ID NO：204)并且编码GGPPS、截短的CDPS、KS、KO、ATR2、EUGT11、SrKAHe1、CPR8、UGT85C2、UGT74G1、UGT76G1以及EUGT11多肽的基因的拷贝数目不同。计算每种转运蛋白敲除菌株的甜菊醇糖苷产生与对照产甜菊醇糖苷菌株的甜菊醇糖苷产生相比的倍数变化。更确切地说，低于1的值对应于甜菊醇糖苷产生与产甜菊醇糖苷对照菌株相比的倍数降低，等于1的值对应于甜菊醇糖苷产生与产甜菊醇糖苷对照菌株相比没有倍数变化，并且大于1的值对应于甜菊醇糖苷产生与产甜菊醇糖苷对照菌株相比的倍数增加。

若干转运蛋白缺失改进了产甜菊醇糖苷菌株中的RebA、RebB、RebD和/或RebM的产生，如通过实施例1的LC-MS方法测量的。在第一产甜菊醇糖苷菌株中，增加的RebB产生由YBR068C(SEQ ID NO：63，SEQ ID NO：64)(1.41)、YBR220C(SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：66)(3.91)、YBR235W(SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：68)(3.26)、YBR293W(SEQ ID NO：69，SEQ IDNO：70)(2.35)、YBR298C(SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：72)(2.24)、YCR011C(SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：74)(3.98)、YCR023C(SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：76)(3.93)、YDL100C(SEQ IDNO：77，SEQ ID NO：78)(2.14)、YDL119C(SEQ ID NO：79，SEQ ID NO：80)(2.20)、YDL138W(SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：82)(3.51)、YDL199C(SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：84)(3.54)、YDL210W(SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：86)(2.64)、YDR061W(SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：90)(2.65)、YDR135C(SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：92)(2.82)、YEL006W(SEQ ID NO：95，SEQ IDNO：96)(1.46)、YFL028C(SEQ ID NO：97，SEQ ID NO：98)(3.00)、YGL006W(SEQ ID NO：99，SEQ ID NO：100)(2.46)、YGR125W(SEQ ID NO：103，SEQ ID NO：104)(2.73)、YGR181W(SEQID NO：105，SEQ ID NO：106)(3.32)、YIL088C(SEQ ID NO：107，SEQ ID NO：108)(3.05)、YJR124C(SEQ ID NO：109，SEQ ID NO：110)(2.68)、YPL134C(SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：112)(2.01)、YPR192W(SEQ ID NO：113，SEQ ID NO：114)(1.71)、YPR194C(SEQ ID NO：115，SEQ ID NO：116)(1.99)、YPR198W(SEQ ID NO：117，SEQ ID NO：118)(3.53)或YPR201W(SEQID NO：119，SEQ ID NO：120)(3.77)的缺失导致，其中在每个SEQ ID NO之后的圆括号中的数字表示所测量的RebB的倍数增加。RebD产生的增加由YBR220C(SEQ ID NO：65，SEQ IDNO：66)(1.50)、YCR023C(SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：76)(1.52)、YDR508C(SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：94)(1.53)、YGL114W(SEQ ID NO：101，SEQ ID NO：102)(1.47)、YPL134C(SEQ IDNO：111，SEQ ID NO：112)(1.61)或YPR201W(SEQ ID NO：119，SEQ ID NO：120)(1.41)的缺失导致，其中每个SEQ ID NO之后的圆括号中的数字表示分泌的RebD的倍数增加。增加的RebM产生由YDL138W(SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：82)(1.53)、YDL245C(SEQ ID NO：87，SEQ IDNO：88)(1.41)或YDR508C(SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：94)(1.54)的缺失导致，其中每个SEQID NO之后的圆括号中的数字表示分泌的RebD的倍数增加。

在包含高拷贝数目的编码GGPPS、截短的CDPS、KS、KO、ATR2、EUGT11、SrKAHe1、CPR8、UGT85C2、UGT74G1、UGT76G1以及EUGT11多肽的基因的第二产甜菊醇糖苷菌株中，增加的RebA产生由YBR235W(SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：68)(1.66)、YCR023C(SEQ ID NO：75，SEQID NO：76)(1.75)、YDL100C(SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：78)(1.67)、YDL138W(SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：82)(1.58)、YDR438W(SEQ ID NO：127，SEQ ID NO：128)(1.51)、YGL084C(SEQID NO：131，SEQ ID NO：132)(1.72)、YGL1 14W(SEQ ID NO：101，SEQ ID NO：102)(1.93)、YGR224W(SEQ ID NO：135，SEQ ID NO：136)(1.56)或YJL093C(SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：54)(1.49)的缺失导致，其中在每个SEQ ID NO之后的圆括号中的数字表示所测量的RebA的倍数增加。增加的RebB产生由YBR235W(SEQ ID NO：67.SEQ ID NO：68)(1.47)、YCR023C(SEQID NO：75，SEQ ID NO：76)(1.43)、YDL100C(SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：78)(1.50)、YDL138W(SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：82)(1.49)、YGL084C(SEQ ID NO：131，SEQ ID NO：132)(1.61)、YGL114W(SEQ ID NO：101，SEQ ID NO：102)(1.70)的缺失导致，其中每个SEQ ID NO之后的圆括号中的数字表示所测量的RebB的倍数增加。增加的RebD产生由YAL067C(SEQ ID NO：121，SEQ ID NO：122)(1.66)、YBL089W(SEQ ID NO：123，SEQ ID NO：124)(1.58)、YBR220C(SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：66)(1.77)、YBR235W(SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：68)(2.06)、YCR011C(SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：74)(1.45)、YCR023C(SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：76)(1.99)、YCR028C(SEQ ID NO：125，SEQ ID NO：126)(1.61)、YDL100C(SEQ ID NO：77，SEQ IDNO：78)(2.13)、YDL138W(SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：82)(1.94)、YDL199C(SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：84)(1.65)、YDR438W(SEQ ID NO：127，SEQ ID NO：128)(1.84)、YFL011W(SEQ IDNO：129，SEQ ID NO：130)(1.48)、YGL006W(SEQ ID NO：99，SEQ ID NO：100)(1.71)、YGL084C(SEQ ID NO：131，SEQ ID NO：132)(2.17)、YGL104C(SEQ ID NO：133，SEQ ID NO：134)(1.78)、YGL114W(SEQ ID NO：101，SEQ ID NO：102)(2.55)、YGR125W(SEQ ID NO：103，SEQID NO：104)(1.67)、YGR224W(SEQ ID NO：135，SEQ ID NO：136)(1.79)、YHR032W(SEQ IDNO：137，SEQ ID NO：138)(1.59)、YJL093C(SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：54)(1.74)、YMR034C(SEQ ID NO：139，SEQ ID NO：140)(1.43)、YNR055C(SEQ ID NO：141，SEQ ID NO：142)(1.86)、YOL020W(SEQ ID NO：143，SEQ ID NO：144)(1.16)或YOL075C(SEQ ID NO：145，SEQID NO：146)(1.41)的缺失导致，其中在每个SEQ ID NO之后的圆括号中的数字表示所测量的RebD的倍数增加。增加的RebM产生由YBR235W(SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：68)(1.73)，YCR023C(SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：76)(1.55)，YCR028C(SEQ ID NO：125，SEQ ID NO：126)(1.69)，YDL100C(SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：78)(1.88)，YDL138W(SEQ ID NO：81，SEQ IDNO：82)(1.67)，YDR438W(SEQ ID NO：127，SEQ ID NO：128)(1.56)，YGL006W(SEQ ID NO：99，SEQ ID NO：100)(1.58)，YGL084C(SEQ ID NO：131，SEQ ID NO：132)(1.56)，YGL104C(SEQID NO：133，SEQ ID NO：134)(1.62)，YGL114W(SEQ ID NO：101，SEQ ID NO：102)(2.29)或YGR224W(SEQ ID NO：135，SEQ ID NO：136)(1.43)的缺失导致，其中每个SEQ ID NO之后的圆括号中的数字表示分泌的13-SMG的倍数增加。

表3.本文所公开的序列。

SEQ ID NO：1

SEQ ID NO：2

SEQ ID NO：3

SEQ ID NO：4

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已详细描述本发明并且已参考本发明的特定实施方案，显然在不脱离所附权利要求书所界定的本发明的范围的情况下，修改和变化都是可能的。更具体来说，虽然本发明的一些方面在本文中被鉴定为特别有利的，但是预期本发明并不必限于本发明的这些特定方面。

Claims

1.一种能够产生至少一种甜菊醇糖苷的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞包含：

(a)编码糖流出转运蛋白(SET)多肽的基因；和/或

(b)编码糖转运蛋白SWEET(SWEET)多肽的基因；

其中所述基因中的至少一种为重组基因。

2.如权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述SET多肽与SEQ ID NO：18中所列出的大肠杆菌糖流出转运蛋白A(SetA)多肽、SEQ ID NO：20中所列出的大肠杆菌糖流出转运蛋白B(SetB)多肽或SEQ ID NO：22中所列出的大肠杆菌糖流出转运蛋白C(SetC)多肽具有至少50％同一性。

3.如权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述SWEET多肽与SEQ ID NO：24中所列出的芜菁SWEET多肽、SEQ ID NO：26中所列出的矮牵牛SWEET多肽或SEQ ID NO：28中所列出的图小麦SWEET多肽具有至少50％同一性。

4.一种能够产生至少一种甜菊醇糖苷的重组宿主细胞，其中所述宿主包含编码运输衔接子多肽的基因的缺失。

5.如权利要求4所述的重组宿主细胞，其中在缺失之前，所缺失的基因编码与以下任一种具有至少50％同一性的所述运输衔接子多肽：SEQ ID NO：30中所列出的衔接子蛋白Artl0、SEQ ID NO：32中所列出的衔接子蛋白Artl、SEQ ID NO：34中所列出的衔接子蛋白Art2、SEQ ID NO：36中所列出的衔接子蛋白Art3、SEQ ID NO：38中所列出的衔接子蛋白Art4、SEQ ID NO：40中所列出的衔接子蛋白Art6、SEQ ID NO：42中所列出的衔接子蛋白Art7、SEQ ID NO：44中所列出的衔接子蛋白Art8、SEQ ID NO：166中所列出的衔接子蛋白衔接子蛋白Art9、SEQ ID NO：46中所列出的衔接子蛋白Bul1、SEQ ID NO：48中所列出的衔接子蛋白Bul2、SEQ ID NO：168中所列出的衔接子蛋白Bsd2、SEQ ID NO：170中所列出的衔接子蛋白Earl、SEQ ID NO：172中所列出的衔接子蛋白Ssh4或SEQ ID NO：174中所列出的衔接子蛋白Tre1。

6.如权利要求5所述的重组宿主细胞，其中SEQ ID NO：36中所列出的衔接子蛋白Art3、SEQ ID NO：42中所列出的衔接子蛋白Art7、SEQ ID NO：166中所列出的衔接子蛋白Art9、SEQ ID NO：30中所列出的衔接子蛋白Art10或SEQ ID NO：46中所列出的衔接子蛋白Bul1的缺失增加了RebD的分泌。

7.如权利要求5所述的重组宿主细胞，其中SEQ ID NO：32中所列出的衔接子蛋白Art1、SEQ ID NO：34中所列出的衔接子蛋白Art2、SEQ ID NO：36中所列出的衔接子蛋白Art3、SEQID NO：38中所列出的衔接子蛋白Art4、SEQ ID NO：40中所列出的衔接子蛋白Art6、SEQ IDNO：42中所列出的衔接子蛋白Art7、SEQ ID NO：44中所列出的衔接子蛋白Art8、SEQ ID NO：166中所列出的衔接子蛋白Art9、SEQ ID NO：30中所列出的衔接子蛋白衔接子蛋白Art10、SEQ ID NO：46中所列出的衔接子蛋白Bul1、SEQ ID NO：48中所列出的衔接子蛋白Bul2、SEQID NO：174中所列出的衔接子蛋白Tre1、SEQ ID NO：170中所列出的衔接子蛋白Ear1或SEQID NO：172中所列出的衔接子蛋白Ssh4的缺失增加了RebM的分泌。

8.一种能够产生至少一种甜菊醇糖苷的重组宿主细胞，其中所述宿主包含编码转运蛋白多肽的基因的缺失，其中所述转运蛋白多肽为SEQ ID NO：2中所列出的YOR087W、SEQ IDNO：4中所列出的YML038C、SEQ ID NO：6中所列出的YJR135W-A、SEQ ID NO：8中所列出的YDR406W、SEQ ID NO：10中所列出的YIR028W、SEQ ID NO：12中所列出的YGR138C、SEQ IDNO：14中所列出的YJL214W、SEQ ID NO：16中所列出的YDR345C或其功能性同源物。

9.一种能够产生至少一种甜菊醇糖苷的重组宿主细胞，其中所述宿主包含编码转运蛋白多肽的基因的缺失，其中所述转运蛋白多肽为SEQ ID NO：64中所列出的YBR068C、SEQ IDNO：66中所列出的YBR220C、SEQ ID NO：68中所列出的YBR235W、SEQ ID NO：70中所列出的YBR293W、SEQ ID NO：72中所列出的YBR298C、SEQ ID NO：74中所列出的YCR011C、SEQ IDNO：76中所列出的YCR023C、SEQ ID NO：78中所列出的YDL100C、SEQ ID NO：80中所列出的YDL119C、SEQ ID NO：82中所列出的YDL138W、SEQ ID NO：84中所列出的YDL199C、SEQ IDNO：86中所列出的YDL210W、SEQ ID NO：88中所列出的YDL245C、SEQ ID NO：90中所列出的YDR061W、SEQ ID NO：92中所列出的YDR135C、SEQ ID NO：94中所列出的YDR508C、SEQ IDNO：96中所列出的YEL006W、SEQ ID NO：98中所列出的YFL028C、SEQ ID NO：100中所列出的YGL006W、SEQ ID NO：102中所列出的YGL114W、SEQ ID NO：104中所列出的YGR125W、SEQ IDNO：106中所列出的YGR181W、SEQ ID NO：108中所列出的YIL088C、SEQ ID NO：110中所列出的YJR124C、SEQ ID NO：112中所列出的YPL134C、SEQ ID NO：114中所列出的YPR192W、SEQID NO：116中所列出的YPR194C、SEQ ID NO：118中所列出的YPR198W、SEQ ID NO：120中所列出的YPR201W、SEQ ID NO：122中所列出的YAL067C、SEQ ID NO：124中所列出的YBL089W、SEQID NO：126中所列出的YCR028C、SEQ ID NO：128中所列出的YDR438W、SEQ ID NO：130中所列出的YFL011W、SEQ ID NO：132中所列出的YGL084C、SEQ ID NO：134中所列出的YGL104C、SEQID NO：136中所列出的YGR224W、SEQ ID NO：138中所列出的YHR032W、SEQ ID NO：54中所列出的YJL093C、SEQ ID NO：140中所列出的YMR034C、SEQ ID NO：142中所列出的YNR055C、SEQID NO：144中所列出的YOL020W、SEQ ID NO：146中所列出的YOL075C或其功能性同源物。

10.如权利要求5-9中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述基因的所述缺失通过同源重组来进行。

11.如权利要求1-10中任一项所述的重组宿主细胞，其还包含以下一种或多种：

(a)编码香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPPS)多肽的基因；

(b)编码对映-柯巴基二磷酸合酶(CDPS)多肽的基因；

(c)编码贝壳杉烯氧化酶(KO)多肽的基因；

(d)编码贝壳杉烯合酶(KS)多肽的基因；

(e)编码甜菊醇合酶(KAH)多肽的基因；

(f)编码细胞色素P450还原酶(CPR)多肽的基因；或者

(g)编码UGT85C2多肽的基因；

(h)编码UGT76G1多肽的基因；

(i)编码UGT74G1多肽的基因；

(j)编码UGT91D2功能性同源物的基因；和/或

(k)编码EUGT11多肽的基因；

其中所述基因中的至少一种为重组基因。

12.如权利要求11所述的重组宿主细胞，其中：

(a)所述GGPPS多肽包括与SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：210、SEQ IDNO：212、SEQ ID NO：214、SEQ ID NO：216、SEQ ID NO：218或SEQ ID NO：220中所列出的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；

(b)所述CDPS多肽包括与SEQ ID NO：184、SEQ ID NO：222、SEQ ID NO：224、SEQ ID NO：226、SEQ ID NO：228或SEQ ID NO：230中所列出的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；

(c)所述KO多肽包括与SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：246、SEQ ID NO：249、SEQ ID NO：251、SEQ ID NO：253、SEQ ID NO：255、SEQ ID NO：257、SEQ ID NO：259或SEQ ID NO：261中所列出的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；

(d)所述KS多肽包括与SEQ ID NO：186、SEQ ID NO：232、SEQ ID NO：234、SEQ ID NO：236、SEQ ID NO：238中所列出的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；

(e)所述KAH多肽包括与SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：266、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：270、SEQ ID NO：271、SEQ ID NO：272、SEQ ID NO：273、SEQ ID NO：275、SEQ ID NO：277、SEQID NO：279、SEQ ID NO：281或SEQ ID NO：283中所列出的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；

(f)所述CPR多肽包括与SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：263、SEQ ID NO：265、SEQ ID NO：287、SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：291或SEQ ID NO：293中所列出的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；

13.如权利要求1-12中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主包括植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞或细菌细胞。

14.如权利要求13所述的重组宿主细胞，其中所述细菌细胞包括埃希氏菌属细菌细胞、乳杆菌属细菌细胞、乳球菌属细菌细胞、棒状杆菌属细菌细胞、醋杆菌属细菌细胞、不动杆菌属细菌细胞或假单胞菌属细菌细胞。

15.如权利要求13所述的重组宿主细胞，其中所述真菌细胞包括酵母细胞。

16.如权利要求15所述的重组宿主细胞，其中所述酵母细胞为来自以下的细胞：酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、解脂耶氏酵母、光滑假丝酵母、棉阿舒囊霉、产版假丝酵母、巴斯德毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母、多形汉逊酵母、博伊丁假丝酵母、解腺嘌呤阿氏酵母、红法夫酵母或白假丝酵母种类。

17.如权利要求16所述的重组宿主细胞，其中所述酵母细胞为酵母菌。

18.如权利要求17所述的重组宿主细胞，其中所述酵母细胞为来自酿酒酵母种类的细胞。

19.如权利要求1-18中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞相对于不具有修饰的转运蛋白基因表达的产甜菊醇糖苷宿主分泌降低的量的甜菊醇-13-O-葡糖苷(13-SMG)。

20.如权利要求1-19中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞相对于不具有修饰的转运蛋白基因表达的产甜菊醇糖苷宿主分泌增加的量的RebA、RebB、RebD和/或RebM。

21.如权利要求1-20中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞相对于不具有修饰的转运蛋白基因表达的产甜菊醇糖苷宿主产生增加的量的RebA、RebB、RebD和/或RebM。

22.一种增加重组宿主细胞中的甜菊醇糖苷的产生或者增加甜菊醇糖苷到培养基中的分泌的方法，其包括在基因得到表达的条件下使如权利要求1-21中任一项所述的重组宿主细胞在细胞培养物发酵液中生长；

其中所述甜菊醇糖苷由所述重组宿主细胞产生。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述甜菊醇糖苷为RebA、RebB、RebD和/或RebM。

24.一种增加由重组宿主细胞产生的RebA、RebB、RebD和/或RebM的量的方法，其包括使如权利要求1-21中任一项所述的重组宿主细胞在细胞培养物发酵液中生长；

其中RebA、RebB、RebD和/或RebM由所述重组宿主细胞产生。

25.如权利要求22-24中任一项所述的方法，其还包括分离单独或组合的RebA、RebB、RebD和/或RebM。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述分离步骤包括：

27.如权利要求25所述的方法，其中所述分离步骤包括：

(c)提供一种或多种离子交换或离子交换或反相色谱柱；以及

28.如权利要求25所述的方法，其中所述分离步骤包括：

29.如权利要求22-28中任一项所述的方法，其还包括回收单独的RebA、RebB、RebD和/或RebM或者包含RebA、RebB、RebD和/或RebM的组合物。

30.如权利要求29所述的方法，其中所回收的组合物相对于甜叶菊植物的糖苷组合物富含RebA、RebB、RebD和/或RebM，并且相对于植物来源的甜叶菊提取物具有减少的水平的非糖苷甜叶菊植物来源的组分。

31.如权利要求30所述的方法，其中所回收的组合物相对于植物来源的甜叶菊提取物具有减少的水平的非糖苷甜叶菊植物来源的组分。

32.如权利要求22-31中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物发酵液包含：

(a)由如权利要求1-21中任一项所述的重组宿主细胞产生的一种或多种RebA、RebB、RebD和/或RebM，

(b)葡萄糖、果糖和/或蔗糖；和/或

33.一种培养物发酵液，其包含：

(a)如权利要求1-21中任一项所述的重组宿主细胞；以及

(b)一种或多种RebA、RebB、RebD和/或RebM；

34.一种细胞培养物发酵液，其包含：

(a)如权利要求1-21中任一项所述的重组宿主细胞；以及

(b)由如权利要求1-21中任一项所述的重组宿主细胞产生的一种或多种RebA、RebB、RebD和/或RebM，

35.一种细胞培养物发酵液，其包含：

(a)如权利要求1-21中任一项所述的重组宿主细胞；以及

其中一种或多种RebA、RebB、RebD和/或RebM以至少0.1mg/l所述培养物发酵液的浓度存在并且所述细胞培养物发酵液还包含葡萄糖、UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖、N-乙酰基-葡糖胺和/或YNB；

36.一种细胞培养物发酵液，其包含：

(a)如权利要求1-21中任一项所述的重组宿主细胞；以及

37.一种细胞裂解物，其包含由如权利要求1-21中任一项所述的重组宿主细胞产生的一种或多种RebA、RebB、RebD和/或RebM，并且所述细胞裂解物还包含葡萄糖、UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖、N-N-乙酰基-葡糖胺和/或YNB。

38.由如权利要求1-21中任一项所述的重组宿主细胞产生的RebA、RebB、RebD和/或RebM。

39.通过如权利要求22-32中任一项所述的方法产生的RebA、RebB、RebD和/或RebM。

40.一种甜味剂组合物，其包含如权利要求38或39所述的RebA、RebB、RebD和/或RebM。

41.一种食物产品，其包含如权利要求40所述的甜味剂组合物。

42.一种饮料或饮料浓缩物，其包含如权利要求40所述的甜味剂组合物。