CN108337892A - 在重组宿主中生产甜菊醇糖苷 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于生产甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇和糖基化的对映贝壳杉烯酸的重组微生物和方法。

Description

在重组宿主中生产甜菊醇糖苷

技术领域

本公开内容涉及在重组宿主中重组生产甜菊醇糖苷和甜菊醇糖苷前体。特别地，本公开内容涉及在重组宿主中生产甜菊醇糖苷，包括甜菊醇-13-O-葡糖苷(13-SMG)、甜菊醇-19-O-葡糖苷(19-SMG)、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜茶苷(rubusoside，Rubu)、莱鲍迪苷A(RebA)、莱鲍迪苷B(RebB)、莱鲍迪苷D(RebD)、莱鲍迪苷E(RebE)、莱鲍迪苷M(RebM)、莱鲍迪苷Q(RebQ)、莱鲍迪苷I(RebI)、二糖基化的甜菊醇、三糖基化的甜菊醇、四糖基化的甜菊醇、五糖基化的甜菊醇、六糖基化的甜菊醇、七糖基化的甜菊醇、糖基化的对映贝壳杉烯醇、糖基化的对映贝壳杉烯酸和/或其异构体。

相关技术描述

甜味剂作为最常用于食品、饮料或糖果业的成分是公知的。甜味剂既可以在生产过程中加入最终食品，也可以在适当稀释的情况下作为佐餐甜味剂(tabletop sweeter)或者作为烘培中糖的家用替代品单独使用。甜味剂包括天然甜味剂(例如蔗糖、高果糖玉米糖浆、糖蜜、枫糖浆和蜂蜜)和人工甜味剂(例如阿斯巴甜、糖精和三氯半乳蔗糖(sucralose))。甜菊提取物(stevia extract)是可从多年生灌木甜菊(Steviarebaudiana)中分离和提取的天然甜味剂。甜菊在南美洲和亚洲被普遍种植用于商业生产甜菊提取物。以多种程度纯化的甜菊提取物在商业中用作食品中的高甜度甜味剂，以及在共混物中或单独地作为佐餐甜味剂。

图1中示出了几种甜菊醇糖苷的化学结构，包括二萜甜菊醇和多种甜菊醇糖苷。甜菊植物的提取物通常包含有助于甜味的甜菊醇糖苷，尽管每种甜菊醇糖苷的量在不同的生产批次之间通常不同。

由于从甜菊植物中回收和纯化甜菊醇糖苷已被证明是劳动密集型的和低效的，因此仍然需要可以高产率积累所需甜菊醇糖苷(如RebD和RebM)的重组生产***。还需要改进重组宿主中甜菊醇糖苷的生产以用于商业用途。另外，仍需要鉴定对特定底物具有选择性的酶，以生产一种或更多种特定的甜菊醇糖苷。在一些方面中，仍需要提高具有19-O糖基化活性的酶的催化能力，以生产更高产率的甜菊醇糖苷。

发明内容

在上述背景下，本发明提供了相对于现有技术的某些优点和进步。

尽管本文公开的本发明不限于特定的优点或功能，但是本发明提供了重组宿主细胞，其包含以下的至少一种重组基因：

(a)编码与SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的UGT91D2e多肽的基因；

(b)编码与SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的嵌合多肽的基因；

(c)编码与SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的UGT85C2多肽的基因；和/或

(d)编码与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的UGT76G1多肽的基因；

其中所述重组宿主细胞能够在细胞培养液中生产甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物。

在本文公开的重组宿主细胞的一个方面中，UGT91D2e多肽包含在SEQ ID NO：11的残基93、99、114、144、148、152、195、196、199、211、213、221、286、384、426、438或466处具有至少一个氨基酸替换的UGT91D2e多肽。

在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，UGT85C2多肽包含在SEQ ID NO：7的残基21、48、49、84、86、87、91、92、95、122、334或334处具有至少一个氨基酸替换的UGT85C2多肽。

在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，UGT76G1多肽包含在SEQ ID NO：9的残基23、26、55、146、257、283和337处具有至少一个氨基酸替换的UGT76G1多肽。

在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，UGT91D2e多肽包含一种或更多种UGT91D2e多肽变体，所述UGT91D2e多肽变体包含：SEQ ID NO：11的P93V、S99I、S114F、T144K、T144L、T144M、A148K、M152T、L195G、L195C、L195S、L195N、L195V、V196P、K199C、L211H、L211M、L211I、L211C、L211T、L213E、S221I、V286C、V286N、V286S、G384W、G384K、G384Y、E426G、E438H、3438M或A466V。

在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，UGT85C2多肽包含一种或更多种UGT85C2多肽变体，所述UGT85C2多肽变体包含：SEQ ID NO：7的Q21L、Q21T、Q21V、F48S、F48H、F48Y、F48R、F48Q、F48W、F48T、I49V、S84G、S84A、S84T、S84C、S84P、S84N、S84V、P86R、P86G、I87H、I87P、I87M、I87Y、L91K、L91R、L91T、L92F、L92I、L92M、I95K、F122S、L334S或L334M。

在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，UGT76G1多肽包含一种或更多种UGT76G1多肽变体，所述UGT76G1多肽变体包含：SEQ ID NO：9的Q23H、I26W、T146G、H155L、L257G、S253W、T284G、S283N、K337P或T55K。

在一个方面，本文公开的重组宿主细胞还包含以下的至少一种重组基因：

(a)编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(GGPPS)多肽的基因；

(b)编码对映柯巴基二磷酸合酶(CDPS)多肽的基因；

(c)编码对映贝壳杉烯合酶(KS)多肽的基因；

(d)编码对映贝壳杉烯氧化酶(KO)多肽的基因；

(e)编码细胞色素P450还原酶(CPR)多肽的基因；以及

(f)编码对映贝壳杉烯酸羟化酶(KAH)多肽的基因；

(g)编码UGT74G1多肽的基因；和/或

(h)编码EUGT11多肽的基因；

其中所述重组宿主细胞能够在细胞培养液中生产甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物。

在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，

(a)GGPPS多肽包含与SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：116所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；

(b)CDPS多肽包含与SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；

(c)KS多肽包含与SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；

(d)KO多肽包含与SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74或SEQ ID NO：76所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；

(e)CPR多肽包含与SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；

(f)KAH多肽包含与SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：108、SEQID NO：110、SEQ ID NO：112或SEQ ID NO：114所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；

(g)UGT74G1多肽包含与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽；

(h)EUGT11多肽包含与SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列具有至少65％同一性的多肽。

在本文公开的重组宿主细胞的一个方面中，所述细胞培养液包含：

(a)由重组宿主细胞生产的甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物；

(b)葡萄糖、果糖和/或蔗糖；和/或

(c)包含微量金属、维生素、盐、酵母氮源基础(yeast nitrogen base，YNB)和/或氨基酸的补充营养物。

在本文公开的重组宿主细胞的一个方面中，重组宿主包含植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、藻类细胞或细菌细胞。

在本文公开的重组宿主细胞的一个方面中，细菌细胞包含埃希氏菌属(Escherichia)细胞、乳杆菌属(Lactobacillus)细胞、乳球菌属(Lactococcus)细胞、棒状杆菌属(Cornebacterium)细胞、醋杆菌属(Acetobacter)细胞、不动杆菌属(Acinetobacter)细胞或假单胞菌属(Pseudomonas)细胞。

在本文公开的重组宿主细胞的一个方面中，真菌细胞包含酵母细胞。

在本文公开的重组宿主细胞的一个方面中，酵母细胞是来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、棉阿舒囊霉(Ashbyagossypii)、产朊假丝酵母(Cyberlindnera jadinii)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、Arxula adeninivorans、红发夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)或白色念珠菌(Candida albicans)物种的细胞。

在本文公开的重组宿主细胞的一个方面中，酵母细胞是酵母菌(Saccharomycete)。

在本文公开的重组宿主细胞的一个方面中，酵母细胞是来自酿酒酵母物种的细胞。

本发明还提供了在细胞培养液中生产甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物的方法，其包括在表达一种或更多种基因的条件下，在培养基中培养本文公开的重组宿主细胞；

其中所述基因中的至少一种是重组基因；

其中所述甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物由所述重组宿主细胞生产。

在本文公开的方法的一个方面中，组成型地表达一种或更多种基因和/或诱导一种或更多种基因的表达。

本发明还提供了生产甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸的方法，其包括使用以下的一种或更多种进行植物衍生组分(plant-derived component)或者合成甜菊醇或甜菊醇糖苷的全细胞生物转化：

(a)与SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的UGT91D2e多肽；

(b)与SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的嵌合多肽；

(c)与SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的UGT85C2多肽；和/或

(d)与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的UGT76G1多肽；

其中所述多肽中的至少一种是重组多肽。

在本文公开的方法的一个方面中，全细胞是本文公开的重组宿主细胞。

在本文公开的方法的一个方面中，将重组宿主细胞在一定温度下在发酵罐中培养一段时间，其中所述温度和一段时间有利于甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物的生产。

本发明还提供了用于生产甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物的体外方法，其包括向反应混合物中添加以下的一种或更多种：

(a)与SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的UGT91D2e多肽；

(b)与SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的嵌合多肽；

(c)与SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的UGT85C2多肽；和/或

(d)与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的UGT76G1多肽，

以及植物衍生组分或者合成甜菊醇或甜菊醇糖苷；

其中所述多肽中的至少一种是重组多肽；以及

(b)在所述反应混合物中合成甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物。

在一个方面中，本文公开的方法还包括从细胞培养液中分离单独的或组合的甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物。

在本文公开的方法的一个方面中，分离步骤包括：

(a)提供包含单独的或组合的甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物的细胞培养液；

(b)使细胞培养液的液相与细胞培养液的固相分离以获得包含单独的或组合的甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物的上清液；

(c)提供一种或更多种吸附树脂，包括提供在填充柱中的吸附树脂；以及

(d)使步骤(b)的上清液与所述一种或更多种树脂接触以获得单独的或组合的甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物的至少一部分，从而分离单独的或组合的甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物。

在一个方面中，本文公开的方法还包括回收单独的甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物，或者包含甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物的组合物。

在本文公开的方法的一个方面中，回收的组合物相对于甜菊植物的甜菊醇糖苷组合物富含甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物，并且相对于植物衍生甜菊提取物具有降低水平的非甜菊醇糖苷甜菊植物衍生组分。

在本文公开的方法的一个方面中，细胞培养液包含：

(a)由本文公开的重组宿主细胞生产的一种或更多种甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物；

(b)葡萄糖、果糖和/或蔗糖；和/或

(c)包含微量金属、维生素、盐、YNB和/或氨基酸的补充营养物。

在本文公开的方法的一个方面中，反应混合物包含：

(a)在反应混合物中生产的一种或更多种甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物；

(b)UGT多肽；

(c)UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和/或N-乙酰基-葡糖胺；和/或；

(d)反应缓冲液和/或盐。

在本文公开的方法的一个方面中，重组宿主细胞包含植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、藻类细胞或细菌细胞。

在本文公开的方法的一个方面中，细菌细胞包含埃希氏菌属细胞、乳杆菌属细胞、乳球菌属细胞、棒状杆菌属细胞、醋杆菌属细胞、不动杆菌属细胞或假单胞菌属细胞。

在本文公开的方法的一个方面中，真菌细胞包含酵母细胞。

在本文公开的方法的一个方面中，酵母细胞是来自酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、解脂耶氏酵母、光滑念珠菌、棉阿舒囊霉、产朊假丝酵母、巴斯德毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母、多形汉逊酵母、博伊丁假丝酵母、Arxula adeninivorans、红发夫酵母或白色念珠菌物种的细胞。

在本文公开的方法的一个方面中，酵母细胞是酵母菌。

在本文公开的方法的一个方面中，酵母细胞是来自酿酒酵母物种的细胞。

在本文公开的重组宿主和方法的一个方面中，

(a)甜菊醇糖苷包括13-SMG、19-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜茶苷、RebA、RebB、RebD、RebE、RebM、二糖基化、三糖基化的甜菊醇、四糖基化的甜菊醇、五糖基化的甜菊醇、六糖基化的甜菊醇、七糖基化的甜菊醇和/或其异构体；

(b)糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物包括二糖基化的对映贝壳杉烯醇、三糖基化的对映贝壳杉烯醇和/或其异构体；和/或

(c)糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物包括二糖基化的对映贝壳杉烯酸、三糖基化的对映贝壳杉烯酸和/或其异构体。

在本文公开的重组宿主和方法的一个方面中，

(a)二糖基化的甜菊醇包含表1的化合物2.23；

(b)三糖基化的甜菊醇包含表1的化合物3.1和/或化合物3.34；

(c)四糖基化的甜菊醇包含表1的化合物4.26和/或化合物4.33；

(d)五糖基化的甜菊醇包含表1的化合物5.22、化合物5.24和/或化合物5.25；

(e)六糖基化的甜菊醇包含表1的化合物6.1和/或化合物6.23；

(f)七糖基化的甜菊醇包含表1的化合物7.2、化合物7.5和/或化合物7.13；

(g)糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物包含表1的化合物KA3.1、化合物KA3.2和/或化合物KA2.7；和/或

(h)糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物包含表1的化合物KL2.8和/或与化合物KL3.6共洗脱的化合物KL3.1。

在本文公开的重组宿主和方法的一个方面中，

(a)化合物4.26具有以下结构：

(b)化合物5.22具有以下结构：

(c)化合物6.1具有以下结构：

(d)化合物7.2具有以下结构：

(e)化合物7.5具有以下结构

(f)化合物KA3.1具有以下结构：

(g)化合物KA3.2具有以下结构：

以及

(h)化合物KL3.1具有以下结构：

在本文公开的重组宿主和方法的一个方面中，

(a)三糖基化的对映贝壳杉烯酸包括具有以下结构的化合物：

(b)五糖基化的甜菊醇包括具有以下结构的化合物：

(c)六糖基化的甜菊醇包括具有以下结构的化合物：

以及

(d)七糖基化的甜菊醇包括具有以下结构的化合物：

本发明还提供了由本文公开的重组宿主细胞或由本文公开的方法生产的甜菊醇糖苷组合物，其中所述组合物具有这样的甜菊醇糖苷组合物，所述甜菊醇糖苷组合物相对于甜菊植物的甜菊醇糖苷组合物富含RebD、RebM或其异构体，并且相对于植物衍生甜菊提取物具有降低水平的非甜菊醇糖苷甜菊植物衍生组分。

本发明还提供了细胞培养液，其包含：

(a)本文公开的重组宿主细胞；和

(b)由所述重组宿主细胞生产的一种或更多种甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物；

其中一种或更多种甜菊醇糖苷以至少1mg/升培养液的浓度存在。

本发明还提供了细胞培养液，其包含：

(a)由本文公开的重组宿主细胞生产的一种或更多种甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物；

(b)葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、乙醇和/或甘油，和/或

(c)包含微量金属、维生素、盐、YNB和/或氨基酸的补充营养物。

本发明还提供了细胞裂解物，其包含：

(a)由本文公开的重组宿主细胞生产的一种或更多种甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物；

(b)葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、乙醇、甘油、尿苷二磷酸(UDP)-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和/或N-乙酰基-葡糖胺；和/或

(c)包含微量金属、维生素、盐、YNB和/或氨基酸的补充营养物。

本发明还提供了反应混合物，其包含：

(a)在所述反应混合物中生产的一种或更多种甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物；

(b)UGT多肽；

(c)葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、乙醇、甘油、尿苷二磷酸(UDP)-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和/或N-乙酰基-葡糖胺；和/或

(d)反应缓冲液和/或盐。

从下文的详细描述结合所附权利要求将更充分地理解本发明的这些和其他一些特点和优点。应注意，所述权利要求的范围由其中的记载限定，而不是由对在本描述中所阐述的特点和优点的具体讨论所限定。

附图简述

当结合以下附图阅读时，可以最好地理解本发明实施方案的以下详细描述，其中类似的结构用相同的参考数字表示，其中：

图1示出了使用牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(GGPPS)、对映柯巴基二磷酸合酶(CDPS)、对映贝壳杉烯合酶(KS)、对映贝壳杉烯氧化酶(KO)和对映贝壳杉烯酸羟化酶(KAH)多肽在酵母中由牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯生产甜菊醇的工程化生物合成途径的示意图。

图2示出了由合适的尿苷5′-二磷酸(UDP)糖基转移酶(UGT)酶促催化的代表性甜菊醇糖苷糖基化反应和几种甜菊醇糖苷化合物的化学结构。

图3示出了用于由KO催化的甜菊醇途径步骤的甜菊醇合成中间体对映贝壳杉烯醇及其生物转化产物对映贝壳杉烯酸，以及潜在的糖基化副产物(单-、二-和/或三-糖基化的对映贝壳杉烯醇和单-、二-和/或三-糖基化的对映贝壳杉烯酸)。

图4A示出了通过UGT85C2(SEQ ID NO：7)缺失的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株进行的对映贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)和对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)的积累。图4B示出了通过UGT85C2(SEQ ID NO：7)缺失的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株进行的19-SMG的积累。图4C示出了UGT85C2(SEQ ID NO：7)缺失的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株的甜菊醇、甜菊醇+2Glc(#23)和甜菊醇+3Glc(#34)的积累。参见实施例6。

图5示出了由包含UGT85C2变体的细菌裂解物将甜菊醇转化为甜茶苷。将细菌裂解物与甜菊醇一起孵育24小时。参见实施例7。

图6A示出了与表达野生型UGT76G1的对照甜菊醇糖苷生产菌株(黑色条)相比，表达UGT76G1 H155L的甜菊醇糖苷生产菌株(灰色条)中RebM、RebD、RebA、RebB、13-SMG和甜茶苷的生产。图6B示出了与表达野生型UGT76G1的对照菌株(黑色条)相比，表达UGT76G1H155L的甜菊醇糖苷生产菌株(灰色条)中1，2-二糖苷、甜茶苷(Rubu)、RebG和RebE的生产。图6C示出了与表达野生型UGT76G1的对照菌株(黑色条)相比，表达UGT76G1 H155L的甜菊醇糖苷生产菌株(灰色条)中可量化的甜菊醇糖苷(13-SMG+1，2-二糖苷+Rubu+RebG+RebB+RebA+RebE+RebD+RebM)的生产和RebD+RebM滴度。图6D示出了与表达野生型UGT76G1的对照菌株(黑色条)相比，表达UGT76G1 H155L的甜菊醇糖苷生产菌株(灰色条)中三糖基化的甜菊醇分子(甜菊醇+3Glc(#1))、四糖基化分子(甜菊醇+4Glc(#26))、三种五糖基化的甜菊醇分子(甜菊醇+5Glc(#22)、甜菊醇+5Glc(#24)和甜菊醇+5Glc(#25))、两种六糖基化的甜菊醇分子(甜菊醇+6Glc(异构体1)和甜菊醇+6Glc(#23))和两种七糖基化的甜菊醇分子(甜菊醇+7Glc(异构体2)和甜菊醇+7Glc(#13))的生产。参见实施例9。

图7A示出了三糖基化的对映贝壳杉烯酸(对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和2))、对映贝壳杉烯酸+2Glc+1GlcNAc和三糖基化的对映贝壳杉烯醇(对映贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1))的NMR阐明的结构。图7B示出了甜菊醇+6Glc(异构体1)和甜菊醇+7Glc(异构体2)的NMR阐明的结构。图7C示出了甜菊醇+6Glc(异构体4)和甜菊醇+7Glc(异构体5)的NMR阐明的结构。图7D示出了甜菊醇+4Glc+1GlcNAc(#11)和甜菊醇+4Glc(#26)的NMR阐明的结构。图7E示出了甜菊醇+5Glc(#22)和甜菊醇+7Glc(#14)的NMR阐明的结构。参见实施例6、8和9。

图8A、8B和8C示出了对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)的¹H NMR谱以及¹H和¹³C NMR化学位移(以ppm计)。图8D、8E和8F示出了对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)的¹H NMR谱以及¹H和¹³C NMR化学位移(以ppm计)。图8G、8H和8I示出了对映贝壳杉烯酸+2Glc+1GlcNAc的¹HNMR谱以及¹H和¹³C NMR化学位移(以ppm计)。图8J、8K和8L示出了对映贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1)的¹H NMR谱以及¹H和¹³C NMR化学位移(以ppm计)。图8M、8N、8O和8P示出了甜菊醇+6Glc(异构体1)的¹H NMR谱以及¹H和¹³C NMR化学位移(以ppm计)。图8Q、8R、8S和8T示出了甜菊醇+7Glc(异构体2)的¹H NMR谱以及¹H和¹³C NMR化学位移(以ppm计)。图8U、8V、8W和8x示出了甜菊醇+6Glc(异构体4)的¹H NMR谱以及¹H和¹³C NMR化学位移(以ppm计)。图8Y、8Z、8AA和8AB示出了甜菊醇+7Glc(异构体5)的¹H NMR谱以及¹H和¹³C NMR化学位移(以ppm计)。图8AC、8AD、8AE和8AF示出了甜菊醇+4Glc+1GlcNAc(#11)的¹H NMR谱以及¹H和¹³C NMR化学位移(以ppm计)。图8AG、8AH、8AI和8AJ示出了甜菊醇+4Glc(#26)的¹H NMR谱以及¹H和¹³C NMR化学位移(以ppm计)。图8AK、8AL、8AM和8AN示出了甜菊醇+5Glc(#22)的¹H NMR谱以及¹H和¹³C NMR化学位移(以ppm计)。图8AO、8AP、8AQ和8AR示出了甜菊醇+7Glc(#14)的¹H NMR谱以及¹H和¹³C NMR化学位移(以ppm计)。参见实施例6、8和9。

图9A示出了在表达UGT76G1变体的酿酒酵母中对映贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)和对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)的积累。图9B示出了表达UGT76G1变体的酿酒酵母中贝壳杉烯醇+2Glc(#8)和与对映贝壳杉烯醇+3Glc(#6)共洗脱的对应贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1)的积累。参见实施例8。

图10A示出了在表达生产RebD的UGT76G1变体的酿酒酵母中1，2-甜菊苷、RebG、甜菊醇+3Glc(#1)、甜菊醇+4Glc(#26)、甜菊醇+5Glc(#22)、甜菊醇+5Glc(#24)、甜菊醇+5Glc(#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1)和甜菊醇+6Glc(#23)的积累。图10B示出了在表达生产RebM的UGT76G1变体的酿酒酵母中1，2-甜菊苷、RebG、甜菊醇+3Gle(#1)、甜菊醇+4Glc(#26)、甜菊醇+5Glc(#22)、甜菊醇+5Glc(#24)、甜菊醇+5Glc(#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1)和甜菊醇+6Glc(#23)的积累。图10C示出了表达UGT76G1变体的酿酒酵母中13-SMG、1，2-二糖苷、甜茶苷、RebA、RebB、RebD、RebE和RebM的积累。参见实施例8。

图11A示出了在酿酒酵母甜菊醇糖苷生产菌株(对照菌株包含三个拷贝的野生型UGT76G1(SEQ ID NO：9)；变体菌株包含两个拷贝的野生型UGT76G1和一个拷贝的UGT76G1变体)中对映贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)、对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、对映贝壳杉烯醇+2Glc(#8)和与对映贝壳杉烯醇+3Glc(#6)共洗脱的对映贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1)的积累。图11B示出了在表达UGT76G1变体的酿酒酵母甜菊醇糖苷生产菌株中糖基化的对映贝壳杉烯酸(对映贝壳杉烯酸+2Glc(#7)+对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)+对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2))的总水平。图11C示出了在表达UGT76G1变体的酿酒酵母甜菊醇糖苷生产菌株中糖基化的对映贝壳杉烯醇(与对映贝壳杉烯醇+3Glc(#6)共洗脱的对映贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1)以及对映贝壳杉烯醇+2Glc(#8))的总水平。图11D示出了在表达UGT76G1变体的酿酒酵母甜菊醇糖苷生产菌株中1，2-二糖苷、1，2-甜菊苷、甜菊醇+3Glc(#1)、甜菊醇+4Glc(#26)、甜菊醇+5Glc(#22)、甜菊醇+5Glc(#24)、甜菊醇+5Glc(#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1)、甜菊醇+6Glc(#23)、甜菊醇+7Glc(异构体2)和甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累。图11E示出了在表达UGT76G1变体的酿酒酵母甜菊醇糖苷生产菌株中13-SMG、1，2-二糖苷、甜茶苷、RebG、RebA、RebB、RebD、RebE和RebM的积累。参见实施例8。

本领域技术人员将理解，附图中的元件是为了简单和清楚而示出，并不一定按比例绘制。例如，附图中的一些元件的尺寸可以相对于其他元件放大以帮助增进对本发明的实施方案的理解。

发明详述

在详细描述本发明之前，将定义多个术语。如本文使用的，除非上下文另有明确规定，否则未指定具体数量的形式和“该/所述”包括复数指示物。例如，提及“核酸”是指一种或更多种核酸。

应注意，术语如“优选”、“一般”和“通常”在本文中并不是用于限制要求保护的发明的范围，或暗示某些特征对于要求保护的发明的结构或功能是关键的、必要的或甚至是重要的。相反，这些术语仅旨在突出可被用在或不被用在本发明的特定实施方案中的替选的或额外的特征。

为了描述和限定本发明的目的，应注意术语“基本上”在本文中用于表示可归因于任何定量比较、值、测量或其他表述的固有的不确定程度。术语“基本上”在本文中也用于表示在不导致所讨论主题的基本功能改变的情况下，定量表达可不同于所述参照的程度。

可使用本领域技术人员公知的方法来构建根据本发明的遗传表达构建体和重组细胞。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术、体内重组技术和聚合酶链式反应(PCR)技术。参见，例如描述于如下文献中的技术：Green&Sambrook，2012，MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL，第四版，Cold Spring Harbor Laboratory，New York；Ausubel等，1989，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，Greene Publishing Associates andWiley Interscience，New York，和PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications(Innis等，1990，Academic Press，San Diego，CA)。

如本文使用的术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可互换使用，是指包括DNA、RNA、其衍生物或其组合的核酸，如技术人员理解的其根据上下文为单链或双链体现形式(embodiment)。

如本文使用的术语“微生物”、“微生物宿主”、“微生物宿主细胞”、“重组宿主”和“重组宿主细胞”可以互换使用。如本文使用的，术语“重组宿主”意指这样的宿主，其基因组已经增强(augment)至少一个DNA序列。这样的DNA序列包括但不限于非天然存在的基因、通常不转录成RNA或翻译成蛋白质(“表达的”)的DNA序列和期望引入宿主中的其他基因或DNA序列。应理解，通常通过稳定引入一个或更多个重组基因来增强本文所述的重组宿主的基因组。一般而言，引入的DNA最初不是作为DNA接受者的宿主中所固有的，而是在本公开内容的范围内从给定宿主中分离DNA片段，并随后将该DNA的一个或更多个另外的拷贝引入同一宿主中，例如用来提高基因产物的产量或改变基因的表达模式。在一些情况下，引入的DNA将通过例如同源重组或定点诱变来修饰或甚至替代内源基因或DNA序列。合适的重组宿主包括微生物。

如本文使用的术语“重组基因”是指引入接受者宿主的基因或DNA序列，不管相同或相似的基因或DNA序列是否可能已经存在于这样的宿主中。在本上下文中，“引入”或“增加”在本领域中已知是指人工(by the hand of man)引入或增加。因此，重组基因可以是来自另一物种的DNA序列，或者可以是源自或存在于相同物种但已通过重组方法并入宿主以形成重组宿主的DNA序列。应理解，引入宿主的重组基因可以与正常存在于被转化宿主中的DNA序列相同，并且被引入以提供所述DNA的一个或更多个另外的拷贝，从而允许该DNA基因产物的过表达或经修饰表达。在一些方面，所述重组基因由cDNA编码。在另一些实施方案中，将重组基因针对在酿酒酵母中的表达进行合成和/或密码子优化。

如本文使用的术语“改造的生物合成途径”是指如本文所述在重组宿主中发生的生物合成途径。在一些方面，生物合成途径的一个或更多个步骤并不天然存在于未经修饰的宿主中。在一些实施方案中，将异源形式的基因引入到包含内源形式之基因的宿主中。

如本文使用的术语“内源”基因是指源自特定生物体、组织或细胞并在其中产生或合成的基因。在一些实施方案中，内源基因是酵母基因。在一些实施方案中，所述基因对于酿酒酵母(包括但不限于酿酒酵母菌株S288C)是内源的。在一些实施方案中，内源酵母基因被过表达。如本文使用的，术语“过表达”用于指生物体中基因以高于野生型生物体中基因表达水平的水平表达。参见例如Prelich，2012，Genetics 190：841-54。在一些实施方案中，使内源酵母基因(例如ADH)缺失。参见例如，Giaever&Nislow，2014，Genetics 197(2)：451-65。如本文使用的，术语“缺失”、“缺失的”、“敲除”和“敲除的”可互换使用，指已***作变得不再在生物体中表达的内源基因，所述生物体包括但不限于酿酒酵母。

如本文使用的术语“异源序列”和“异源编码序列”用于描述来自除重组宿主之外的物种的序列。在一些实施方案中，重组宿主是酿酒酵母细胞，异源序列来自酿酒酵母以外的生物体。异源编码序列例如可以来自原核微生物、真核微生物、植物、动物、昆虫或不同于表达异源序列的重组宿主的真菌。在一些实施方案中，编码序列对宿主是天然的序列。

“可选择标志物”可以是补充宿主细胞营养缺陷型、提供抗生素抗性或导致颜色改变的任何数量的基因之一。然后使用本领域公知的方法(参见下文)将基因置换载体的线性化DNA片段引入细胞。可以基于选择标志物来确定线性片段向基因组中的整合和基因的破坏，并且可以通过例如PCR或Southern印迹分析来验证。在将其用于选择之后，可以通过例如Cre-LoxP***从宿主细胞的基因组中除去可选择性标志物(参见例如Gossen等，2002，Ann.Rev.Genetics 36：153-173和U.S.2006/0014264)。或者，可以以包括待破坏的基因之一部分的方式构建基因置换载体，其中所述部分缺乏任何内源基因启动子序列并且不编码所述基因的编码序列，或编码所述基因的无活性片段。

如本文使用的术语“变体”和“突变体”用于描述与特定蛋白质的野生型序列相比在一个或更多个氨基酸处已经被修饰的蛋白质序列。

如本文使用的术语“无活性片段”是编码活性小于例如从基因的全长编码序列所产生之蛋白质的约10％(例如小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％，或0％)的蛋白质的基因片段。这样的基因部分以这样的方式***载体中，使得没有已知的启动子序列有效地连接到基因序列，但是终止密码子和转录终止序列有效地连接至基因序列的所述部分。该载体随后可以在基因序列的所述部分中线性化并转化到细胞中。然后通过单一同源重组，将该线性化载体整合到基因的内源对应物中，使其失活。

如本文使用的术语“甜菊醇糖苷”指莱鲍迪苷A(RebA)(CAS#58543-16-1)、莱鲍迪苷B(RebB)(CAS#58543-17-2)、莱鲍迪苷C(RebC)(CAS#63550-99-2)、莱鲍迪苷D(RebD)(CAS#63279-13-0)、莱鲍迪苷E(RebE)(CAS#63279-14-1)、莱鲍迪苷F(RebF)(CAS#438045-89-7)、莱鲍迪苷M(RebM)(CAS#1220616-44-3)、甜茶苷(CAS#63849-39-4)、杜尔可苷(dulcoside)A(CAS#64432-06-0)、莱鲍迪苷I(RebI)(MassBank记录号：FU000332)、莱鲍迪苷Q(RebQ)、1，2-甜菊苷(CAS#57817-89-7)、1，3-甜菊苷(RebG)、1，2-二糖苷(MassBank记录号：FU000299)、1，3-二糖苷、甜菊醇-13-O-葡糖苷(13-SMG)、甜菊醇-19-O-葡糖苷(19-SMG)、二糖基化的甜菊醇、三糖基化的甜菊醇、四糖基化的甜菊醇、五糖基化的甜菊醇、六糖基化的甜菊醇、七糖基化的甜菊醇和/或其异构体。参见图2；还参见由Harriet Wallin，Food Agric.Org筹备的Steviol Glycosides Chemical and Technical Assessment 69thJECFA，2007。参见图2、图7、图8和表1；还参见由Harriet Wallin，Food Agric.Org筹备的Steviol Glycosides Chemical and Technical Assessment 69th JECFA，2007。糖基化的甜菊醇化合物可包含一个或更多个葡萄糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、鼠李糖和/或木糖部分。可通过本文所述方法生产的甜菊醇糖苷的非限制性实例示于表1、图7和图8中。

如本文使用的术语“糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物”是指二糖基化的对映贝壳杉烯醇或三糖基化的对映贝壳杉烯醇。如本文使用的术语“糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物”是指二糖基化的对映贝壳杉烯酸或三糖基化的对映贝壳杉烯酸。参见图7、图8和表1。糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物可包含一个或更多个葡萄糖、GlcNAc、鼠李糖和/或木糖部分。可通过本文所述方法生产的糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物的非限制性实例示于表1、图7和图8中。

如本文使用的术语“甜菊醇糖苷前体”和“甜菊醇糖苷前体化合物”用于表示甜菊醇糖苷生物合成途径中的中间体化合物。甜菊醇糖苷前体包括但不限于牻牛儿基牻牛儿基二磷酸/酯/盐(geranylgeranyl diphosphate，GGPP)、对映柯巴基二磷酸/酯/盐、对映贝壳杉烯、对映贝壳杉烯醇、对映贝壳杉烯醛、对映贝壳杉烯酸和甜菊醇。参见图1。在一些实施方案中，甜菊醇糖苷前体本身是甜菊醇糖苷化合物。例如，19-SMG、甜茶苷、甜菊苷和RebE是RebM的甜菊醇糖苷前体。参见图2。可以在体内(即，在重组宿主中)、体外(即，酶促地)或通过全细胞生物转化来生产甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体。如本文使用的术语“生产”和“积累”可以互换使用以描述体内、体外或全细胞生物转化中甜菊醇糖苷和甜菊醇糖苷前体的合成。

如本文使用的术语“细胞培养液”可用于指可以支持或已经支持宿主细胞(包括但不限于酵母宿主细胞)的生长的液体。细胞培养液的组分可以包含例如由宿主细胞生产的甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物，葡萄糖、果糖、蔗糖、微量金属、维生素、盐、酵母氮源基础(YNB)和/或氨基酸。

如本文使用的术语“细胞裂解物”可用于指包含裂解细胞(即，其膜已被化学或机械破坏的细胞)的组分的流体。细胞裂解物还可以包含由宿主细胞生产的甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物，葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、尿苷二磷酸(UDP)-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖、GlcNAc、微量金属、维生素、盐、YNB和/或氨基酸。在一些方面中，细胞裂解物是酵母细胞裂解物(例如酿酒酵母细胞裂解物)或细菌细胞裂解物(例如大肠杆菌细胞裂解物)。

如本文使用的术语“反应混合物”是指用于进行体外反应的溶液。反应混合物的组分可包含但不限于甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物、糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物、多肽例如UGT多肽、UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖、GlcNAC、缓冲液和/或盐。

重组甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株描述于WO 2011/153378、WO 2013/022989、WO2014/122227和WO 2014/122328中。在重组宿主中，通过全细胞生物转化并且在体外生产甜菊醇糖苷的方法也描述于WO 2011/153378、WO 2013/022989、WO 2014/122227和WO 2014/122328中。

在一些实施方案中，通过在重组宿主中参与甜菊醇糖苷生物合成途径的一种或更多种酶的表达，在体内生产甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体。例如，表达一种或更多种以下基因的甜菊醇生产重组宿主可以在体内产生甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体：编码GGPPS多肽的基因、编码CDPS多肽的基因、编码KS多肽的基因、编码KO多肽的基因、编码KAH多肽的基因、编码CPR多肽的基因和编码UGT多肽的基因。参见例如图1和图2。技术人员将理解，这些基因中的一个或更多个对于宿主可以是内源的，条件是这些基因中的至少一个(在一些实施方案中，全部)是引入重组宿主中的重组基因。

本文描述的重组宿主可包含编码能够从法尼基二磷酸(farnesyl diphosphate，FPP)和异戊烯基二磷酸(isopentenyl diphosphate，IPP)合成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP)的多肽的基因，编码能够从GGPP合成对映柯巴基焦磷酸(ent-copalyl dirophosphate)的多肽的基因，编码能够从对映柯巴基焦磷酸合成对映贝壳杉烯的多肽的基因，编码能够从对映贝壳杉烯合成对映贝壳杉烯酸的多肽的基因，编码能够从对映贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽的基因，和/或编码能够将NADPH转化为NADP+的多肽的基因。GGPPS多肽可以从FPP和IPP合成GGPP。CDPS多肽可以从GGPP合成对映柯巴基焦磷酸。KS多肽可以从对映柯巴基焦磷酸合成对映贝壳杉烯。KO多肽可以从对映贝壳杉烯合成对映贝壳杉烯酸。KAH多肽可以从对映贝壳杉烯酸合成甜菊醇。CPR多肽可以将NADPH转化为NADP+。

在另一个实例中，表达编码GGPPS多肽的基因、编码CDPS多肽的基因、编码KS多肽的基因、编码KO多肽的基因、编码KAH多肽的基因和编码CPR多肽的基因的重组宿主可在体内产生甜菊醇。参见例如图1。技术人员将理解，这些基因中的一个或更多个对于宿主可以是内源的，条件是这些基因中的至少一个(在一些实施方案中，全部)是引入重组宿主中的重组基因。

在另一个实例中，表达编码GGPPS多肽的基因、编码CDPS多肽的基因、编码KS多肽的基因、编码KO多肽的基因、编码KAH多肽的基因、编码CPR多肽的基因和编码UGT多肽的一种或更多种基因的重组宿主可以在体内生产甜菊醇糖苷。参见例如图1和图2。技术人员将理解，这些基因中的一个或更多个对于宿主可以是内源的，条件是这些基因中的至少一个(在一些实施方案中，全部)是引入重组宿主中的重组基因。

在一些方面，GGPPS多肽包含具有SEQ ID NO：20(其可以由SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：22(其可以由SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列编码)、SEQ IDNO：24(其可以由SEQ ID NO：23所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：26(其可以由SEQ IDNO：25所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：28(其可以由SEQ ID NO：27所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：30(其可以由SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：32(其可以由SEQ ID NO：31所示的核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：116(其可以由SEQ ID NO：115所示的核苷酸序列编码)所示的氨基酸序列的多肽。

在一些方面，CDPS多肽包含具有SEQ ID NO：34(其可以由SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：36(其可以由SEQ ID NO：35所示的核苷酸序列编码)、SEQ IDNO：38(其可以由SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：40(其可以由SEQ IDNO：39所示的核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：42(其可以由SEQ ID NO：41所示的核苷酸序列编码)所示的氨基酸序列的多肽。

在一些方面，KS多肽包含具有SEQ ID NO：44(其可以由SEQ ID NO：43所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：46(其可以由SEQ ID NO：45所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：48(其可以由SEQ ID NO：47所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：50(其可以由SEQ ID NO：49所示的核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：52(其可以由SEQ ID NO：51所示的核苷酸序列编码)所示的氨基酸序列的多肽。

在一些实施方案中，重组宿主包含编码CDPS-KS多肽的基因。在一些方面，CDPS-KS多肽包含具有SEQ ID NO：54(其可以由SEQ ID NO：53所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：56(其可以由SEQ ID NO：55所示的核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：58(其可以由SEQ ID NO：57所示的核苷酸序列编码)所示的氨基酸序列的多肽。

在一些方面，KO多肽包含具有SEQ ID NO：60(其可以由SEQ ID NO：59所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：62(其可以由SEQ ID NO：61所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：117(其可以由SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：64所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：66(其可以由SEQ ID NO：65所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：68(其可以由SEQ ID NO：67所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：70(其可以由SEQ ID NO：69所示的核苷酸序列编码)、SEQ IDNO：72(其可以由SEQ ID NO：71所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：74(其可以由SEQ IDNO：73所示的核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：76(其可以由SEQ ID NO：75所示的核苷酸序列编码)所示的氨基酸序列的多肽。

在一些方面，CPR多肽包含具有SEQ ID NO：78(其可以由SEQ ID NO：77所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：80(其可以由SEQ ID NO：79所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：82(其可以由SEQ ID NO：81所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：84(其可以由SEQ ID NO：83所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：86(其可以由SEQ ID NO：85所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：88(其可以由SEQ ID NO：87所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：90(其可以由SEQ ID NO：89所示的核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：92(其可以由SEQ ID NO：89所示的核苷酸序列编码)所示的氨基酸序列的多肽。

在一些方面，KAH多肽包含具有SEQ ID NO：94(其可以由SEQ ID NO：93所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：97(其可以由SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：96所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：100(其可以由SEQ ID NO：98或SEQ ID NO：99所示的核苷酸序列编码)、SEQID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106(其可以由SEQID NO：105所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：108(其可以由SEQ ID NO：107所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：110(其可以由SEQ ID NO：109所示的核苷酸序列编码)、SEQ IDNO：112(其可以由SEQ ID NO：111所示的核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：114(其可以由SEQID NO：113所示的核苷酸序列编码)所示的氨基酸序列的多肽。

在一些实施方案中，重组宿主包含编码UGT85C2多肽的核酸(SEQ ID NO：7)、编码UGT76G1多肽的核酸(SEQ ID NO：9)、编码UGT74G1多肽的核酸(SEQ ID NO：4)、编码UGT91D2多肽的核酸和/或编码EUGT11多肽的核酸(SEQ ID NO：16)。在一些方面，UGT91D2多肽可以是UGT91D2e多肽(SEQ ID NO：11)或UGT91D2e-b多肽(SEQ ID NO：13)。在一些方面，UGT85C2多肽可以由SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列编码，UGT76G1多肽可以由SEQID NO：8所示的核苷酸序列编码，UGT74G1多肽可以由SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列编码，UGT91D2e多肽可以由SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列编码，UGT91D2e-b多肽可以由SEQ IDNO：12所示的核苷酸序列编码，以及EUGT11多肽可以由SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列编码。技术人员将理解，这些基因的表达对于生产特定甜菊醇糖苷可能是必要的，但是这些基因中的一个或更多个对于宿主可以是内源的，条件是这些基因中的至少一个(在一些实施方案中，全部)是引入所述重组宿主中的重组基因。在一个具体实施方案中，甜菊醇生产重组微生物包含编码UGT85C2、UGT76G1或UGT91D2多肽的外源核酸。

在另一个具体实施方案中，甜菊醇生产重组微生物包含编码UGT85C2、UGT76G1、UGT74G1和UGT91D2多肽的外源核酸。在另一个具体实施方案中，甜菊醇生产重组微生物包含编码UGT85C2、UGT76G1、UGT74G1和EUGT11多肽的外源核酸。在另一个具体实施方案中，甜菊醇生产重组微生物包含编码UGT85C2、UGT76G1、UGT74G1、UGT91D2(尤其包括UGT91D2e、UGT91D2m、UGT91D2e-b及其功能同源物)和EUGT11多肽的外源核酸。在另一个具体实施方案中，甜菊醇生产重组微生物包含编码UGT85C2、UGT76G1、UGT74G1、UGT91D2和/或EUGT11多肽的外源核酸。在另一个具体实施方案中，甜菊醇生产重组微生物包含编码UGT85C2、UCT76G1、UGT74G1、UGT91D2和/或EUGT11多肽的外源核酸。

在一些实施方案中，重组宿主包含：(a)编码能够对甜菊醇糖苷的19-O葡萄糖的C2′进行β1，2葡糖基化的多肽的基因；(b)编码能够对甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖的C2′进行β1，2葡糖基化的多肽的基因；(c)编码能够对甜菊醇糖苷的19-O-葡萄糖的C3′进行β1，3葡糖基化的多肽的基因；(d)编码能够对甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖的C3′进行β1，3葡糖基化的多肽的基因；(e)编码能够对甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖的C6′进行β1，6葡糖基化的多肽的基因；(f)编码能够对甜菊醇糖苷的13-O二葡糖苷部分的1，3-葡萄糖的C6′进行β1，6葡糖基化的多肽的基因；(g)编码能够对甜菊醇或甜菊糖醇苷的13-OH进行葡糖基化的多肽的基因；(h)编码能够对甜菊醇或甜菊醇糖苷的C-19羧基进行葡糖基化的多肽的基因；(i)编码能够对甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖的C2′进行β1，2鼠李糖基化的多肽的基因；(j)编码能够对甜菊醇苷的13-O-葡萄糖的C2′进行β1，2木糖基化的多肽的基因；(o)编码能够将β1，2GlcNAc转移到甜菊醇糖苷的19-O葡萄糖的C2′的多肽的基因；(k)编码能够将β1，3GlcNAc转移到甜菊醇糖苷的19-O葡萄糖的C2′的多肽的基因；(l)编码能够将β1，3GlcNAc转移到甜菊醇糖苷的13-O葡萄糖的C2′的多肽的基因；(m)编码能够将GlcNAc转移到甜菊醇或甜菊醇糖苷的C-19羧基的多肽的基因；(n)编码能够对贝壳杉烯酸或贝壳杉烯醇的C-19羧基进行葡糖基化的多肽的基因；(o)编码能够对贝壳杉烯酸糖苷或贝壳杉烯醇糖苷的19-O葡萄糖的C2′进行β1，2葡糖基化的多肽的基因；(p)编码能够对贝壳杉烯酸的β1，2二葡糖苷进行β1，2葡糖基化的多肽的基因；(q)编码能够对贝壳杉烯酸的β1，2二葡糖苷进行β1，2GlcNAc转移的多肽的基因；(r)编码能够对贝壳杉烯酸糖苷或贝壳杉烯醇糖苷的19-O葡萄糖的C3′进行β1，3葡糖基化的多肽的基因；和/或(s)编码能够对甜菊醇糖苷的19-O二葡糖苷部分的1，3-葡萄糖的C6′进行β1，6葡糖基化的多肽的基因。

在一些方面，EUGT11(SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16)、UGT91D2e(SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11)、UGT91D2e-b(SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13)、其变体或其嵌合蛋白催化甜菊醇糖苷的19-O葡萄糖的C2′的β1，2葡糖基化。示例性UGT91D2e变体序列在SEQ ID NO：1、2、118-121、123和191-214中示出。在一些方面，UGT91D2e(SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11)、UGT91D2e-b(SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13)、其变体或其嵌合蛋白催化甜菊醇糖苷的13-O葡萄糖的C2′的β1，2葡糖基化。示例性UGT91D2e变体序列在SEQ ID NO：1、2、118-121、123和191-214中示出。示例性UGT91D2e-EUGT11嵌合蛋白序列在SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18中示出。在一些方面，UGT76G1(SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9)、其变体或其嵌合蛋白催化甜菊醇糖苷的19-O葡萄糖的C3′的β1，3葡糖基化和/或甜菊醇糖苷的13-O葡萄糖的C3′的β1，3葡糖基化。示例性UGT76G1变体序列在SEQ ID NO：181-190和217-220中示出。在一些方面，UGT85C2(SEQ ID NO：5/SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7)、其变体或其嵌合蛋白催化甜菊醇或甜菊糖醇苷的13-OH的葡糖基化。示例性UGT85C2变体序列在SEQ ID NO：127和147-180中示出。在一些方面，UGT74G1(SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4)、其变体或其嵌合蛋白催化甜菊醇或甜菊醇糖苷的C-19羧基的葡糖基化。在一些方面，EUGT11(SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16)、UGT91D2e(SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11)、UGT74G1(SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4)和/或UGT76G1(SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9)可以接受尿苷二磷酸N-乙酰基葡糖胺(UDP-Glc-NAc)作为底物。在一些方面，UGT74G1使对映贝壳杉烯醇和对映贝壳杉烯酸糖基化；UGT76G1和UGT91D2e随后通过1，3连接或1，2连接添加另外的葡萄糖或GlcNAc部分以形成三糖基化的化合物。参见图3、7和8。

在一些实施方案中，通过使甜菊醇糖苷前体与参与甜菊醇糖苷途径的一种或更多种酶在体外接触而生产甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体。例如，使甜菊醇与UGT多肽接触可以导致体外生产甜菊醇糖苷。在一些实施方案中，通过使上游甜菊醇糖苷前体与参与甜菊醇糖苷途径的一种或更多种酶在体外接触生产甜菊醇糖苷前体。例如，使对映贝壳杉烯酸与KAH酶接触可以导致体外生产甜菊醇。

在一些实施方案中，通过全细胞生物转化生产甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体。为了发生全细胞生物转化，使表达参与甜菊醇糖苷途径的一种或更多种酶的宿主细胞摄取并修饰细胞中的甜菊醇糖苷前体；在体内修饰后，甜菊醇糖苷保留在细胞中和/或分泌到培养基中。例如，表达编码UGT多肽之基因的宿主细胞可以摄取甜菊醇并在细胞中糖基化甜菊醇；在体内糖基化后，甜菊醇糖苷可以分泌到培养基中。在一些实施方案中，使细胞透化以摄取待修饰的底物或分泌经修饰的产物。

在一些实施方案中，通过共培养两种或更多种宿主产生甜菊醇、一种或更多种甜菊醇糖苷前体和/或一种或更多种甜菊醇糖苷。在一些实施方案中，一种或更多种宿主(其各自表达参与甜菊醇糖苷途径的一种或更多种酶)产生甜菊醇、一种或更多种甜菊醇糖苷前体和/或一种或更多种甜菊醇糖苷。例如，包含GGPPS、CDPS、KO、KS、KAH和/或CPR的宿主和包含一种或更多种UGT的宿主产生一种或更多种甜菊醇糖苷。

在一些实施方案中，适合于在体外在重组宿主中或者通过全细胞生物转化生产甜菊醇糖苷(例如1，2-甜菊苷和RebD)的多肽包括UGT91D2e(SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11)的功能同源物，其包括UGT91D2e-b(SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13)；UGT91D2e V286C(SEQ IDNO：1)；UGT91D2e G384W(SEQ ID NO：2)；UGT91D2e L211M(SEQ ID NO：118)；UGT91D2eL195G(SEQ ID NO：119)；UGT91D2e V196P(SEQ ID NO：120)；UGT91D2e L211H(SEQ ID NO：121)；UGT91D2e L213E(SEQ ID NO：191)；UGT91D2e S221Y(SEQ ID NO：192)；UGT91D2eE438H(SEQ ID NO：193)；UGT91D2e M152T(SEQ ID NO：194)；UGT91D2e L211C(SEQ ID NO：195)；UGT91D2e L195S(SEQ ID NO：196)；UGT91D2e L195V(SEQ ID NO：197)；UGT91D2eV286S(SEQ ID NO：198)；UGT91D2e S221S(SEQ ID NO：199)；UGT91D2e P93V M152G(SEQ IDNO：200)；UGT91D2e S99I(SEQ ID NO：201)；UGT91D2e T144K P201P(SEQ ID NO：202)；UGT91D2e T144L(SEQ ID NO：203)；UGT91D2e T144M(SEQ ID NO：204)；UGT91D2e A148KL211I(SEQ ID NO：205)；UGT91D2e L195N(SEQ ID NO：206)；UGT91D2e K199C(SEQ ID NO：207)；UGT91D2e L211M E426G A466V(SEQ ID NO：208)；UGT91D2e L211T I303I(SEQ IDNO：209)；UGT91D2e V286N(SEQ ID NO：210)；UGT91D2e S114F V286S(SEQ ID NO：211)；UGT91D2e G384K(SEQ ID NO：212)；UGT91D2e G384Y(SEQ ID NO：213)；UGT91D2e E438M(SEQ ID NO：214)；和UGT91D2e L195C(SEQ ID NO：123)。参见实施例3。

在一些实施方案中，有用的UGT91D2同源物可在残基195、196、211、286和384处具有一个或更多个氨基酸替换。参见表2。有用的UGT91D2e同源物的非限制性实例包括在以下残基处具有替换(相对于SEQ ID NO：11)的多肽：残基93(例如残基93处的缬氨酸)；99(例如残基99处的异亮氨酸)、114(例如残基114处的苯丙氨酸)；144(例如残基144处的赖氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸)；148(例如残基148处的赖氨酸)；152(例如残基152处的苏氨酸)；195(例如残基195处的甘氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、精氨酸或缬氨酸)；196(例如残基196处的脯氨酸)；199(例如残基199处的半胱氨酸)；211(例如残基211处的甲硫氨酸、组氨酸、苏氨酸、半胱氨酸或异亮氨酸)；213(例如残基213处的谷氨酸)；221(例如残基221处的异亮氨酸)；286(例如残基286处的丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸或丝氨酸)；384(例如残基384处的色氨酸、赖氨酸或酪氨酸)；426(例如残基426处的甘氨酸)；438(例如残基438处的组氨酸或甲硫氨酸)；或466(例如残基466处的缬氨酸)。参见实施例3。

在一些实施方案中，UGT91D2e变体包含沉默突变。例如，在一些实施方案中，UGT91D2e变体在不限于残基130、残基201或残基221的残基中包含沉默突变。参见实施例3。

在一些实施方案中，不限于UGT91D2e V286C(SEQ ID NO：1)、UGT91D2e G384W(SEQID NO：2)、UGT91D2e L195V(SEQ ID NO：197)、UGT91D2e V286S(SEQ ID NO：198)、UGT91D2eT144K P201P(SEQ ID NO：202)、UGT91D2e L211T I130I(SEQ ID NO：184)、UGT91D2e S11FV286S(SEQ ID NO：211)和UGT91D2e E438M(SEQ ID NO：214)的UGT91D2e变体对甜茶苷具有选择性，优先积累1，2-甜菊苷。在一些实施方案中，不限于UGTD1D2e P93V M152G(SEQ IDNO：200)、UGT91D2e S99I(SEQ ID NO：201)、UGT91D2e T144L(SEQ ID NO：203)、UGT91D2eA148K L221I(SEQ ID NO：205)和UGT91D2e G384K(SEQ ID NO：212)的UGT91D2e变体对RebA具有选择性，优先积累RebD。在一些实施方案中，不限于在残基211处具有突变的UGT91D2e变体(例如，SEQ ID NO：118的UGT91D2e L211M)的UGT91D2e变体催化甜茶苷转化为1，2-甜菊苷以及RebA转化为RebD，优先积累1，2-甜菊苷。参见实施例3以及表2和3。

在一些实施方案中，适合于在重组宿主中生产甜菊醇糖苷例如RebA、RebD、甜茶苷和/或1，2-甜菊苷的多肽包括UGT91D2e-b-EUGT11嵌合酶，例如Chim_3(SEQ ID NO：17)或Chim_7(SEQ ID NO：18)。参见实施例4和表5。

在一些实施方案中，与EUGT11和UGT91D2e相比，Chim_7(SEQ ID NO：18)更有效地将甜茶苷转化为1，2-甜菊苷。在一些实施方案中，Chim_7(SEQ ID NO：18)完全消耗供应量的甜茶苷。在一些实施方案中，与UGT91D2e-b(SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13)相比，Chim_7(SEQ ID NO：18)表现出高1.75倍的对于RebA的活性。在一些实施方案中，Chim_3(SEQ IDNO：17)选择性地将甜茶苷转化为1，2-甜菊苷。参见实施例4和表5。

在一些实施方案中，使用UGT91D2e-b-EUGT11嵌合酶生产甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体，所述UGT91D2e-b-EUGT11嵌合酶为例如Chim_2(SEQ ID NO：122)；Chim_4(SEQ IDNO：124)；Chim_5(SEQ ID NO：125)；Chim_6(SEQ ID NO：126)；Chim_7(SEQ ID NO：18)；Chim_8(SEQ ID NO：128)；Chim_9(SEQ ID NO：129)；Chim_10(SEQ ID NO：130)；Chim_11(SEQ ID NO：131)；Chim_12(SEQ ID NO：132)；Chim_13(SEQ ID NO：133)；Chim_14(SEQ IDNO：134)。

在一些实施方案中，有用的UGT85C2同源物可在残基21、48、49、84、86、87、91、92、95、122、304和334处具有一个或更多个氨基酸替换。参见表7。有用的UGT85C2同源物的非限制性实例包括在以下残基处具有替换(相对于SEQ ID NO：7)的多肽：残基21(例如残基21处的赖氨酸、苏氨酸或缬氨酸)、48(例如残基48处的丝氨酸、组氨酸、酪氨酸、精氨酸、谷氨酰胺或色氨酸)、49(例如残基49处的缬氨酸)、84(例如残基84处的甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、缬氨酸或天冬酰胺)、86(例如残基86处的精氨酸或甘氨酸)；87(例如残基87处的组氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸或酪氨酸)；91(例如残基91处的赖氨酸、精氨酸或苏氨酸)；92(例如残基92处的苯丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或赖氨酸)；122(例如残基122处的丝氨酸)；304(例如残基304处的丝氨酸)；和334(例如残基334处的丝氨酸或甲硫氨酸)。参见SEQ ID NO：127和147-180，表7A是相对于甜菊醇的转化优先催化19-SMG之转化所分析的UGT85C2变体，表7B是相对于19-SMG的转化优先催化甜菊醇之转化的UGT85C2变体，并且表7C是催化19-SMG和甜菊醇转化的另外UGT85C2变体。另参见实施例5。

在一些实施方案中，包含以下重组基因的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株积累对映贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)、对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、19-SMG、甜菊醇、甜菊醇+2Glc(#23)和甜菊醇+3Glc(#34)，但是不积累对映贝壳杉烯醇糖苷，所述重组基因为：编码聚球藻属(Synechococcus sp.)GGPPS多肽(SEQ ID NO：19、SEQID NO：20)的重组基因、编码截短的玉蜀黍(Z.mays)CDPS多肽(SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40)的重组基因、编码拟南芥(A.thaliana)KS多肽(SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52)的重组基因、编码重组甜菊(S.rebaudiana)KO多肽(SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60)的重组基因、编码拟南芥ATR2多肽(SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92)的重组基因、编码水稻(O.sativa)EUGT11多肽(SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16)的重组基因、编码SrKAHe1多肽(SEQ IDNO：93、SEQ ID NO：94)的重组基因、编码甜菊(S.rebaudiana)CPR8多肽(SEQ ID NO：85、SEQID NO：86)的重组基因、编码甜菊UGT74G1多肽(SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4)的重组基因、编码甜菊UGT76G1多肽(SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9)的重组基因、编码甜菊UGT91D2e多肽(SEQID NO：10、SEQ ID NO：11)的重组基因、由SEQ ID NO：67所示的核苷酸序列(对应于SEQ IDNO：117所示的氨基酸序列)编码的重组KO基因，以及编码(SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78)的重组CPR1基因。参见实施例6和图4A-4C。

在一些实施方案中，与甜菊醇相比，UGT85C2的S84V F48S、F48H、F48Y、F48R、F48Q、F48T、F48S、I49V、P86R、P86G和F122S变体对19-SMG具有选择性(表7A)。在一些实施方案中，与19-SMG相比，UGT85C2的S84T、I87M I87P、I87Y、L91K、L91R、L91T、L92M和I95K变体对甜菊醇具有选择性(表7B)。在一些实施方案中，与不表达UGT85C2T304S(SEQ ID NO：127)的甜菊醇糖苷生产宿主相比，在甜菊醇糖苷生产宿主中UGT85C2T304S(SEQ ID NO：127)的表达增加甜菊醇糖苷的积累。参见实施例5。

在一些实施方案中，包含UGT85C2或UGT85C2变体的细胞裂解物表现出对于甜菊醇或19-SMG底物的偏好(preference)。在一些方面，使用甜菊醇作为底物，F48H、F48Y、F48T、I49V、S84A和L92F UGT85C2变体在低于40分钟的孵育期期间表现出高活性，F48H、F48Y、F48T和I49V UGT85C2变体在高于40分钟的孵育期期间表现出高活性(表8A)。使用19-SMG作为底物，F48H、F48Y、F48T、I49V和S84A UGT85C2变体在低于40分钟的孵育期期间表现出高活性，F48H、I49V、S84A、S84V、L91K和L92F UGT85C2变体以及野生型UGT85C2在高于40分钟的孵育期期间表现出高活性(表8B)。在一些方面，L91K、L91R和L92F UGT85C2变体表现出高的13-SMG/甜茶苷比例，而F48Y、F48T、P86G UGT85C2变体表现出低的13-SMG/甜茶苷比例。参见实施例7。

在一些实施方案中，有用的UGT76G1同源物可在残基23、26、55、146、257、283和337处具有一个或更多个氨基酸替换。参见实施例4。有用的UGT76G1同源物的非限制性实例包括在以下残基处具有替换(相对于SEQ ID NO：9)的多肽：残基21(例如残基21处的赖氨酸、苏氨酸或缬氨酸)，残基23(例如残基23处的组氨酸)；残基26(例如残基26处的色氨酸)；残基55(例如残基55处的赖氨酸)；残基146(例如残基146处的甘氨酸)；残基257(例如残基257处的甘氨酸)；残基283(例如残基283处的天冬酰胺)；和残基337(例如残基337处的脯氨酸)。参见SEQ ID NO：181-190。参见表9以及实施例8和9。

在一些实施方案中，与甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株中野生型UGT76G1(SEQ IDNO：9)的表达相比，增加甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株中RebD或RebM之积累的UGT76G1变体的表达(参见WO 2014/122227，其通过引用整体并入)改变了13-SMG、1，2-二糖苷、甜茶苷、RebA、RebB、RebD、RebE、RebM、RebG(1，3-甜菊苷)、甜菊醇+3Glc(#1)、甜菊醇+4Glc(#26)、甜菊醇+5Glc(#22)、甜菊醇+5Glc(#24)、甜菊醇+5Glc(#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1)和甜菊醇+6Glc(#23)的积累。参见图6、10、11D和11E以及实施例8和9。

在一些实施方案中，增加酿酒酵母中RebD水平的UGT变体的表达还导致甜菊醇+5Glc(#22)、1，2-甜菊苷、甜菊醇+6Glc(异构体1)和甜菊醇+3Glc(#1)的积累增加，但是甜菊醇+4Glc(#26)、甜菊醇+5Glc(#24)和RebG(1，3-甜菊苷)的积累减少。在一些实施方案中，UGT76G1H155L(SEQ ID NO：184)的表达导致甜菊醇+5Glc(#25)的积累增加，但是1，2-甜菊苷、甜菊醇+3Glc(#1)、甜菊醇+4Glc(#26)、甜菊醇+5Glc(#22)、甜菊醇+6Glc(异构体1)和甜菊醇+6Glc(#23)的积累减少。在一些实施方案中，UGT76G1S253W(SEQ ID NO：186)的表达导致1，2-甜菊苷和甜菊醇+6Glc(异构体1)的积累减少。在一些实施方案中，UGT76G1284G的表达导致1，2-甜菊苷和甜菊醇+6Glc(异构体1)的积累增加，但是RebG、甜菊醇+4Glc(#26)、甜菊醇+5Glc(#25)和甜菊醇+6Glc(#23)的积累减少。参见图10和实施例8。

在一些实施方案中，UGT76G1 Q23H(SEQ ID NO：181)、UGT76G1 I26W(SEQ ID NO：182)、UGT76G1 T146G(SEQ ID NO：183)、UGT76G1 H155L(SEQ ID NO：184)、UGT76G1 L257G(SEQ ID NO：185)和UGT76G1 S283N(SEQ ID NO：188)的表达减少了甜菊醇+4Glc(#26)的积累。在一些实施方案中，与表达野生型UGT76G1的对照菌株相比，UGT76G1 Q23H(SEQ ID NO：181)、UGT76G1 I26W(SEQ ID NO：182)、UGT76G1 T146G(SEQ ID NO：183)、UGT76G1 L257G(SEQ ID NO：185)或UGT76G1 S283N(SEQ ID NO：188)(其均提高RebD的产生)的表达减少了甜菊醇+5Glc(#25)的积累。在一些实施方案中，提高RebM生产的UGT76G1 H155L(SEQ IDNO：184)的表达增加了甜菊醇+5Glc(#25)的积累。参见图11D和实施例8。

在一些实施方案中，与表达野生型UGT76G1的对照菌株相比，UGT76G1 Q23H(SEQID NO：181)、UGT76G1 I26W(SEQ ID NO：182)、UGT76G1 T146G(SEQ ID NO：183)、UGT76G1L257G(SEQ ID NO：185)或UGT76G1 S283N(SEQ ID NO：188)的表达增加了甜菊醇+6Glc(#23)的积累。在一些实施方案中，UGT76G1 H155L(SEQ ID NO：184)的表达减少了甜菊醇+6Glc(#23)的积累。在一些实施方案中，与表达野生型UGT76G1的对照菌株相比，UGT76G1Q23H(SEQ ID NO：181)、UGT76G1 I26W(SEQ ID NO：182)、UGT76G1 T146G(SEQ ID NO：183)、UGT76G1 L257G(SEQ ID NO：185)或UGT76G1 S283N(SEQ ID NO：188)的表达增加了甜菊醇+7Glc(异构体2)的积累。在一些实施方案中，UGT76G1 H155L(SEQ ID NO：184)的表达减少了甜菊醇+7Glc(异构体2)的积累。在一些实施方案中，UGT76G1 Q23H(SEQ ID NO：181)、UGT76G1 I26W(SEQ ID NO：182)、UGT76G1 T146G(SEQ ID NO：183)、UGT76G1 L257G(SEQ IDNO：185)或UGT76G1 S283N(SEQ ID NO：188)的表达增加了甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累。参见图11D和实施例8。

在一些实施方案中，相对于不表达编码UGT变体或UGT嵌合多肽的基因的宿主，表达编码UGT变体或UGT嵌合多肽的基因的宿主产生提高水平的糖基化的对映贝壳杉烯酸和/或糖基化的对映贝壳杉烯醇。在一些实施方案中，UGT变体或UGT嵌合多肽包含UGT91D2e变体、编码UGT91D2e-b-EUGT11嵌合多肽的基因、编码UGT85C2变体的基因和/或编码UGT76G1变体的基因。

在一些实施方案中，相对于不表达编码UGT变体或UGT嵌合多肽的基因的宿主，表达编码UGT变体或UGT嵌合多肽的基因的宿主产生降低水平的糖基化的对映贝壳杉烯酸和/或糖基化的对映贝壳杉烯醇。在一些实施方案中，UGT变体或UGT嵌合多肽包含UGT91D2e变体、编码UGT91D2e-b-EUGT11嵌合多肽的基因、编码UGT85C2变体的基因和/或编码UGT76G1变体的基因。

在一些实施方案中，与表达UGT76G1 Q23H(SEQ ID NO：181)、UGT76G1 I26W(SEQID NO：182)、UGT76G1 T146G(SEQ ID NO：183)、UGT76G1 H155L(SEQ ID NO：184)、UGT76G1L257G(SEQ ID NO：185)、UGT76G1 S253W(SEQ ID NO：186)、UGT76G1 T284G(SEQ ID NO：187)、UGT76G1 S283N(SEQ ID NO：188)、UGT76G1 K337P(SEQ ID NO：189)或UGT76G1 T55K(SEQ ID NO：190)的酿酒酵母菌株相比，表达野生型UGT76G1(SEQ ID NO：9)的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株中对映贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)、对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、对映贝壳杉烯醇+2Glc(#8)和与对映贝壳杉烯醇+3Glc(#6)共洗脱的对映贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1)的水平改变。参见图9、图11A-11C和实施例8。

在一些实施方案中，与表达野生型UGT76G1的酿酒酵母菌株相比，表达提高RebD水平的UGT76G1变体的酿酒酵母菌株还增加对映贝壳杉烯酸+2Glc(#7)和对映贝壳杉烯酸+2Glc(异构体1)的积累，但是减少对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)的积累。在一些实施方案中，提高RebD水平的UGT76G1变体还增加对映贝壳杉烯醇+2Glc(#8)的积累，但是减少与对映贝壳杉烯醇+3Glc(#6)共洗脱的对映贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1)的积累。在一些实施方案中，提高RebM水平的变体UGT76G1 H155L(SEQ ID NO：184)的表达减少对映贝壳杉烯酸+2Glc(#7)和映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)的积累。参见图9和实施例8。

在一些实施方案中，在表达UGT76G1 Q23H(SEQ ID NO：181)、UGT76G1 I26W(SEQID NO：182)和UGT L257G(SEQ ID NO：185)的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株中，糖基化的对映贝壳杉烯酸(对映贝壳杉烯酸+2Glc(#7)+对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)+对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2))的总水平提高。在一些实施方案中，在表达UGT76G1 Q23H(SEQ IDNO：181)、UGT76G1 I26W(SEQ ID NO：182)和UGT T146G(SEQ ID NO：183)的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株中，糖基化的对映贝壳杉烯醇(与对映贝壳杉烯醇+3Glc(#6)共洗脱的对映贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1)以及对映贝壳杉烯醇+2Glc(#8))的总水平改变。参见图11b和11C以及实施例8。

在一些实施方案中，不限于UGT76G1、UGT85C2和/或UGT91D2e变体的UGT变体改变了在体外、宿主体内和/或通过全细胞生物转化生产的甜菊醇糖苷与生产的GlcNAc化合物及其异构体的比例。示例性的GlcNAc结构包括对映贝壳杉烯酸+2Glc+1GlcNAc和甜菊醇+4Glc+1GlcNAc(#11)。参见例如图7A、7D、8G-8I和8AC-8AF以及实施例6、8和9。

在一些实施方案中，在体内、体外或通过全细胞生物转化生产的甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体组合物包含比特别是来自甜菊植物的甜菊提取物更少的污染物或更少的任何特定污染物。污染物可以包括有助于异味的植物来源的化合物。潜在污染物包括色素、脂质、蛋白质、酚类、糖类、脂肪醇和其他倍半萜、劳丹烷二萜(labdane diterpene)、单萜、癸酸、8，11，14-二十碳三烯酸、2-甲基十八烷、二十五烷、二十八烷、二十四烷、十八烷醇、豆固醇、β谷固醇、α-香树素(amyrin)和β-香树素、羽扇豆醇、β香树素乙酸酯、五环三萜类、centauredin、槲皮素(quercitin)、表-α-杜松醇(epi-alpha-cadinol)、丁香烯(carophyllene)和衍生物、β-蒎烯、β-谷固醇和赤霉素。

如本文使用的术语“可检测的量”、“可检测浓度”、“可测量的量”和“可测量的浓度”是指以曲线下面积(AUC)、μM/OD₆₀₀、mg/L、μM或mM测量的甜菊醇糖苷水平。可以通过本领域技术人员通常可获得的技术检测和/或分析甜菊醇糖苷产量(即总的、上清液和/或细胞内甜菊醇糖苷水平)，例如但不限于：液相色谱-质谱法(liquid chromatography-massspectrometry，LC-MS)、薄层色谱法(thin layer chromatography，TLC)、高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography，HPLC)、紫外-可见光谱/分光光度法(ultraviolet-visible spectroscopy/spectrophotometry，UV-Vis)、质谱法(massspectrometry，MS)和核磁共振光谱法(nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR)。

如本文使用的术语“不可检测的浓度”是指太低而无法通过例如TLC、HPLC、UV-Vis、MS或NMR的技术测量和/或分析的化合物水平。在一些实施方案中，“不可检测的浓度”的化合物不存在于甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体组合物中。

如本文使用的术语“或”和“和/或”用于描述多种成分的组合或彼此排除。例如，“x、y和/或z”可以单独指“x”，单独指“y”，单独指“z”，“x、y和z”，“(x和y)或z”，“x或(y和z)”或“x或y或z”。在一些实施方案中，“和/或”用于指重组细胞包含的外源核酸，其中重组细胞包含选自一组的一种或更多种外源核酸。在一些实施方案中，“和/或”用于指甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体的生产。在一些实施方案中，“和/或”用于指甜菊醇糖苷的生产，其中生产一种或更多种甜菊醇糖苷。在一些实施方案中，“和/或”用于指甜菊醇糖苷的生产，其中通过以下步骤中的一个或更多个生产一种或更多种甜菊醇糖苷：培养重组微生物，在重组微生物中合成一种或更多种甜菊醇糖苷，和/或分离一种或更多种甜菊醇糖苷。

功能同源物

上述多肽的功能同源物也适用于在重组宿主中生产甜菊醇糖苷。功能同源物是与参照多肽具有序列相似性并且执行参照多肽的一种或更多种生化或生理功能的多肽。功能同源物和参照多肽可以是天然存在的多肽，并且序列相似性可以归因于收敛或发散的演化事件。因此，功能同源物有时在文献中指定为同源物、或直系同源物或旁系同源物。天然存在的功能同源物的变体(例如由野生型编码序列的突变体编码的多肽)本身可以是功能同源物。还可以通过对多肽编码序列的定点诱变，或通过组合来自不同天然存在多肽的编码序列的结构域(“域交换”)来产生功能同源物。用于修饰编码本文所述功能性多肽之基因的技术是已知的，并且尤其包括定向演化技术，定点诱变技术和随机诱变技术，并且可用于增加多肽的比活性、改变底物特异性、改变表达水平、改变亚细胞定位或以期望的方式修饰多肽-多肽相互作用。这种经修饰的多肽被认为是功能同源物。术语“功能同源物”有时应用于编码功能同源多肽的核酸。

功能同源物可以通过分析核苷酸和多肽序列比对来鉴定。例如，对核苷酸或多肽序列的数据库进行查询可以鉴定甜菊醇糖苷生物合成多肽的同源物。序列分析可以涉及使用UGT氨基酸序列作为参照序列的非冗余数据库的BLAST、交互BLAST或PSI-BLAST分析。在某些情况下，氨基酸序列是从核苷酸序列推导的。数据库中那些具有大于40％序列同一性的多肽是进一步评估其作为甜菊醇糖苷生物合成多肽的适用性的候选物。氨基酸序列相似性允许进行保守氨基酸替换，例如以一个疏水性残基替换另一个疏水性残基，或以一个极性残基替换另一个极性残基。如果需要，可以对这些候选物进行手动检查，以缩小待进一步评估的候选物数目。可以通过选择那些似乎具有存在于甜菊醇糖苷生物合成多肽中的结构域(例如保守功能结构域)的候选物来进行手动检查。在一些实施方案中，从转录组数据中基于表达水平而不是通过使用BLAST分析来鉴定核酸和多肽。

可以通过在甜菊醇糖苷生物合成多肽的一级氨基酸序列内定位这样的区域来鉴定保守区，所述区域为重复序列、形成一些二级结构(例如螺旋和β片层)、建立带正电或带负电的结构域、或代表蛋白质基序或结构域。参见例如在万维网上描述多种蛋白质基序和结构域的共有序列的Pfam网站，sanger.ac.uk/Software/Pfam/和pfam.janelia.org/。包括在Pfam数据库中的信息在Sonnhammer等，Nucl.Acids Res.，26：320-322(1998)；Sonnhammer等，Proteins，28：405-420(1997)；和Bateman等，Nucl.Acids Res.，27：260-262(1999)中描述。保守区也可以通过对来自密切相关物种的相同或相关多肽的序列进行比对来确定。密切相关的物种优选来自同一科。在一些实施方案中，对来自两种不同物种的序列比对足以鉴定此类同源物。

通常，表现出至少约40％氨基酸序列同一性的多肽可用于鉴定保守区。相关多肽的保守区表现出至少45％的氨基酸序列同一性(例如至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，或至少90％的氨基酸序列同一性)。在一些实施方案中，保守区表现出至少92％、94％、96％、98％或99％的氨基酸序列同一性。

例如，适用于在重组宿主中产生甜菊醇的多肽包括UGT的功能同源物。

对例如UGT的底物特异性进行修饰的方法是本领域技术人员已知的，其包括但不限于定点/合理诱变方法、随机定向演化方法和其中在酶的活性位点附近进行随机诱变/饱和技术的组合。例如参见Osmani等，2009，Phytochemistry70：325-347。

候选序列通常具有参照序列长度的80％至200％的长度，例如82、85、87、89、90、93、95、97、99、100、105、110、115、120、130、140、150、160、170、180、190或200％的参照序列长度。功能同源物多肽通常具有参照序列长度的95％至105％的长度，例如90、93、95、97、99、100、105、110、115或120％的参照序列长度，或其间的任何范围。任何候选核酸或多肽相对于参照核酸或多肽的％同一性可以如下确定。使用计算机程序Clustal Omega(版本1.2.1，默认参数)将参照序列(例如，本文所述的核酸序列或氨基酸序列)与一个或更多个候选序列比对，所述程序允许对核酸或多肽序列的全长进行比对(全局比对)。Chenna等，2003，Nucleic Acids Res.31(13)：3497-500。

Clustal Omega计算参照序列与一个或更多个候选序列之间的最佳匹配，并对其进行比对，以使得可以确定同一性、相似性和差异度。可以将一个或更多个残基的空位***参照序列、候选序列或两者中，以使序列比对最大化。对于核酸序列的快速成对比对，使用以下默认参数：字体大小：2；窗口大小：4；评分方法：％年龄；顶对角线数：4；空位罚分：5。对于核酸序列的多重比对，使用以下参数：空位开放罚分：10.0；空位延伸罚分：5.0；权重转换：是。对于蛋白质序列的快速成对比对，使用以下参数：字体大小：1；窗口大小：5；评分方法：％年龄；顶对角线数：5；空位罚分：3。对于蛋白质序列的多重比对，使用以下参数：权重矩阵：blosum；空位开放罚分：10.0；空位延伸罚分：0.05；亲水性空位：开；亲水性残基：Gly，Pro，Ser，Asn，Asp，Gln，Glu，Arg和Lys；残基特异性空位罚分：开。Clustal Omega输出的是反映序列之间关系的序列比对。可以例如在万维网上的Baylor College of MedicineSearch Launcher网站(searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html)和欧洲生物信息学研究所网站(http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/.)上运行Clustal Omega。

为了确定候选核酸或氨基酸序列与参照序列的同一性％，使用Clustal Omega比对序列，将比对中的相同匹配数除以参照序列的长度，并将结果乘以100。应注意的是，同一性％值可以四舍五入到最接近的十分位。例如，78.11、78.12、78.13和78.14被四舍五入到78.1，而78.15、78.16、78.17、78.18和78.19被四舍五入到78.2。

将理解，功能性UGT蛋白质可以包括不参与由酶进行的酶促活性的其他氨基酸。在一些实施方案中，UGT蛋白是融合蛋白。术语“嵌合体”、“融合多肽”、“融合蛋白”、“融合酶”、“融合构建体”、“嵌合蛋白”、“嵌合多肽”、“嵌合构建体”和“嵌合酶”在本文中可互换使用，指通过连接编码不同蛋白质的两个或更多个基因而工程化改造的蛋白质。在一些实施方案中，编码UGT多肽的核酸序列可以包含标签序列，其编码设计成用于辅助所编码的多肽的后续操作(例如，辅助纯化或检测)、分泌或定位的“标签”。标签序列可***编码多肽的核酸序列中，以使得所编码的标签位于多肽的羧基或氨基末端。所编码标签的非限制性实例包括绿色荧光蛋白(GFP)、人流感血凝素(HA)、谷胱甘肽S转移酶(GST)、多组氨酸标签(HIS标签)和Flag^TM标签(Kodak，New Haven，CT)。标签的其他实例包括叶绿体转运肽、线粒体转运肽、淀粉体肽、信号肽或分泌标签。

在一些实施方案中，融合蛋白是通过域交换改变的蛋白质。如本文使用的术语“域交换”用于描述用第二蛋白质的结构域替换第一蛋白质的结构域的过程。在一些实施方案中，第一蛋白质的结构域和第二蛋白质的结构域在功能上是相同的或功能上相似的。在一些实施方案中，第二蛋白质结构域的结构和/或序列与第一蛋白质结构域的结构和/或序列不同。在一些实施方案中，通过域交换改变UGT多肽。

甜菊醇和甜菊醇糖苷生物合成核酸

编码本文所述的多肽的重组基因包含所述多肽的编码序列，该序列与适合表达所述多肽之一个或更多个调控区按照有义方向有效连接。因为许多微生物能够由多顺反子mRNA表达多种基因产物，因此如果期望的话，可以在这些微生物的单一调控区的控制下表达多个多肽。当调控区和编码序列被定位成使得调控区能够有效地调节所述序列的转录或翻译时，认为该编码序列和调控区有效连接。通常来说，对于单顺反子基因，编码序列的翻译阅读框的翻译起始位点位于调控区下游1到约50个核苷酸之间。

在许多情况下，本文所述的多肽之编码序列是在重组宿主以外的物种中鉴定到的，即编码序列是异源核酸。因此，如果重组宿主是微生物，则编码序列可以来自其它原核或真核微生物、植物或动物。然而在一些情况下，编码序列是宿主先天具有的且被重新引入该生物体的序列。天然序列(native sequence)与天然存在的序列(naturally occurringsequence)的区别通常在于存在与外源核酸连接的非天然序列，例如例如位于重组核酸构建体中天然序列侧翼的非天然调节序列。此外，稳定转化的外源核酸通常整合到发现天然序列的位置之外的位置。“调控区”是指含有影响转录或翻译的起始和速率、以及转录或翻译产物的稳定性和/或移动性之核苷酸序列的核酸。调控区包括但不限于，启动子序列、增强子序列、反应元件、蛋白质识别位点、诱导型元件、蛋白质结合序列、5’和3’非翻译区(UTR)、转录起始位点、终止序列、多腺苷酸化序列、内含子、及其组合。调控区通常包含至少一个核心(基本)启动子。调控区还可以包含至少一个控制元件，例如增强子序列、上游元件或者上游激活区(upstream activation region，UAR)。通过将调控区与编码序列定位成使得调控区有效地调节序列的转录或翻译来使得调控区与编码序列有效连接。例如，为了有效连接编码序列和启动子序列，编码序列的翻译阅读框的翻译起始位点通常定位于启动子下游的1到约50个核苷酸之间。但调控区也可能被定位在翻译起始位点上游多达约5000个核苷酸或者转录起始位点上游约2000核苷酸的位置。

对要包含的调控区的选择取决于几个因素，包括但不限于效率、可选择性、可诱导性、期望的表达水平，以及在某些培养阶段期间优先表达。对于本领域技术人员而言，通过对于编码序列适当选择并定位调控区来调整编码序列的表达是常规手段。应理解可能存在多于一个调控区，例如内含子、增强子、上游激活区、转录终止子和诱导型元件。

可以将一个或更多个基因以“模块(modules)”组合在重组核酸构建体中，所述模块可用于甜菊醇和/或甜菊醇糖苷生产的一个独立方面。以模块组合多个基因，特别是多顺反子模块，便于在多种物种中使用所述模块。例如，可以以多顺反子模块组合甜菊醇生物合成基因簇或者UGT基因簇，从而使得在***合适的调控区后，可以将模块引入众多的物种中。作为另一个实例，可以将UGT基因簇组合，以使得每个UGT编码序列有效连接独立的调控区从而形成UGT模块。这样的模块可以用在那些必须或者期望单顺反子表达的物种中。除了对甜菊醇或甜菊醇糖苷生产有用的基因以外，重组构建体通常还含有复制起点和使构建体保持在合适的物种中的一个或更多个可选择标志物。

应理解，由于遗传密码的简并性，许多核酸可以编码特定多肽，即对于许多氨基酸，有多于一个核苷酸三联体充当该氨基酸的密码子。因此，使用针对宿主(例如，微生物)的合适密码子偏向性表格，可以将给定多肽的编码序列中的密码子进行修饰，从而获得在所述特定宿主中的最佳表达。作为经分离的核酸，这些经修饰的序列可以作为经纯化分子存在，也可以整合到载体或病毒中用于构建重组核酸构建体的模块。

在一些情况下，期望抑制内源多肽的一种或更多种功能，以将代谢中间体转向甜菊醇或甜菊醇糖苷生物合成。例如，可能期望下调酵母菌株中固醇的合成，以例如通过下调角鲨烯环氧酶来进一步增加甜菊醇或甜菊醇糖苷的产量。作为另一个实例，可能需要抑制某些内源基因产物(例如，从次级代谢物中除去葡萄糖部分的糖基水解酶或如本文所讨论的磷酸酶)的降解功能。在这种情况下，可以在转化入菌株的重组构建体中包括过表达所述多肽或基因产物的核酸。或者，可使用诱变来生成期望增加或增强其功能的基因的突变体。

宿主微生物

重组宿主可用于表达生产甜菊醇糖苷的多肽。许多原核生物和真核生物适合用于构建本文所述的重组微生物，例如革兰氏阴性细菌、真菌(即酵母)、哺乳动物、昆虫、植物和藻类细胞。首先分析选择用作甜菊醇糖苷生产菌株的物种和菌株，以确定哪些生产基因对于菌株是内源的，哪些基因不存在。对于其内源对应物不存在于菌株中的基因，其有利地装配在一个或更多个重组构建体中，然后将其转化入菌株以提供丧失的功能。

通常，使重组微生物在发酵罐中在一定温度下生长一段时间，其中所述温度和一段时间有利于甜菊醇糖苷的生产。本发明提供的经构建和经遗传改造的微生物可以使用常规发酵方法培养，尤其包括恒化器、分批、补料分批培养、半连续发酵如吸取和填充、连续灌注发酵和连续灌注细胞培养。根据该方法中使用的特定微生物，也可以存在和表达其他重组基因，例如异戊烯基生物合成基因和萜合酶和环化酶基因。可以通过从培养基中提取样品以根据公开的方法进行分析来确定底物和中间体(例如，异戊烯基二磷酸、二磷酸二甲基烯丙酯、GGPP、对映贝壳杉烯和对映贝壳杉烯酸)的水平。

本方法中使用的碳源包括可以被重组宿主细胞代谢以促进生长和/或甜菊醇糖苷生产的任何分子。合适的碳源的实例包括但不限于蔗糖(例如，如在糖蜜(molasse)中发现的)、果糖、木糖、乙醇、甘油、葡萄糖、纤维素、淀粉、纤维二糖或其他含葡萄糖的聚合物。例如在使用酵母作为宿主的实施方案中，碳源如蔗糖、果糖、木糖、乙醇、甘油和葡萄糖是合适的。碳源可以在整个培养期间提供给宿主生物体，或者替选地，生物体可以在另一种能量源(例如蛋白质)的存在下生长一段时间，然后仅在补料分批阶段期间提供碳源。

在重组微生物在培养物中已经生长一段时间(其中所述温度和一段时间有利于甜菊醇糖苷的生产)后，可以使用本领域已知的多种技术从培养物中回收甜菊醇和/或一种或更多种甜菊醇糖苷。在一些实施方案中，可以加入透化剂以帮助原料进入宿主和产物离开。例如，可以将培养的微生物的粗裂解物离心以获得上清液。然后可将所得上清液施加到色谱柱例如C-18柱上，并用水洗涤以除去亲水性化合物，随后用溶剂如甲醇洗脱目标化合物。然后可以通过制备型HPLC进一步纯化化合物。也参见，WO 2009/140394。

应理解，本文所讨论的多种基因和模块可以存在于两个或更多个重组宿主中，而不是单个宿主中。当使用多种重组宿主时，它们可以在混合培养物中生长以积累甜菊醇和/或甜菊醇糖苷。

或者，两种或更多种宿主各自可在单独的培养基中生长，并且可以将第一培养基的产物(例如甜菊醇)引入第二培养基中以转化为随后的中间体或最终产物(例如RebA)。然后回收由第二或最终宿主生产的产物。还将理解，在一些实施方案中，使用除培养基之外的营养源并利用除发酵罐之外的***来培养重组宿主。

示例性的原核和真核物种在下文更详细地描述。然而，应理解，其他物种也是合适的。例如，合适的物种可以是这样的属，例如伞菌属(Agaricus)、曲霉属(Aspergillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、念珠菌属(Candida)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、假囊酵母属(Eremothecium)、埃希菌属(Escherichia)、镰孢菌(Fusarium)/赤霉属(Gibberella)、克鲁维酵母属(Kluyveromyce)、硫磺菌属(Laetiporus)、香菇属(Lentinus)、红发夫酵母属(Phaffia)、平革菌属(Phanerochaete)、毕赤酵母属(Pichia)、藓属(Physcomitrella)、红酵母属(Rhodoturula)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、痂圆孢属(Sphaceloma)、红发夫酵母属(Xanthophyllomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)。来自这些属的示例性物种包括虎皮香菇(Lentinus tigrinus)、硫磺菌(Laetiporussulphureus)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、产朊假丝酵母(Cyberlindnera jadinii)、小立碗藓(Physcomitrellapatens)、粘红酵母(Rhodoturula glutinis)、胶红酵母(Rhodoturula mucilaginosa)、红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)、红发夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)、藤仓镰刀菌(Fusarium fujikuroi)/腾仓赤霉(Gibberella fujikuroi)、产朊假丝酵母(Candidautilis)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、白色念珠菌和解脂耶氏酵母。

在一些实施方案中，微生物可以是原核生物如埃希氏菌属(Escherichia)细菌细胞，例如大肠杆菌(Escherichia coli)细胞；乳杆菌属(Lactobacillus)细菌细胞；乳球菌属(Lactococcus)细菌细胞；棒状杆菌属(Cornebacterium)细菌细胞；醋杆菌属(Acetobacter)细菌细胞；不动杆菌属(Acinetobacter)细菌细胞或假单胞菌属(Pseudomonas)细菌细胞。

在一些实施方案中，微生物可以是子囊菌(Ascomycete)，例如腾仓赤霉、乳酸克鲁维酵母、粟酒裂殖酵母、黑曲霉、解脂耶氏酵母、棉阿舒囊霉或酿酒酵母。

在一些实施方案中，微生物可以是藻类细胞、例如三孢布拉氏霉菌(Blakesleatrispora)、杜氏盐藻(Dunaliella salina)、雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)、小球藻(Chlorella sp.)、裙带菜(Undaria pinnatifida)、马尾藻(Sargassum)、海带(Laminaria japonica)、almeriensis栅藻(Scenedesmus almeriensis)物种。

在一些实施方案中，微生物可以是蓝细菌细胞，例如三孢布拉氏霉菌、杜氏盐藻、雨生红球藻、小球藻、裙带菜、马尾藻、海带、almeriensis栅藻。

酵母属

酵母是合成生物学中广泛使用的经典生物体，并且可以用作重组微生物平台。例如，存在可用于酿酒酵母的突变体、质粒、代谢的详细计算机模型和其他信息的文库，允许各种模块的合理设计以提高产物产量。用于制备重组微生物的方法是已知的。

曲霉属

曲霉属物种(例如米曲霉(A.oryzae)、黑曲霉(A.niger)和酱油曲霉(A.sojae))是食品生产中广泛使用的微生物，并且还可用作重组微生物平台。构巢曲霉(A.nidulans)、烟曲霉(A.fumigatus)、米曲霉、棒曲霉(A.clavatus)、黄曲霉(A.flavus)、黑曲霉和土曲霉(A.terreus)的基因组核苷酸序列是均是可获得的，从而允许合理设计和修饰内源途径以提高通量和提高产物产率。已经开发了用于曲霉属的代谢模型，以及转录组学研究和蛋白组学研究。黑曲霉被培养用于工业化生产多种食品成分，例如柠檬酸和葡糖酸，并且因此例如黑曲霉的物种通常适用于生产甜菊醇糖苷。

大肠杆菌

大肠杆菌，合成生物学中另一种广泛使用的平台生物体，也可以用作重组微生物平台。与酵母相似，大肠杆菌拥有可供使用的突变体文库、质粒、代谢的详细计算机模型以及其他信息，从而允许合理设计多种模块以提高产物的产率。可使用与上文针对酵母属所述的那些类似的方法来制备重组大肠杆菌微生物。

伞菌属、赤霉属和平革菌属

伞菌属、赤霉属和平革菌属是可用的，因为已知它们在培养物中生产大量类异戊二烯。因此用于大量生产甜菊醇糖苷的萜前体已由内源基因产生。因此，可将包含甜菊醇糖苷生物合成多肽的重组基因的模块引入来自这些属的物种中，而无需引入甲羟戊酸或MEP途径基因。

Arxula adeninivorans(Blastobotrys adeninivorans)

Arxula adeninivorans是具有独特生化特征的二态酵母(其在高至42℃的温度下生长为类似于面包酵母的出芽酵母，高于该阈值时，其以丝状形式生长)。其可在多种底物上生长，并且可同化硝酸盐。其已成功地应用于产生可以生产天然塑料的菌株或者应用于开发用于环境样品中之***的生物传感器。

解脂耶氏酵母

解脂耶氏酵母是二态酵母(参见Arxula adeninivorans)并且属于半子囊菌科(family Hemiascomycetes)。解脂耶氏酵母的整个基因组是已知的。耶氏酵母属物种是需氧的并且被认为是非致病性的。耶氏酵母在使用疏水性底物(例如烷烃、脂肪酸、油)方面是高效的，并且可以在糖上生长。它具有很高的工业应用潜力，是一种产油微生物。解脂耶氏酵母可以将脂质含量积累到其干细胞重量的约40％，并且是用于脂质积累和再活化的模式生物体。参见例如Nicaud，2012，Yeast 29(10)：409-18；Beopoulos等，2009，Biochimie 91(6)：692-6；Bankar等，2009，Appl Microbiol Biotechnol.84(5)：847-65。

红酵母属(Rhodotorula sp.)

红酵母是单细胞的、含色素的酵母。产油的红酵母，粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)已经显示从粗甘油生产脂质和类胡萝卜素(Saenge等，2011，ProcessBiochemistry 46(1)：210-8)。圆红冬孢酵母(Rhodotorula toruloides)菌株已经显示为用于改善生物质和脂质生产力的高效补料分批发酵***(Li等，2007，Enzyme andMicrobial Technology 41：312-7)

圆红冬孢酵母

圆红冬孢酵母是产油酵母，并且可用于工程化脂质生产途径(参见例如Zhu等，2013，Nature Commun.3：1112；Ageitos等，2011，Applied Microbiology andBiotechnology 90(4)：1219-27)。

博伊丁假丝酵母

博伊丁假丝酵母是甲基营养型酵母(其可在甲醇上生长)。与其他的甲基营养型物种(例如多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)和巴斯德毕赤酵母)类似，博伊丁假丝酵母为生产异源蛋白质提供优异的平台。已报道了分泌型外来蛋白的多克级范围的产率。最近，计算方法IPRO预测了在实验上将博伊丁假丝酵母木糖还原酶的辅因子特异性从NADPH转化至NADH的突变。参见例如Mattanovich等，2012，Methods Mol Biol.824：329-58；Khoury等，2009，Protein Sci.18(10)：2125-38。

多形汉逊酵母(安格斯毕赤酵母，Pichia angusta)

多形汉逊酵母是甲基营养型酵母(参见，博伊丁假丝酵母)。其还可在多种其他底物上生长；其耐热并且可以同化硝酸盐(另参见乳酸克鲁维酵母)。多形汉逊酵母已被应用于生产乙型肝炎疫苗、胰岛素和用于治疗丙型肝炎的干扰素α-2a，还用于一系列技术酶。参见例如Xu等，2014，Virol Sin.29(6)：403-9。

乳酸克鲁维酵母

乳酸克鲁维酵母是常规地应用于生产克非尔(kefir)的酵母。其可在数种糖上生长，最重要的是可在存在于乳和乳清中的乳糖上生长。乳酸克鲁维酵母已被成功地应用于生产凝乳酶(通常存在于牛的胃中的一种酶)等以生产奶酪。生产以40,000L的规模在发酵罐中进行。参见例如van Ooyen等，2006，FEMS Yeast Res.6(3)：381-92。

巴斯德毕赤酵母

巴斯德毕赤酵母是甲基营养型酵母(参见博伊丁假丝酵母和多形汉逊酵母)。巴斯德毕赤酵母为外来蛋白质的生产提供有效的平台。平台元件可作为试剂盒获得并且在世界范围内在学术界中被用于生产蛋白质。已将菌株改造成可生产复杂的人N-多糖(酵母多糖与在人中发现的那些类似但不相同)。参见例如Piirainen等，2014，N Biotechnol.31(6)：532-7。

小立碗藓属(Physcomitrella spp.)

小立碗藓苔藓(Physcomitrella mosse)在悬浮培养物中生长时具有与酵母或其他真菌培养物相似的特征。该属可用于生产可能难以在其他类型的细胞中生产的植物次级代谢物。

甜菊醇糖苷组合物

甜菊醇糖苷在不同的食品***中不一定具有等同的性能。因此，期望其具有将合成引导至所选择的甜菊醇糖苷组合物的能力。本文描述的重组宿主可以生产选择性富集特定甜菊醇糖苷(例如RebD或RebM)并具有一致的味道特性的组合物。如本文使用的术语“富集”用于描述与来自甜菊植物的甜菊醇糖苷组合物(提取物)相比，具有增加的特定甜菊醇糖苷比例的甜菊醇糖苷组合物。因此，本文所述的重组宿主可以促进这样的组合物的生产，所述组合物被调整以满足给定食品所需的甜味特性，并且每批次之间具有一致比例的各甜菊醇糖苷。在一些实施方案中，本文所述的宿主不产生或仅产生减少量的在甜菊提取物中发现的不期望的植物副产物。因此，由本文所述的重组宿主产生的甜菊醇糖苷组合物与源自甜菊植物的组合物是可区分的。

将理解，由本文公开的重组宿主细胞生产的单一甜菊醇糖苷(例如，RebA、RebB、RebD或RebM)的量可以在细胞培养液中积累，为约1至约7,000mg/L，例如，约1至约10mg/L、约3至约10mg/L、约5至约20mg/L、约10至约50mg/L、约10至约100mg/L、约25至约500mg/L、约100至约1,500mg/L、或约200至约1,000mg/L、至少约1,000mg/L、至少约1,200mg/L、至少约至少1,400mg/L、至少约1,600mg/L、至少约1,800mg/L、至少约2,800mg/L、或至少约7,000mg/L。在一些方面中，培养液中由文公开的重组宿主细胞生产的单一甜菊醇糖苷的量可以超过7,000mg/L。

将理解，由本文公开的重组宿主细胞生产的甜菊醇糖苷(例如，RebA、RebB、RebD或RebM)的组合的量可以在细胞培养液中积累，为约1mg/L至约7,000mg/L，例如约200至约1,500、至少约2,000mg/L、至少约3,000mg/L、至少约4,000mg/L、至少约5,000mg/L、至少约6,000mg/L，或至少约7,000mg/L。在一些方面中，由本文公开的重组宿主细胞生产的甜菊醇糖苷的组合的量可以超过7,000mg/L。一般来说，更长的培养时间将导致更大量的产物。因此，重组微生物可以培养1天至7天、1天至5天、3天至5天、约3天、约4天或约5天。

应理解，本文所讨论的多种基因和模块可以存在于两种或更多种重组微生物中，而不是单一微生物中。当使用多种重组微生物时，它们可以在混合培养物中生长以生产甜菊醇和/或甜菊醇糖苷。例如，第一微生物可以包含用于生产甜菊醇糖苷前体的一种或更多种生物合成基因，而第二微生物包含甜菊醇糖苷生物合成基因。然后回收由第二或最终微生物生产的产物。还将理解，在一些实施方案中，使用除培养基之外的营养源并利用除发酵罐之外的***来培养重组微生物。

或者，两种或更多种微生物可各自在单独的培养基中生长，并且第一培养基的产物(例如甜菊醇)可以被引入第二培养基中以转化为随后的中间体，或转化为最终产品(例如RebA)。然后回收由第二或最终微生物生产的产物。还将理解，在一些实施方案中，使用除培养基之外的营养源并利用除发酵罐之外的***来培养重组微生物。

通过本文公开的方法获得的甜菊醇糖苷和组合物可用于制备食品、膳食补充剂和甜味剂组合物。参见例如WO 2011/153378、WO 2013/022989、WO 2014/122227和WO 2014/122328。

例如，基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷(例如RebM或RebD)可以包含在食品中，例如冰淇淋、碳酸饮料、果汁、酸奶、烘焙食品、口香糖、硬糖和软糖和调味汁(sauce)。基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷也可以包含在非食品产品例如药品、医药产品、膳食补充剂和营养补充剂中。基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷也可以包含在用于农业工业和伴侣动物工业的动物饲料产品中。或者，可以通过分别培养重组微生物来制备甜菊醇和/或甜菊醇糖苷的混合物，每种重组微生物生产特定的甜菊醇或甜菊醇糖苷，从每种微生物中回收基本上纯的形式的甜菊醇或甜菊醇糖苷，然后合并这些化合物以获得包含所需比例的每种化合物的混合物。与目前的甜菊产品相比，本文所述的重组微生物允许获得更精确和一致的混合物。

在另一替代方案中，可将基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷与其他甜味剂一起并入食品中，所述其他甜味剂例如糖精、右旋糖、蔗糖、果糖、赤藓糖醇、阿斯巴甜、三氯蔗糖、莫纳甜(monatin)或乙酰磺胺酸钾。甜菊醇或甜菊醇糖苷相对于其他甜味剂的重量比可以根据需要改变以在最终食品中达到令人满意的味道。参见例如，U.S.2007/0128311。在一些实施方案中，甜菊醇或甜菊醇糖苷可以与风味剂(例如柑橘)一起提供，以作为风味调节剂。

由本文所述的重组微生物所生产的组合物可以并入食品中。例如，取决于甜菊醇糖苷和食品的类型，由重组微生物生产的甜菊醇糖苷组合物可以基于干重以约20mg甜菊醇糖苷/kg食品至约1800mg甜菊醇糖苷/kg食品的量并入食品中。例如，由重组微生物生产的甜菊醇糖苷组合物可以并入甜点、冷的糖食(例如冰淇淋)、乳制品(例如酸奶)或饮料(例如碳酸饮料)中，以使得食品基于干重具有最多500mg甜菊醇糖苷/kg食品。由重组微生物生产的甜菊醇糖苷组合物可以并入烘焙食品(例如饼干)中，以使得食品基于干重具有最多300mg甜菊醇糖苷/kg食品。由重组微生物生产的甜菊醇糖苷组合物可以并入到调味汁(例如巧克力糖浆)或蔬菜产品(例如腌菜)中，以使得食品基于干重具有最多1000mg甜菊醇糖苷/kg食品。由重组微生物生产的甜菊醇糖苷组合物可以掺入面包中以使得食品基于干重具有最多160mg甜菊醇糖苷/kg食品。由重组微生物、植物或植物细胞生产的甜菊醇糖苷组合物可以并入硬糖或软糖中，以使得食品基于干重具有最多1600mg甜菊醇糖苷/kg食品。由重组微生物、植物或植物细胞生产的甜菊醇糖苷组合物可以并入加工的水果产品(例如果汁、水果馅、果酱和果冻)中，以使得食品基于干重具有最多1000mg甜菊醇糖苷/kg食品。在一些实施方案中，本文生产的甜菊醇糖苷组合物是药物组合物的组分。参见例如由HarrietWallin，Food Agric.Org.筹备的Steviol Glycosides Chemical and TechnicalAssessment 69th JECFA，2007；EFSA Panel on Food Additives and Nutrient Sourcesadded to Food(ANS)，“Scientific Opinion on the safety of steviol glycosidesfor the proposed uses as a food additive，”2010，EFSA Journal 8(4)：1537；美国食品和药物管理局GRAS通知323；美国食品和药物管理局GRAS通知329；WO 2011/037959；WO2010/146463；WO 2011/046423；和WO 2011/056834。

例如，这样的甜菊醇糖苷组合物可具有90-99重量％的RebA和不可检测量的甜菊植物衍生的污染物，并基于干重以25-1600mg/kg，例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg并入食品中。

这样的甜菊醇糖苷组合物可以是富含RebB的组合物，其具有大于3重量％的RebB并被并入食品中，以使得产物中RebB的量基于干重为25-1600mg/kg，例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。通常，富含RebB的组合物具有不可检测量的源自甜菊植物的污染物。

这样的甜菊醇糖苷组合物可以是富含RebD的组合物，其具有大于3重量％的RebD并被并入食品中，以使得产物中RebD的量基于干重为25-1600mg/kg，例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。通常，富含RebD的组合物具有不可检测量的源自甜菊植物的污染物。

这样的甜菊醇糖苷组合物可以是富含RebE的组合物，其具有大于3重量％的RebE并被并入食品中，以使得产物中RebE的量基于干重为25-1600mg/kg，例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。通常，富含RebE的组合物具有不可检测量的源自甜菊植物的污染物。

这样的甜菊醇糖苷组合物可以是富含RebM的组合物，其具有大于3重量％的RebM并被并入食品中，以使得产物中RebM的量基于干重为25-1600mg/kg，例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。通常，富含RebM的组合物具有不可检测量的源自甜菊植物的污染物。

在一些实施方案中，将基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷并入到佐餐甜味剂或“杯对杯(“cup-for-cup”)”产品中。这样的产品通常用本领域技术人员已知的一种或更多种填充剂(例如麦芽糖糊精)稀释至适当的甜味水平。富含RebA、RebB、RebD、RebE或RebM的甜菊醇糖苷组合物可包装在小袋中(例如，以基于干重的10,000至30,000mg甜菊醇糖苷/kg产品)用于佐餐使用。在一些实施方案中，在体外、体内或通过全细胞生物转化产生甜菊醇糖苷。

将在以下实施例中进一步描述本发明，这些实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。

实施例

以下实施例说明本发明的具体实施方案及其多种用途。它们仅出于说明的目的而列出，并且不被认为是限制本发明。

实施例1.LC-MS分析过程

使用配有Kinetex C18柱(150×2.1mm，2.6μm颗粒，孔径)的Agilent 1200Series HPLC***(Agilent Technologies)进行实施例3和4的LC-MS分析，所述柱连接到具有加热电喷雾离子(HESI)源的TSQ Quantum Access(ThermoFisherScientific)三重四极杆质谱仪。使用洗脱液B(含0.1％甲酸的MeCN)和洗脱液A(含0.1％甲酸的水)的流动相，通过增加梯度来进行洗脱，所述梯度为：0.0至1.0分钟从10％增加至40％B；1.0至6.5分钟从40％增加至50％B；以及6.5至7.0分钟从50％增加至100％B。流量为0.4mL/分钟，柱温度为30℃。使用SIM(单离子监测，Single Ion Monitoring)以正模式检测1，2-甜菊苷和RebD。

在具有配备有前置柱(2.1×5mm，1.7μm颗粒，孔径)的Waters ACQUITYBEH C18柱(2.1×50mm，1.7μm颗粒，孔径)的Waters ACQUITY(Waters Corporation)上进行实施例8和9的LC-MS分析，所述前置柱偶联到具有以负离子模式操作的电喷雾离子化(ESI)的Waters ACQUITY TQD三重四极杆质谱仪。使用两种流动相的梯度实现化合物分离：A(含0.1％甲酸的水)和B(含0.1％甲酸的MeCN)，0.3至2.0分钟从20％增加至50％B，在2.01分钟增加至100％B，保持100％B 0.6分钟，以及重新平衡0.6分钟。流量为0.6mL/分钟，柱温度设置为55℃。使用SIM(单离子监测)监测甜菊醇糖苷，并通过与可信标准物比较来进行定量。检测的甜菊醇糖苷的m/z迹线和保留时间值参见表1。

表1：甜菊醇和甜菊醇糖苷的LC-MS分析

可以使用本文所述的方法分离甜菊醇糖苷，包括GlcNAc衍生物、糖基化的对映贝壳杉烯醇和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸。例如，在发酵后，可以将培养液在4℃下以7000rpm离心30分钟以除去细胞，或者可以通过过滤除去细胞。可以例如通过机械破坏或酶破坏宿主细胞以及另外的离心以除去细胞碎片来获得无细胞裂解物。也可以例如通过超声处理对干燥培养液材料进行机械破碎。在进一步纯化(例如通过制备色谱)之前，可使用微米或亚微米来过滤溶解的或悬浮的培养液材料。可任选地处理发酵培养基或无细胞裂解物以除去低分子化合物(例如盐)；并且可任选地在纯化之前干燥并再溶解在水和溶剂的混合物中。可以如下纯化上清液或无细胞裂解物：可以用例如HP20树脂(Supelco)或其他合适的非极性吸附剂或反相色谱树脂填充柱，并且可将上清液或无细胞裂解物的等分试样加载到柱上并用水洗涤以除去亲水性组分。可以通过逐步递增增加水中的溶剂浓度或梯度(例如，从0％至100％甲醇)来洗脱甜菊醇糖苷产物。然后可以通过LC-MS分析各级分(包括流过(flow-through))中甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸的水平。然后可以将级分合并并使用真空蒸发器减小体积。如果需要，可以使用额外的纯化步骤，例如额外的色谱步骤和结晶。

实施例2：菌株工程化和发酵

如WO 2011/153378、WO 2013/022989、WO 2014/122227和WO 2014/122328(其各自通过引用整体并入本文)中所述构建甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株。例如，包含一个或更多个拷贝的以下重组基因的酵母菌株产生甜菊醇糖苷：编码聚球藻属(Synechococcus sp.)GGPPS多肽(SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20)的重组基因、编码截短的玉蜀黍(Z.mays)CDPS多肽(SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40)的重组基因、编码拟南芥(A.thaliana)KS多肽(SEQ IDNO：51、SEQ ID NO：52)的重组基因、编码重组甜菊(S.rebaudiana)KO多肽(SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60)的重组基因、编码拟南芥ATR2多肽(SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92)的重组基因、编码水稻(O.sativa)EUGT11多肽(SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16)的重组基因、编码SrKAHe1多肽(SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94)多肽的重组基因、编码甜菊CPR8多肽(SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86)的重组基因、编码甜菊UGT85C2多肽(SEQ ID NO：5/SEQID NO：6、SEQ ID NO：7)或SEQ ID NO：7的UGT85C2变体(或功能同源物)的重组基因、编码甜菊UGT74G1多肽(SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4)或SEQ ID NO：4的UGT74G1变体(或功能同源物)的重组基因、编码甜菊UGT76G1多肽(SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9)或SEQ ID NO：9的UGT76G1变体(或功能同源物)的重组基因，以及编码甜菊UGT91D2e多肽(SEQ ID NO：10、SEQID NO：11)或SEQ ID NO：11的UGT76G1变体(或功能同源物)例如UGT91D2e-b(SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13)多肽的重组基因。

实施例3：UGT91D2e的底物特异性的调节

UGT91D1(GenBank登录号AY345980)在甜菊植物中高度表达，并被认为是功能性UGT。然而，其底物不是甜菊醇糖苷。这表明UGT91D1具有与UGT91D2e不同的底物，其可由与UGT91D2e不同的22个氨基酸定义。使用(Life Technologies)和简并NNK引物制备与UGT91D1不同的22个氨基酸的UGT91D2e位点饱和文库(site saturation library，SSL)筛选。

在大肠杆菌XJb(DE3)Autolysis^TM细胞(Zymo Research)中表达UGT91D2SSL克隆。使克隆在37℃下在96深孔板中生长过夜，所述深孔板具有包含15g胰蛋白胨、7.5g NaCl、7.5g酵母提取物、1.5g酪蛋白氨基酸、3g MgSO₄，并用100mg/L氨苄青霉素和33mg/L氯霉素强化的1mL NZCYM(pH 7.0)。将150μL过夜培养物转移到包含具有氨苄青霉素、0.1mM异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、3mM L-***糖和2％(v/v)乙醇的3mL NZCYM的24深孔板中，并且在20℃下孵育20小时。使细胞沉淀并且在100μL裂解缓冲液(10mM Tris-HClpH 8.0、5mM MgCl₂、1mM CaCl₂、3片/100mL完全小蛋白酶抑制剂混合物(Roche))中通过单个冻融循环和50μL DNA酶混合物(1μL 1.4mg/mL脱氧核糖核酸酶(Calbiochem)、1.2μL 500mMMgCl₂和47.8μL 4×PBS缓冲液)裂解。将板在25℃下以500rpm摇动5分钟以允许降解基因组DNA。然后将板在4℃下以4000rpm离心30分钟。参见WO 2013/022989，其通过引用整体并入本文。

在体外测试UGT91D2e变体的活性以评估UGT91D2e变体对底物甜茶苷和RebA的特异性。将6μL裂解物用24μL反应混合物(终浓度：100mM Tris-HCl(pH 8.0)、5mM MgCl₂、1mMKCl、300μM尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和100μM甜茶苷或RebA)稀释。将反应混合物在30℃下孵育24小时，并且通过LC-MS测量1，2-甜菊苷和RebD产生。结果示于表2。

表2：UGT91D2e-b和UGT91D2e变体对分别产生1，2-甜菊苷和RebD的甜茶苷或RebA的活性

如表2所示，甜茶苷和RebA是UGT91D2e-b(SEQ ID NO：13)、UGT91D2e L211M(SEQID NO：118)、UGT91D2e L195G(SEQ ID NO：119)、UGT91D2e V196P(SEQ ID NO：120)和UGT91D2e L211H(SEQ ID NO：121)的底物，因为当酶与甜茶苷或RebA接触后产生了1，2-甜菊苷和RebD。然而，由UGT91D2e-b(SEQ ID NO：13)、UGT91D2e L211M(SEQ ID NO：118)、UGT91D2e L195G(SEQ ID NO：119)、UGT91D2e V196P(SEQ ID NO：120)和UGT91D2e L211H(SEQ ID NO：121)产生的1，2-甜菊苷/RebD比例从24.2至198.2波动，表明酶对于任一底物不具有同等的选择性。UGT91D2e V286C和UGT91D2e G384W变体对甜茶苷具有选择性；在任一变体与RebA接触后不产生RebD。

使用上述测定发现UGT91D2e的另外的变体表现出对于甜茶苷或RebA的底物特异性。参见表3。SEQ ID NO：200(P93V M152G)、SEQ ID NO：201(S99I)、SEQ ID NO：203(T144L)、SEQ ID NO：205(A148K L221I)、SEQ ID NO：212(G384K)的变体对RebA具有选择性。SEQ ID NO：197(L195V)、SEQ ID NO：198(V286S)、SEQ ID NO：202(T144K P201P(沉默))、SEQ ID NO：209(L211T I130I(沉默))、SEQ ID NO：211(S114F V286S)、SEQ ID NO：214(E438M)的UGT91D2e变体对甜茶苷具有选择性。

表3.UGT91D2e变体对于分别产生1，2-甜菊苷和RebD的甜茶苷或RebA的活性

实施例4：UGT91D2e-b-EUGT11嵌合酶的评估

在体外测试UGT91D2e-b-EUGT11嵌合酶以获得对底物甜茶苷和RebA的活性。使用表4中的引物，通过聚合酶链式反应(PCR)-扩增和重叠延伸PCR产生UGT91D2e-b-EUGT11嵌合酶。

表4.用于产生UGT91D2e-b-EUGT11嵌合酶的引物

在大肠杆菌XJb(DE3)Autolysis^TM细胞(Zymo Research)中表达UGT91D2e-b-EUGT11嵌合酶。将克隆培养在含有氨苄青霉素和氯霉素的50mL NZCYM(pH 7.0)中，并再接种到具有IPTG、L-***糖和乙醇的500mL NZCYM中。在15mL裂解缓冲液中，随后在150μLDNA酶和200μL 500mM MgCl₂中进行细胞裂解物制备。通过将1/3体积的4×PBS缓冲液(560mM NaCl，10.8mM KCl，40mM Na₂HPO₄，7.2mM KH₂PO₄(pH 7.3))添加到裂解物上清液中，然后与谷胱甘肽琼脂糖4B(GE Healthcare)一起孵育(2小时，4℃)并且加载到色谱柱(Bio-Rad)上来进行嵌合酶的GST-标签亲和纯化。将珠用1×PBS缓冲液洗涤两次，并用50mM Tris-HCl(pH 8.0)和10mM还原型谷胱甘肽洗脱。通过添加甘油至终浓度为50％来使洗脱的蛋白质稳定。使用4-12％Bis-Tris 1.0mm预制凝胶(Invitrogen)、NuPAGE MOPS(Invitrogen)运行缓冲液和SimplyBlue SafeStain(Invitrogen)进行SDS-PAGE。使用ImageJ软件从凝胶图像的相对染色强度确定产生的嵌合体的量。

通过将20μL纯化的UGT91D2e-b、EUGT11或UGT91D2e-b-EUGT11嵌合酶(0.02mg/mL)添加至包含100mM Tris-HCl(pH 8.0)、5mM MgCl₂、1mM KCl、300μM尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和100μM甜茶苷或RebA之总体积80μL的反应混合物来筛选嵌合体。将反应物在30℃下孵育24小时，并且通过LC-MS测量RebA、RebD、甜茶苷和1，2-甜菊苷的水平。并非所有纯化的嵌合体都在上述测定中有活性(参见表5，对于甜茶苷和/或RebA具有活性的酶)。

表5.EUGT11、UGT91D2e-b和EUGT11-UGT91D2e-b嵌合酶对于RebA和甜茶苷的活性

＊NF＝未发现

如表5所示，与EUGT11和UGT91D2e相比，Chim_7(SEQ ID NO：18)更有效地将甜茶苷转化为1，2-甜菊苷。与EUGT11或UGT91D2e不同，Chim_7(SEQ ID NO：18)完全消耗了供应量的甜茶苷。当将EUGT11与甜茶苷一起孵育时，甜茶苷的C19位被1，2-糖基化，还产生了RebE和1，2-甜菊苷(表5)。另外，与UGT91D2e-b相比，Chim_7(SEQ ID NO：18)对于RebA表现出1.75倍高的活性。Chim_3(SEQ ID NO：17)选择性地将甜茶苷转化为1，2-甜菊苷；Chim_3(SEQ ID NO：17)没有将RebA转化为RebD(表5)。

实施例5：UGT85C2变体的评估

使用三种PDB模板(模型1：2PQ6、2VCE、2C1X；模型2：2PQ6；模型3：2PQ6、2C1X)的组合并且使用UGT85H2、UGT72B1和VvGT1的标准设置和序列(参见PDB2PQ6、PDB2VCE和PCB2C1X)，在Sybyl-X2.0(Certara)中利用ORCHESTRA模块产生UGT85C2的三个同源模型。利用molprobity和ProQ网络服务器检查模型几何形状和质量(参见Chen等，ActaCrystallographica.Seetion D，Biological Crystallography 66(Pt 1)：12-21(2010)，Davis等，Nucleic Acids Research 35：W375-83(2007)，Wallner&Elofsson，ProteinScience：A Publication of the Protein Society 12(5)：1073-86(2003)。在接受者甜菊醇、13-SMG、19-SMG或甜茶苷之前，将来自PDB：2VCE的氟化UDPG糖供体类似物UDP-2FGlc运输到UGT85C2的UDPG结合位点中。使用Sybyl-X小分子构建物(small molecule builder)制备甜菊醇和甜菊醇糖苷，并且利用Surflex Dock套件使用标准GeomX设置连接到酶的活性位点。通过在对接分析(docking analysis)中选择配体的内在PDB模板中不是100％保守的所有残基来确定位点饱和文库(SSL)的位点。参见表6。

表6.用于UGT85C2对接分析的SSL残基

x：对接分析中甜菊醇、19-SMG和UDPG的内的残基

C：保守残基

产生了表6中预测在配体残基的内的34个非保守氨基酸的SSL克隆。利用重叠NNK引物和Phusion聚合酶，使用全质粒扩增方法的修改版本(Zheng等.Nucleic AcidsResearch 32(14)：e115(2004))。将10μL PCR反应物用10U DpnI(New England Biolabs)在37℃处理1小时，在65℃热灭活20分钟，并且转化到大肠杆菌DH5α细胞中。在Luria Broth(LB)+卡那霉素琼脂板上选择菌落，并在用卡那霉素强化的4mL LB中生长。使用GeneJET^TM微量制备试剂盒(Thermo Fisher Scientific)纯化质粒并测序。

将序列验证的位点饱和文库(SSL)克隆转化到大肠杆菌XJb(DE3)Autolysis^TM细胞(Zymo Research)中，并在LB+卡那霉素琼脂板上选择。将单个菌落接种到用30mg/L卡那霉素强化的1mL NZCYM中，并在37℃和200rpm轨道摇动下孵育过夜。将50μL过夜培养物转移到用30mg/L卡那霉素，3mM***糖和0.1mM IPTG强化的1mL新鲜NZCYM中，并在20℃和200rpm轨道摇动下孵育过夜。将细胞在4℃以3220g/10分钟离心，并重悬在包含完全小不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(1片/25mL GT缓冲液；Roche Diagnostics)的50μL GT缓冲液(10mMTris-HCl(pH 7.5)，5mM MgCl₂，1mM CaCl₂)中。通过在4℃下以200rpm/5分钟的轨道摇动使沉淀重悬。在开始裂解步骤之前，将细胞在-80℃下孵育至少15分钟。

通过将样品加热至25℃并且添加包含2.39mL 4×His结合缓冲液(80mM Tris-HCl(pH 7.5)，500mM NaCl，10mM咪唑)以及50μL 1.4mg/mL DNA酶I牛胰腺(Calbiochem)和60μLMgCl₂(500mM)的25μL DNA酶I混合物来裂解细胞。将裂解物通过1.2μm 96孔滤板(EMDMillipore)过滤，并转移到另外的1.2μm滤板中，该滤板包含用1×结合缓冲液预洗涤两次的50μL His选择珠(Sigma-Aldrich)。然后将裂解物和珠在4℃下以500rpm轨道摇动孵育2小时。将板以450g/2分钟离心。使用Bradford测定试剂(Sigma-Aldrich)测量流过中的总蛋白质浓度，通过离心样品，除去上清液并添加50μL 1×His结合缓冲液将样品洗涤两次。将洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl(pH7.5)，500mM NaCl，250mM咪唑)添加到珠中并在4℃下以500rpm轨道摇动孵育5分钟，并且将蛋白质洗脱到96孔PCR板(FrameStar 96，4titude)中。通过在具有4-12％Bis-Tris预制凝胶(Invitrogen)的SDS-PAGE凝胶***上运行流过的样品、洗涤步骤和洗脱来评估纯度。

测量纯化的UGT85C2变体的活性。将2.0μg/mL UGT85C2变体在37℃下与反应缓冲液(100mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM KCl，小牛肠碱性磷酸酶(New England Biolabs)，120μMUDPG，以及40μM甜菊醇或40μM 19-SMG)孵育20分钟。在该测定中，UDPG上的葡萄糖转移至甜菊醇或19-SMG；产物为UDP和13-SMG或甜茶苷。然后通过磷酸酶释放UDP上的磷酸，使用孔雀石绿方案(Malachite green protocol)(Baykov等，Analytical Biochemistry 171(2)：266-70)在Abs₆₀₀测量释放的磷酸的量。通过使用Bradford试剂(Sigma-Aldrich)测量的释放的总蛋白质对值进行归一化。

候选物选择为具有一个标准偏差或高于野生型活性的活性，或者对一种底物具有小于50％活性，同时对另一种底物保持野生型活性(例如，显示底物特异性)。野生型UGT85C2(SEQ ID NO：7)的甜菊醇样品与19-SMG样品的Abs₆₀₀比例平均为0.94，表明野生型UGT85C2催化甜菊醇和19-SMG的转化，几乎没有或没有底物偏好。表7A示出了分析的UGT85C2变体，其相对于甜菊醇的转化，优先催化19-SMG的转化，表7B示出了分析的UGT85C2变体，其相对于19-SMG的转化，优先催化甜菊醇的转化，以及图7C示出了分析的UGT85C2变体，其催化19-SMG和甜菊醇的转化，对任一底物几乎不具有偏好。不只一次地选择通过位点饱和文库(SSL)筛选产生的特定克隆，对应于表7A-C中的不只一个条目。

表7A.对于19-SMG作为底物具有选择性的UGT85C2SSL筛选候选物

表7B.对于作为底物的甜菊醇具有选择性的UGT85C2SSL筛选候选物

表7C.对于甜菊醇或19-SMG没有底物选择性的UGT85C2SSL筛选候选物

纯化的UGT85C2的S84V和P86R变体对于19-SMG具有选择性；UGT85C2 S84V和UGT85C2 P86R未表现出对于甜菊醇的活性(表7A)。纯化的F48S、F48H、F48Y、F48R、F48Q、F48T、F48S、I49V、P86R、P86G和F122S UGT85C2变体也表现出对于19-SMG的选择性(表7A)。然而，纯化的UGT85C2的S84T和I87M变体对于甜菊醇具有选择性；UGT85C2 S84T和UGT85C2I87M未表现出对于19-SMG的活性(表7B)。纯化的I87P、I87Y、L91K、L91R、L91T、L92M和I95KUGT85C2变体也表现出对于甜菊醇的选择性(表7B)。

实施例6：UGT85C2缺失的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株的表征

实施例2中描述的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株的修改形式，由SEQ ID NO：67所示的核苷酸序列(对应于SEQ ID NO：117所示的氨基酸序列)编码的重组KO基因以及重组CPR1基因编码(SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78)缺失甜菊UGT85C2多肽(SEQ ID NO：5/SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7)。在收获前，将16个独立克隆在30℃下在合成完全(SC)培养基中摇动(深孔400rpm)培养5天。在DMSO的存在下将培养样品(未除去细胞)加热，用于利用LC-MS检测总糖苷含量。

如图4A所示，与对照菌株(未缺失UGT85C2)相比，UGT85C2缺失的细胞的培养物样品没有积累对映贝壳杉烯醇糖苷(对映贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1)、对映贝壳杉烯醇+3Glc(#6)或对映贝壳杉烯醇_2Glc(#8)。该结果表明UGT85C2负责对映贝壳杉烯醇的19-O-葡糖基化。还如图4A所示，UGT85C2缺失的细胞的培养物样品没有积累对映贝壳杉烯酸糖苷(对映贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)和对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2))。而对照样品积累了13-SMG，UGT85C2缺失的细胞的培养物样品积累了19-SMG、甜菊醇、甜菊醇+2Glc(#23)和甜菊醇+3Glc(#34)，参见图4B和4C。甜菊醇+2Glc(#23)和甜菊醇+3Glc(#34)可能分别具有连接在甜菊醇骨架的19位的两个或三个葡萄糖部分。

通过NMR阐明的分离的三糖基化的对映贝壳杉烯酸的结构与三糖基化的对映贝壳杉烯醇的结构一起示于图7A中。通过标准同核和异核多脉冲NMR实验¹H，¹H-COSY、¹H，¹H-ROESY、¹H，¹³C-HSQC和¹H，¹³C-HMBC解析这些结构。将化合物溶于60μL DMSO-d6中，并在25℃下测量。在配备有低温探针(5mm CPTCI 1H-13C/15N/D Z-GRD Z44909/0010)的800MHzBruker Avance仪器(对于¹H为800MHz，对于¹³C为201MHz)上获得这些化合物的光谱。另外，通过LC-MS获得了所检测的3种分子的¹H-NMR光谱，其与一般对映贝壳杉烯酸+2Glc、对映贝壳杉烯醇+3Glc(异构体2)和对映贝壳杉烯醇+Glc+GlcNAc结构一致。对于这些化合物的¹HNMR谱和¹H和¹³C NMR化学位移，参见图8A-8L。

随后使用正向引物(SEQ ID NO：215)和反向引物(SEQ ID NO：216)以及PGK1启动子将UGT85C2变体克隆到USER载体(用于在ChrXII-1整合)中。然后将UGT85C2变体整合到UGT85C2缺失的甜菊醇糖苷生产菌株中。将转化体从转化板中重新划线。在96深孔板(DWP)中的500μL合成完全URA(SC-URA)培养基中，从重新划线板建立预培养物，并在30℃和300rpm下培养过夜。通过将50μL的预培养物转移到包含500μL SC-URA培养基的96孔DWP中来建立培养物。

孵育1天后，从预培养物(500μL SC-URA中50μL)建立培养物，并在Duetz***中培养5天(与预培养物相同的条件)。在板阅读器上以1∶10稀释度测量OD₆₀₀，通过将50μL样品转移到50μL 100％DMSO中收集样品。将混合物加热至80℃10分钟，随后离心(4000rcf，4℃，10分钟)。将15μL的每种上清液与105μL 50％DMSO(1∶16的总稀释度)混合，并通过LC-MS分析样品。

实施例7：评估在细胞裂解物中的UGT85C2变体活性

将来自实施例6的纯化变体UGT85C2DNA分别转化到XJB自溶z感受态细胞中。将来自每个转化板的三个菌落的预培养物接种到包含卡那霉素(600mg/L)的600μL LB中，并在96孔DWP中在200rpm和37℃下孵育过夜。通过将50μL预培养物转移到包含1mL/孔的NZCYM培养液的新的96孔DWP中来诱导蛋白质产生和细胞壁降解，所述NZCYM培养液包含卡那霉素(600mg/L)+3mL/L 1M***糖和100μL/L 1M IPTG。将培养物在20℃、200rpm下孵育约20小时，然后使细胞沉淀(4000rcf，5分钟，4℃)并除去上清液。向每个孔中添加具有蛋白酶抑制剂(cOmplete^TM，小的不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物片剂，11836170001 Roche)的50μL GT缓冲液。通过在4℃下以200rpm摇动5分钟使沉淀重悬。将每个样品的75μL等分试样转移到PCR板中并在-80℃冷冻。将沉淀在室温下解冻，当样品接近解冻时，添加25μL/孔DNA酶混合物(每板2，39mL 4×结合缓冲液+50μL DNA酶I(1.4mg/mL)+60μL MgCl₂(1M))。将板在室温下轻柔摇动孵育5分钟，随后在4000rcf下离心5分钟。将每个上清液转移到新鲜的PCR板中进行活性测量。

将每个上清液在包含最终浓度为100mM Tris(pH 8.0)、4mM MgCl₂、1mM KCl、300μM UDP-葡萄糖和100μM底物的测定反应混合物中孵育。底物是甜菊醇或19-SMG。使用纯化的野生型UGT85C2酶和UGT85C2细菌裂解物作为阳性对照。将反应在30℃下(在板摇动器上)孵育，20分钟、40分钟和19小时后，通过将20μL样品与20μL 100％DMSO混合来停止反应。通过添加60μL 50％DMSO进一步稀释样品，随后通过LC-MS分析。对应于测量的13-SMG、19-SMG、甜茶苷和甜菊醇水平的AUC值示于表8A-C中。

表8A.使用甜菊醇作为底物在UGT85C2变体活性测定中测量的13-SMG和甜菊醇AUC值。

表8B.使用19-SMG作为底物在UGT85C2变体活性测定中测量的13-SMG、19-SMG和甜茶苷AUC值。

表8C.在对照UGT85C2测定中测量的13-SMG、19-SMG、甜茶苷和甜菊醇AUC值。

使用甜菊醇作为底物，在UGT85C2变体活性测定中没有观察到19-SMG和甜茶苷的积累。使用甜菊醇作为底物，F48H、F48Y、F48T、I49V、S84A和L92F UGT85C2变体在小于40分钟的孵育期期间显示出高活性，F48H、F48Y、F48T和I49V UGT85C2变体在超过40分钟的孵育期期间表现出高活性(表8A)。使用19-SMG作为底物，F48H、F48Y、F48T、I49V和S84A UGT85C2变体在小于40分钟的孵育期期间表现出高活性，F48H、I49V、S84A、S84V、L91K和L92FUGT85C2变体以及野生型UGT85C2在超过40分钟的孵育期期间表现出高活性(表8B)。对UGT85C2I87H，观察到甜菊醇和19-SMG的缓慢转化(表8A和8B)。

计算UGT85C2变体的13-SMG/甜茶苷比例。高13-SMG/甜茶苷比例表示UGT85C2变体对于甜菊醇的偏好，而低13-SMG/甜茶苷比例表示UGT85C2变体对于19-SMG的偏好。L91K、L91R和L92F UGT85C2变体表现出高13-SMG/甜茶苷比例，而F48Y、F48T、P86G UGT85C2变体表现出低13-SMG/甜茶苷比例。

发现UGT85C2变体在24小时后将甜菊醇转化为甜茶苷。甜茶苷水平(AUC)示于图5中。与对照相比，氨基酸48和49位的突变产生了提高水平的甜茶苷。在86、1和92位具有氨基酸突变的变体似乎产生较低水平的甜茶苷。

实施例8：UGT76G1变体的评估

在实施例2中描述的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株的修改形式中测试UGT76G1变体，以确定对甜菊醇糖苷、三糖基化的对映贝壳杉烯醇和三糖基化的对映贝壳杉烯酸水平的影响。背景菌株描述于WO 2014/122227的实施例9中，其中使用选择性标志物通过同源重组使UGT76G1的两个拷贝缺失。该菌株在染色体水平上包含重新整合的野生型UGT76G1(WT对照)或UGT76G1的变体。

与野生型UGT76G1相比，UGT76G1 H155L(SEQ ID NO：184)的表达提高了产生的RebM/RebD的比例。与野生型UGT76G1相比，菌株中UGT76G1Q23H(SEQ ID NO：181)、UGT76G1T146G(SEQ ID NO：183)、UGT76G1 L257G(SEQ ID NO：185)或UGT76G1 S283N(SEQ ID NO：188)的表达均导致对映贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、1，2-二糖苷、1，2-甜菊苷、RebE、RebD、甜菊醇+5Glc(#22)和甜菊醇+6Glc(异构体1)的积累增加，产生的RebM/RebD的比例提高，以及RebB和RebA的积累减低。参见表9A-9C。具体地，与野生型UGT76G1相比，UGT76G1 T146G(SEQID NO：183)的表达导致对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)、甜菊醇+3Glc(#1)和Stev3Glc(#34)的积累增加。与野生型UGT76G1相比，UGT76G1 L257G(SEQ ID NO：185)的表达增加了甜菊醇+7Glc(异构体2)的量。与野生型UGT76G1相比，UGT76G1 S283N(SEQ ID NO：188)的表达增加了甜菊醇+3Glc(#1)和Stev3Glc(#34)的量。参见表9A-9C。

表9A.包含野生型UGT76G1或UGT76G1变体的宿主中甜菊醇糖苷(以μM计)的积累

表9B.包含野生型UGT76G1或UGT76G1变体的宿主中甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯酸或糖基化的对映贝壳杉烯醇(以AUC计)的积累

-KA：对映贝壳杉烯酸

-KL：对映贝壳杉烯醇

表9C.包含野生型UGT76G1或UGT76G1变体的宿主中甜菊醇糖苷(以AUC计)的积累

还测试了双重UGT76G1变体。双重变体为：UGT76G1 Q23H H155L(SEQ ID NO：217)、UGT76G1 T146G H155L(SEQ ID NO：218)、UGT76G1 L257G H155L(SEQ ID NO：219)和UGT76G1 S283N H155L(SEQ ID NO：220)。与三种单重变体UGT76G1 Q23H(SEQ ID NO：181)、UGT76G1 T146G(SEQ ID NO：183)和UGT76G1 L257G(SEQ ID NO：185)相比，双重变体UGT76G1 Q23H H155L(SEQ ID NO：217)、UGT76G1 T146G H155L(SEQ ID NO：218)和UGT76G1L257G H155L(SEQ ID NO：219)导致RebM积累增加。参见表9A-9C。具体地，与UGT76G1 Q23H(SEQ ID NO：181)变体相比，UGT76G1 Q23H H155L(SEQ ID NO：217)的表达增加了RebM和甜菊醇+7Glc(异构体2)的量。与UGT76G1 T146G(SEQ ID NO：183)变体相比，UGT76G1 T146GH155L(SEQ ID NO：218)的表达增加了RebA、RebD、RebM和甜菊醇+7Glc(异构体2)的积累，并降低了对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)、1，2-二糖苷、1，2-甜菊苷、甜菊醇+3Glc(#1)、Stev3Glc(#34)、RebE和甜菊醇+5Glc(#22)的积累。与UGT76G1 L257G(SEQ ID NO：185)变体相比，UGT76G1 L257G H155L(SEQ ID NO：219)的表达增加了对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、RebA和RebM的积累，并降低了RebE和甜菊醇+6Glc(异构体1)的积累。参见表9A-9C。因此，对于UGT76G1双重变体观察到协同作用。

还在包含更高拷贝数的UGT91D2e(SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11)、UGT74G1(SEQID NO：3，SEQ ID NO：4)和ATR2(SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：92)的上述菌株的修改形式中分析了UGT76G1变体。与表达野生型UGT76G1的甜菊醇生产酿酒酵母菌株相比，表达导致增加的RebD水平的UGT76G1变体(包括UGT76G1 Q23H、UGT76G T146G和S283N)的甜菊醇生产酿酒酵母菌株还增加了对映贝壳杉烯酸+2Glc(#7)和对映贝壳杉烯酸+2Glc(异构体1)的积累，但是减少了对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)的积累。参见图9A。增加RebD水平的UGT76G1变体还增加了对映贝壳杉烯醇+2Glc(#8)的积累，但是减少了与对映贝壳杉烯醇+3Glc(#6)共洗脱的对映贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1)的积累(图9B)。

增加RebM水平的变体UGT76G1 H155L变体(SEQ ID NO：184)的表达导致对映贝壳杉烯酸+2Glc(#7)和对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)的积累减少(图9A)。与表达野生型UGT76G1的菌株相比，在表达增加RebM水平的UGT76G1变体后，对映贝壳杉烯醇糖苷的水平没有显著变化(图9B)。

甜菊醇糖苷生产菌株中产生的13-SMG、1，2-二糖苷、甜茶苷、RebA、RebB、RebD、RebE、RebM、RebG(1，3-甜菊苷)、甜菊醇+3Glc(#1)、甜菊醇+4Glc(#26)、甜菊醇+5Glc(#22)、甜菊醇+5Glc(#24)、甜菊醇+5Glc(#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1)和甜菊醇+6Glc(#23)的水平示于图10A-10C中。导致增加的RebD水平的UGT变体的表达还增加了甜菊醇+5Glc(#22)、1，2-甜菊苷、甜菊醇+6Glc(异构体1)和甜菊醇+3Glc(#1)的积累，但是减少了甜菊醇+4Glc(#26)、甜菊醇+5Glc(#24)和RebG(1，3-甜菊苷)的积累(图10A)。UGT76G1 H155L(SEQ IDNO：184)的表达导致甜菊醇+5Glc(#25)的积累增加，但是1，2-甜菊苷、甜菊醇+3Glc(#1)、甜菊醇+4Glc(#26)、甜菊醇+5Glc(#22)、甜菊醇+6Glc(异构体1)和甜菊醇+6Glc(#23)的积累减少(图10B)。UGT76G1S253W(SEQ ID NO：186)的表达导致减少的1，2-甜菊苷和甜菊醇+6Glc(异构体1)的积累(图10B)。UGT76G1284G的表达导致1，2-甜菊苷和甜菊醇+6Glc(异构体1)的积累增加，但是RebG、甜菊醇+4Glc(#26)、甜菊醇+5Glc(#25)和甜菊醇+6Glc(#23)的积累减少(图10B)。图10C示出了表达野生型UGT76G1(SEQ ID NO：9)或增加RebD或RebM的积累的UGT76G1变体的酿酒酵母中13-SMG、1，2-二糖苷、甜茶苷、RebA、RebB、RebD、RebE和RebM的积累。

在独立的实验中还测试包含较高拷贝数的UGT91D2e(SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11)、UGT74G1(SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4)和ATR2(SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92)的甜菊醇糖苷生产菌株。如表9D-9F所示，与野生型UGT76G1相比，UGT76G1 H155L(SEQ ID NO：184)的表达导致甜菊醇+5Glc(#25)的积累增加，产生的RebM/RebD的比例增加，以及1，2-二糖苷、甜菊醇+3Glc(#1)、RebE、甜菊醇+6Glc(异构体1)和甜菊醇+6Glc(#23)的积累减少。UGT76G1Q23H(SEQ ID NO：181)、UGT76G1 T146G(SEQ ID NO：183)、UGT76G1 L257G(SEQ ID NO：185)或UGT76G1 S283N(SEQ ID NO：188)的表达增加了1，2-二糖苷、1，2-甜菊苷、甜菊醇+3Glc(#1)、Stev+3Glc(#34)、RebE和甜菊醇+5Glc(#22)的积累，增加产生的RebD/RebM的比例，以及减少RebG、RebA、甜菊醇+5Glc(#25)、甜菊醇+7Glc(异构体2)和甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累。具体地，UGT76G1 Q23H(SEQ ID NO：181)的表达导致甜茶苷、甜菊醇+6Glc(异构体1)的积累增加，以及RebB、甜菊醇+5Glc(#24)的积累减少。UGT76G1 T146G(SEQ ID NO：183)的表达导致甜茶苷的积累增加，以及RebB、甜菊醇+5Glc(#24)和甜菊醇+6Glc(#23)的积累减少。UGT76G1 L257G(SEQ ID NO：185)的表达导致甜菊醇+6Glc(异构体1)的积累增加。UGT76G1S283N(SEQ ID NO：188)的表达导致甜茶苷的积累增加，以及RebB、甜菊醇+5Glc(#24)和甜菊醇+6Glc(#23)的积累减少。参见表9D-F。

表9D.包含野生型UGT76G1或UGT76G1变体的宿主中甜菊醇糖苷(以μM计)的积累

表9E.包含野生型UGT76G1或UGT76G1变体的宿主中甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯酸或糖基化的对映贝壳杉烯醇(以AUC计)的积累

-KA：对映贝壳杉烯酸

-KL：对映贝壳杉烯醇

表9E包含野生型UGT76G1或UGT76G1变体的宿主中甜菊醇糖苷(以AUC计)的积累

与UGT76G1Q23H(SEQ ID NO：181)相比，UGT76G1Q23H H155L(SEQ ID NO：217)的表达增加了对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)和对映贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1)的积累，并减少了对映贝壳杉烯醇+2Glc(#8)和甜菊醇+6Glc(异构体1)的积累。与UGT76G1 T146G(SEQID NO：183)相比，UGT76G1 T146G H155L(SEQ ID NO：218)增加了对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、对映贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1)、RebB、RebA、RebD、甜菊醇+6Glc(#23)和甜菊醇+7Glc(异构体2)的表达，并减少了对映贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映贝壳杉烯醇+2Glc(#8)、1，2-二糖苷、甜茶苷、1，2-甜菊苷、RebE、甜菊醇+5Glc(#22)的积累。与UGT76G1L257G(SEQID NO：185)相比，GT76G1 L257G H155L(SEQ ID NO：219)的表达增加了对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、对映贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1)和甜菊醇+7Glc(异构体2)的积累，并且减少了对映贝壳杉烯醇+2Glc(#8)、1，2-二糖苷和甜菊醇+6Glc(异构体1)的积累。同样地，与野生型UGT76G1相比，UGT76G1 L257G H155L(SEQ ID NO：219)增加了RebD的积累。与UGT76G1 S283N(SEQ ID NO：188)相比，UGT76G1 S283N H155L(SEQ ID NO：220)的表达减少了甜菊醇+6Glc(异构体1)的积累。参见表9D-F。

UGT76G1变体也在包含额外拷贝的CPR1(SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：78)，额外拷贝的SrKAHe1(SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：94)和额外拷贝的UGT76G1(SEQ ID NO：8，SEQ IDNO：9)或UGT76G1变体的甜菊醇糖苷生产菌株中表达。测量甜菊醇糖苷、三糖基化的对映贝壳杉烯醇和三糖基化的对映贝壳杉烯酸水平的积累。参见图11。

增加RebD或RebM的积累的UGT76G1变体也在包含额外拷贝的CPR1(SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：78)和额外拷贝的SrKAHe1(SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：94)的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株中表达。对照甜菊醇糖苷生产菌株包含三个拷贝的野生型UGT76G1(SEQ ID NO：9)，包含变体的菌株包含两个拷贝的野生型UGT76G1(SEQ ID NO：9)和一个拷贝的UGT76G1变体。图11A示出了表达野生型UGT76G1(SEQ ID NO：9)、UGT76G1 Q23H(SEQ ID NO：181)、UGT76G1 I26W(SEQ ID NO：182)、UGT76G1 T146G(SEQ ID NO：183)、UGT76G1 H155L(SEQ IDNO：184)、UGT76G1 L257G(SEQ ID NO：185)或UGT76G1 S283N(SEQ ID NO：188)的生产菌株中对映贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)、对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、对映贝壳杉烯醇+2Glc(#8)以及与对映贝壳杉烯醇+3Glc(#6)共洗脱的对映贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1)的水平。在表达UGT76G1 Q23H(SEQ ID NO：181)、UGT76G1 I26W(SEQID NO：182)和UGT76G1 L257G(SEQ ID NO：185)的生产菌株中，糖基化的对映贝壳杉烯酸(对映贝壳杉烯酸+2Glc(#7)+对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)+对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2))的总水平最显著地增加(图11B)，并且对于表达UGT76G1 Q23H(SEQ ID NO：181)、UGT76G1 I26W(SEQ ID NO：182)和UGT76G1 T146G(SEQ ID NO：183)的生产菌株，糖基化的对映贝壳杉烯醇(与对映贝壳杉烯醇+3Glc(#6)共洗脱的对映贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1)以及对映贝壳杉烯醇+2Glc(#8)的总水平显著受到影响(图11C)。

图11D和11E示出了表达野生型UGT76G1(SEQ ID NO：9)、UGT76G1 Q23H(SEQ IDNO：181)、UGT76G1 I26W(SEQ ID NO：182)、UGT76G1 T146G(SEQ ID NO：183)、UGT76G1H155L(SEQ ID NO：184)、UGT76G1 L257G(SEQ ID NO：185)或UGT76G1 S283N(SEQ ID NO：188)的生产菌株中1，2-二糖苷、1，2-甜菊苷、甜菊醇+3Glc(#1)、甜菊醇+4Glc(#26)、甜菊醇+5Glc(#22)、甜菊醇+5Glc(#24)、甜菊醇+5Glc(#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1)、甜菊醇+6Glc(#23)、甜菊醇+7Glc(异构体2)、甜菊醇+7Glc(异构体5)、13-SMG、甜茶苷、RebG(1，3-甜菊苷)、RebA、RebB、RebD、RebE和RebM的积累。

图11D中测试的所有UGT76G1变体示出甜菊醇+4Glc(#26)的积累减少。与表达野生型UGT76G1的对照菌株相比，UGT76G1 Q23H(SEQ ID NO：181)、UGT76G1 I26W(SEQ ID NO：182)、UGT76G1 T146G(SEQ ID NO：183)、UGT76G1 L257G(SEQ ID NO：185)或UGT76G1 S283N(SEQ ID NO：188)(其均增加RebD的产生)的表达导致甜菊醇+5Glc(#25)的积累减少(图11D)。然而，增加RebM产生的UGT76G1 H155L(SEQ ID NO：184)变体的表达导致甜菊醇+5Glc(#25)的积累增加(图11D)。

与表达野生型UGT76G1的对照菌株相比，UGT76G1 Q23H(SEQ ID NO：181)、UGT76G1I26W(SEQ ID NO：182)、UGT76G1 T146G(SEQ ID NO：183)、UGT76G1 L257G(SEQ ID NO：185)或UGT76G1 S283N(SEQ ID NO：188)的表达导致甜菊醇+6Glc(#23)的积累增加，而UGT76G1H155L(SEQ ID NO：184)变体的表达导致甜菊醇+6Glc(#23)的积累减少(图11D)。与表达野生型UGT76G1的对照菌株相比，UGT76G1 Q23H(SEQ ID NO：181)、UGT76G1 I26W(SEQ ID NO：182)、UGT76G1 T146G(SEQ ID NO：183)、UGT76G1 L257G(SEQ ID NO：185)或UGT76G1 S283N(SEQ ID NO：188)的表达导致甜菊醇+7Glc(异构体2)的积累增加，而UGT76G1 H155L(SEQID NO：184)变体的表达导致甜菊醇+7Glc(异构体2)的积累减少(图11D)。UGT76G1 Q23H(SEQ ID NO：181)、UGT76G1 I26W(SEQ ID NO：182)、UGT76G1 T146G(SEQ ID NO：183)、UGT76G1 L257G(SEQ ID NO：185)或UGT76G1 S283N(SEQ ID NO：188)的表达导致甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累增加(图11D)。

在独立的实验中还测试了包含较高拷贝数的CPR1(SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78)和SrKAHe1(SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94)的甜菊醇糖苷生产菌株。如表9G-9I所示，与野生型UGT76G1相比，UGT76G1 H155L(SEQ ID NO：184)的表达降低了对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)、RebD、甜菊醇+6Glc(#23)、甜菊醇+7Glc(异构体2)的水平。与野生型UGT76G1相比，UGT76G1 Q23H(SEQ ID NO：181)、UGT76G1 T146G(SEQ ID NO：183)、UGT76G1 L257G(SEQ IDNO：185)或UGT76G1 S283N(SEQ ID NO：188)的表达各自减少了甜菊醇+4Glc(#26)和甜菊醇+5Glc(#24)的积累。具体地，与野生型UGT76G1相比，UGT76G1 T146G(SEQ ID NO：183)的表达增加了对映贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)、RebD、甜菊醇+6Glc(#23)和甜菊醇+7Glc(异构体2)的量，并且减少了RebG、甜菊醇+5Glc#25的量。与野生型UGT76G1相比，UGT76G1 L257G(SEQ ID NO：185)的表达增加了对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)的积累，并减少了对映贝壳杉烯酸酸+3Glc(异构体2)和甜菊醇+5Glc(#25)的积累。与野生型UGT76G1相比，UGT76G1 S283N(SEQ ID NO：188)的表达增加了对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)、RebD、甜菊醇+6Glc(异构体1)和甜菊醇+7Glc(异构体2)的积累，并减少了RebG和甜菊醇+5Glc(#25)的积累。与单变体UGT76G1 L257G相比，UGT76G1 L257G H155L的表达减少了对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)的积累。与野生型UGT76G1相比，双变体UGT76G1Q23H H155L的表达减少了甜菊醇+5Glc(#25)的积累。与野生型UGT76G1相比，双变体UGT76G1 S283N H155L的表达减少了对映贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)的积累。参见表9G-9I。

表9G.包含野生型UGT76G1或UGT76G1变体的宿主中甜菊醇糖苷(以μM计)的积累

表9H.包含野生型UGT76G1或UGT76G1变体的宿主中甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯酸或糖基化的对映贝壳杉烯醇(以μM计)的积累

-KA：对映贝壳杉烯酸

-KL：对映贝壳杉烯醇

表9I.包含野生型UGT76G1或UGT76G1变体的宿主中甜菊醇糖苷(以AUC计)的积累

实施例9：UGT76G1 H155L变体的进一步表征

在实施例2和8中描述的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株中表达UGT76G1 H155L(SEQID NO：184)。如图6A所示，与表达野生型UGT76G1的对照菌株(黑色条)相比，表达UGT76G1H155L的菌株(灰色条)产生更高水平的RebM、RebA、RebB、13-SMG和甜茶苷。表达UGT76G1H155L的甜菊醇糖苷生产菌株产生与RebD相比更高滴度的RebM(图6A)。

与表达野生型UGT76G1的对照菌株(黑色条)相比，表达UGT76G1 H155L(SEQ IDNO：184)的菌株产生更高总水平的甜菊醇糖苷(13-SMG+1，2-二糖苷+甜茶苷+RebG+RebB+RebA+RebE+RebD+RebM)和RebD+RebM(灰色条)(图6B)。因此，与表达野生型UGT76G1的对照菌株(黑色条)相比，表达UGT76G1 H155L的甜菊醇糖苷生产菌株(灰色条)表现出甜菊醇糖苷生产的20％增加，以及RebD和RebM滴度的10％增加(图6C)。

与表达野生型UGT76G1的对照菌株(黑色条)相比，表达UGT76G1 H155L的菌株(灰色条)还产生较少量的1，2-二糖苷、1，2-甜菊苷、三糖基化的甜菊醇分子(甜菊醇+3Glc(#1))、五糖基化的甜菊醇分子(甜菊醇+5Glc(#22)、两种六糖基化的甜菊醇分子(甜菊醇+6Glc(异构体1和#23))和七糖基化的甜菊醇分子(甜菊醇+7Glc(异构体2))，但是增加量的四糖基化分子(甜菊醇+4Glc(#26))和两种五糖基化的甜菊醇分子(甜菊醇+5Glc(#24和#25))。对于检测的特定的甜菊醇糖苷的结构，参见图1、图7和图8。

已经详细地并通过参考其具体实施方案描述了本发明，但是明显的是，在不脱离由所附权利要求限定的本发明的范围的情况下，可以进行修改和变化。更具体地，尽管在本文中将本发明的一些方面鉴定为特别有利的，但是预期本发明不一定限于本发明的这些特定方面。

表10.本文中所公开的序列

Claims (42)

1.重组宿主细胞，其包含以下的至少一种重组基因：

(a)编码与SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的UGT91D2e多肽的基因；

(b)编码与SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的嵌合多肽的基因；

(c)编码与SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的UGT85C2多肽的基因；和/或

(d)编码与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的UGT76G1多肽的基因；

其中所述重组宿主细胞能够在细胞培养液中生产甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物.

2.权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述UGT91D2e多肽包含在SEQ ID NO：11的残基93、99、114、144、148、152、195、196、199、211、213、221、286、384、426、438或466处具有至少一个氨基酸替换的UGT91D2e多肽.

3.权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述UGT85C2多肽包含在SEQ ID NO：7的残基21、48、49、84、86、87、91、92、95、122、334或334处具有至少一个氨基酸替换的UGT85C2多肽.

4.权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述UGT76G1多肽包含在SEQ ID NO：9的残基23、26、55、146、257、283和337处具有至少一个氨基酸替换的UGT76G1多肽.

5.权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述UGT91D2e多肽包含一种或更多种UGT91D2e多肽变体，所述UGT91D2e多肽变体包含：SEQ ID NO：11的P93V、S99I、S114F、T144K、T144L、T144M、A148K、M152T、L195G、L195C、L195S、L195N、L195V、V196P、K199C、L211H、L211M、L211I、L211C、L211T、L213E、S221I、V286C、V286N、V286S、G384W、G384K、G384Y、E426G、E438H、3438M或A466V.

6.权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述UGT85C2多肽包含一种或更多种UGT85C2多肽变体，所述UGT85C2多肽变体包含：SEQ ID NO：7的Q21L、Q21T、Q21V、F48S、F48H、F48Y、F48R、F48Q、F48W、F48T、I49V、S84G、S84A、S84T、S84C、S84P、S84N、S84V、P86R、P86G、I87H、I87P、I87M、I87Y、L91K、L91R、L91T、L92F、L92I、L92M、I95K、F122S、L334S或L334M.

7.权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述UGT76G1多肽包含一种或更多种UGT76G1多肽变体，所述UGT76G1多肽变体包含：SEQ ID NO：9的Q23H、I26W、T146G、H155L、L257G、S253W、T284G、S283N、K337P或T55K.

8.权利要求1至7中任一项所述的重组宿主细胞，其还包含以下的至少一种重组基因：

(a)编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(GGPPS)多肽的基因；

(b)编码对映柯巴基二磷酸合酶(CDPS)多肽的基因；

(c)编码对映贝壳杉烯合酶(KS)多肽的基因；

(d)编码对映贝壳杉烯氧化酶(KO)多肽的基因；

(e)编码细胞色素P450还原酶(CPR)多肽的基因；以及

(f)编码对映贝壳杉烯酸羟化酶(KAH)多肽的基因；

(g)编码UGT74G1多肽的基因；和/或

(h)编码EUGT11多肽的基因；

其中所述重组宿主细胞能够在细胞培养液中生产甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物.

9.权利要求8所述的重组宿主细胞，其中：

(a)所述GGPPS多肽包含与SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：116所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；

(b)所述CDPS多肽包含与SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；

(c)所述KS多肽包含与SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；

(d)所述KO多肽包含与SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74或SEQ ID NO：76所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；

(e)所述CPR多肽包含与SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；

(f)所述KAH多肽包含与SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：108、SEQID NO：110、SEQ ID NO：112或SEQ ID NO：114所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；

(g)所述UGT74G1多肽包含与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽；

(h)所述EUGT11多肽包含与SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列具有至少65％同一性的多肽.

10.权利要求1至9中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述细胞培养液包含：

(a)由所述重组宿主细胞生产的甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物；

(b)葡萄糖、果糖和/或蔗糖；和/或

(c)包含微量金属、维生素、盐、酵母氮源基础(YNB)和/或氨基酸的补充营养物.

11.权利要求1至10中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主包含植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、藻类细胞或细菌细胞.

12.权利要求11所述的重组宿主细胞，其中所述细菌细胞包含埃希氏菌属(Escherichia)细胞、乳杆菌属(Lactobacillus)细胞、乳球菌属(Lactococcus)细胞、棒状杆菌属(Cornebacterium)细胞、醋杆菌属(Acetobacter)细胞、不动杆菌属(Acinetobacter)细胞或假单胞菌属(Pseudomonas)细胞.

13.权利要求11所述的重组宿主细胞，其中所述真菌细胞包含酵母细胞。

14.权利要求13所述的重组宿主细胞，其中所述酵母细胞是来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、棉阿舒囊霉(Ashbyagossypii)、产朊假丝酵母(Cyberlindnera jadinii)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、Arxula adeninivorans、红发夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)或白色念珠菌(Candida albicans)物种的细胞.

15.权利要求14所述的重组宿主细胞，其中所述酵母细胞是酵母菌(Saccharomycete).

16.权利要求15所述的重组宿主细胞，其中所述酵母细胞是来自酿酒酵母物种的细胞.

17.在细胞培养液中生产甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物的方法，其包括在表达一种或更多种基因的条件下，在培养基中培养权利要求1至16中任一项所述的重组宿主细胞；

其中所述基因中的至少一种是重组基因；

其中所述甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物由所述重组宿主细胞生产.

18.权利要求17所述的方法，其中组成型地表达一种或更多种所述基因，和/或诱导一种或更多种所述基因的表达.

19.用于生产甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物的方法，其包括使用以下的一种或更多种进行植物衍生组分或者合成甜菊醇或甜菊醇糖苷的全细胞生物转化：

(a)与SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的UGT91D2e多肽；

(b)与SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的嵌合多肽；

(c)与SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的UGT85C2多肽；和/或

(d)与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的UGT76G1多肽；

其中所述多肽中的至少一种是重组多肽.

20.权利要求19所述的方法，其中所述全细胞是权利要求1至16中任一项所述的重组宿主细胞.

21.权利要求17至20中任一项所述的方法，其中将所述重组宿主细胞在一定温度下在发酵罐中培养一段时间，其中所述温度和时间有利于甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物的生产.

22.用于生产甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物的体外方法，其包括向反应混合物中添加以下的一种或更多种：

(a)与SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的UGT91D2e多肽；

(b)与SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的嵌合多肽；

(c)与SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的UGT85C2多肽；和/或

(d)与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的UGT76G1多肽，

以及植物衍生组分或者合成甜菊醇或甜菊醇糖苷；

其中所述多肽中的至少一种是重组多肽；以及

在所述反应混合物中合成甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物.

23.权利要求17至22中任一项所述的方法，其还包括从所述细胞培养液中分离单独的或组合的甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物.

24.权利要求23所述的方法，其中所述分离步骤包括：

(a)提供包含单独的或组合的甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物的细胞培养液；

(b)使所述细胞培养液的液相与所述细胞培养液的固相分离以获得包含单独的或组合的甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物的上清液；

(c)提供一种或更多种吸附树脂，包括提供在填充柱中的吸附树脂；以及

(d)使步骤(b)的所述上清液与所述一种或更多种吸附树脂接触以获得单独的或组合的甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物的至少一部分，从而分离单独的或组合的甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物.

25.权利要求17至22中任一项所述的方法，其还包括回收单独的甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物，或者包含甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物的组合物.

26.权利要求25所述的方法，其中回收的组合物相对于甜菊植物的甜菊醇糖苷组合物富含甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物，并且相对于植物衍生甜菊提取物具有降低水平的非甜菊醇糖苷甜菊植物衍生组分.

27.权利要求17至22中任一项所述的方法，其中所述细胞培养液包含：

(a)由权利要求1至12中任一项所述的重组宿主细胞生产的一种或更多种甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物；

(b)葡萄糖、果糖和/或蔗糖；和/或

(c)包含微量金属、维生素、盐、YNB和/或氨基酸的补充营养物.

28.权利要求22所述的方法，其中所述反应混合物包含：

(a)在所述反应混合物中生产的一种或更多种甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物；

(b)UGT多肽；

(c)UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和/或N-乙酰基-葡糖胺；和/或；

(d)反应缓冲液和/或盐.

29.权利要求17至28中任一项所述的方法，其中所述重组宿主细胞包含植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、藻类细胞或细菌细胞.

30.权利要求29所述的方法，其中所述细菌细胞包含埃希氏菌属细胞、乳杆菌属细胞、乳球菌属细胞、棒状杆菌属细胞、醋杆菌属细胞、不动杆菌属细胞或假单胞菌属细胞.

31.权利要求29所述的方法，其中所述真菌细胞包含酵母细胞.

32.权利要求31所述的方法，其中所述酵母细胞是来自酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、解脂耶氏酵母、光滑念珠菌、棉阿舒囊霉、产朊假丝酵母、巴斯德毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母、多形汉逊酵母、博伊丁假丝酵母、Arxula adeninivorans、红发夫酵母或白色念珠菌物种的细胞.

33.权利要求31所述的方法，其中所述酵母细胞是酵母菌.

34.权利要求33所述的方法，其中所述酵母细胞是来自酿酒酵母物种的细胞.

35.权利要求1至16中任一项所述的重组宿主细胞或权利要求17至34中任一项所述的方法，其中

(a)所述甜菊醇糖苷包括13-SMG、19-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜茶苷、RebA、RebB、RebD、RebE、RebM、二糖基化、三糖基化的甜菊醇、四糖基化的甜菊醇、五糖基化的甜菊醇、六糖基化的甜菊醇、七糖基化的甜菊醇和/或其异构体；

(b)所述糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物包含二糖基化的对映贝壳杉烯醇、三糖基化的对映贝壳杉烯醇和/或其异构体；和/或

(c)所述糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物包括二糖基化的对映贝壳杉烯酸、三糖基化的对映贝壳杉烯酸和/或其异构体.

36.权利要求35所述的重组宿主细胞或方法，其中

(a)所述二糖基化的甜菊醇包含表1的化合物2.23；

(b)所述三糖基化的甜菊醇包含表1的化合物3.1和/或化合物3.34；

(c)所述四糖基化的甜菊醇包含表1的化合物4.26和/或化合物4.33；

(d)所述五糖基化的甜菊醇包含表1的化合物5.22、化合物5.24和/或化合物5.25；

(e)所述六糖基化的甜菊醇包含表1的化合物6.1和/或化合物6.23；

(f)所述七糖基化的甜菊醇包含表1的化合物7.2、化合物7.5和/或化合物7.13；

(g)所述糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物包含表1的化合物KA3.1、化合物KA3.2和/或化合物KA2.7；和/或

(h)所述糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物包含表1的化合物KL2.8和/或与化合物KL3.6共洗脱的化合物KL3.1.

37.权利要求36所述的重组宿主细胞或方法，其中

(a)化合物4.26具有以下结构：

(b)化合物5.22具有以下结构：

(c)化合物6.1具有以下结构：

(d)化合物7.2具有以下结构：

(e)化合物7.5具有以下结构

(f)化合物KA3.1具有以下结构：

(g)化合物KA3.2具有以下结构：

以及

(h)化合物KL3.1具有以下结构：

38.由权利要求1至16中任一项所述的重组宿主细胞或者权利要求17至34中任一项所述的方法生产的甜菊醇糖苷组合物，其中所述组合物具有这样的甜菊醇糖苷组合物，所述甜菊醇糖苷组合物相对于甜菊植物的甜菊醇糖苷组合物富含RebD、RebM或其异构体，并且相对于植物衍生甜菊提取物具有降低水平的非甜菊醇糖苷甜菊植物衍生组分.

39.细胞培养液，其包含：

(a)权利要求1至16中任一项所述的重组宿主细胞；以及

(b)由所述重组宿主细胞生产的一种或更多种甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物；

其中一种或更多种甜菊醇糖苷以至少1mg/升培养液的浓度存在.

40.细胞培养液，其包含：

(a)由权利要求1至16中任一项所述的重组宿主细胞生产的一种或更多种甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物；

(b)葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、乙醇和/或甘油，和/或

(c)包含微量金属、维生素、盐、YNB和/或氨基酸的补充营养物.

41.细胞裂解物，其包含：

(a)由权利要求1至16中任一项所述的重组宿主细胞生产的一种或更多种甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物；

(b)葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、乙醇、甘油、尿苷二磷酸(UDP)-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和/或N-乙酰基-葡糖胺；和/或

(c)包含微量金属、维生素、盐、YNB和/或氨基酸的补充营养物.

42.反应混合物，其包含：

(a)在所述反应混合物中生产的一种或更多种甜菊醇糖苷、糖基化的对映贝壳杉烯醇化合物和/或糖基化的对映贝壳杉烯酸化合物；

(b)UGT多肽；

(c)葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、乙醇、甘油、尿苷二磷酸(UDP)-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和/或N-乙酰基-葡糖胺；和/或

(d)反应缓冲液和/或盐。