CN108142443B - 一种细辛提取物及其作为植物抗菌物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种细辛提取物,所述的细辛提取物为水提物或醇提物,其中醇提物提取方法为:是称取粉碎样品800g,用5倍量的乙醇浸泡植物干粉,室温下静置12h;超声提取2h;减压抽滤,连续提取3次,合并滤液,在45℃下用旋转蒸发仪浓缩,干燥后,4℃中保存、备用;还包括细辛提取物作为植物抗菌物的应用,其中包括其能够明显抑制炭黑曲霉赭曲霉毒素A(OTA)的产生。本发明所用的细辛提取物是一种植物源生物农药,其具有抗菌活性高、抑菌谱广、不易产生抗性、对人和动物无毒的特点,可以提高葡萄果实食品安全性。
Description
技术领域
本发明涉及生物农药领域,具体涉及植物源生物农药,更具体涉及一种细辛提取物及其作为植物抗菌物的应用。
背景技术
葡萄是世界上最古老的、分布最广的水果之一。其栽培历史源远流长,产量约占世界水果总产量的四分之一。全球已经报道了超过70种葡萄属植物,葡萄品种8000余种,分布于温带和亚热带,一般为北纬20°-52°,南纬30°-45°。根据地理起源差异,葡萄被分为北美、欧亚和东亚三个种群。中国是葡萄属植物资源分布最为丰富的国家之一,东亚种群已知种类有42个种中国都有,还有1个亚种、12个变种。种植的葡萄品种约有500种,葡萄种植面积位居全球第二,仅次于西班牙。2016年,我国葡萄面积已超过800千公顷(1240万亩),鲜食葡萄产量自2000年之后一直稳居世界首位。
由于葡萄外形风味俱佳且营养丰富,且近20年来栽培葡萄获得了良好的经济效益和社会效益,我国葡萄产业发展迅速。但是,葡萄与其它园艺作物一样,病虫害的严重危害是产业健康发展的限制因子,常见的、危害严重的葡萄病害如葡萄灰霉病、白腐病、炭疽病等;这些病害的为害严重影响葡萄质量和产量,不但是我国葡萄生产上必须解决的困难,而且也是世界性葡萄生产上的难题。此外,真菌毒素是影响食品安全重要因素,其中最重要的有炭黑曲霉病菌产生的赫曲霉毒素A(OTA)毒素;该毒素含量超标会对人体造成很大的伤害,甚至致癌。农业生产中,常用防控方法为使用化学农药,但是化学防治存在引起葡萄病原菌的抗药性、残留污染、再猖獗等风险。因此寻找非化学农药是产业发展的重要任务,也是科学研究的重要课题。从植物中挖掘植物源方法,包括开发植物源农药、从植物源化合物中寻找先导化合物、甚至植物浸提液的直接利用,是这个发展方向的重要内容。
细辛(Asarum sieboldii Miq.)是马兜铃科(Aristolochiaceae)细辛属(Asarum)植物,产于山东、安徽、浙江、江西、河南、湖北、陕西、四川,生于海拔1200-2100米林***湿腐植土中。日本和朝鲜也有。本种全草入药。但未见将其作为生物农药应用到葡萄病害防治的报道和研究。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种细辛提取物及其作为植物抗菌物的应用,能够达到较理想的防治效果,且对炭黑曲霉产OTA能力具有显著的抑制作用,可提高葡萄食品安全性。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案是:
一种细辛提取物,所述的细辛提取物为水提物或醇提物,所述的水提物提取方法为:称取细辛粉碎干品100g,加蒸馏水1000mL,浸泡30min。先用武火煮沸,后改用文火,煎煮提取40min,药液用4层纱布趁热过滤,重复提取一次,合并2次滤液后用文火浓缩至浓度为1000mg/mL,4℃保存、备用;所述的醇提物提取方法为:是称取粉碎样品800g,用5倍量的乙醇浸泡植物干粉,室温下静置12h;超声提取2h;减压抽滤,连续提取3次,合并滤液,在45℃下用旋转蒸发仪浓缩,干燥后,4℃中保存、备用。
还涉及一种细辛提取物作为植物抗菌物的应用,所述的细辛提取物对以下病害病原菌有显著的抑菌活性,主要包括葡萄灰霉病菌、葡萄白腐病菌、葡萄炭疽病菌和炭黑曲霉病菌。
进一步,其中所述的葡萄炭疽病菌包括对多菌灵高抗炭疽病菌菌株,所述的灰霉病菌包括对多菌灵高抗灰霉病菌菌株。
进一步,所述的水提物浓度为6.25mg/mL-100mg/mL,所述的醇提物浓度为0.3125mg/mL-5mg/mL。
进一步,当水提物为100mg/mL时,对炭疽病菌、白腐病菌和灰霉病菌的抑菌率为40.40%、74.87%和37.50%;当醇提物浓度为5mg/mL时,对灰霉病菌抑菌率为97.13%,对白腐病菌、炭疽病菌、炭黑曲霉病菌抑制率均高达100%。当醇提物浓度为2.5mg/mL时,对4种病原菌的抑菌率均在85.5%以上;当醇提物浓度为5mg/mL时,对多菌灵敏感炭疽病菌菌株FJZZ-62、coll-9、coll-20抑菌率分别为96.30%、94.33%和96.88%,对多菌灵高抗炭疽病菌菌株FJND-9、GZSD-89抑制率均高达100%,对FJND-40的抑制率也达到96.09%,对多菌灵敏感灰霉病菌菌株GXGL-7、GXNN-7病菌菌抑菌率均高达100%,对GXNN-6抑菌率为96.21%,对多菌灵高抗灰霉病菌菌株HBLF-10、GXZY-7抑制率均高达100%,对GXZY-4的抑制率达97.01%。
进一步,所述的醇提物对炭黑曲霉病菌产生OTA具有明显的抑制作用,当醇提物浓度为5mg/mL时,OTA产生滞后最明显
本发明的有益效果是:本发明涉及的细辛提取物作为有效成分的杀菌药物是一种植物源生物农药,属于生物药物的一种,符合现代社会对新农药的要求。其次,细辛提取物具有抗菌活性高、抑菌谱广、不易产生抗性、对人和动物无毒的特点。另外,其不仅对葡萄果实常见病原菌有抑制效果,还对炭黑曲霉产OTA能力具有显著的抑制作用,可以提高葡萄果实食品安全性。
具体实施方式
下面结合较佳实施例进行详细阐述,以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解,从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例1:
一、水提物和醇提物的制备
本发明的细辛购自安徽亳州药材市场。将备用材料晒干,粉碎,放在通风干燥处保存备用。
水提物提取方法为:称取龙葵粉碎干品100g,加蒸馏水1000mL,浸泡30min。先用武火煮沸,后改用文火,煎煮提取40min。药液用4层纱布趁热过滤。重复提取一次,合并2次滤液后用文火浓缩至浓度为1000mg/mL。4℃保存、备用。细辛醇提步骤为:是称取粉碎样品800g,用5倍量的乙醇浸泡植物干粉,室温下静置12h;超声提取2h;减压抽滤,连续提取3次,合并滤液,在45℃下用旋转蒸发仪浓缩,干燥后,4℃中保存、备用。
二、抑菌培养及OTA的检测方法
采用菌丝生长速率法测定细辛水提物、醇提物对葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、葡萄白腐病菌(Coniothyrium diplodiella)、葡萄炭疽病菌(Glomerellacingulata)和炭黑曲霉(Aspergillus carbonarius)的抑菌活性。具体步骤如下:
将菌种活化后,用无菌打孔器(Ф=5mm)在培养皿边缘菌丝生长旺盛处均匀打孔,制得菌饼,接种到培养基上,每个培养皿中央接一个菌饼,在温度为25-28℃、湿度为73%的培养箱中倒置培养2-7d后,用十字交叉法测菌落直径,计算抑制率。每个处理设3个重复。
菌种在CYA培养基上培养14d,每天用无菌打孔器(Φ=5mm)打取12块带菌体的培养物。将带菌培养物放于5mL小试管中,称量后加入甲醇2mL,漩涡震荡1min,静止提取60min后,先用0.45μm滤膜过滤,然后用0.22μm滤膜过滤,最后用超高效液相-串级质谱仪进行检测。
超高效液相-串质谱仪检测条件:采用美国Water的超高液相色谱仪XevoTM TQ-S进行编程并自动进样。流动相为A1:色谱乙腈;A2:色谱甲醇;B1:0.2%甲酸水;B2:水;流速设置为:0.3mL/min;进样量:1μL。根据所取琼脂块的质量和检测出的毒素含量计算出每克培养物中的毒素浓度,表示为毒素产量(ng/g)。
三、水提物及醇提物的抑菌作用
结果表明,细辛水提物对白腐病菌的抑菌率为74.87%,抑菌效果优于炭疽病菌、灰霉病菌,而对炭黑曲霉病菌没有抑制作用。
细辛醇提物对4种葡萄病原真菌表现出较好的抑菌效果。当细辛醇提物浓度为5mg/mL时,对灰霉病菌抑菌率为97.13%,对白腐病菌、炭疽病菌、炭黑曲霉病菌抑制率均高达100%。当醇提物浓度为2.5mg/mL时,对4种病原菌的抑菌率均在85.5%以上,EC50值为0.48-1.10mg/mL。细辛醇提物对白腐病菌的抑菌效果最好,当醇提物浓度为1.25mg/mL时,对白腐病菌的抑制率高达98.08%。
四、醇提物对多菌灵敏感炭疽病菌菌株的抑制作用
当细辛醇提物浓度为5mg/mL时,对多菌灵敏感炭疽病菌菌株FJZZ-62、coll-9、coll-20抑菌率分别为96.30%、94.33%和96.88%,其EC50分别为0.52、0.92和0.46mg/mL。
五、醇提物对多菌灵高抗炭疽病菌菌株的抑制作用
细辛醇提物对多菌灵高抗炭疽病菌菌株表现出很好的抑制作用。当醇提物浓度为5mg/mL时,对多菌灵高抗炭疽病菌菌株FJND-9、GZSD-89抑制率均高达100%,对FJND-40的抑制率也达到96.09%。EC50分别为0.46、1.39和0.77mg/mL。而100μg/mL多菌灵对FJND-9、FJND-40和GZSD-89菌株的抑制率分别为9.80%、21.50%和10.01%。当醇提物浓度为0.625mg/mL时,其对高抗菌株的抑制活性也显明强于100μg/mL多菌灵的活性。
六、醇提物对多菌灵敏感灰霉病菌菌株的抑制作用
细辛醇提物浓度为5mg/mL时,对多菌灵敏感灰霉病菌菌株GXGL-7、GXNN-7病菌菌抑菌率均高达100%,对GXNN-6抑菌率为96.21%,其EC50为1.06-1.59mg/mL的。
七、醇提物对多菌灵高抗灰霉病菌菌株的抑制作用
浓度为100μg/mL多菌灵对HBLF-10、GXZY-4和GXZY-7菌株的抑制率分别为53.45%、55.11%和14.76%。细辛醇提物对多菌灵高抗灰霉病菌菌株具有较好的抑制作用,其作用强于100μg/mL多菌灵。当其浓度为5mg/mL时,对多菌灵高抗灰霉病菌菌株HBLF-10、GXZY-7抑制率均高达100%,对GXZY-4的抑制率达97.01%。其EC50为1.04-1.34mg/mL。
八、醇提物对黑曲霉产毒素的抑制作用
在空白对照中,OTA在第3d开始产生,浓度为6.22ng/g,第9d OTA产量达到高峰,浓度为2970.78ng/g。当培养基添加细辛醇提物以后,OTA的产生较空白对照出现延滞。细辛醇提物浓度越高,OTA产生的时间越滞后,产毒素越少。醇提物浓度为0.3125mg/mL时,第5d则开始有OTA产生,OTA浓度为196.44ng/g。醇提物浓度为5mg/mL时,OTA产量滞后最明显,第9d才有少量OTA产生,OTA浓度为31.56ng/g,14d时为563.78ng/g,明显低于对照。
以上所述仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换,或直接或间接运用在其他相关的技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (5)
1.一种细辛提取物作为植物抗病原菌的应用,其特征在于:所述的细辛提取物为水提物或醇提物,所述的水提物提取方法为:称取细辛粉碎干品100g,加蒸馏水1000mL,浸泡30min,先用武火煮沸,后改用文火,煎煮提取40min,药液用4层纱布趁热过滤,重复提取一次,合并2次滤液后用文火浓缩至浓度为1000mg/mL,4℃保存、备用;所述的醇提物提取方法为:称取粉碎样品800g,用5倍量的乙醇浸泡植物干粉,室温下静置12h;超声提取2h;减压抽滤,连续提取3次,合并滤液,在45℃下用旋转蒸发仪浓缩,干燥后,4℃中保存、备用,所述病原菌包括葡萄灰霉病菌、葡萄白腐病菌、葡萄炭疽病菌和炭黑曲霉病菌。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,其中所述的葡萄炭疽病菌包括对多菌灵高抗炭疽病菌菌株,所述的灰霉病菌包括对多菌灵高抗灰霉病菌菌株。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述的水提物浓度为6.25mg/mL-100mg/ mL,所述的醇提物浓度为0.3125mg/mL-5mg/mL。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,当水提物为100mg/mL时,对炭疽病菌、白腐病菌和灰霉病菌的抑菌率分别为40.40%、74.87%和37.50%;当醇提物浓度为5mg/mL时,对灰霉病菌抑菌率为97.13%,对白腐病菌、炭疽病菌、炭黑曲霉病菌抑制率均高达100%;当醇提物浓度为2.5mg/mL时,对4种病原菌的抑菌率均在85.5%以上;当醇提物浓度为5mg/mL时,对多菌灵敏感炭疽病菌菌株FJZZ-62、coll-9、coll-20抑菌率分别为96.30%、94.33%和 96.88%,对多菌灵高抗炭疽病菌菌株FJND-9、GZSD-89抑制率均高达100%,对FJND-40的抑制率也达到96.09%,对多菌灵敏感灰霉病菌菌株GXGL-7、GXNN-7病菌菌抑菌率均高达100%,对GXNN-6抑菌率为96.21%,对多菌灵高抗灰霉病菌菌株HBLF-10、GXZY-7抑制率均高达100%,对GXZY-4的抑制率达97.01%。
5.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述的醇提物对炭黑曲霉病菌产生OTA具有明显的抑制作用,当醇提物浓度为5mg/mL时,OTA产生滞后最明显。
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