CN111778165B - 黑曲霉dfy1及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株黑曲霉DFY1及其应用，所述黑曲霉DFY1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏日期：2020年8月10日，保藏编号：CGMCC NO.20242，菌种的分类命名为Aspergillus niger。本发明的黑曲霉DFY1源于辽细辛根部的内生真菌，可以通过提高孢子数量增加细辛醚产量。得率相对于干燥菌丝达到4.5%，经过初步纯化可以获得。

Description

黑曲霉DFY1及其应用
技术领域
本发明涉及一株黑曲霉及其在制备细辛醚中的应用。
背景技术
细辛醚，又称细辛脑，是一种来源于植物中的芳香醚化合物，化学名称为2，4，5-三甲氧基-1-丙烯基苯，分子式C12H16O3，常见两种同分异构体顺式（β）和反式（α）细辛醚。顺式和反式细辛醚均有报道称可以对脑损伤有一定的修复作用。然而从植物中提取天然化合物，不仅受到地域、季节、天气、产量等因素的严重限制，且产量低，植物消耗量大，需要大量的种植环节。
反式细辛醚传统制备方法是以对二苯酚为原料经过一系列复杂的化学合成方法制得，顺式细辛醚制备方法则多为植物挥发油纯化。因此，为了降低生产对环境的污染及减少对作物的消耗，达到可持续发展的目标，尽量简化工艺的目标，开发高效绿色的生产工艺是社会发展的必然要求。
发明内容
为了避免现有细辛醚合成繁琐工艺、作物过度消耗，同时解决植物提取率低，降低产品生产成本等问题，本发明提供了一株黑曲霉DFY1及其应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
黑曲霉DFY1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏日期：2020年8月10日，保藏编号：CGMCC NO.20242，菌种的分类命名为Aspergillus niger。
本发明中，所述黑曲霉DFY1为从新鲜的七年生辽细辛根部分离纯化后得到的内生真菌，其菌落形态如下：黑曲霉特有的形态学，在固体平板上开始是白色或黄色的菌落，2~5天后生成黑色孢子，绒毛质地。棉蓝指示剂染色后的显微镜观察到分生孢子头是放射状，顶囊球形，小梗，密生于顶囊全部表面。黑曲霉DFY1的ITS1和ITS4鉴定结果通过NCBI/blast比对后发现与典型的黑曲霉例如CMXY30575的序列同源性高达100%，确定为黑曲霉。
本发明中，所述黑曲霉DFY1可用于制备细辛醚，具体制备方法如下：
步骤一、将黑曲霉DFY1接种于发酵培养基中进行发酵培养，获得发酵菌液或者固体斜面孢子，其中：
所述黑曲霉DFY1为固体孢子发酵后的孢子或液体发酵后的菌丝体，孢子数量为（1~4）×108cfu/mL，接种量为0.5~1%（v/v）；
所述发酵培养过程在摇瓶中，发酵培养温度为28~37℃，时间为5~60天，转速为100~200rpm；
所述发酵培养基为麦芽汁液体培养基、麦芽汁固体培养基、土豆-葡萄糖液体培养基或土豆-葡萄糖固体培养基；
所述发酵培养基为麦芽汁液体培养基时，发酵培养温度优选为32℃，时间优选为5~15天，转速优选为120rpm；
所述发酵培养基为麦芽汁固体培养基时，发酵培养温度优选为32℃，时间优选为5~15天；
所述发酵培养基为土豆-葡萄糖液体培养基时，发酵培养温度优选为28℃，时间优选为18~30天，转速优选为120rpm；
所述发酵培养基为土豆-葡萄糖固体培养基时，培养温度优选为28℃，时间优选为18~30天；
所述发酵培养基在使用前优选的经过高温湿热灭菌，高温湿热灭菌的温度优选为121℃，时间优选为20min；
步骤二、将发酵菌液或固体斜面孢子冷冻真空干燥，获得黑曲霉DFY1固体菌粉，其中：所述黑曲霉DFY1固体菌粉中含水量小于5%（v/v），黑曲霉DFY1菌粉中活孢子优选为（1~3）×108cfu/g；
步骤三、向黑曲霉DFY1固体菌粉中添加甲醇进行超声萃取，而后采用有机溶剂进行分级纯化得到纯度为80%的顺式细辛醚粗产品，顺式细辛醚的产率相对于菌丝体的重量为4.5%。
相比于现有技术，本发明具有如下优点：
本发明的黑曲霉DFY1源于辽细辛根部的内生真菌，可以通过提高孢子数量增加细辛醚产量。得率相对于干燥菌丝达到4.5%，经过初步纯化可以获得。
保藏信息：
保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏单位简称：CGMCC；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所；
保藏日期：2020年8月10日；
保藏编号：CGMCC NO.20242；
分类命名：Aspergillus niger。
附图说明
图1为马铃薯-葡萄糖固体培养基孢子；
图2为棉兰染色后油镜观察孢子；
图3为黑曲霉DFY1产顺式细辛醚时间比对结果，（上）发酵21天，（下）顺式细辛醚标准品；
图4为黑曲霉DFY1孢子产顺式细辛醚结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
实施例1
（1）培养基准备：
马铃薯-葡萄糖液体培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、蒸馏水1000mL，pH7.0，分装至摇瓶中，于121℃灭菌20min。
马铃薯-葡萄糖固体培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH7.0，121℃灭菌20min，于45~55℃倾倒至无菌的培养皿。
麦芽汁液体培养基：麦芽浸粉130g，氯霉素0.1g，蒸馏水1000mL，pH6.0，分装至摇瓶中，于121℃灭菌20min。
（2）真菌筛选：
挑选干净无害的辽细辛根部，用75%乙醇和无菌生理盐水分别浸泡1min，重复2次。用灭菌剪刀将细辛根切成1mm的块状放置在马铃薯-葡萄糖固体培养基，放置28℃培养箱中倒置培养5天，观察并挑选长势良好的菌落于新的马铃薯-葡萄糖固体培养基（图1）；将所挑选出的菌于马铃薯-葡萄糖液体培养基和麦芽汁液体培养基中进行培养，收集发酵产物后用甲醇进行超声浓缩后，用高效液相色谱在313nm下进行观察，得到一株产顺式细辛醚的黑曲霉，命名为DFY1菌株。
（3）菌株的鉴定
A、形态鉴定：Aspergillus niger DFY1菌株的菌落具有典型的黑曲霉特有的形态，在固体平板上开始是白色或黄色的菌落，2~5天后生成黑色孢子，绒毛质地。棉蓝染色后的显微镜观察到分生孢子头是放射状，顶囊球形，小梗，密生于顶囊全部表面（图2）。
B、ITS比对测序：以成熟孢子为模版，ITS引物采用ITS1和ITS4，PCR反应体系为50μL，其中模版DNA1μL，10×Buffer5μL，Taq聚合酶1μL，dNTP1μL，上游引物1.5μL，下游引物1.5μL，ddH2O39μL。反应条件：95℃预变性5min，95℃30s变性，58℃30s退火，72℃1min延伸，72℃7min终延伸，循环35次。PCR产物纯化后送样测序。测的序列在NCBI进行BLAST比对分析。
（4）菌株DFY1鉴定结论
根据菌株形态学和ITS测序比对分析结果，鉴定DFY1为黑曲霉（Aspergillusniger）。
实施例2
黑曲霉DFY1产顺式细辛醚时间比对实验：
用接种环轻轻蘸取一环黑曲霉孢子接入到灭菌后的马铃薯-葡萄糖液体培养基50mL；接种好的液体培养基置于28℃震荡培养箱中，以转速120rpm震荡培养，每3天取出3瓶进行后续测定实验，21天结束实验；将发酵好的发酵产物置于-40℃冷冻24h后进行冷冻干燥至无水分的状态；干燥后的发酵产物添加50mL甲醇，超声1h，期间保持超声温度低于50℃；将超声后的产物抽真空浓缩至1mL，过0.22μL膜纯化后用高效液相色谱进行检测。结果见图3，本发明的黑曲霉DFY1在液体培养的前期阶段未见明显的细辛醚生产，稳定期以后细辛醚产量增加。
实施例3
黑曲霉DFY1产顺式细辛醚液体和固体培养基比对实验：
用接种环轻轻蘸取一环黑曲霉孢子接入到灭菌后的马铃薯-葡萄糖液体培养基50mL；接种好的液体培养基置于28℃震荡培养箱中，以转速120rpm震荡培养 21天结束实验；将发酵好的发酵产物和固体斜面上的孢子分别置于-40℃冷冻24h后进行冷冻干燥至无水分的状态；干燥后的发酵产物添加50mL甲醇，超声1h，期间保持超声温度低于50℃；将超声后的产物抽真空浓缩至1mL，过0.22μL膜纯化后用高效液相色谱进行检测。结果见图4，本发明的黑曲霉DFY1在固体斜面上会有细辛醚产生，间接证明成熟的孢子是细辛醚生产场所。
实施例4
黑曲霉DFY1菌液、固体菌粉的制备：
在固体斜面上挑取黑色孢子，接种于50mL马铃薯-葡萄糖和马铃薯-乳糖液态培养基（121℃下，灭菌20min）中，28℃、120rpm下培养21天，得到发酵成熟菌液表面覆盖孢子。
黑曲霉DFY1菌粉制备：
上述所得发酵成熟的菌液经过无菌生理盐水清洗除去多余的培养基，留下孢子和菌丝体，置于-40℃冰箱冷冻24h，冷冻结束后用抽真空冷冻冻干装置进行冷冻干燥至菌粉中水含量小于5%（W/W）。

Claims (8)

1.黑曲霉（Aspergillus niger）DFY1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC NO.20242。
2.权利要求1所述的黑曲霉DFY1在制备细辛醚中的应用。
3.根据权利要求2所述的黑曲霉DFY1在制备细辛醚中的应用，其特征在于所述细辛醚的具体制备方法如下：
步骤一、将黑曲霉DFY1接种于发酵培养基中进行发酵培养，获得发酵菌液；
步骤二、将发酵菌液冷冻真空干燥，获得黑曲霉DFY1固体菌粉；
步骤三、向黑曲霉DFY1固体菌粉中添加甲醇进行超声萃取，而后采用有机溶剂进行分级纯化得到顺式细辛醚粗产品。
4.根据权利要求3所述的黑曲霉DFY1在制备细辛醚中的应用，其特征在于所述步骤一中黑曲霉DFY1的接种孢子数量为（1~4）×108cfu/mL，接种量为0.5~1% v/v。
5.根据权利要求3所述的黑曲霉DFY1在制备细辛醚中的应用，其特征在于所述发酵培养过程在摇瓶中，发酵培养温度为28~37℃，时间为18~60天，转速为100~200rpm。
6.根据权利要求3所述的黑曲霉DFY1在制备细辛醚中的应用，其特征在于所述发酵培养基为土豆-葡萄糖液体培养基。
7.根据权利要求3或6所述的黑曲霉DFY1在制备细辛醚中的应用，其特征在于所述发酵培养基在使用前经过高温湿热灭菌，高温湿热灭菌的温度为121℃，时间为20min。
8.根据权利要求3所述的黑曲霉DFY1在制备细辛醚中的应用，其特征在于所述黑曲霉DFY1固体菌粉中含水量小于5% w/w，黑曲霉DFY1菌粉中活孢子为（1~3）×108cfu/g。
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