CN1846793B - 一种组织工程骨及其构建与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学工程中用组织工程方法构建人工器官技术领域，具体是涉及一种组织工程骨及其构建与应用。本发明所述的组织工程骨，包括载体支架和种子细胞，种子细胞附着于载体支架上，形成具有骨组织三维结构和生物活性的复合体，所述的载体支架为改性的具有大孔径和高孔隙率并经过去酸化处理的PLGA，其上负载有细胞因子骨形态发生蛋白，即BMP；所述的种子细胞为骨髓基质干细胞。本发明所述的组织工程骨可用于构建修复大段骨缺损的功能性组织工程化骨移植物。

Description

一种组织工程骨及其构建与应用

技术领域

本发明属于生物医学工程中用组织工程方法构建人工器官技术领域，具体是涉及一种组织工程骨及其构建与应用。

背景技术

近年来，随着组织工程技术的发展，研究开发具有修复、维持或改善损伤组织功能的生物替代物的报道逐渐增多，其中骨组织工程研究更是一大热点，目前已经逐渐形成了较为完善的关于种子细胞、细胞载体支架及组织构建的理论和技术路线。但不可否认的是这些成果距离骨组织工程最终在临床的应用尚有一定距离。因此，有必要开发一种可迅速应用于临床的新型组织工程骨产品。

组织工程人造组织的基本做法是将活体内取得的组织用机械法或酶消化法分散成单细胞悬液，然后在模拟体内环境的体外条件下进行孵育培养，使细胞存活、生长和扩增。然后将在体外培养的具有一定浓度的细胞种植到具有一定空间结构的三维支架材料上，进一步培养，通过细胞之间的相互粘附、生长、繁殖、分泌细胞外基质，形成具有一定结构和功能的组织和器官。体外培养的细胞应具有体内细胞的大部分功能。如体外培养的成骨细胞具有较高的碱性磷酸酶活性，分泌骨钙素，合成并分泌I、II型胶原等。有研究表明，在钙化条件(钙离子、β-甘油磷酸钠、维生素C、***等)存在时，成骨细胞即可在培养瓶中形成骨小梁。因此，利用组织工程方法将成骨细胞接种到一定的支架材料上，并添加某些促进骨生长和骨神经血管化的细胞因子在体外进行培养，获得一块骨组织是完全可行的。

目前骨组织工程研究中最大的问题是支架材料的选择。骨组织工程所需要支架材料应具有以下特点：具有良好的生物相容性和生物降解性，在体内的降解产物对人体无害；②具有一定的骨诱导性和骨传导性，利于细胞贴附及增殖；③具有一定强度，在机体内保持自身形状并能对抗外力；④易于塑形，可根据需要加工成各种形状和大小；⑤具有负荷最大量细胞的高渗透性；⑥支持成骨细胞生长和功能分化的表面化学性质与微结构；⑦可与其他生物活性分子如骨形态发生蛋白(BMP)复合、控释从而对种子细胞的生长进行调控；⑧易消毒性。目前骨组织工程支架材料来源可分为无机材料和有机材料两大类。无机材料主要是指生物陶瓷类材料。这类材料主要由钙、磷元素组成，与人体内主要无机成分类似，故具有良好的生物相容性、生物降解性以及骨传导性。但是这类材料的最大缺陷在于降解极其困难，影响了新生骨的生成和改建。有机材料可分为天然与人工有机材料。天然有机材料包括胶原、壳聚糖、纤维蛋白凝胶等，这类材料的共性是生物相容性好，利于细胞贴附、增殖、分化，但是作为骨组织工程支架机械强度不够，降解时间难以控制。

骨形态发生蛋白是((Bone morphogenetic protein，BMP))研究较早的骨生长因子，其诱导成骨的作用已被多次实验所证实。它是唯一能够单独诱导骨组织形成的局部生长因子，在一定条件下，能诱导未分化的间充质细胞向骨系细胞转化，促进骨细胞的生长增殖。目前认为BMP是骨组织工程中促进成骨作用最重要的一种。但由于BMP在骨组织中的含量极少(约1mg/kg湿骨)，且在体内扩散很快，容易被蛋白酶所分解，因而不能在局部发挥持续刺激和诱导成骨的作用，其诱导活性难以得到充分的发挥。

尽管组织工程骨研制方面已取得巨大进展，部分产品已进入临床试验阶段，但是这些产品仍不完善，在方法成熟、研制周期及产品成本诸多方面存在缺陷，尤其是对临床上大段骨缺损的修复仍无明显效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种组织工程骨。该组织工程骨在移植入人体后无排斥反应、在一定时间内可完全降解吸收、诱导成骨效应明显、可对大段骨缺损进行修复、成本较低廉。

本发明所述的一种组织工程骨，包括载体支架和种子细胞，种子细胞附着于载体支架上，形成具有骨组织三维结构和生物活性的复合体，所述的载体支架为改性的具有大孔径和高孔隙率并经过去酸化处理的PLGA，其上负载有细胞因子骨形态发生蛋白，即BMP；所述的种子细胞为骨髓基质干细胞(bone marrow stem cells，BMSCs)。

所述的种子细胞是取自同一骨髓，经分离、扩增并体外培养为第3代的骨髓基质干细胞，其细胞密度为1×10⁶-1×10⁷个/ml。

所述的PLGA载体支架的孔径为150～200um，孔径率为85～95％。

本发明还提供了所述的组织工程骨的构建方法。

本发明所述的组织工程骨的构建方法，包括以下步骤：

A.以改性的具有大孔径和高孔隙率并经过去酸化处理的PLGA为原料，在组织工程骨载体支架的构建过程中加入细胞因子骨形态发生蛋白，即BMP；

B.将取自同一骨髓，经分离、扩增并体外培养为第3代的骨髓基质干细胞消化、离心，以1×10⁶-1×10⁷/ml浓度接种到PLGA载体支架上；

C.将复合了细胞的PLGA载体支架放入孵箱中培养3-6小时，加入DMEM条件培养基，放回孵箱中继续培养3-5天，即获得组织工程骨。

上述构建方法中，所述的种子细胞即骨髓基质干细胞是通过下列步骤构建：

(1)获取松质骨骨髓，以全骨髓培养法在换液过程中逐步洗去红细胞，获得骨髓基质干细胞；

(2)以0.25％胰蛋白酶消化、传代至第3代骨髓基质干细胞；

(3)传至第3代细胞开始用DMEM条件培养基换液，进行成骨细胞定向诱导，培养3-5天后备用。

所述的DMEM条件培养基包含15％血清、50μg/m l抗坏血酸、10^-8mol/L***、10mmol/L β-甘油磷酸钠。

上述构建方法中，所述的PLGA支架是通过下列步骤构建：

a、以改性的具有大孔径和高孔隙率的PLGA为原料，加入磨成粉末状的细胞因子骨形态发生蛋白即BMP，并修切成型；

b、超声波振荡清洗；

c、表面去酸化处理；

d、37℃环氧乙烷熏蒸灭菌浸泡；

e、加入含15％血清的DMEM完全培养基，浸泡2-3天；

f、加入10％多聚赖氨酸溶液，浸泡1-2天；

g、紫外灯下15-25℃干燥，保存备用。

本发明采用的载体支架原料为聚乳乙醇酸(polylactic-glycol acid，PLGA)，它是人工有机材料PLA的衍生物，具备良好的生物相容性、降解产物无毒性、易加工、一定强度等优点，使本发明所述的组织工程骨可以得到广泛的应用。

本发明采用的细胞因子为骨形态发生蛋白(BMP)，其不仅可以加速骨的再生，而且还起着加速支架材料降解的作用。

本发明对PLGA支架材料三维结构进行了优化处理，可以最大限度地发挥BMP的生物学效能。采用以改性的具有大孔径和高孔隙率并经过去酸化处理的PLGA为原料，优选的PLGA载体支架的孔径为150～200um，孔径率为85～95％，且可以根据实验要求任意加工为各种规格。

本发明还提供了所述的组织工程骨的用途。

本发明所述的组织工程骨可用于构建修复大段骨缺损的功能性组织工程化骨移植物。该用途通过动物骨缺损修复试验得以确立。

附图说明

图1是本发明所述的组织工程骨的结构示意图，其中，(a)为部分剖开的示意图，(b)为(a)中A-A向剖视图。

图2为本发明所述的组织工程骨培养3天后的相差显微镜观察(100×)图。

图3为利用本发明所述的组织工程骨修复兔桡骨缺损后4周骨缺损断端HE染色切片图。

图4为利用本发明所述的组织工程骨修复兔桡骨缺损后4、8、12周的局部X线图，自左至右分别为第4、8、12周。

具体实施方式

现结合实验将本发明和实施效果作进一步说明。

如图1所示，本发明所述的一种组织工程骨，包括载体支架和种子细胞，种子细胞附着于载体支架上，形成具有骨组织三维结构和生物活性的复合体，所述的载体支架为改性的具有大孔径和高孔隙率并经过去酸化处理的PLGA，其上负载有细胞因子骨形态发生蛋白，即BMP；所述的种子细胞为骨髓基质干细胞。

图1为微观示意图，其比例不代表实际产品的比例。

实施例一：骨髓基质干细胞的体外培养、扩增和定向诱导

按照全骨髓细胞培养方法，以骨髓穿刺针刺入髂骨骨髓腔，抽吸双侧骨髓共3-5ml，混入DMEM培养基，500U/ml肝素溶液抗凝，混匀后800r/min低速离心5min，去除上清液，培养基重悬后过90目滤网接种。于37℃、5％CO₂孵箱中培养，4天后半量换液(DMEM完全培养基，15％血清)，以后2～3天全量换液一次，倒置显微镜逐日观察，待细胞汇合成单层后以0.25％胰蛋白酶消化，计数，传代培养，常规3天换液1次。传至第3代细胞开始用DMEM条件培养基(含15％血清、50μg/mi抗坏血酸、10^-8mol/L***、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠)换液，备用。

实施例二：PLGA支架与细胞因子的负载

(1)以改性的具有大孔径和高孔隙率的PLGA为原料，加入磨成粉末状的细胞因子骨形态发生蛋白即BMP，并修切成型；

(2)超声波振荡清洗：以三蒸水利用超声波振荡清洗，自然干燥

(3)表面去酸化处理：依次浸入1％NaOH₂ 2小时、PBS缓冲液清洗、50％乙醇2小时、PBS缓冲液清洗；

(4)37℃下环氧乙烷熏蒸灭菌；

(5)加入含15％血清的DMEM完全培养基，浸泡2-3天；

(6)加入10％多聚赖氨酸溶液，浸泡1-2天；

(7)紫外灯下15-25℃干燥，保存备用。

本实施例中，PLGA支架为4×4×2mm块状，孔径150～200um，孔径率85～95％。

实施例三：负载细胞因子的组织工程骨的构建

将按照实施例一所述方法已传第3代、并经过条件培养基诱导后生长良好的BMSCs以胰蛋白酶消化、离心，以1×10⁶-1×10⁷/ml浓度利用微量移液器将细胞悬液接种到实施例二所构建的材料上，放入37℃、5％CO₂孵箱中培养4h小时，加入适量条件培养基，放回孵箱中继续培养3-5天，即获得组织工程骨，保存备用。

实施例四：动物骨缺损修复试验

取新西兰大耳白兔，2月龄，体重1.5～2.0kg，雌雄不限，购自南方医科大学(原第一军医大学)动物中心。无菌条件下分别在右侧桡骨中段构建长15mm标准骨缺损，植入实施例三所构建的组织工程骨，逐层关闭切口，术后动物正常活动。对照组分别为空白PLGA组、PLGA+BMSCs组。于4、8、12周处死动物，作以下检测：(1)大体及X线观察：观察动物活动、步态、伤口愈合及缺损修复情况，并对骨缺损区新生骨进行光密度值比较。(2)组织学观察：取双桡骨中段骨标本，10％多聚甲醛固定，脱钙，常规石蜡包埋切片，HE染色，光镜观察新生骨生长情况。(3)将骨缺损区新生骨与同部位正常骨进行生物力学试验，做压应变和三点弯曲试验。

结果：

大体观察：取材时可见组织工程骨组兔骨缺损完全修复，外观正常。

相差显微镜观察：如图2所示，BMSCs与负载BMP的PLGA支架符合培养3天后，可见细胞与材料贴附良好，且分泌出大量细胞基质，细胞间间隙不清。

组织学观察：如图3所示，可见PLGA支架降解为网孔样，且软骨细胞及大量软骨基质形成。HE染色显示4周时已有大量新生骨形成，各时间段成骨均明显优于对照组。

X线观察：如图4(a)所示，第4周X线显示骨缺损区有明显新骨生长，植入组织工程骨与宿注骨之间界面变模糊；如图4(b)所示，第8周骨缺损区出现连续性骨痂，密度明显增高；如图4(c)所示，第12周后骨缺损基本完全修复，且出现髓腔再通。

光密度检测：显示本发明所述的组织工程骨组成骨量最大。

生物力学检测：显示各组间载荷、弯曲应力差异显著。

Claims (6)

1.一种组织工程骨，包括载体支架和种子细胞，种子细胞附着于载体支架上，形成具有骨组织三维结构和生物活性的复合体，其特征在于：所述的载体支架为改性的具有大孔径和高孔隙率并经过去酸化处理的PLGA，所述PLGA载体支架的孔径为150～200um，孔隙率为85～95％，所述PLGA载体支架上负载有细胞因子，该细胞因子为骨形态发生蛋白即BMP；所述的种子细胞是源自同一骨髓的第3代的骨髓基质干细胞，其细胞密度为1×10⁶-1×10⁷个/ml。

2.如权利要求1所述的组织工程骨的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

A.以改性的具有大孔径和高孔隙率并经过去酸化处理的PLGA为原料，在组织工程骨载体支架的构建过程中加入细胞因子骨形态发生蛋白，即BMP；

B.将取自同一骨髓，经分离、扩增并体外培养为第3代的骨髓基质干细胞消化、离心，以1×10⁶-1×10⁷/ml浓度接种到PLGA载体支架上；

C.将复合了细胞的PLGA载体支架放入孵箱中培养3-6小时，加入DMEM条件培养基，放回孵箱中继续培养3-5天，即获得组织工程骨。

3.根据权利要求2所述的组织工程骨的构建方法，其特征在于，所述的骨髓基质干细胞是通过下列步骤构建：

(1)获取松质骨骨髓，以全骨髓培养法在换液过程中逐步洗去红细胞，获得骨髓基质干细胞；

(2)以0.25％胰蛋白酶消化、传代至第3代骨髓基质干细胞；

(3)传至第3代细胞开始用DMEM条件培养基换液，进行成骨细胞定向诱导，培养3-5天后备用。

4.根据权利要求3所述的组织工程骨的构建方法，其特征在于，所述的DMEM条件培养基包含15％血清、50μg/ml抗坏血酸、10^-8mol/L***与10mmol/Lβ-甘油磷酸钠。 

5.根据权利要求2所述的组织工程骨的构建方法，其特征在于，所述的PLGA支架是通过下列步骤构建：

a、以改性的具有大孔径和高孔隙率的PLGA为原料，加入磨成粉末状的细胞因子骨形态发生蛋白即BMP，并修切成型；

b、超声波振荡清洗；

c、表面去酸化处理；

d、37℃环氧乙烷熏蒸灭菌浸泡；

e、加入含15％血清的DMEM完全培养基，浸泡2-3天；

f、加入10％多聚赖氨酸溶液，浸泡1-2天；

g、紫外灯下15-25℃干燥，保存备用。

6.如权利要求1所述的组织工程骨用于构建修复大段骨缺损的功能性组织工程化骨移植物的用途。 

Images