CN107412855A - 具有涂层的3d打印支架及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一具有涂层的3D打印支架及其制备方法和应用。所述支架包括聚丁二酸丁二醇酯支架基体、多巴胺膜和介孔硅酸镁微球涂层或掺铜介孔硅酸镁微球涂层，所述的介孔硅酸镁微球涂层或掺铜介孔硅酸镁微球涂层中，微球粒径为180‑220nm，微球孔径为3‑5nm，多巴胺膜厚度为50‑100nm。实验结果证明，本发明的具有介孔硅酸镁微球或掺铜介孔硅酸镁微球涂层的3D打印支架具有良好的组织相容性和体外活性，可促进细胞粘附、增殖和分化，还具有优异的促进体内新骨和血管生成的作用，在制备骨缺损修复材料领域具有较好的应用前景。

Description

具有涂层的3D打印支架及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药工程领域，具体地，涉及具有涂层的3D打印支架及其制备方法和应用。
背景技术
骨骼是人体重要组成部分，具有一定的机械性能，起到人体支撑作用。但由于外界创伤、骨疾病(骨肿瘤、骨髓炎等)以及感染多种原因造成的骨缺损，在临床上很常见且难以完全修复，尤其是骨的缺损修复研究中血管化问题是目前面临的主要挑战。近期研究表明，骨组织再生过程中，微血管的形成和延伸，为骨组织的生长和分化提供了氧气和营养物质，是最终形成钙化组织的主要影响因素。而目前常用的骨缺损修复材料中，3D打印聚丁二酸丁二醇酯(PBSu)支架具有高度规则的孔结构和优异的孔贯通性，具备了骨修复支架样品要求的孔结构和力学强度，但却没有生物活性。因此，本领域急需一种具有生物活性且制备简单易操作的PBSu支架。
发明内容
本发明的目的是解决骨缺损修复领域缺乏具有生物活性的聚丁二酸丁二醇酯(PBSu)支架的问题，进而提供了一具有涂层的3D打印支架及其制备方法和应用。本发明的支架在多巴胺改性3D打印PBSu支架的基础上，在其表面涂覆介孔硅酸镁微球(NMS)或掺铜介孔硅酸镁微球(CuNMS)，赋予其体外生物活性。实验结果证明，本发明的具有介孔硅酸镁微球或掺铜介孔硅酸镁微球涂层的3D打印支架具有良好的组织相容性和体外活性，还具有优异的促进体内新骨和血管生成的作用，在制备骨缺损修复材料领域具有较好的应用前景。
本发明是通过以下技术方案来解决上述技术问题的。
本发明第一方面提供了一具有涂层的聚丁二酸丁二醇酯(PBSu)支架，其中，所述支架包括聚丁二酸丁二醇酯支架基体、多巴胺膜和介孔硅酸镁微球(NMS)涂层或掺铜介孔硅酸镁微球(CuNMS)涂层；
所述的介孔硅酸镁微球涂层或掺铜介孔硅酸镁微球涂层涂覆在多巴胺膜的外层；
所述的多巴胺膜位于聚丁二酸丁二醇酯支架基体的表面；
所述的介孔硅酸镁微球涂层或掺铜介孔硅酸镁微球涂层中，微球粒径为 180-220nm，微球的孔径为3-5nm；
所述多巴胺膜的厚度为50-100nm。
所述的支架，其中，
所述聚丁二酸丁二醇酯为本领域常规使用，数均分子量优选为 4×104-7×104，重均分子量/数均分子量优选为1.2-2.4。
所述多巴胺膜的厚度优选为60-80nm。
所述的介孔硅酸镁微球的比表面积优选为500-570m2/g，更优选538.1 m2/g。
所述的掺铜介孔硅酸镁微球的比表面积优选为450-550m2/g，更优选 490.4m2/g。
所述的掺铜介孔硅酸镁微球中，铜的含量优选为3-7wt％，更优选5wt％。
所述的介孔硅酸镁微球或掺铜介孔硅酸镁微球的孔径优选为4nm。
所述的介孔硅酸镁微球或掺铜介孔硅酸镁微球的粒径优选为200nm。
所述的介孔硅酸镁微球和掺铜介孔硅酸镁微球均为本领域常规使用，其制备方法也为本领域常规的制备方法，一般采用模板及自组装法制备。
在本发明的一较佳实施例中，介孔硅酸镁微球采用包括如下步骤的方法制备：
S1、35-40℃下，将十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶解于水中，CTAB 完全溶解后，依次加入氨水、正硅酸乙酯(TEOS)和六水合硝酸镁(Mg(NO3)2·6H2O)静置反应；
S2、将S1所得的反应产物离心并洗涤所得白色沉淀物，烘干；
S3、将S2所得烘干产物置于马弗炉中烧结，除去CTAB，得到的白色粉末即为介孔硅酸镁微球(NMS)。
其中，步骤S1中，所述水可为去离子水。在本发明一较佳实施例中，步骤S1按照如下操作进行：在35-40℃下，0.6-0.8g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶解于30-35mL去离子水中，CTAB完全溶解后，依次加入6.5-7.5 mL 1M氨水，3.2-3.8正硅酸乙酯(TEOS)和2.3-2.5g六水合硝酸镁。
其中，步骤S1中，静置反应时间为3-6小时，优选4小时。
其中，步骤S2中，所述洗涤白色沉淀物包括两次用乙醇洗涤和一次用去离子水洗涤的步骤。
其中，步骤S2中，所述烘干的操作和条件为本领域常规的烘干的操作和条件，较佳地在60℃的电热鼓风干燥箱中进行。
其中，步骤S3中，所述烧结的温度较佳地为500-700℃，更佳地为600℃，所述烧结保温的时间较佳地为2-4小时，更佳地为3小时。
在本发明的一较佳实施例中，掺铜介孔硅酸镁微球采用包括如下步骤的方法制备：
M1、在35-40℃下，将十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶解于水中， CTAB完全溶解后，加入六水合硝酸镁(Mg(NO3)2·6H2O)及三水合硝酸铜 (Cu(NO3)2·3H2O)，静置反应；
M2、将M1所得的反应产物离心并洗涤所得淡绿色沉淀物，烘干；
M3、将M2所得烘干产物置于马弗炉中烧结，除去CTAB，得到的淡绿色粉末即为掺铜介孔硅酸镁微球(CuNMS)。
其中，步骤M1中，所述水可为去离子水。在本发明一较佳实施例中，步骤M1按照如下操作进行：在35-40℃下，0.6-0.8g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶解于30-35mL去离子水中，CTAB完全溶解后，1.6-1.8g六水合硝酸镁及0.5-0.6g三水合硝酸铜，静置反应。
其中，步骤M1中，静置反应时间为3-6小时，优选4小时。
其中，步骤M2中，所述洗涤淡绿色沉淀物包括两次用乙醇洗涤和一次用去离子水洗涤的步骤。
其中，步骤M2中，所述烘干的操作和条件为本领域常规的烘干的操作和条件，较佳地在60℃的电热鼓风干燥箱中进行。
其中，步骤M3中，所述烧结的温度较佳地为500-700℃，更佳地为600℃，所述烧结保温的时间较佳地为2-4小时，更佳地为3小时。
本发明第二方面提供了一种制备如本发明第一方面所述的具有涂层的聚丁二酸丁二醇酯支架的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)3D打印制备聚丁二酸丁二醇酯支架基体；
(2)在步骤(1)制备的聚丁二酸丁二醇酯支架基体表面形成多巴胺膜，得到多巴胺表面改性聚丁二酸丁二醇酯支架(DP)；
(3)在步骤(2)制备的DP上涂覆所述介孔硅酸镁微球或掺铜介孔硅酸镁微球，即得到本发明的具有涂层的聚丁二酸丁二醇酯支架。
步骤(1)中，3D打印制备聚丁二酸丁二醇酯支架基体的方法为本领域常规的3D打印方法。在本发明的一较佳实施例中，聚丁二酸丁二醇酯支架基体采用包括如下步骤的方法制备：
将聚丁二酸丁二醇酯(PBSu)加入到3D打印设备的料筒内，加热料筒温度到110-115℃，进行3D打印，打印完毕，冷却，即得PBSu支架基体。
其中，所述3D打印设备为本领域常规，较佳地由上海富奇凡机电科技有限公司提供，设备型号为HTS-300。
其中，所述3D打印的技术参数包括如下：
3D打印设备的出料速率较佳地为100-200g/min，更佳地为150g/min；
3D打印设备的机械臂移动速率较佳地为0.1-1m/s，更佳地为0.5m/s；
所述冷却较佳地为自然冷却。
步骤(2)中，在聚丁二酸丁二醇酯支架基体表面形成多巴胺膜的方法为领域常规，在本发明的一较佳实施例中，采用包括以下步骤的方法进行：
将PBSu支架基体超声清洗，然后浸入多巴胺溶液中搅拌；用去离子水清洗、烘干，从而得到支架样品DP。
其中，所述PBSu支架基体的超声清洗较佳地在去离子水中进行，超声时间较佳地为5-20分钟，更佳地为10分钟。
其中，所述的多巴胺溶液较佳地为多巴胺的Tris-HCl缓冲溶液，所述多巴胺溶液的浓度较佳地为1-3mg/ml，更佳地2mg/ml。
在本发明一优选实施例中，所述多巴胺溶液的配制按照如下操作进行：
称取180-220mg多巴胺粉末，溶解于100mL 10mM的Tris-HCl缓冲溶液(pH＝8.5)中，从而得到所述多巴胺溶液。
其中，所述PBSu支架基体在多巴胺溶液中的搅拌速度较佳地为100-300 转/分钟，更佳地为150-200转/分钟；搅拌时间较佳地为18-36小时，更佳地为24小时。
其中，所述烘干的操作和条件为本领域常规的烘干的操作和条件，较佳地为在60℃的电热鼓风干燥箱中进行。
步骤(3)中，涂覆所述介孔硅酸镁微球或掺铜介孔硅酸镁微球的方法可为领域常规，在本发明的一较佳实施例中，采用包括以下步骤的方法进行：
将步骤(2)获得的支架样品DP浸泡于介孔硅酸镁微球悬浮液或掺铜介孔硅酸镁微球悬浮液中并搅拌；用去离子水清洗、烘干，从而得到所述的具有涂层的聚丁二酸丁二醇酯支架。
其中，所述支架样品DP在介孔硅酸镁微球悬浮液或掺铜介孔硅酸镁微球悬浮液中的搅拌速度较佳地为100-300转/分钟，更佳地为150-200转/分钟；搅拌时间较佳地为18-36小时，更佳地为24小时。
其中，所述介孔硅酸镁微球悬浮液或掺铜介孔硅酸镁微球悬浮液的配制方法为本领域常规的配制方法，在本发明的一较佳实施例中，所述配制方法按照如下操作进行：取0.9-1.1克介孔硅酸镁微球或掺铜介孔硅酸镁微球，分别分散到100ml去离子水中，即得。
其中，所述烘干的操作和条件为本领域常规的烘干的操作和条件，较佳地为在60℃的电热鼓风干燥箱中进行。
本发明第三方面提供了一种由本发明第二方面所述的方法制备的具有涂层的聚丁二酸丁二醇酯(PBSu)支架。
本发明第四方面提供了一种如本发明第一方面或第三方面所述的具有涂层的聚丁二酸丁二醇酯(PBSu)支架在制备骨缺损修复材料领域中的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明的技术方案为在3D打印聚丁二酸丁二醇酯支架基体表面形成多巴胺膜，并在多巴胺膜表面涂覆有介孔硅酸镁微球或掺铜介孔硅酸镁微球涂层。所述支架具有良好的组织相容性和体外活性，可促进细胞粘附、增殖和分化，还具有优异的促进体内新骨和血管生成的作用，在骨缺损修复材料领域具有较高的应用价值。
附图说明
图1为本发明介孔硅酸镁微球(NMS)粉末和掺铜介孔硅酸镁微球 (CuNMS)粉末的数码相片图。其中(a)为介孔硅酸镁微球粉末，(b)为掺铜介孔硅酸镁微球粉末。
图2为本发明介孔硅酸镁微球(NMS)粉末和掺铜介孔硅酸镁微球 (CuNMS)粉末的透射电镜图。其中，(a)和(b)为NMS粉末，(c)和(d)为CuNMS 粉末。
图3为本发明介孔硅酸镁微球(NMS)和掺铜介孔硅酸镁微球(CuNMS) 的氮吸附/脱附等温线图(图A)和孔径分布曲线图(图B)。
图4为本发明介孔硅酸镁微球(NMS)和掺铜介孔硅酸镁微球(CuNMS) 的XPS图及在923-966eV处的放大图，其中(A)和(C)为NMS，(B)和(D)为 CuNMS。
图5为本发明对比例1的PBSu支架，对比例2的多巴胺表面改性PBSu 支架(DP)，实施例1的介孔硅酸镁微球涂覆的PBSu支架(NDP)和实施例2的掺铜介孔硅酸镁微球涂覆的PBSu支架(CNDP)的数码相片图，其中(a)为PBSu，(b)为DP，(c)为NDP，(d)为CNDP。
图6为本发明对比例1的PBSu支架，对比例2的多巴胺表面改性PBSu 支架(DP)，实施例1的介孔硅酸镁微球涂覆的PBSu支架(NDP)和实施例2的掺铜介孔硅酸镁微球涂覆的PBSu支架(CNDP)的XRD图谱(图 A)和FTIR图谱(图B)，其中(a)为PBSu，(b)为DP，(c)为NDP，(d)为CNDP。
图7本发明对比例1的PBSu支架，对比例2的多巴胺表面改性PBSu 支架(DP)，实施例1的介孔硅酸镁微球涂覆的PBSu支架(NDP)和实施例2的掺铜介孔硅酸镁微球涂覆的PBSu支架(CNDP)的扫描电镜图，其中(a)为PBSu，(b)为DP，(c)为NDP，(d)为CNDP。
图8为本发明对比例1的PBSu支架，实施例1的介孔硅酸镁微球涂覆的PBSu支架(NDP)和实施例2的掺铜介孔硅酸镁微球涂覆的PBSu支架 (CNDP)浸泡在模拟体液(SIMULATED BODY FLUID，SBF)4天和7天后的表面SEM照片。其中(a)和(d)为PBSu，(b)和(c)为NDP，(c)和(f)为CNDP；以及(a)、(b)、(c)为浸泡4天后的SEM照片，(d)、(e)、(f)为浸泡7天后的 SEM照片。
图9中，图(A)为本发明对比例1的PBSu支架，实施例1的介孔硅酸镁微球涂覆的PBSu支架(NDP)和实施例2的掺铜介孔硅酸镁微球涂覆的PBSu 支架(CNDP)在SBF溶液中浸泡7天后的EDS谱图；图(B)为CNDP在SBF 溶液中浸泡不同时间后的离子浓度的变化。
图(A)和图(B)中，(a)为PBSu，(b)为NDP，(c)为CNDP。
图10为BMSCs细胞分别粘附在对比例1的PBSu支架，实施例1的介孔硅酸镁微球涂覆的PBSu支架(NDP)和实施例2的掺铜介孔硅酸镁微球涂覆的PBSu支架(CNDP)上12小时的SEM图及3，6和12小时的粘附率图(图d)，其中(a)为PBSu，(b)为NDP，(c)为CNDP。
图11中，图(A)为BMSCs细胞分别在对比例1的PBSu支架，实施例1 的介孔硅酸镁微球涂覆的PBSu支架(NDP)和实施例2的掺铜介孔硅酸镁微球涂覆的PBSu支架(CNDP)表面培养1、3、5天后的细胞增殖率图；图(B)为BMSCs细胞分别在PBSu/NDP/CNDP支架样品表面培养7、10和14 天后的ALP活性图。
图(A)和图(B)中，(a)为PBSu，(b)为NDP，(c)为CNDP。
图12为HUVECs细胞分别在对比例1的PBSu支架，实施例1的介孔硅酸镁微球涂覆的PBSu支架(NDP)和实施例2的掺铜介孔硅酸镁微球涂覆的PBSu支架(CNDP)上的细胞增殖情况图，其中(a)为PBSu，(b)为NDP， (c)为CNDP。
图13为HUVECs细胞分别与对比例1的PBSu支架，实施例1的介孔硅酸镁微球涂覆的PBSu支架(NDP)和实施例2的掺铜介孔硅酸镁微球涂覆的PBSu支架(CNDP)共培养7天后，在基质胶上培养1小时的激光共聚焦显微镜图，其中(a)和(d)为PBSu，(b)和(e)为DP，(c)和(f)为NDP，(d) 为CNDP；以及(a)、(b)、(c)为DAPI染色的细胞核照片，(d)、(e)、(f)为FITC染色的F-actin照片。
图14兔股骨缺损修复模型及手术流程图。
图15为对比例1的PBSu支架，实施例1的介孔硅酸镁微球涂覆的PBSu 支架(NDP)和实施例2的掺铜介孔硅酸镁微球涂覆的PBSu支架(CNDP) 分别植入兔股骨内1、2和3个月后的数码照片，其中(a)为PBSu，(b)为NDP， (c)为CNDP。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明实施例中，六水合硝酸镁(Mg(NO3)2·6H2O)，购自国药化学试剂有限公司，纯度为AR；三水合硝酸铜(Cu(NO3)2·3H2O)，购自国药化学试剂有限公司；正硅酸乙酯(TEOS)，购自上海凌峰化学试剂有限公司，纯度为AR；聚丁二酸丁二醇酯(PBSu)购自安庆和兴化工有限责任公司，纯度为AR。
电热鼓风干燥箱为DHG-9070A，购自上海一恒科学仪器公司；马弗炉为SGM 2892A，购自上海西格马高温电炉公司；3D打印机为FFS-MDJ(The Freeform Fabrication Systemwith Micro-Droplet Jetting)，购自上海富奇凡机电科技有限公司，型号为HTS-300。
其它原料和试剂皆市售可得。
对比例1聚丁二酸丁二醇酯(PBSu)支架的制备
本对比例的聚丁二酸丁二醇酯(PBSu)支架采用以下方法制备：
将30克聚丁二酸丁二醇酯(PBSu)加入到3D打印机的不锈钢料筒内，加热料筒温度升高到112℃，进行3D打印，从而制得PBSu支架。
对比例2多巴胺改性聚丁二酸丁二醇酯支架(DP)的制备
本对比例的多巴胺改性聚丁二酸丁二醇酯(PBSu)支架采用以下方法制备：
准确称取200mg多巴胺粉末，溶解到100mL 10mM的Tris-HCl缓冲溶液(pH＝8.5)中，配制溶液(2mg/mL)。将对比例1中制得的PBSu支架浸泡在去离子水中，超声清洗10分钟，烘干后浸入上述多巴胺溶液中。搅拌 24小时后，取出支架，用去离子水清洗，于50摄氏度烘箱烘干。此时，支架表面已形成了黑色的多巴胺膜，所得支架样品即为DP。
实施例1介孔硅酸镁微球涂覆的聚丁二酸丁二醇酯支架(NDP)的制备
(1)介孔硅酸镁微球(NMS)悬浮液的制备
称取1g NMS粉末，分散到100mL去离子水中，即得介孔硅酸镁微球悬浮液。
(2)介孔硅酸镁微球涂覆的聚丁二酸丁二醇酯支架(NDP)的制备
将支架样品DP浸泡于NMS悬浮液中搅拌，速度为200转/分钟，搅拌 24小时后，取出支架，用去离子水清洗，在60℃的电热鼓风干燥箱中烘干，即得NDP。
实施例2掺铜介孔硅酸镁微球涂覆的聚丁二酸丁二醇酯支架(CNDP) 的制备
(1)掺铜介孔硅酸镁微球(CNMS)悬浮液的制备
称取1g CNMS粉末，分散到100mL去离子水中，即得掺铜介孔硅酸镁微球悬浮液。
(2)掺铜介孔硅酸镁微球涂覆的聚丁二酸丁二醇酯支架(CNDP)的制备
将支架样品DP浸泡于CNMS悬浮液中搅拌，速度为200转/分钟，搅拌24小时后，取出支架，用去离子水清洗，在60℃的电热鼓风干燥箱中烘干，即得CNDP。
实施例3介孔硅酸镁微球涂覆的聚丁二酸丁二醇酯支架(NDP-1)的制备
(1)介孔硅酸镁微球(NMS)悬浮液的制备
称取1.1g NMS粉末，分散到100mL去离子水中，即得介孔硅酸镁微球悬浮液。
(2)介孔硅酸镁微球涂覆的聚丁二酸丁二醇酯支架(NDP-1)的制备
将支架样品DP浸泡于NMS悬浮液中搅拌，速度为200转/分钟，搅拌 24小时后，取出支架，用去离子水清洗，在60℃的电热鼓风干燥箱中烘干，即得NDP-1。
实施例4掺铜介孔硅酸镁微球涂覆的聚丁二酸丁二醇酯支架(CNDP-1) 的制备
(1)掺铜介孔硅酸镁微球(CNMS)悬浮液的制备
称取1.1g CNMS粉末，分散到100mL去离子水中，即得掺铜介孔硅酸镁微球悬浮液。
(2)掺铜介孔硅酸镁微球涂覆的聚丁二酸丁二醇酯支架(CNDP-1)的制备
将支架样品DP浸泡于CNMS悬浮液中搅拌，速度为200转/分钟，搅拌24小时后，取出支架，用去离子水清洗，在60℃的电热鼓风干燥箱中烘干，即得CNDP-1。
效果实施例1NMS和CuNMS的表征
①数码相片图
本发明使用的介孔硅酸镁微球(NMS)粉末和掺铜介孔硅酸镁微球 (CuNMS)粉末的数码相片图如图1所示。
由图可知，NMS粉末为白色，CuNMS粉末呈淡绿色。
②透射电镜(TEM)观察
采用投射电子显微镜(TEM，JEM-1400，日本电子株式会社)分别对介孔硅酸镁微球(NMS)粉末和掺铜介孔硅酸镁微球(CuNMS)粉末进行观察。观察结果见图2。
由图可知，NMS和CuNMS的颗粒粒径分布较为均匀，约为200nm；且具有明显的孔径，约为4nm。说明掺杂铜元素前后，颗粒的粒径和孔径均无明显区别。
③BET分析
采用氮气吸附脱附仪(Tristar-3000，美国麦克公司)，分别测定介孔硅酸镁微球(NMS)和掺铜介孔硅酸镁微球(CuNMS)对氮气的吸附脱附曲线，采用BJH模型(Barrett-Joyer-Hanlenda)对介孔孔道进行分析(比表面积、孔容和孔径)。结果见图3。
从吸附脱附等温线(图3A)可见，两种材料均具有H1型回滞环，说明该材料是有序介孔材料。NMS和CuNMS的比表面积分别为538.1m2/g和 490.4m2/g。NMS和CuNMS的平均孔径分别为3.4nm和3.2nm。结果表明，掺杂铜元素后，其比表面积和孔径均略有降低，无明显影响。
④XPS分析
用X射线光电子能谱仪(ESCALAB 250Xi，Thermo Fisher，US)对掺杂铜前后的介孔硅酸镁材料的组成元素进行测定，得到XPS总谱图以及所含元素的结合能谱图。结果见图4。
由图可知，掺杂铜之后，谱图中Mg1s峰强度略有下降。在923和966 eV之间的扩大，可以清楚地看出，NMS没有峰出现，而CuNMS明显出现 Cu2p峰。结果表明，除了Mg，Si和O元素之外，CuNMS中含有Cu元素，与数码相片中淡绿色粉末结果一致。
效果实施例2对本发明的支架进行结构、形貌、元素等的表征
①支架的数码相片图
本发明的PBSu支架，多巴胺表面改性PBSu支架(DP)，介孔硅酸镁微球涂覆的PBSu支架(NDP)和掺铜介孔硅酸镁微球涂覆的PBSu支架 (CNDP)的数码相片图见图5。
由图可见，PBSu支架呈白色，而DP呈棕黑色，NDP和CNDP颜色略浅，仍为棕色。此外，支架NDP-1和CNDP-1的观察效果分别与NDP和CNDP 的效果相当。
②XRD分析
采用傅立叶变换红外光谱仪(IR，Nicolet 5700型，美国Nicolet公司)，分别对支架进行分子结构和化学组成分析，测试范围使用中红外光(约 4000-400cm-1)。
采用X射线衍射仪(XRD，Rigaku D/max 2550/PC 18KW，日本理学电机rigaku)，分别在广角(10-80°)进行测试，测试结果如图6所示。
由图B可知，在19.3°、22.2°和29°处有明显的衍射峰，这是PBSu的特征峰。表面改性后，没有明显的变化。一方面是因为NMS和CuNMS均为无定性物质；另一方面是因为涂层很薄，所以涂层对XRD没有影响。
③SEM观察
对本发明四种支架PBSu、DP、NDP和CNDP进行了微观结构扫描电镜SEM观察。结果见图7。
由图可见，PBSu支架表面是光滑的。而经多巴胺改性后，DP表面仍较光滑，略有凹凸。从图c和图d中可以看出，支架表面都铺满了一层颗粒均匀的球形粒子，粒子分别是NMS和CuNMS。球形粒子在表面分布较均匀，为单层涂层。结果表明，采用多巴胺改性后，多孔支架表面可粘附一层球形粒子，且粒子分布均匀。此外，支架NDP-1和CNDP-1的观察效果分别与 NDP和CNDP的效果相当。
效果实施例3本发明支架的体外生物活性测定
将支架样品(PBSu、NDP和CNDP)浸于SBF溶液中，在第4天和第 7天使用SEM观察支架表面形貌变化，并通过EDS分析其表面元素，测定溶液中的离子浓度变化(ICP)。结果见图8和图9。
由图8可知，浸泡在SBF溶液4天后，PBSu表面光滑，没有明显变化。 NDP表面有少量不规则颗粒，CNDP表面则形成了形状规则的矿物晶体。浸泡7天后，除了PBSu表面没有明显变化之外，NDP和CNDP表面沉积的矿物质量均有明显增加，且CNDP表面球状物质聚集连接到一起，基本完全覆盖了材料表面。结果表明，表面涂覆NMS和CuNMS之后，支架样品具备了良好的体外生物活性，可以诱导类骨羟基磷灰石沉积于表面，有助于在体内成骨中与周围骨组织产生化学键合，从而形成新生骨组织。
由图9A可知，PBSu表面仅有C和O元素，NDP和CNDP表面有明显的钙和磷元素的峰出现。化学计量Ca/P≈1.67。
由图9B可知，在整个浸泡周期过程中，Ca和P离子的浓度一直保持下降趋势，而Si，Mg和Cu离子呈现出上升趋势，这一结果主要由于CNDP 的降解所导致。
此外，支架NDP-1和CNDP-1的观察效果分别与NDP和CNDP的效果相当。
综上结果表明，在PBSu支架表面涂覆NMS和CuNMS涂层，提高了支架样品的体外生物活性。
效果实施例4本发明支架的细胞活性测定
①骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离和培养
取4周龄的SD大鼠，处死后将股骨两端截断，抽取骨髓2mL，注入到含肝素(200U/mL)的PBS中，1500r/min离心10分钟，弃去上清液，用 PBS制成细胞悬液，再小心加到2倍体积的淋巴细胞分离液上层，室温下以 2500r/min离心25分钟。用吸管吸取液面交界处云雾状液体，置于含PBS 5 mL的离心管中，吹打混匀，室温下1000r/min离心5分钟后弃去上清液。用PBS将管内的沉淀清洗一遍后，悬浮于含有20％FCS的α-MEM培养液中，经细胞计数板计数后，按密度(1×104/cm2)接种到100mL培养瓶中，置于培养箱(5％CO2，37℃)中常规培养。培养24小时后换液。观察细胞增殖至80％～90％汇合度时，传代培养。
原代BMSCs进行传代培养时，使用0.25％的胰蛋白酶于37℃消化1min，然后加入含20％FCS的α-MEM培养液终止消化，离心后，使用含20％FCS，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素的α-MEM重悬成BMSCs悬液，充分吹打后计数，按后续实验所需要的细胞密度进行接种。选用2-5代BMSCs进行后续实验。
②细胞粘附及形貌观察
本实施例中细胞在支架表面的粘附情况通过观察其细胞形态进行表征，具体为在培养的第12小时、3天和5天时，用PBS清洗样品，再用2.5％的戊二醛溶液固定，用于SEM和CLSM观察。
SEM观察：在培养第12小时、3天、5天时，用PBS清洗样品2-3次，将戊二醛固定液洗净，然后依次用1mL的10％、30％、50％、70％、85％和 90％乙醇溶液脱水处理，每次时间为15min，最后再用100％无水乙醇脱水两次。将样品在37℃下烘干。采用SEM对支架(PBSu、NDP和CNDP)进行表面的细胞形态观察。检测结果见图10。
由图10可知，细胞在三种支架样品上具有良好的的粘附形态和生长状况，表明三种支架无细胞毒性。细胞的形状主要呈现出长条状和纺锤状。NDP (图b)和CNDP(图c)表面粘附的细胞数目明显多于PBSu(图a)，且细胞逐渐铺展并伸出伪足，呈现出多边形。结果表明，NDP和CNDP表面粘附细胞数目更多，具有更好的细胞相容性。此外，支架NDP-1和CNDP-1的检测结果分别与NDP和CNDP的结果相当。
③细胞增殖和碱性磷酸酶(ALP)活性
当细胞在支架表面附着、铺展后，需要尽快表达一定的增殖性，才能使支架附近产生富集大量细胞的微环境，从而使得细胞外基质的分泌和各类蛋白的合成，促进材料与周围组织紧密结合。
本效果实施例采用MTT法测定BMSCs细胞的增殖性并进行统计分析。在细胞培养第1、3和5天时，每孔加入100μL 5％MTT液(Sigma Aldrich Chemistry)，37℃培养4h，然后加入200μL二甲基亚砜(DMSO)，最后用酶标仪在570nm处，测吸光度值(O.D.)。至少选择5组平行样本进行测试， p<0.05表示具有统计学显著性差异，所有的定量数据采用平均值使用Origin pro8.2进行分析。检测结果见图11(a)。
碱性磷酸酶(ALP)活性测定方法为：细胞接种到支架样品上，组织培养板(TCP)作为对照。培养4天和7天后，弃去培养基，样品用PBS冲洗三次。每孔加入500μL的1％NonidetP-40(NP-40)溶液，在室温下裂解细胞1小时，获得细胞裂解液。每孔加入50μL1mg/mL的硝基苯磷酸二钠盐(p-nitrophenylphosphate；Songon，中国)溶液(含0.1mol/L甘氨酸和1mmol/L六水氯化镁，pH＝9)，置于37℃培养箱内孵育1小时。结束后，每孔加入100μL的0.1mol/LNaOH溶液终止显色反应。最后使用酶标仪(384SPECTRAmax，Molecular Devices，美国)在405nm处，测定 O.D.值。裂解液中总蛋白的含量采用牛血清白蛋白为标准蛋白，使用BCA试剂盒(碧云天生物科技，中国)进行测定。ALP活性表示为405nm处O.D. 值/总蛋白含量。检测结果见图11(a)。
由图11(a)可知，在培养第1天时，三组细胞的O.D.值都较低，无显著差异。在第3天和第5天时，NDP和CNDP上细胞的O.D.值大幅度提升，明显高于PBSu。这是由于涂层表面的介孔硅酸镁微球(NMS)和掺铜介孔硅酸镁微球(CuNMS)可以在材料与细胞界面周围形成弱碱性的微环境，适合细胞的粘附和生长。此外，NMS在培养液中可以缓释出Mg和Si离子，二者均可以促进细胞的增殖。
由图11(a)可知，在7天时，三种支架样品上的细胞ALP活性无明显区别。随着时间的推移，三种支架样品表面细胞的ALP活性都逐渐提高。NDP 和CNDP表面的细胞的ALP活性都明显高于PBSu，具有显著性差异。结果表明，NDP和CNDP对BMSCs细胞的ALP活性表达有显著的促进作用。此外，支架NDP-1和CNDP-1的检测结果分别与NDP和CNDP的结果相当。
④HUVECs细胞的增殖
HUVECs细胞在三种支架样品PBSu/NDP/CNDP表面培养1、3和5天时的增殖率见图12。由图可见，在培养第1天时，三种支架样品表面HUVECs 细胞的O.D.值基本相同。3天时，细胞的O.D.值均明显增加，且CNDP的 O.D.值显著高于PBSu(P<0.05)。5天时，NDP和CNDP的O.D.值均显著高于PBSu(P<0.05，P<0.01)。此外，支架NDP-1和CNDP-1的检测结果分别与NDP和CNDP的结果相当。
结果表明，CNDP可以明显促进HUVECs细胞增殖。
⑤HUVECs的体外芽体发生
HUVECs细胞与三种支架样品PBSu/NDP/CNDP共培养7天后，转移到基质胶上培养1小时，然后用激光共聚焦显微镜观察其体外芽体发生的情况，结果见图13。由图可见，HUVECs与PBSu支架共培养后，并没有发生明显的变化；细胞呈点状分布，且相比其他两组，细胞数目较少(图a，b)。 HUVECs与NDP支架共培养后，细胞与细胞间开始相互靠拢，交流增强，部分细胞与细胞之间伪足相连，已经有芽体的雏形产生(图c，d)。HUVECs 与CNDP支架共培养后，可以观察到细胞与细胞间丝状伪足相连，芽体发生情况非常显著(图e，f)。此外，支架NDP-1和CNDP-1的检测结果分别与 NDP和CNDP的结果相当。
效果实施例5本发明支架的动物实验及效果
细胞最适宜的生长环境是在体内，整个动物机体是一个不可拆分的整体，当机体的某个部位收到外界的刺激发生损伤和缺损时，其自身会产生促进损伤部位周围细胞生长的环境。由于体外细胞培养的环境无法模拟细胞在体内生长的真正状态，所以体内动物实验就尤为重要。在体内存在自身免疫反应和体液微环境，在体内对植入材料的影响或者环境的促进因素尚不明确，所以只有将材料植入动物体内观察，才能真正判断该材料的成骨性和是否可以修复骨缺损。
本效果实施例构建兔右侧股骨缺损作为动物模型，将支架 PBSu/NDP/CNDP植入缺损部位，术后第1、2和3个月取出股骨缺损区域。采用同步辐射micro-CT二维和三维成像进行检测分析,评估新生骨组织生长情况以及成熟骨组织成骨量分析。
①兔股骨模型植入实验
动物实验使用的支架样品规格为Φ6×6mm。先将支架密封，然后利用紫外辐射进行灭菌。
本实验采用兔右侧股骨末端缺损模型考察三种支架样品 (PBSu/NDP/CNDP)的体内成骨效果。所有手术过程及动物饲养均在国家组织工程技术研究中心(上海，中国)进行，由当地伦理委员会批准。选取27只雌雄各半的实验用新西兰白兔(年龄5个月，平均体重为3kg)进行动物实验，随机平均分成三组，每组9只分别植入一种多孔支架样品。
动物实验在无菌手术室进行。麻醉剂用量按动物体重计算(25mg/kg舒泰和0.15mL/kg 2％Rompon)，经肌肉注射后进行全身麻醉。新西兰大白兔右后肢剃毛、消毒，按俯卧位放置在手术台上。右侧股骨髁部位取约长1cm 的切口，逐层分离皮肤、肌肉、骨膜等组织，显露兔股骨外髁。选用骨科钻孔器，沿股骨纵轴和矢状轴垂直方向制造6mm×6mm圆柱腔骨洞缺损，上述三种支架分别植入兔骨缺损模型，逐层严密缝合创口，在伤口表面涂抹碘伏进行伤口消毒。术后单笼饲养，正常喂食，连续3天肌肉注射青霉素以消炎。手术过程见图14。
分别于术后4，8和12周通过注射过量戊巴比妥钠处死动物，取出缺损修复部位，剥除肌肉组织后获得骨样标本。拍摄数码照片，对骨缺损情况进行大体观察。然后使用10％中性***缓冲液来固定标本，进行各种检测。
②大体观察
支架样品PBSu，NDP和CNDP植入兔股骨内1，2和3个月后的数码照片见图15。由图可见，支架植入1个月后，PBSu仍旧暴露在外面，可清晰看到支架，表面骨缺损较明显，未得到显著修复。NDP和CNDP的植入部位有明显的凹坑存在，但是支架本身已经包裹在组织内部。支架植入2个月后，三组支架缺损部位均有明显的愈合趋势。支架植入3个月后，PBSu 植入部位，仍旧存在明显的骨缺损未能修复；NDP植入部位，缺损部位与支架样品的边界模糊，只剩下很小的孔洞尚未修复；CNDP植入部位，缺损部位与支架样品的边界消失，无法直观看到宿主骨和植入材料的界限。结果显示，CNDP具有较好的体内相容性和成骨诱导性，可以有效促进新生骨组织的再生。此外，支架NDP-1和CNDP-1的检测结果分别与NDP和CNDP的结果相当。

Claims (10)

1.一具有涂层的聚丁二酸丁二醇酯支架，其特征在于，所述支架包括聚丁二酸丁二醇酯支架基体、多巴胺膜和介孔硅酸镁微球涂层或掺铜介孔硅酸镁微球涂层；
所述的介孔硅酸镁微球涂层或掺铜介孔硅酸镁微球涂层涂覆在多巴胺膜的外层；
所述的多巴胺膜位于聚丁二酸丁二醇酯支架基体的表面；
所述的介孔硅酸镁微球涂层或掺铜介孔硅酸镁微球涂层中，微球粒径为180-220nm，微球的孔径为3-5nm；
所述的多巴胺膜的厚度为50-100nm。
2.如权利要求1所述的支架，其特征在于，
所述多巴胺膜的厚度为60-80nm；
和/或，所述介孔硅酸镁微球或掺铜介孔硅酸镁微球的孔径为4nm；
和/或，所述介孔硅酸镁微球或掺铜介孔硅酸镁微球的粒径为200nm；
和/或，所述介孔硅酸镁微球的比表面积为500-570m2/g，优选538.1m2/g；
和/或，所述掺铜介孔硅酸镁微球的比表面积为450-550m2/g，优选490.4m2/g；
和/或，所述的掺铜介孔硅酸镁微球中，铜的含量为3-7wt％，优选5wt％；
和/或，所述聚丁二酸丁二醇酯的数均分子量为4×104-7×104，重均分子量/数均分子量为1.2-2.4；
和/或，所述介孔硅酸镁微球由包括如下步骤的方法制得：
S1、将十六烷基三甲基溴化铵完全溶解于水中，加入氨水、正硅酸乙酯和六水合硝酸镁，静置反应；
S2、将S1所得的反应产物离心并洗涤所得白色沉淀物，烘干；
S3、将S2所得烘干产物置于马弗炉中烧结，除去十六烷基三甲基溴化铵，所得白色粉末即为介孔硅酸镁微球；
和/或，所述掺铜介孔硅酸镁微球由包括如下步骤的方法制得：
M1、将十六烷基三甲基溴化铵完全溶解于水中，加入六水合硝酸镁及三水合硝酸铜，静置反应；
M2、将M1所得的反应产物离心并洗涤所得淡绿色沉淀物，烘干；
M3、将M2所得烘干产物置于马弗炉中烧结，除去十六烷基三甲基溴化铵，所得淡绿色粉末即为掺铜介孔硅酸镁微球。
3.如权利要求2所述的支架，其特征在于，
步骤S1中的水为去离子水；
和/或，步骤S1中，所述氨水的浓度为1-1.5M，优选1M；
和/或，步骤S1中，所述静置反应的时间为3-6小时，优选4小时；
和/或，步骤S1按照如下操作进行：在35-40℃下，0.6-0.8g十六烷基三甲基溴化铵溶解于30-35mL去离子水中，依次加入6.5-7.5mL 1M氨水，3.2-3.8mL正硅酸乙酯和2.3-2.5g六水合硝酸镁，静置反应；
和/或，步骤S2中，所述洗涤采用去离子水和无水乙醇进行洗涤；
和/或，步骤S2中，所述烘干的温度为50-70℃，较佳地为60℃；
和/或，步骤S3中，所述烧结的温度为500-700℃，优选600℃；所述烧结的保温时间为2-4小时，优选3小时；
和/或，步骤M1中，所述氨水的浓度为1-1.5M，优选1M；
和/或，步骤M1中，所述水为去离子水；
和/或，步骤M1中，所述静置反应的时间为3-6小时，优选4小时；
和/或，步骤M1按照如下操作进行：在35-40℃下，0.6-0.8g十六烷基三甲基溴化铵溶解于30-35mL去离子水中，加入1.6-1.8g六水合硝酸镁及0.5-0.6g三水合硝酸铜，静置反应；
和/或，步骤M2中，所述洗涤采用去离子水和无水乙醇进行洗涤；
和/或，步骤M2中，所述烘干的温度为50-70℃，优选60℃；
和/或，步骤M3中，所述烧结的温度为500-700℃，优选600℃，所述烧结的保温时间为2-4小时，优选3小时。
4.一种制备如权利要求1-3任一项所述的具有涂层的聚丁二酸丁二醇酯支架的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)3D打印制备聚丁二酸丁二醇酯支架基体；所述3D打印的技术参数优选如下：3D打印设备的料筒温度为105-120℃，优选112℃；3D打印设备的出料速率为100-200g/min；3D打印设备的机械臂移动速率为0.1-1m/s；
(2)在步骤(1)制备的聚丁二酸丁二醇酯支架基体表面形成多巴胺膜，得到多巴胺表面改性聚丁二酸丁二醇酯支架；
(3)在步骤(2)得到的多巴胺表面改性聚丁二酸丁二醇酯支架上涂覆介孔硅酸镁微球或掺铜介孔硅酸镁微球，从而制得所述的具有涂层的聚丁二酸丁二醇酯支架。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)采用包括以下操作的方法进行：
将聚丁二酸丁二醇酯支架基体超声清洗，浸入多巴胺溶液中搅拌；用去离子水清洗、烘干，得到多巴胺表面改性聚丁二酸丁二醇酯支架。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，
所述支架基体的超声清洗在去离子水中进行，超声时间为5-20分钟，优选为10分钟；
和/或，所述多巴胺溶液为多巴胺的Tris-HCl缓冲溶液；
和/或，所述多巴胺溶液的浓度为1-3mg/ml，优选为2mg/ml；
和/或，所述支架基体在多巴胺溶液中的搅拌速度为100-300转/分钟，优选150-200转/分钟；搅拌时间为18-36小时，优选24小时；
和/或，所述烘干的温度为50-70℃，优选60℃。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)采用包括以下操作的方法进行：
将步骤(2)获得的多巴胺表面改性聚丁二酸丁二醇酯支架浸泡于介孔硅酸镁微球悬浮液或掺铜介孔硅酸镁微球悬浮液中并搅拌；用去离子水清洗、烘干，从而制得所述的具有涂层的聚丁二酸丁二醇酯支架。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，
所述多巴胺表面改性聚丁二酸丁二醇酯支架在介孔硅酸镁微球悬浮液或掺铜介孔硅酸镁微球悬浮液中的搅拌速度为100-300转/分钟，优选150-200转/分钟；搅拌时间为18-36小时，优选24小时；
和/或，所述介孔硅酸镁微球悬浮液或掺铜介孔硅酸镁微球悬浮液中，微球与分散液体的质量体积比为0.5-2g/100ml，优选1g/100ml；
和/或，所述烘干的温度为50-70℃，优选60℃。
9.一种由权利要求4-8任一项所述的方法制备的具有涂层的聚丁二酸丁二醇酯支架。
10.一种如权利要求1-3或9任一项所述的具有涂层的聚丁二酸丁二醇酯支架在制备骨缺损修复材料领域中的应用。
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