CN108064274A - 用于培养多能干细胞的培养基 - Google Patents

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Abstract

公开了包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂和轴蛋白稳定剂以及任选地还包含PKC抑制剂的培养基。还公开了包含其的细胞培养物及其用途。

Description

用于培养多能干细胞的培养基
发明领域与背景
本发明，在其一些实施方案中，涉及可用于产生和扩增通常多能干细胞、更具体地幼稚多能干细胞的新型培养基。
可通过与幼稚小鼠ESC共有全部定义特征的不同转录因子，最初为Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的异位表达，从体细胞产生称为诱导多能(iPS)细胞的ESC样细胞。该重编程过程通常需要至少一周时间段的大量细胞增殖，之后细胞子代的某一部分以不可预测的方式和不同的时间潜伏期成功地转化成ES样状态。在鉴定当与Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc (OSKM)组合时可替换某些外源因子或提高重编程效率的其它和替代的转录因子和小分子时，取得了巨大进展。已鉴定出在促进在部分供体细胞子代中导致真实iPSC重编程所需的早期和晚期染色质变化中与重编程因子合作的多种酶和染色质重构因子(例如Wdr5、Utx、Tet2)。
虽然有这些进展，但是体细胞的重编程效率仍然低。此外，对于用过表达的重编程因子攻击的各个体细胞表观基因组，结果是高度随机的，且大多数细胞呈现不同的重编程水平。
首先通过在白血病抑制因子(LIF)细胞因子和小鼠胚胎饲养(MEF)细胞存在下体外移植发育胚胎的内细胞团(ICM)，从小鼠胚胎中分离胚胎干细胞(ESC)。小鼠ESC再现出新生ICM的分子特性，因此被称为“幼稚多能细胞”。这包括Oct4、Nanog和Klf多能性基因的表达；外胚层和体细胞早期谱系特异性标志物的缺乏和具有在雌性细胞中有活性的两个X染色体的前X失活状态(pre X-inactivation state)的维持。此外，细胞保持不受限制的发育潜力，因为它们体外可稳健地分化成所有细胞类型，并且在注射入小鼠胚泡时，它们有效地促进3个胚层和嵌合动物的种系。最后，小鼠ES细胞的高生长速率和开放染色质构象，通过允许经由同源重组的有效基因特异性靶向，使这些细胞成为小鼠遗传学的最有价值的工具之一。
最近，通过在补充FGF2 [也称为“碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)”]和激活蛋白的生长条件中移植植入后外胚层，得到显著不同类型的多能细胞(称为EpiSC)。虽然EpiSC是多能的，但与ESC相比，发育潜力受限制，因此被称为“致敏多能细胞(primed pluripotent cell)”。EpiSC在产生动物嵌合体时是极低效的，已进行了X染色体失活，并显示早期谱系定型标志物的异源表达。虽然通过促进激活蛋白和FGF2信号转导，幼稚鼠多能细胞体外可分化成致敏EpiSC样状态，但是通过确定的信号转导刺激物，EpiSC可在表观遗传上回复到ESC样幼稚多能性。
引人注目的是，来源于人的ESC与EpiSC细胞而非与小鼠ESC共有几种定义性特征。与小鼠ESC不同，人ES细胞的维持需要FGF2和激活蛋白A(而非LIF/Stat3信号转导)，它们对作为单细胞的传代高度敏感，显示外胚层和谱系定型标志物的异源表达，并利用近端增强子元件驱动Oct4在植入后外胚层中表达(而非在ICM中有活性的远端Oct4增强子)。因此，人ESC与小鼠外胚层EpiSC的分子和生物相似性表明人ESC相当于小鼠ESC的致敏多能状态而非幼稚状态，并且这可能是阻碍其用于疾病相关研究的常规人ESC的生物学性质的根本原因。这包括费力的培养条件、同源重组的低的基因靶向效率和不同的人ESC和iPSC系中分化倾向的显著异质性。
常规/致敏人ESC衍生于ICM的事实已导致致敏状态是可在人中分离的多能性的唯一或“默认”状态的错误信念。只要外源提供另外的信号转导分子或转录因子以及LIF细胞因子，则小鼠幼稚ESC细胞可衍生于非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠胚泡(例如幼稚NOD ESC和iPSC可在PD0325901/CHIR99021/LIF或Kenopaullone/CHIR99021/LIF中或在Klf4/Lif和c-Myc/LIF的组成型表达条件中增殖)。在这些其它的因子不存在的情况下(或在仅LIF的条件下)，幼稚状态，即使分离自小鼠ICM，被体外获得的多能状态掩蔽，所述状态与在正常的早期发育期间可能模仿体内分化的过程中的EpiSC细胞几乎难以区别。这些研究结果允许从以前所认为的“非许可性”品系产生完全多能的幼稚ES和iPS细胞。在NOD小鼠中的实验提出了这样的问题，即是否尚未设计出允许幼稚或小鼠ESC样干细胞在人中衍化的适当条件和幼稚人多能状态的稳定是否需要其它未确定的因子(与用于NOD小鼠和大鼠ESC/iPSC的因子类似或不同)。对移植的胚泡体外分化成致敏状态的可能性的其它支持通过密切监测体外衍生的人雌性ESC系中的X染色体动力学来产生，并表明细胞进行X染色体失活作为在这种衍生后的体外适应过程的一部分，并且这可通过高氧浓度来加速，通过加入LIF或提供不确定信号的特定类型的饲养细胞来部分减弱。这些结果表明，XaXa (X-活性，X-活性，根据XIST体(XIST body)的不存在)幼稚细胞可存在于人ICM中，体外捕获的常规人ESC较差地反映其ICM对应物。
这些观察结果提出了未能设计出允许从迄今已产生致敏或EpiSC样细胞的各个物种(可能包括人)中分离幼稚干细胞的合适条件的可能性。实际上在继续研究中，提供了衍生与鼠ESC更广泛共有定义性特征的替代人多能细胞状态的可能性的证据。如前所示(Hanna等，2010b)，采取了涉及引入支持幼稚多能状态的重编程因子和/或小分子的筛选方法，所述幼稚多能状态导致与鼠ESC共有几种定义性特征的新的多能细胞状态的体外稳定(Hanna等，2010b)。在LIF细胞因子和ERK1/2抑制剂PD0325901和GSK3b抑制剂CHIR99021(简写为2i补充条件—ERK1/2信号转导和GSK3β的两种小分子抑制剂以促进WNT信号转导，简写为“PD/CH”或“2i”条件)下增殖以及OCT4/KLF4或KLF2/KLF4的过表达诱导常规人ES和iPS细胞转化为当时被误称为人幼稚多能状态，使人联想起小鼠ESC的幼稚多能状态(Hanna等，2010b)。通过几个可获得的标准包括胚体分化和体内畸胎瘤形成，这些之前描述的幼稚人ESC是多能的。重要的是，它们在表观遗传上和分子上不同于常规“致敏的”人ESC/iPSC。通过Hanna等(2010b)产生的“幼稚” hPSC显示两个X等位基因上的XIST甲基化、高的单细胞克隆效率，并显示类似于幼稚小鼠ES细胞的(缺乏MHC I类表达，且在9773个表达的直向同源基因的物种间无偏基因聚类中与鼠幼稚ESC聚类)基因表达模式(Hanna等，2010b)。然而，主要的限制和未解决的问题仍然是对之前发表/建立的系的真实多能性及其稳定性的质疑。只有转基因依赖性幼稚ESC/iPSC可维持超过18次传代。毛喉素使得能够置换外源因子以及2i/LIF，但只不超过19次传代，且培养物保持高分化倾向(Hanna等，2010b)。XIST在之前提及的幼稚人ESC/iPSC中被完全甲基化，且细胞没有任何XIST转录(Hanna等，2010b)，这与清楚表明XIST转录的人胚泡中的体内结果不一致(没有形成XIST体，即XIST包覆X染色体) (Okamoto等，2011)。总的来说，这些研究结果表明，分离细胞迄今不反映人ICM的真实性质，并保留受损的多能性和升高的分化倾向。许多不同小组产生的大量的公开数据强调迄今仍未适当分离出遗传上未修饰的多能幼稚人干细胞，并且不知道允许扩增所述细胞的条件及其分子性质(如果证实它们的确存在)的观点下的理论基础(De Los Angeles等，2012；Hanna等，2010b)。
多细胞生物体已经进化了组织稳态机制，以确保其器官和***的终身适合性。在这些机制中，调节消除不合需要的不太合适的细胞的那些机制是组织发育和稳态的基础。虽然明显损伤或过度增殖的细胞通常触发良好表征的细胞自主性凋亡途径或引起癌症，但调查活细胞适应性以优化组织的细胞组成的机制尚不太了解。候选机制是首先在果蝇中描述的“细胞竞争”(也称为“细胞欺骗”)的现象。
蝇类中的研究已经显示，生长中的器官的细胞能够比较它们的适合性与邻近细胞的适合性，并且当面临更适合的细胞群体(竞争者)时，消除(竞争掉)不太适合、但另外还活的细胞。对于存活的细胞竞争是一个活跃的过程，因为除了来自差别增殖的贡献之外，它通过细胞非自主机制通过凋亡或衰老介导的不太适合群体的消除来执行。触发蝇类中的竞争的细胞参数包括蛋白合成能力、生长因子接受性和dMyc(细胞合成代谢的主要激活物)的表达水平的差异。超级竞争或欺骗是细胞竞争的变体，其中适度过表达Myc的细胞竞争胜过野生型(WT)细胞。通过细胞竞争替代细胞群体是表型沉默的，因为竞争细胞大多符合大小控制机制。该过程对于组织性能的长期维持是潜在重要的，因为它可能提供从干细胞生态位和祖细胞库中消除次优细胞的机制。此外，细胞存活的竞争可能有助于增强再生期间的组织替代。
最近，细胞竞争已经在小鼠中表征。一项研究显示，小鼠外胚层E6.5阶段中相邻细胞之间的Myc剂量的不平衡促进细胞竞争，并且小鼠胚胎中的c-Myc过表达细胞表现得像“欺骗者”并且胜过它们在属于相同物种的相同小鼠胚胎中的邻近者(Dejosez M等, 2013."Safeguards for cell cooperation in mouse embryogenesis shown by genome-widecheater screen”. Science. 2013 Sep 27;341(6153):1511-4;和Clavería C.,等,2013. “Myc-driven endogenous cell competition in the early mammalian embryo“.Nature. 2013 Aug 1;500(7460):39-44)。其它研究显示，小鼠胚胎干细胞中或造血干细胞中P53的部分或完全消耗赋予它们同样胜过WT小鼠细胞的能力。
其它背景技术包括Xu Y., 等, 2013 (Journal of Biological Chemistry,288：9767-9778)；Luo M., 等, 2013 (Stem Cells. Mar 26. doi：10.1002/stem.1374.[印刷前的电子出版物])；国际申请号PCT/US08/04516 ("Reprogramming of SomaticCells", Jaenisch；Rudolf；等)；Kim, H., Wu, J., Ye, S., Tai, C.-I., Zhou, X.,Yan, H., Li, P., Pera, M.,和Ying, Q.-L. (2013). Modulation of b-cateninfunction maintains mouse epiblast stem cell and human embryonic stem cellself-renewal. Nature Communications 4, 1–11；Li, X., Zhu, L., Yang, A., Lin,J., Tang, F., Jin, S., Wei, Z., Li, J.,和Jin, Y. (2011). Calcineurin-NFATSignaling Critically Regulates Early Lineage Specification in Mouse EmbryonicStem Cells and Embryos. Stem Cell 8, 46–58和Shimizu, T., Ueda, J., Ho, J.C.,Iwasaki, K., Poellinger, L., Harada, I.,和Sawada, Y. (2012). Dual Inhibitionof Src and GSK3 Maintains Mouse Embryonic Stem Cells, Whose DifferentiationIs Mechanically Regulated by Src Signaling. Stem Cells 30, 1394–1404。
发明概述
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂和轴蛋白稳定剂的培养基。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含PKC抑制剂。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、轴蛋白稳定剂和PKC抑制剂的培养基。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含至少一种选自以下的试剂：ROCK抑制剂、SRC抑制剂、抗坏血酸、PKA激动剂、YAP/TAZ抑制剂、NOTCH抑制剂、SHH抑制剂、TGFβR抑制剂、BMP抑制剂、FGFR抑制剂、JNK抑制剂、ERK5抑制剂、BRAF抑制剂、ARAFi、CRAFi、p38抑制剂、GSK3b抑制剂、LSD1抑制剂、PI3K激活剂、SMAD激活剂和DOT1L抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述SMAD激活剂选自：激活蛋白A、TGFβ1和BMP4。
根据本发明的一些实施方案，所述PI3K激活剂选自：IGF1、IGF2、SCF和FGF2。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含GSK3b抑制剂。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、轴蛋白稳定剂、PKC抑制剂和GSK3b抑制剂的培养基。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含至少一种选自以下的试剂：ROCK抑制剂、SRC抑制剂、抗坏血酸、PKA激动剂、YAP/TAZ抑制剂、NOTCH抑制剂、SHH抑制剂、TGFβR抑制剂、BMP抑制剂、FGFR抑制剂、JNK抑制剂、ERK5抑制剂、BRAF抑制剂、ARAFi、CRAFi、p38抑制剂、LSD1抑制剂、PI3K激活剂、SMAD激活剂和DOT1L抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含至少一种选自以下的试剂：碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子β1 (TGFβ1)、激活蛋白A、GSK3b抑制剂、ROCK抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、NOTCH抑制剂、SRC抑制剂、***1 (IGF1)、***II (IGFII)、骨形态发生蛋白(BMP)信号传导抑制剂、Sonic Hedgehog通路(SHH)抑制剂、ERK5抑制剂、毛喉素、Kenpaullone、BayK8644、G9a和/或Glp的抑制剂(例如，BIX01294或UNC0638)、干细胞因子(SCF)、YAP/TAZ抑制剂、L-抗坏血酸, LSD1抑制剂和DOT1L抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含至少一种选自以下的试剂：转化生长因子受体(TGFR)抑制剂、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)抑制剂、激活蛋白A、GSK3b抑制剂、ROCK抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、NOTCH抑制剂、SRC抑制剂、***1(IGF1)、***II (IGFII)、骨形态发生蛋白(BMP)信号传导抑制剂、SonicHedgehog通路(SHH)抑制剂、ERK5抑制剂、毛喉素、Kenpaullone、BayK8644、G9a和/或Glp的抑制剂(例如，BIX01294或UNC0638)、干细胞因子(SCF)、YAP/TAZ抑制剂、L-抗坏血酸、LSD1抑制剂和DOT1L抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含至少一种选自以下的试剂：激活蛋白A、转化生长因子β1(TGFβ1)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)抑制剂、GSK3b抑制剂、ROCK抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、NOTCH抑制剂、SRC抑制剂、***1(IGF1)、***II (IGFII)、骨形态发生蛋白(BMP)信号传导抑制剂、SonicHedgehog通路(SHH)抑制剂、ERK5抑制剂、毛喉素、Kenpaullone、BayK8644、G9a和/或Glp的抑制剂(例如，BIX01294或UNC0638)、干细胞因子(SCF)、YAP/TAZ抑制剂、L-抗坏血酸、LSD1抑制剂和DOT1L抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含至少一种选自以下的试剂：碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子受体(TGFR)抑制剂、GSK3b抑制剂、ROCK抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、NOTCH抑制剂、SRC抑制剂、***1 (IGF1)、***II (IGFII)、骨形态发生蛋白(BMP)信号传导抑制剂、Sonic Hedgehog通路(SHH)抑制剂、ERK5抑制剂、毛喉素、Kenpaullone、BayK8644、G9a和/或Glp的抑制剂(例如，BIX01294或UNC0638)、干细胞因子(SCF)、YAP/TAZ抑制剂、L-抗坏血酸、LSD1抑制剂和DOT1L抑制剂。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了包含ERK1/2抑制剂、STAT3激活剂和SRC抑制剂的培养基。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含轴蛋白复合物稳定剂(AXINs)。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含GSK3β抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含p38抑制剂。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了包含ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、p38抑制剂、STAT3激活剂和至少一种选自SRC抑制剂和轴蛋白复合物稳定剂(AXINs)的试剂的培养基。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了包含ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、p38抑制剂、JNK抑制剂、STAT3激活剂、转化生长因子β受体(TGFβR)抑制剂、PKC抑制剂、p38抑制剂和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的培养基。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了包含细胞和本发明的一些实施方案的培养基的细胞培养物。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了产生幼稚多能干细胞(PSC)的方法，其包括：
在本发明的一些实施方案的培养基中培育非幼稚PSC细胞，其允许从非幼稚PSC产生幼稚PSC，其中：
(i) 当幼稚PSC是雌性PSC时，则幼稚雌性PSC具有X染色体失活特异性转录因子(XIST)基因的启动子的两个未甲基化等位基因；和
(ii) 当幼稚PSC是雄性PSC时，则幼稚雄性PSC具有XIST基因的启动子的一个未甲基化等位基因；和/或
幼稚PSC中的转录因子E3(TFE3)的表达水平的特征在于如通过免疫染色测定法确定的等于或高于1的细胞核与细胞质表达比率；和/或
幼稚PSC的特征在于幼稚PSC的细胞表面上的C-KIT (CD117) 的阳性表达，
由此产生幼稚PSC。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了产生幼稚多能干细胞(PSC)的方法，其包括在允许从非幼稚PSC产生幼稚PSC的条件下培育非幼稚PSC细胞，所述幼稚PSC包含：
未甲基化的X染色体失活特异性转录因子(XIST)基因，其中：
(i) 当幼稚PSC是雌性PSC时，则幼稚雌性PSC具有XIST基因的启动子的两个未甲基化等位基因；和
(ii) 当幼稚PSC是雄性PSC时，则幼稚雄性PSC具有XIST基因的启动子的一个未甲基化等位基因，
和/或
转录因子E3(TFE3)的表达水平的特征在于如通过免疫染色测定法确定的等于或高于1的细胞核与细胞质表达比率，
其中所述条件含有包含KO-DMEM、N2补充剂(Gibco)、B27补充剂、LIF、ERK1/2抑制剂、PKC抑制剂、轴蛋白稳定剂的培养基，由此产生幼稚PSC。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了产生幼稚多能干细胞(PSC)的方法，其包括在允许从非幼稚PSC产生幼稚PSC的条件下培育非幼稚PSC细胞，所述幼稚PSC包含：
未甲基化的X染色体失活特异性转录因子(XIST)基因，其中：
(i) 当幼稚PSC是雌性PSC时，则幼稚雌性PSC具有XIST基因的启动子的两个未甲基化等位基因；和
(ii) 当幼稚PSC是雄性PSC时，则幼稚雄性PSC具有XIST基因的启动子的一个未甲基化等位基因，
和/或
转录因子E3(TFE3)的表达水平的特征在于如通过免疫染色测定法确定的等于或高于1的细胞核与细胞质表达比率，
其中所述条件含有包含DMEM-F12/ NEURObasal (GIBCO) 1:1混合物、N2补充剂(Gibco)、B27补充剂(GIBCO)、LIF(STAT3激活剂)、ERK1/2抑制剂、PKC抑制剂、轴蛋白稳定剂的培养基，
由此产生幼稚PSC。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了产生幼稚多能干细胞(PSC)的方法，其包括在允许从非幼稚PSC产生幼稚PSC的条件下培育非幼稚PSC细胞，所述幼稚PSC包含：
未甲基化的X染色体失活特异性转录因子(XIST)基因，其中：
(i) 当幼稚PSC是雌性PSC时，则幼稚雌性PSC具有XIST基因的启动子的两个未甲基化等位基因；和
(ii) 当幼稚PSC是雄性PSC时，则幼稚雄性PSC具有XIST基因的启动子的一个未甲基化等位基因，
和/或
转录因子E3(TFE3)的表达水平的特征在于如通过免疫染色测定法确定的等于或高于1的细胞核与细胞质表达比率，
其中所述条件含有包含DMEM-F12、N2补充剂(Gibco)、B27补充剂、LIF(STAT3激活剂)、ERK1/2抑制剂、PKC抑制剂、轴蛋白稳定剂的培养基，由此产生幼稚PSC。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了产生幼稚多能干细胞(PSC)的方法，其包括在允许从非幼稚PSC产生幼稚PSC的条件下培育非幼稚PSC细胞，所述幼稚PSC包含：
未甲基化的X染色体失活特异性转录因子(XIST)基因，其中：
(i) 当幼稚PSC是雌性PSC时，则幼稚雌性PSC具有XIST基因的启动子的两个未甲基化等位基因；和
(ii) 当幼稚PSC是雄性PSC时，则幼稚雄性PSC具有XIST基因的启动子的一个未甲基化等位基因，
和/或
转录因子E3(TFE3)的表达水平的特征在于如通过免疫染色测定法确定的等于或高于1的细胞核与细胞质表达比率，
其中所述条件含有包含KO-DMEM、N2补充剂(Gibco)、B27补充剂、LIF、ERK1/2抑制剂、GSK3b抑制剂、PKC抑制剂、轴蛋白稳定剂的培养基，由此产生幼稚PSC。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了产生幼稚多能干细胞(PSC)的方法，其包括在允许从非幼稚PSC产生幼稚PSC的条件下培育非幼稚PSC细胞，所述幼稚PSC包含：
未甲基化的X染色体失活特异性转录因子(XIST)基因，其中：
(i) 当幼稚PSC是雌性PSC时，则幼稚雌性PSC具有XIST基因的启动子的两个未甲基化等位基因；和
(ii) 当幼稚PSC是雄性PSC时，则幼稚雄性PSC具有XIST基因的启动子的一个未甲基化等位基因，
和/或
转录因子E3(TFE3)的表达水平的特征在于如通过免疫染色测定法确定的等于或高于1的细胞核与细胞质表达比率，
其中所述条件含有包含DMEM-F12/ NEURObasal (GIBCO) 1:1混合物、N2补充剂(Gibco)、B27补充剂(GIBCO)、LIF(STAT3激活剂)、ERK1/2抑制剂、GSK3b抑制剂、PKC抑制剂、轴蛋白稳定剂的培养基，由此产生幼稚PSC。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了产生幼稚多能干细胞(PSC)的方法，其包括在允许从非幼稚PSC产生幼稚PSC的条件下培育非幼稚PSC细胞，所述幼稚PSC包含：
未甲基化的X染色体失活特异性转录因子(XIST)基因，其中：
(i) 当幼稚PSC是雌性PSC时，则幼稚雌性PSC具有XIST基因的启动子的两个未甲基化等位基因；和
(ii) 当幼稚PSC是雄性PSC时，则幼稚雄性PSC具有XIST基因的启动子的一个未甲基化等位基因，
和/或
转录因子E3(TFE3)的表达水平的特征在于如通过免疫染色测定法确定的等于或高于1的细胞核与细胞质表达比率，
其中所述条件含有包含DMEM-F12、N2补充剂(Gibco)、B27补充剂、LIF(STAT3激活剂)、ERK1/2抑制剂、GSK3b抑制剂、PKC抑制剂、轴蛋白稳定剂的培养基，由此产生幼稚PSC。
根据本发明的一些实施方案，培育在不含饲养细胞的培养条件下进行。
根据本发明的一些实施方案，培育在包括在饲养细胞上培养的培养条件下进行。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了改善从体细胞产生诱导多能干细胞(iPSC)的方法，其包括：
(a) 在体细胞内表达选自Nanog、ESRRB、KLF2、TBX3、ERAS和KLF17的第一因子和选自Nanog、ESRRB、KLF2、TBX3、ERAS、Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc和KLF17的第二因子，其中第一和第二因子是不同的；和
(b) 抑制体细胞中的Mbd3和/或Gatad2a表达和/或活性，由此改善从体细胞产生iPSC。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含ROCK抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含JNK抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含至少一种选自以下的试剂：碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子 (TGF)诱导剂、转化生长因子受体(TGFR)抑制剂和成纤维细胞生长因子受体(FGFR)抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含至少两种选自以下的试剂：碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子 (TGF)诱导剂、转化生长因子受体(TGFR)抑制剂和成纤维细胞生长因子受体(FGFR)抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含 TGF诱导物，其中所述TGF诱导物选自转化生长因子β1 (TGFβ1)、转化生长因子β2 (TGFβ2)和激活蛋白。
根据本发明的一些实施方案，所述TGF诱导物选自转化生长因子β1 (TGFβ1)、转化生长因子β2 (TGFβ2)和激活蛋白。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含蛋白激酶C (PKC)抑制剂和/或BMP抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含至少一种选自以下的额外试剂：***1 (IGF1)、***II (IGFII)、骨形态发生蛋白4 (BMP4)、Sonic Hedgehog通路(SHH)抑制剂、ERK5抑制剂、毛喉素、Kenpaullone、BayK8644、G9a和/或Glp的抑制剂(例如，BIX01294或UNC0638)和干细胞因子(SCF)。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、bFGF、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂和SRC家族激酶抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、bFGF、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂和SRC家族激酶抑制剂和BMP抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、bFGF、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂和SRC家族激酶抑制剂和PKC抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、bFGF、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、SRC家族激酶抑制剂和BMP抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、bFGF、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂和SRC家族激酶抑制剂、BMP抑制剂和PKC抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、bFGF、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂和SRC家族激酶抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、bFGF、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、SRC家族激酶抑制剂和BMP抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、bFGF、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、SRC家族激酶抑制剂和PKC抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、bFGF、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、SRC家族激酶抑制剂、BMP抑制剂和PKC抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂和SRC家族激酶抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、SRC家族激酶抑制剂和BMP抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、SRC家族激酶抑制剂和PKC抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、SRC家族激酶抑制剂、PKC抑制剂和BMP抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、FGF2、TGFβ1、ROCK抑制剂和SRC家族激酶抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、FGF2、TGFβ1、ROCK抑制剂、SRC家族激酶抑制剂和BMP抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、FGF2、TGFβ1、ROCK抑制剂、SRC家族激酶抑制剂和PKC抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、FGF2、TGFβ1、ROCK抑制剂、SRC家族激酶抑制剂、PKC抑制剂和BMP抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂和SRC家族激酶抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、SRC家族激酶抑制剂和BMP抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、SRC家族激酶抑制剂和PKC抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、SRC家族激酶抑制剂、PKC抑制剂和BMP抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、ROCK抑制剂、轴蛋白抑制剂和SRC家族激酶抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、SRC家族激酶抑制剂和BMP抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、SRC家族激酶抑制剂和PKC抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、SRC家族激酶抑制剂、PKC抑制剂和BMP抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂和轴蛋白抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白抑制剂和BMP抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白抑制剂和PKC抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白抑制剂、PKC抑制剂和BMP抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、SRC家族激酶抑制剂和FGF受体抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、SRC家族激酶抑制剂、FGF受体抑制剂和BMP抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、SRC家族激酶抑制剂、FGF受体抑制剂和PKC抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、SRC家族激酶抑制剂、FGF受体抑制剂、PKC抑制剂和BMP抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白抑制剂和FGF受体抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、FGF受体抑制剂和BMP抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、FGF受体抑制剂和PKC抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、FGF受体抑制剂、PKC抑制剂和BMP抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、Src家族激酶抑制剂和TGF受体抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、Src家族激酶抑制剂、TGF受体抑制剂和BMP抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、Src家族激酶抑制剂、TGF受体抑制剂和PKC抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、Src家族激酶抑制剂、TGF受体抑制剂、PKC抑制剂和BMP抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述STAT3激活剂选自白血病抑制因子(LIF)和白介素6 (IL6)。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含至少一种选自以下的试剂：BMP抑制剂、ROCK抑制剂、SRC抑制剂和轴蛋白复合物稳定剂(AXINs)。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、p38抑制剂、JNK抑制剂、STAT3激活剂、转化生长因子β受体(TGFβR)抑制剂、PKC抑制剂、p38抑制剂和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，还包含至少一种选自以下的试剂：a BMP抑制剂、ROCK抑制剂、SRC抑制剂和轴蛋白复合物稳定剂(AXINs)。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含选自N2补充剂和B27补充剂的补充剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含抗坏血酸。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含油酸。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含亚油酸和/或2-哌啶酸。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基不含动物血清。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含血清替代物。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基能够将多能干细胞在未分化状态下维持至少2代。
根据本发明的一些实施方案，所述多能干细胞是幼稚多能干细胞。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含MBD3抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含克罗莫结构域解旋酶DNA结合蛋白4(CHD4)抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含P66α卷曲-螺旋结构域或p66α抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述非幼稚PSC选自致敏的PSC、囊胚、诱导多能干细胞(iPSC)和体细胞。
根据本发明的一些实施方案，所述非幼稚PSC包含体细胞，则所述方法进一步包括使所述体细胞经历去分化条件，以由此获得诱导多能干细胞。
根据本发明的一些实施方案，所述去分化条件包括在体细胞内外源表达至少两种选自Oct4、Sox2、Klf4、Nanog、ESRRB、KLF2、TBX3、ERAS、c-Myc和KLF17的因子。
根据本发明的一些实施方案，通过抑制Mbd3与核小体重塑和脱乙酰酶(NuRD)复合物的结合来进行抑制Mbd3活性。
根据本发明的一些实施方案，使用克罗莫结构域解旋酶DNA结合蛋白4(CHD4)抑制剂来进行抑制Mbd3与NuRD复合物的结合。
根据本发明的一些实施方案，使用P66α卷曲-螺旋结构域来进行抑制Mbd3与NuRD复合物的结合。
根据本发明的一些实施方案，通过抑制Mbd3与核小体重塑和脱乙酰酶(NuRD)复合物的结合来进行抑制Mbd3活性，其中使用P66α卷曲-螺旋结构域来进行抑制Mbd3与NuRD复合物的结合。
根据本发明的一些实施方案，使用蛋白激酶C(PKC)抑制剂来进行抑制Mbd3表达。
根据本发明的一些实施方案，所述方法还包括外源表达ES细胞表达的Ras(ERAS)编码序列或激活体细胞中的ERAS的内源表达。
根据本发明的一些实施方案，表达进行至少48小时，使得将Mbd3抑制至表达之前的Mbd3水平的10-30％。
根据本发明的一些实施方案，表达进行约48小时，且在约48小时后实现抑制。
根据本发明的一些实施方案，所述iPSC是鼠iPSC。
根据本发明的一些实施方案，所述方法还包括在包含LIF、ERK1/2抑制剂和GSK3b抑制剂的培养基中培养鼠iPSC。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含选自SRC抑制剂和轴蛋白复合物稳定剂(AXINs)的试剂。
根据本发明的一些实施方案，当iPSC是人iPSC时，所述方法还包括：
(c)在包含LIF、ERK1/2抑制剂、GSK3b抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子-β1(TGFβ1)的培养基中培养人iPSC 。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含ROCK抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含SRC抑制剂和轴蛋白复合物稳定剂(AXINs)。
根据本发明的一些实施方案，步骤(c)在从步骤(a)的表达起约48小时后进行。
根据本发明的一些实施方案，使用所述因子的DNA转染进行表达。
根据本发明的一些实施方案，使用所述因子的RNA转染进行表达。
根据本发明的一些实施方案，使用所述因子的蛋白转染进行表达。
根据本发明的一些实施方案，雌性细胞中的XIST基因的启动子的未甲基化的等位基因包含由SEQ ID NO:70所示的XIST启动子扩增子中少于20％的CpG位点被甲基化。
根据本发明的一些实施方案，雄性细胞中的XIST基因的启动子的未甲基化的等位基因包含由SEQ ID NO:70所示的XIST启动子扩增子中少于20％的CpG位点被甲基化。
根据本发明的一些实施方案，G9a的抑制剂和/或Glp的抑制剂选自：BIX01294和UNC0638。
根据本发明的一些实施方案，G9a的抑制剂和/或Glp的抑制剂是BIX01294。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了分离的幼稚多能干细胞，其经遗传修饰以过表达选自C-MYC、N-MYC、L-MYC、EDAR(外胚层发育异常蛋白A受体)、MDM2和ERAS的致癌蛋白，和/或下调选自P53和NFκB抑制剂α的肿瘤抑制蛋白。
根据本发明的一些实施方案，所述肿瘤抑制基因的下调通过将所述肿瘤抑制蛋白的显性失活突变体引入细胞来进行。
根据本发明的一些实施方案，所述肿瘤抑制蛋白的显性失活物包含GenBank登录号AAA39883.1 (SEQ ID NO:212)中所示的P53蛋白中的P53 R172H显性失活突变。
根据本发明的一些实施方案，所述肿瘤抑制蛋白的显性失活物包含GenBank登录号BAC16799.1 (SEQ ID NO:210)中所示的P53蛋白中的R175H、G245S、R248W、R249S、R273H和/或R282W显性失活突变。
根据本发明的一些实施方案，所述肿瘤抑制蛋白的显性失活包含GenBank登录号NP_065390.1 (SEQ ID NO:211)中所示的NFκB抑制剂α蛋白中的S32D和S36D突变、S32E和S36E突变、S32D和S36E突变和/或S32E和S36D突变。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的遗传修饰的分离的幼稚多能干细胞的特征在于：
其中
(i) 当所述幼稚PSC是雌性PSC时，则所述幼稚雌性PSC具有X染色体失活特异性转录因子(XIST)基因的启动子的两个未甲基化等位基因；和
(ii) 当所述幼稚PSC是雄性PSC时，则所述幼稚雄性PSC具有所述XIST基因的所述启动子的一个未甲基化等位基因，
和/或
所述幼稚PSC中的转录因子E3(TFE3)的表达水平的特征在于如通过免疫染色测定法确定的等于或高于1的细胞核与细胞质表达比率，
和/或
所述幼稚PSC的特征在于幼稚PSC的细胞表面上的C-KIT (CD117) 的阳性表达。
根据本发明的一些实施方案，所述幼稚多能干细胞是灵长类动物细胞。
根据本发明的一些实施方案，所述幼稚多能干细胞是人细胞。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了产生嵌合动物的方法，其包括将本发明的一些实施方案的分离的幼稚多能干细胞或本发明的一些实施方案的原始生殖细胞引入宿主动物的胚胎，由此产生嵌合动物。
根据本发明的一些实施方案，所述胚胎是植入前胚胎。
根据本发明的一些实施方案，所述方法还包括允许所述植入前胚胎离体或体内生长。
根据本发明的一些实施方案，所述引入在体内进行。
根据本发明的一些实施方案，所述引入在体外或离体进行。
根据本发明的一些实施方案，所述植入前胚胎包含至少4个细胞。
根据本发明的一些实施方案，所述植入前胚胎包含不多于128个细胞。
根据本发明的一些实施方案，所述宿主动物是小鼠。
根据本发明的一些实施方案，分离的幼稚多能干细胞对于宿主动物是同种异体的。
根据本发明的一些实施方案，分离的幼稚多能干细胞对于宿主动物是异种的。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了包含本发明的一些实施方案的分离的幼稚多能干细胞和培养基的细胞培养物。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基能够将所述多能干细胞在幼稚状态下维持至少5代。
根据本发明的一些实施方案，本发明的细胞培养物中包括的培养基是上文和下文所述的培养基中的任一种。
根据本发明的一些实施方案，本发明的细胞培养物中包括的培养基是本发明的一些实施方案的培养基。根据本发明的一些实施方案，本发明的细胞培养物中包括的培养基是培养基1-147中的任一种。
根据本发明的一些实施方案，本发明的细胞培养物中包括的培养基是通过引用全文完全并入本文的WO2014/174470中所述的培养基中的任一种。
根据本发明的一些实施方案，本发明的细胞培养物中包括的培养基包含ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、p38抑制剂、JNK抑制剂、STAT3激活剂和至少一种选自碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子β1 (TGFβ1)、蛋白激酶C (PKC)抑制剂、ROCK抑制剂和NOTCH抑制剂的试剂。
根据本发明的一些实施方案，本发明的细胞培养物中包括的培养基包含ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、p38抑制剂、JNK抑制剂、STAT3激活剂和至少一种选自转化生长因子受体(TGFR)抑制剂、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)抑制剂、蛋白激酶C (PKC)抑制剂、ROCK抑制剂和NOTCH抑制剂的试剂。
根据本发明的一些实施方案，所述STAT3激活剂选自白血病抑制因子(LIF)和白介素6 (IL6)。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含至少一种选自以下的额外试剂：***1 (IGF1)、***II (IGFII)、骨形态发生蛋白(BMP)信号传导抑制剂、Sonic Hedgehog通路(SHH)抑制剂、ERK5抑制剂、毛喉素、Kenpaullone、BayK8644、Bix1294和干细胞因子(SCF)。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含至少一种选自以下的额外试剂：***1 (IGF1)、***II (IGFII)、骨形态发生蛋白4 (BMP4)、Sonic Hedgehog通路(SHH)抑制剂、ERK5抑制剂、毛喉素、Kenpaullone、BayK8644、Bix1294和干细胞因子(SCF)。
根据本发明的一些实施方案，所述STAT3激活剂包含LIF，且其中所述至少一种试剂包含PKC抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述STAT3激活剂包含LIF，且其中所述至少一种试剂包含TGFβ1和蛋白激酶C抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含FGFR抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含TGFR抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述STAT3激活剂包含LIF，且其中所述至少一种试剂包含TGFβ1和蛋白激酶C抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含FGFR抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述STAT3激活剂包含LIF，且其中所述至少一种试剂包含bFGF和TGFβ1。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含ROCK抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含蛋白激酶C抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述STAT3激活剂包含LIF，且其中所述至少一种试剂包含bFGF、ROCK抑制剂、骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂、NOTCH抑制剂和转化生长因子受体(TGFR)抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含Sonic Hedgehog通路(SHH)抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述STAT3激活剂包含LIF，且其中所述至少一种试剂包含NOTCH抑制剂和成纤维细胞生长因子受体(FGFR)抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含选自***II(IGFII)、干细胞因子(SCF)和转化生长因子β1 (TGFβ1)的试剂。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了包含白血病抑制因子(LIF)、ERK1/2抑制剂、GSK3b抑制剂、p38抑制剂、JNK抑制剂和蛋白激酶C抑制剂的培养基。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基还包含FGFR抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基还包含TGFR抑制剂。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了包含白血病抑制因子(LIF)、ERK1/2抑制剂、GSK3b抑制剂、p38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1和蛋白激酶C抑制剂的培养基。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基还包含FGFR抑制剂。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了包含白血病抑制因子(LIF)、ERK1/2抑制剂、GSK3b抑制剂、p38抑制剂、JNK抑制剂、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子-β1 (TGFβ1)的培养基。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基还包含ROCK抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基还包含蛋白激酶C抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基还包含选自以下的试剂：骨形态发生蛋白4 (BMP4)、IGF1, IGFII、毛喉素、FGFR抑制剂、TGFR抑制剂、Kenpaullone、BayK8644、Bix1294和干细胞因子(SCF)。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基还包含BMP I型受体(ALK2、3、6)抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基还包含抗坏血酸。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基还包含油酸。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基还包含亚油酸。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基还包含2-哌啶酸。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基不含动物血清。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基还包含血清替代物。
除非另有定义，本文所使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。虽然与本文所述方法和材料类似或相当的方法和材料可用于本发明实施方案的实践和测试，但下面描述了示例性的方法和/或材料。在冲突的情况下，则以本专利说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实例只是说明性的，并无意必定是限制性的。
附图的几个视图的简述
本文仅举例、参照附图描述了本发明的一些实施方案。现在具体参照附图细节，应强调，所述细节只是举例方式，并用于说明性论述本发明实施方案的目的。在这一方面，与附图一起呈现的描述使本领域技术人员清楚可如何实施本发明的实施方案。
在附图中：
图1是说明携带Oct4-GFP报道分子的WIBR3 hESC系的FACS分析的图。将细胞在明胶/DR4饲养层包被的板上在5% O2中向以下基础培养基添加条件1-40的所示补充剂的情况下进行扩增：Neurobasal培养基(Invitrogen 21103-049)和DMEM/F12 (BiologicalIndustries 06-1170-50-1A)的1:1混合物 – 总共475 ml，Pen-strep 5 ml (BiologicalIndustries 03-033-1B)，L-谷氨酰胺5 ml (Biological Industries - 02-022-1B)，NEAA– 5 ml (Biological Industries 01-340-1B)，50 μl 50 mM储备β-巯基乙醇(1 vile)，5ml B27补充剂(Invitrogen 17504-044)，胰岛素(Sigma I-1882)，脱铁运铁蛋白(Sigma T-1147，100 μg/ml终浓度)，孕酮(Sigma P8783，0.02 μg/ml终浓度)，腐胺(SigmaP5780，16 μg/ml终浓度)，***钠(Sigma S5261)，L-抗坏血酸2-磷酸盐(Sigma A8960) (50 μg/ml终浓度)，BSA (100X级分V 7.5%溶液Gibco 15260-037)。将细胞扩增至多21代，并通过FACS分析来评估OCT4-GFP+报道分子。结果显示细胞在所述条件下维持其多能性。
图2是说明携带deltaPEOct4-GFP报道分子的WIBR3 hESC系的FACS分析(描述于Gafni等Nature 2013)的图。将细胞在明胶/DR4饲养层包被的板上在5% O2中向以下基础培养基添加条件1-40的所示补充剂的情况下进行扩增：Neurobasal培养基(Invitrogen21103-049)和DMEM/F12 (Biological Industries 06-1170-50-1A)的1:1混合物 – 总共475 ml，Pen-strep 5 ml (Biological Industries 03-033-1B)，L-谷氨酰胺5 ml(Biological Industries - 02-022-1B)，NEAA – 5 ml (Biological Industries 01-340-1B)，50 μL 50 mM储备β-巯基乙醇(1 vile)，5 ml B27补充剂(Invitrogen 17504-044)，胰岛素(Sigma I-1882) - 12.5微克/ml胰岛素)，脱铁运铁蛋白(Sigma T-1147，100μg/ml终浓度)，孕酮(Sigma P8783，0.02 μg/ml终浓度)，腐胺(SigmaP5780，16 μg/ml终浓度)，***钠(Sigma S5261，每500ml培养基添加5 μl 3 mM储备溶液)，L-抗坏血酸2-磷酸盐(Sigma A8960) (50 μg/ml终浓度)，BSA (100X级分V 7.5%溶液Gibco 15260-037)。将细胞扩增至多21代，并通过FACS分析来评估OCT4-GFP+报道分子。结果显示细胞在所述条件下维持其多能性。
图3A、3B、3C、3D、3E和3F是在所示选择条件下在P12的多能细胞集落的代表性图像。图3A - 条件1；图3B - 条件2；图3C - 条件3；图3D - 条件4；图3E - 条件9；图3F - 条件11。将WIS2 hESC系在玻连蛋白包被的板上在5% O2中用以下基础培养基进行扩增：Neurobasal培养基(Invitrogen 21103-049)和DMEM/F12 (Biological Industries 06-1170-50-1A)的1:1混合物 – 总共475 ml，Pen-strep 5 ml (Biological Industries 03-033-1B)，L-谷氨酰胺5 ml (Biological Industries - 02-022-1B)，NEAA – 5 ml(Biological Industries 01-340-1B)，50 μL 50 mM储备β-巯基乙醇(1 vile)，5 ml B27补充剂(Invitrogen 17504-044)，胰岛素(Sigma I-1882 - 12.5微克/ml胰岛素)，脱铁运铁蛋白(Sigma T-1147，100 μg/ml终浓度)，孕酮(Sigma P8783，0.02 μg/ml终浓度)，腐胺(SigmaP5780，16 μg/ml终浓度)，***钠(Sigma S5261，每500ml培养基添加5 μl 3 mM储备溶液)，L-抗坏血酸2-磷酸盐(Sigma A8960) (50 μg/ml终浓度)，BSA (100X级分V 7.5%溶液Gibco 15260-037)。
图4A、4B、4C和4D是在所示选择条件下在P20的多能细胞集落的代表性图像。图4A- 条件9；图4B - 条件10；图4C - 条件11；图4D - 条件4。将WIS2 hESC系在明胶/DR4饲养细胞包被的板上在5% O2中用以下基础培养基进行扩增：Neurobasal培养基(Invitrogen21103-049)和DMEM/F12 (Biological Industries 06-1170-50-1A)的1:1混合物 – 总共475 ml，Pen-strep 5 ml (Biological Industries 03-033-1B)，L-谷氨酰胺5 ml(Biological Industries - 02-022-1B)，NEAA – 5 ml (Biological Industries 01-340-1B)，50 μL 50 mM储备β-巯基乙醇(1 vile)，5 ml B27补充剂(Invitrogen 17504-044)，胰岛素(Sigma I-1882) - 12微克/ml胰岛素)，脱铁运铁蛋白(Sigma T-1147，100 μg/ml终浓度)，孕酮(Sigma P8783，0.02 μg/ml终浓度)，腐胺(SigmaP5780，16 μg/ml终浓度)，***钠(Sigma S5261，每500 ml培养基添加5 μl 3 mM储备溶液)，L-抗坏血酸2-磷酸盐(Sigma A8960) (50 μg/ml终浓度)，BSA (100X级分V 7.5%溶液Gibco 15260-037 -每500ml培养基瓶0.16ml)。
图5A、5B和5C是在所示选择条件下在P18-20的多能细胞集落的代表性图像。图5A- 条件9；图5B - 条件10；图5C - 条件4。将WIS2 hESC系在明胶/DR4饲养细胞包被的板上在5% O2中用以下基础培养基进行扩增：Neurobasal培养基(Invitrogen 21103-049)和DMEM/F12 (Biological Industries 06-1170-50-1A)的1:1混合物 – 总共475 ml，Pen-strep 5 ml (Biological Industries 03-033-1B)，L-谷氨酰胺5 ml (BiologicalIndustries - 02-022-1B)，NEAA – 5 ml (Biological Industries 01-340-1B)，50 μL50 mM储备β-巯基乙醇(1 vile)，5 ml B27补充剂(Invitrogen 17504-044)，胰岛素(SigmaI-1882) - 12微克/ml胰岛素)，脱铁运铁蛋白(Sigma T-1147，100 μg/ml终浓度)，孕酮(Sigma P8783，0.02 μg/ml终浓度)，腐胺(SigmaP5780，16 μg/ml终浓度)，***钠(SigmaS5261，每500 ml培养基添加5 μl 3 mM储备溶液)，L-抗坏血酸2-磷酸盐(Sigma A8960)(50 μg/ml终浓度)，BSA (100X级分V 7.5%溶液Gibco 15260-037 - 每500ml培养基瓶0.16ml)。将细胞针对碱性磷酸酶干细胞标志物(AP)染色，并且发现阳性，如所示选择条件中在P18-20的多能细胞集落的代表性图像所示。
图6A、6B、6C、6D、6E和6F是在无L-谷氨酰胺的具体条件下扩增的人幼稚ESCs/iPSC的图像。图6A - 条件1；图6B - 条件2；图6C - 条件3；图6D - 条件4；图6E - 条件9；图6F- 条件11。将FX71人iPSC系在明胶/DR4饲养细胞包被的板上在5% O2中用以下基础培养基进行扩增：Neurobasal培养基(Invitrogen 21103-049)和DMEM/F12 (BiologicalIndustries 06-1170-50-1A)的1:1混合物 – 总共475 ml，Pen-strep 5 ml (BiologicalIndustries 03-033-1B)，NEAA – 5 ml (Biological Industries 01-340-1B)，50 μL 50mM储备β-巯基乙醇(1 vile)，5 ml B27补充剂(Invitrogen 17504-044)，胰岛素(Sigma I-1882) - 12.5微克/ml胰岛素)，脱铁运铁蛋白(Sigma T-1147，100 μg/ml终浓度)，孕酮(Sigma P8783，0.02 μg/ml终浓度)，腐胺(SigmaP5780，16 μg/ml终浓度)，***钠(SigmaS5261，每500 ml培养基添加5 μl 3 mM储备溶液)，L-抗坏血酸2-磷酸盐(Sigma A8960)(50 μg/ml终浓度)，BSA (100X级分V 7.5%溶液Gibco 15260-037 - 每500ml培养基瓶0.16ml)。显示了在不同的WIS-NHSM条件下的细胞的代表性图像，表明在这些条件下没有外源性L-谷氨酰胺补充的集落的扩增。
图7是描绘用于设计WIS-NHSM条件的策略的示意图，并且包括小分子及其浓度范围的非限制性实例。
图8描绘了针对人幼稚iPSC和ESC衍生和维持测试的不同WIS-NHSM实例(条件41-60)的补充剂。所用的基础培养基描述于下文实施例5中。
图9描绘了针对人幼稚iPSC和ESC衍生和维持测试的不同WIS-NHSM实例(条件61-80)的补充剂。所用的基础培养基描述于下文实施例5中。
图10描绘了针对人幼稚iPSC和ESC衍生和维持测试的不同WIS-NHSM实例(条件81-99)的补充剂。所用的基础培养基描述于下文实施例5中。
图11描绘了针对人幼稚iPSC和ESC衍生和维持测试的不同WIS-NHSM实例(条件100-119)的补充剂。所用的基础培养基描述于下文实施例5中。
图12描绘了针对人幼稚iPSC和ESC衍生和维持测试的不同WIS-NHSM实例(条件120-131)的补充剂。所用的基础培养基描述于下文实施例5中。
图13是说明携带deltaPEOct4-GFP报道分子的WIBR3 hESC系的FACS分析(描述于Gafni等Nature 2013)的图。将细胞在明胶/DR4饲养层包被的板上在5% O2中向以下基础培养基添加条件41-99(描述于下文实施例5中)的所示补充剂的情况下进行扩增：Neurobasal培养基(Invitrogen 21103-049)和DMEM/F12 (Biological Industries 06-1170-50-1A)的1:1混合物 – 总共475 ml，Pen-strep 5 ml (Biological Industries 03-033-1B)，L-谷氨酰胺5 ml (Biological Industries - 02-022-1B)，NEAA – 5 ml (BiologicalIndustries 01-340-1B)，50 μL 50 mM储备β-巯基乙醇(1 vile)，10 ml B27补充剂(Invitrogen 17504-044)，胰岛素(Sigma I-1882) – 每1瓶添加6.25 mg胰岛素以得到约额外12.5微克/ml胰岛素)，脱铁运铁蛋白(Sigma T-1147，100 μg/ml终浓度)，孕酮(SigmaP8783，0.02 μg/ml终浓度)，腐胺(Sigma P5780，16 μg/ml终浓度)，***钠(SigmaS5261，每500 ml培养基添加5 μl 3 mM储备溶液)，BSA (100X级分V 7.5%溶液Gibco15260-037 - 每500 ml培养基瓶添加0.16 ml)。将细胞扩增28天(总共6代)，并通过FACS分析来评估OCT4-GFP+报道分子。结果显示细胞在所述条件下维持其多能性。2i/LIF/PKCi (5微M)条件用作阴性对照，因为细胞在这些条件中丢失其多能性。
图14是说明携带deltaPEOct4-GFP报道分子的WIBR3 hESC系的FACS分析(描述于Gafni等Nature 2013)的图。将细胞在层粘连蛋白-521包被的板(BIOLAMINA INC. – 目录号:www(dot)biolamina(dot)com/product-ln-521)上在5% O2中向以下基础培养基添加条件41-99(描述于下文实施例5中)的所示补充剂的情况下进行扩增：Neurobasal培养基(Invitrogen 21103-049)和DMEM/F12 (Biological Industries 06-1170-50-1A)的1:1混合物 – 总共475 ml，Pen-strep 5 ml (Biological Industries 03-033-1B)，L-谷氨酰胺5 ml (Biological Industries - 02-022-1B)，NEAA – 5 ml (Biological Industries01-340-1B)，50 μL 50 mM储备β-巯基乙醇(1 vile)，10 ml B27补充剂(Invitrogen17504-044)，胰岛素(Sigma I-1882) – 每1瓶添加6.25 mg胰岛素以得到约额外12.5微克/ml胰岛素)，脱铁运铁蛋白(Sigma T-1147，100 μg/ml终浓度)，孕酮(Sigma P8783，0.02 μg/ml终浓度)，腐胺(Sigma P5780，16 μg/ml终浓度)，***钠(Sigma S5261，每500 ml培养基添加5 μl 3 mM储备溶液)，BSA (100X级分V 7.5%溶液Gibco 15260-037 - 每500 ml培养基瓶添加0.16 ml)。将细胞扩增28天(总共6代)，并通过FACS分析来评估OCT4-GFP+报道分子。结果显示细胞在所述条件下维持其多能性。2i/LIF/PKCi (5微M)条件用作阴性对照，因为细胞在这些条件中丢失其多能性。
图15是说明携带deltaPEOct4-GFP报道分子的WIBR3 hESC系的FACS分析(描述于Gafni等Nature 2013)的图。将细胞在明胶/DR4饲养层包被的板上在5% O2中向以下基础培养基添加条件100-131(描述于下文实施例5中)的所示补充剂的情况下进行扩增：Neurobasal培养基(Invitrogen 21103-049)和DMEM/F12 (Biological Industries 06-1170-50-1A)的1:1混合物 – 总共475 ml，Pen-strep 5 ml (Biological Industries 03-033-1B)，L-谷氨酰胺5 ml (Biological Industries - 02-022-1B)，NEAA – 5 ml(Biological Industries 01-340-1B)，50 μL 50 mM储备β-巯基乙醇(1 vile)，10 ml B27补充剂(Invitrogen 17504-044)，胰岛素(Sigma I-1882) – 每1瓶添加6.25 mg胰岛素以得到约额外12.5微克/ml胰岛素)，脱铁运铁蛋白(Sigma T-1147，100 μg/ml终浓度)，孕酮(Sigma P8783，0.02 μg/ml终浓度)，腐胺(Sigma P5780，16 μg/ml终浓度)，***钠(Sigma S5261，每500 ml培养基添加5 μl 3 mM储备溶液)，BSA (100X级分V 7.5%溶液Gibco 15260-037 - 每500 ml培养基瓶添加0.16 ml)。将细胞扩增28天(总共6代)，并通过FACS分析来评估OCT4-GFP+报道分子。结果显示细胞在所述条件下维持其多能性。2i/LIF/PKCi (5微M)条件用作阴性对照，因为细胞在这些条件中丢失其多能性。
图16是说明携带deltaPEOct4-GFP报道分子的WIBR3 hESC系的FACS分析(描述于Gafni等Nature 2013)的图。将细胞在层粘连蛋白-521包被的板(BIOLAMINA INC. – 目录号:www(dot)biolamina(dot)com/product-ln-521)上在5% O2中向以下基础培养基添加条件100-131(描述于下文实施例5中)的所示补充剂的情况下进行扩增：Neurobasal培养基(Invitrogen 21103-049)和DMEM/F12 (Biological Industries 06-1170-50-1A)的1:1混合物 – 总共475 ml，Pen-strep 5 ml (Biological Industries 03-033-1B)，L-谷氨酰胺5 ml (Biological Industries - 02-022-1B)，NEAA – 5 ml (Biological Industries01-340-1B)，50 μL 50 mM储备β-巯基乙醇(1 vile)，10 ml B27补充剂(Invitrogen17504-044)，胰岛素(Sigma I-1882) – 每1瓶添加6.25 mg胰岛素以得到约额外12.5微克/ml胰岛素)，脱铁运铁蛋白(Sigma T-1147，100 μg/ml终浓度)，孕酮(Sigma P8783，0.02 μg/ml终浓度)，腐胺(Sigma P5780，16 μg/ml终浓度)，***钠(Sigma S5261，每500 ml培养基添加5 μl 3 mM储备溶液)，BSA (100X级分V 7.5%溶液Gibco 15260-037 - 每500 ml培养基瓶添加0.16 ml)。将细胞扩增28天(总共6代)，并通过FACS分析来评估OCT4-GFP+报道分子。结果显示细胞在所述条件下维持其多能性。2i/LIF/PKCi (5微M)条件用作阴性对照，因为细胞在这些条件中丢失其多能性。
图17A-F描绘了XIST启动子的亚硫酸氢盐测序分析。显示了XIST启动子扩增子的单克隆中的6个CpG位点的亚硫酸氢盐测序分析。实心圆形=甲基化的CpG位点；空心圆形=未甲基化的CpG位点。对于幼稚PSC，将细胞在指定培养基(图17A-E)中在DR4照射MEF细胞和0.2％明胶包被的板上在5% O2条件下、在37℃下扩增14天。所有培养基都包括L-抗坏血酸(以50 μg/ml的终浓度)。对于非幼稚条件(致敏的PSC)，将细胞在mTESR1 (Stem CellTechnologies –目录号05850)中在Matrigel包被的板上培养。图17A - 培养基包括：Srci1 μM、ERK1/2i 1 μM、LIF 20 ng/ml；图17B - 培养基包括：AXINs 5 μM、ERK1/2i 1 μM、LIF20 ng/ml；图17C - 培养基包括：AXINs 5 μM、ERK1/2i 1 μM、LIF 20 ng/ml、PKCi 4 μM、GSK3i 1.5 μM；图17D - 培养基包括：AXINs 5 μM、ERK1/2i 1 μM、LIF 20 ng/ml、PKCi 4 μM、GSK3i 1.5 μM、P38i 2 μM和JNKi 5 μM。图17E - 培养基包括：AXINs 5 μM、ERK1/2i 1 μM、LIF 20 ng/ml、PKCi 4 μM、GSK3i 1.5 μM、P38i 2 μM、JNKi 5 μM和SRCi 1 μM。小分子缩写的关键：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901 1 μM)、AXINs (IWR1 5 μM)、PKCi(Go6983 4 μM)、GSK3βi (CHIR99021 1.5 μM)、P38i (BIRB796 2 μM)、JNKi (SP600125 5μM)、SRCi (CGP77675 1 μM)。注意，在幼稚PSC中，两个等位基因都被去甲基化(未甲基化的)(图17A-E，雌性细胞)。相比之下，注意，在非幼稚(即，致敏的PSC)中，XIST启动子在雄性细胞中被完全甲基化，并在雌性细胞的一个等位基因上被甲基化(图17F)。这些结果结论性地证明，雄性和雌性幼稚hESCs/iPSC在各种WIS-NHSM条件下保持独特的前-X失活状态。
图18是表示用于将多能干细胞维持在幼稚状态下的策略的方案，且包括根据本发明的一些实施方案的培养基的小分子和浓度范围的实例。
图19提供了本发明的一些实施方案的培养基的非限制性实例，其能够将人幼稚PSC维持在幼稚和未分化状态下，且用于ESC衍生。基础培养基描述于下文实施例6中。
图20是描绘当在本发明的一些实施方案的培养基(培养基132-147，下文实施例6和图19中所述)中培养时GFP-阳性细胞(“GFP +”)的百分比的柱状图。携带Oct4-GFP报道分子的WIBR3 hESC系(描述于Gafni等，Nature 2013)在明胶/DR4照射的MEF包被的板上在5%O2中用下文实施例部分的实施例6中所述的基本培养基扩增，其中用于这些实验的培养基还包括L-抗坏血酸2-磷酸(Sigma A8960)(50μg/ml终浓度)。将细胞扩增至多23代，并通过FACS分析来评估OCT4-GFP+报道分子。结果显示细胞在所述条件下维持其多能性。2i/LIF/PKCi (5微M)条件用作阴性对照，因为细胞在这些条件中丢失其多能性。
图21是描绘当在本发明的一些实施方案的培养基(培养基132-147，下文实施例6和图19中所述)中培养时GFP-阳性细胞(“GFP +”)的百分比的柱状图。携带deltaPEOct4-GFP报道分子的WIBR3 hESC系(描述于Gafni等，Nature 2013)在Matrigel包被的板上在5%O2中用下文实施例部分的实施例6中所述的基本培养基扩增，其中用于这些实验的培养基还包括L-抗坏血酸2-磷酸(Sigma A8960)(50μg/ml终浓度)。将细胞扩增至多23代，并通过FACS分析来评估OCT4-GFP+报道分子。结果显示细胞在所述条件下维持其多能性。2i/LIF/PKCi (5微M)条件用作阴性对照，因为细胞在这些条件中丢失其多能性。
图22A-C显示亚硫酸氢盐序列分析的结果，其证明雄性和雌性幼稚hESC或iPSC在WIS-NHSM条件(本发明的一些实施方案的培养基)中保留独特的前-X失活状态。实心圆形=甲基化的CpG位点；空心圆形=未甲基化的CpG位点。显示了XIST启动子扩增子的单克隆中的6个CpG位点的亚硫酸氢盐测序分析。注意，在幼稚细胞中，两个等位基因都被去甲基化。将细胞在指定培养条件中在DR4照射MEF细胞和0.2％明胶包被的板上在5% O2条件下、在37℃下扩增14天。所有培养基都包括L-抗坏血酸(50 μg/ml)。图22A - 培养基包括：AXINs 5 μM、ERK1/2i 1 μM、LIF 20 ng/ml、PKCi 2 μM、GSK3i 1.5 μM、P38i 0.25 μM、JNKi 5 μM、SRCi 0.5 μM。图22B - 培养基包括：AXINs 5 μM、ERK1/2i 1 μM、LIF 20 ng/ml、PKCi 2 μM、GSK3i 1.5 μM、P38i 0.25 μM、JNKi 5 μM、SRCi 0.5 μM和G9ai 0.5 μM。小分子缩写的关键：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901、1 μM)、AXINs (IWR1、5 μM)、PKCi (Go6983、2 μM)、GSK3βi (CHIR99021、1.5 μM)、P38i (BIRB796、0.25 μM)、JNKi (SP600125、5 μM)、SRCi(CGP77675、0.5 μM)和G9ai (BIX01294、0.5 μM)。图22C - 非幼稚条件(致敏的PSC)包括将细胞在mTESR1 (Stem Cell Technologies –目录号05850)中在Matrigel包被的板上培养。注意，在幼稚PSC中，雌性细胞的两个等位基因都被去甲基化(未甲基化)(图22A-B，右小图显示雌性细胞)。相比之下，注意，在非幼稚(即，致敏的PSC)中，XIST启动子在雄性细胞中被完全甲基化(图22C，左小图，雄性细胞)，并在雌性细胞的一个等位基因上被甲基化(图22C，右小图，雌性细胞)。这些结果结论性地证明，雄性和雌性幼稚hESCs/iPSC在本发明的一些实施方案的各种培养基下保留独特的前-X失活状态。
图23A-D描绘了LIS 38 tg-pTrip lck EGFP hTP53 crispr的产生。图23A - 显示野生型LIS38 (SEQ ID NO:195)和Crispr_C2 (SEQ ID NO:196)的序列。两个序列(SEQ IDNO:134和135) 之间的序列比对证明经由CRISPR/CAS9-sgRNA靶向区域缺失TP53的外显子3的一部分。图23B-显示与WT亲本细胞系(左泳道)相比，LIS38 tg-pTrip lck EGFP p53crispr靶向细胞(右泳道)中WT p53蛋白的丢失的蛋白质免疫印迹。图23C- LIS38 tg-pTrip lck EGFP p53 crispr细胞的核型分析，表明46XY正常核型。图23D- LIS38 tg-pTrip lck EGFP p53 crispr细胞的代表性图像。左：明场图像；右：显示GFP荧光阳性信号的暗场图像。这表明细胞系用GFP荧光蛋白组成性标记，这使得能够在微注射后追踪宿主组织中的该细胞系衍生的细胞。总之，这些结果描述了在这种情况下经由CRISPR/CAS9 sgRNA介导的靶向并随后用组成型表达的荧光蛋白标记细胞来产生耗尽P53蛋白的人幼稚PSC系的方法。这些细胞可以注射至宿主胚胎中以产生嵌合胚胎。
图24A-B显示将LIS 38 EGFP hTP53 C2幼稚人iPS细胞显微注入小鼠桑椹胚产生具有高贡献和嵌合体水平的跨物种嵌合人源化小鼠。图24A - 用LIS 38 EGFP hTP53幼稚人iPS细胞注射的小鼠胚胎。图24B-使用相同分析的未注射的小鼠胚胎。显示了代表性图像，其证明GFP-标记的人幼稚iPS衍生的细胞广泛整合入E9.5小鼠胚胎的不同位置。Hoechst和CellTracker用于复染。第一列显示整个胚胎。第2列至第4列(从左侧)显示聚焦于头部区域的图像的放大图(第一列的图像中的白色方块)。图24A显示注射的胚胎，其中人iPS衍生的细胞(GFP阳性细胞)整合至大部分浅表颅组织中。图24B显示未注射人幼稚iPS衍生的细胞的对照胚胎；在该对照胚胎中没有检测到GFP阳性细胞。
图25A-C描绘了WIBR3 hESC致敏的或幼稚PSC的C-KIT (CD117)细胞表面蛋白的表达的FACS分析。WIBR3 hESC，在用于致敏的PSC的条件下(如下所述)或“幼稚”条件下(培养基136或138中)生长，然后使用0.05％胰蛋白酶-EDTA解离成单细胞悬浮液。为了标记细胞表面抗原，在冰冷FACS缓冲液(2% (体积/体积)胎牛血清(FBS)/PBS)中将细胞与一抗(Brilliant Violent 421 -缀合的小鼠抗人CD117 (C-KIT) IgG, BD目录号：562434，稀释1:200)一起培育或保持未染色(对照)30分钟，随后洗涤两次。然后使用流式细胞仪FACSAria II用FACSDiva软件版本6.1.3 (BD Biosciences)分析细胞标记。MFI =平均荧光强度。注意，虽然致敏的PSC不表达C-KIT(即它们是CD117-阴性)(图25A)，但幼稚PSC表达C-KIT(即它们是CD117阳性)(图25B和25C)。这些结果支持C-KIT是人幼稚、但未致敏的PSC的新标志物的结论。
图26A-C描绘了具有敲入mCherry荧光报道分子的靶向人ESRRB(基因/转录因子)基因座。图26A – 说明靶向方案。剪刀表示CRISPR – sgRNA切割位点。为了产生与内源人ESRRB基因座共表达的mCherry报告分子，本发明人已选择以敲入与人ESRRB基因的最后一个外显子同框的p2a-mCherry编码序列。本发明人已将对ESRRB基因的终止密码子区特异性的寡核苷酸***编码CAS9切口酶和sgRNA的px335质粒中。如图26A中所示制备供体构建体。本发明人已经靶向WIBR3人ESC OCT4 GFP敲入细胞系。靶向的效率为约30％(48个克隆中的15个)，如通过外部PCR所验证。正确的靶向也通过具有外部和抗mCherry探针的Southern印迹(SB)验证(图26B)。用翻转酶进行Neo盒切割后，扩增来自克隆之一的整个靶向的基因座并测序。正确靶向克隆2-6(图26C)。
图26D-H是描绘PSC中的ESRRB-mCherry报道分子的表达的FACS分析。将在指定条件下扩增的具有(图26E、26F和26H)或不具有(图26D和26G) ESRRB mCherry敲入报告分子的WIBR3 hESC使用0.05％胰蛋白酶-EDTA解离为单细胞悬浮液，并重悬于冰冷的FACS缓冲液(PBS(磷酸盐缓冲盐水)中的2％(体积/体积)胎牛血清(FBS))中。然后针对ESRRB-mCherry表达使用流式细胞仪FACSAria II用FACSDiva软件版本6.1.3 (BD Biosciences)同时分析细胞。MFI =平均荧光强度。结果表明幼稚条件136如何特异性诱导ESRRB mCherry表达(比较图26E与26D)，并且当从培养基中去除BIX01294时(图26H与图26E相比)或当加入激活蛋白A时(图26F)该作用丢失。这些结果显示，本文所述的一些幼稚组合物特异性诱导幼稚多能转录因子ESRRB。
本发明具体实施方案的描述
本发明，在其一些实施方案中，涉及可用于产生和扩增通常多能干细胞、更具体地幼稚多能干细胞的新型培养基。
在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应当理解，本发明的应用不一定限于下面描述中描述或由实施例例举的细节。本发明能够具有其它实施方案或者以各种方式实践或进行的其它实施方案。
本发明人已经发现了分离和产生灵长类动物(例如，人)幼稚多能干细胞且将其维持在幼稚状态下所需的新型条件。
因此，如下面实施例部分的实施例5和图7-16中所示，本发明人已经发现了新型条件，其包括能够将幼稚PSC维持在如下文所述且如通过OCT4-GFP+(阳性)细胞的表达所证明的“幼稚状态”下的培养基。这种培养基包含STAT3激活剂、MEK/ERK1/2抑制剂(例如，PD0325901)和轴蛋白稳定剂。
如本文所使用，短语“幼稚状态”是指在未分化状态下，其中雌性细胞的X染色体失活特异性转录因子(XIST)基因的启动子的两个等位基因都是未甲基化的，或其中雄性细胞的XIST等位基因的启动子是未甲基化的。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂和轴蛋白稳定剂的培养基。
如本文所使用，短语“培养基”是指用于支持干细胞生长并将其维持在未分化状态下的固体或液体物质。优选地，如本文所使用的短语“培养基”是指能够将干细胞维持在未分化状态下的液体物质。
本发明使用的培养基可以是包括以下物质的组合的基于水的培养基，所述物质诸如盐、营养物、矿物质、维生素、氨基酸、核酸、蛋白诸如细胞因子、生长因子和激素，所有这些都是细胞增殖所需的并且能够将干细胞维持在未分化状态下。例如，所述培养基可以是合成的组织培养基，诸如Ko-DMEM (Gibco-Invitrogen Corporation产品, Grand Island,NY, USA)，DMEM/F12 (Gibco-Invitrogen Corporation产品, Grand Island, NY, USA)，Neurobasal培养基(Invitrogen Corporation产品, Grand Island, NY, USA 21103-049)或DMEM/F12 (无HEPES；Biological Industries, Beit Haemek, Israel)，其补充有如下文进一步描述的必要添加剂。
根据一个具体实施方案，所述培养基是Neurobasal培养基和DMEM F/12的1:1混合物。
根据又另一个实施方案，所述培养基是MTESR1 (Stem Cell Technologies)。在一些情况下，该培养基已经包含TGFβ和FGF2，因此仅适用于制备包含这些生长因子的那些培养基。在其它情况下，所述培养基在不含FGF和TGFβ的情况下制备(参见例如Ludwing和Thomson：Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 2:1C.2.1-1C.2.16)。
优选地，本发明的培养基中包括的所有成分是基本上纯的，具有组织培养级别。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基不含血清，例如不含任何动物血清。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基不含任何动物污染物，即动物细胞、流体或病原体(例如，感染动物细胞的病毒)，例如不含异源物。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基不含人源血清。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含血清替代物(即，血清的替代物)，诸如KNOCKOUT™血清替代物(Gibco-Invitrogen Corporation, Grand Island, NY USA)、ALBUMAX®II (Gibco®；Life Technologies – Invitrogen, 目录号11021-029；用于细胞培养的富含脂质的牛血清白蛋白)或化学上确定的脂质浓缩物(Gibco®；Invitrogen,Life Technologies – Invitrogen, 目录号11905-031)。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含N2补充剂(Gibco®；LifeTechnologies – Invitrogen, 目录号17502-048)，化学上确定的无血清补充剂。对于500ml培养基，可以加入5 ml N2混合物(Invitrogen)。
可选地，可以将下列材料(代替N2补充剂)加入500 ml培养基中：每500 ml培养基加入12.5微克/ml(μg/ml)终浓度的重组胰岛素(Sigma I-1882)；500 μg/ml终浓度的脱铁运铁蛋白(Sigma T-1147)；0.02 μg/ml终浓度的孕酮(Sigma-P8783)；16 μg/ml终浓度的腐胺(Sigma-P5780)和5微升(μl) 3 mM硒酸钠的储备物(Sigma-S5261)[即，以3 nM的终浓度(例如，WIS-NHSM)]。
根据本发明的一些实施方案，以以下浓度提供KNOCKOUT™血清替代物：至少0.5％，例如，约0.5％-25％的范围内，例如，约5％、约10％、约15％、约20％或约25％。
根据本发明的一些实施方案，以以下浓度提供ALBUMAX™：至少0.01％，例如，约0.01％-10％的范围内，例如，约0.1％、约0.2%、约0.3%、约0.4%、约0.5%、约0.6%、约0.7%、约0.8%、约0.9%、约1%、约2%、约3%、约4%、约5%、约6%、约7%、约8%、约9%或约10％，例如1％。
根据本发明的一些实施方案，以以下浓度提供定义的脂质浓缩物：至少约0.1％，例如，0.1-5%的范围内，例如，约0.2%、约0.3%、约0.4%、约0.5%、约0.6%、约0.7%、约0.8%、约0.9%、约1%、约2%、约3%、约4%、约5%，例如1％。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含N2补充剂(例如，每500 ml培养基5ml N2)和定义的脂质浓缩物(每500 ml培养基5 ml定义的脂质浓缩物)。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含N2补充剂(例如，每500 ml培养基5ml N2)和ALBUMAX®II (例如， 1% Albumax®II；Gibco®；Life Technologies –Invitrogen)。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基可以还包括抗生素(例如，PEN-STREP)、L-谷氨酰胺、NEAA(非必需氨基酸)。
如本文所使用，术语“STAT3”是指信号转导及转录激活蛋白3基因产物(急性期反应因子)(基因ID 6774)。响应于细胞因子和生长因子，STAT家族成员被受体相关激酶磷酸化，然后形成同源或异源二聚体，其易位至细胞核，在细胞核中，它们用作转录激活剂。已知的STAT3激活剂包括但不限于干扰素(IFN)、表皮生长因子(EGF)、白介素5(IL5)、白介素6(IL6)、肝细胞生长因子(HGF)、白血病抑制因子(LIF)和骨形态发生蛋白2 (BMP2)。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基中使用的STAT3激活剂选自LIF、IL6和EGF。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基中使用的STAT3激活剂选自LIF和IL6。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基中使用的STAT3激活剂是LIF。
如本文所使用，术语“白血病抑制因子(LIF)”是指包含由GenBank登录号NM_001257135 (SEQ ID NO:30)所示的核苷酸序列编码的如GenBank登录号NP_001244064.1(SEQ ID NO:119)所示的氨基酸序列的多肽。优选地，根据本发明的一些实施方案的方法使用的LIF能够与本文所述的其它因子一起支持幼稚灵长类动物(例如人)PSC的未分化生长，同时维持其多能性。LIF可以获得自各种制造商诸如Millipore、Peprotech和R&D systems。
根据本发明的一些实施方案，以以下浓度范围提供LIF：约0.5纳克/毫升(ng/ml)至约1000 ng/ml，例如，约1-1000 ng/ml，例如，约1-900 ng/ml，例如，约1-800 ng/ml，例如，约1-700 ng/ml，例如，约1-600 ng/ml，例如，约1-500 ng/ml，例如，约1-400 ng/ml，例如，约1-300 ng/ml，例如，约1-200 ng/ml，例如，约1-100 ng/ml，例如，约1-50 ng/ml，例如，约2-50 ng/ml，例如，约4-50 ng/ml，例如，约5-50 ng/ml，例如，约10-50 ng/ml，例如，约10-40 ng/ml，例如，约10-30 ng/ml，例如，约20 ng/ml。
如本文所使用，术语“白介素6 (IL6)”是指包含由GenBank登录号NM_000600.3(SEQ ID NO:111)所示的核苷酸序列编码的GenBank登录号NP_000591.1 (SEQ ID NO:120)所示的氨基酸序列的多肽。优选地，根据本发明的一些实施方案的方法使用的IL6能够与本文所述的其它因子一起支持幼稚灵长类动物(例如人)PSC的未分化生长，同时维持其多能性。IL6可以获得自各种制造商诸如Speed BioSystems、Millipore、Peprotech和R&Dsystems。
根据本发明的一些实施方案，以以下浓度范围提供IL6：约0.1 ng/ml至约100 ng/ml，例如，约0.1-90 ng/ml，例如，约0.1-80 ng/ml，例如，约0.1-70 ng/ml，例如，约0.1-50ng/ml，例如，约0.1-40 ng/ml，例如，约0.1-30 ng/ml，例如，约0.1-20 ng/ml，例如，约0.1-10 ng/ml，例如，约0.1-8 ng/ml，例如，约0.1-7 ng/ml，例如，约0.1-6 ng/ml，例如，约0.1-5 ng/ml，例如，约0.1-4 ng/ml，例如，约0.1-3 ng/ml，例如，约0.1-4 ng/ml，例如，约0.5-4ng/ml，例如，约0.5-4 ng/ml，例如，约3 ng/ml。
如本文所使用，术语“EGF”是指表皮生长因子基因产物。编码的蛋白(EGF)被合成为大前体分子，其被蛋白水解切割以产生53个氨基酸的表皮生长因子肽。EGF蛋白用作有效的促有丝***因子，其在许多细胞类型的生长、增殖和分化中起重要作用；其通过结合高亲和力细胞表面受体、表皮生长因子受体来起作用。根据本发明的一些实施方案可以使用的EGF蛋白包含由可变剪接产生的EGF同种型1-3中的任一种。因此，转录变体1 [GenBank登录号NM_001963.4 (SEQ ID NO:179)]代表最长的转录物并编码最长同种型，即同种型1[GenBank登录号NP_001954.2 (SEQ ID NO:178)]。与变体1相比在编码区中缺乏框内外显子的转录物变体2 [GenBank登录号NM_001178130.1 (SEQ ID NO:181)]编码同种型2[GenBank登录号NP_001171601.1 (SEQ ID NO:180)]。与变体1相比在编码区中缺乏框内外显子的转录物变体3 [GenBank登录号NM_001178131.1 (SEQ ID NO:183)]编码同种型3[GenBank登录号NP_001171602.1 (SEQ ID NO:182)]。
根据本发明的一些实施方案，以以下浓度范围提供EGF：约1 ng/ml至约20 ng/ml，例如，约2-20 ng/ml，例如，约3-19 ng/ml，例如，约4-18 ng/ml，例如，约5-15 ng/ml，例如，约1 ng/ml，例如，约2 ng/ml，例如，约3 ng/ml，例如，约4 ng/ml，例如，约5 ng/ml，例如，约6 ng/ml，例如，约7 ng/ml，例如，约8 ng/ml，例如，约9 ng/ml，例如，约10 ng/ml，例如，约11 ng/ml，例如，约12 ng/ml，例如，约13 ng/ml，例如，约14 ng/ml，例如，约15 ng/ml，例如，约16 ng/ml，例如，约17 ng/ml，例如，约18 ng/ml，例如，约19 ng/ml，例如，约20 ng/ml。
如本文所使用，术语“ERK1”是指具有MAPK信号传导活性的GenBank登录号NP_002737.2 (SEQ ID NO:33)所示的促***原活化蛋白激酶3(MAPK3)同种型1、GenBank登录号NP_001035145.1 (SEQ ID NO:34)所示的MAPK3同种型2、GenBank登录号NP_001103361.1(SEQ ID NO:35)所示的MAPK3同种型3和/或GenBank登录号M84490 (SEQ ID NO:36)所示的ERK1。
如本文所使用，术语“ERK2”是指具有MAPK信号传导活性的GenBank登录号NP_002736.3 (SEQ ID NO:37)和/或GenBank登录号NP_620407.1 (SEQ ID NO:38)所示的促***原活化的蛋白激酶1(MAPK1)。
如本文所使用，术语“ERK1/2抑制剂”是指如通过磷酸化的ERK1/2蛋白的蛋白质印迹蛋白检测测定的能够抑制ERK1/2的活性的任何分子。
ERK1/2抑制剂(也称为MEK1/2抑制剂)的非限制性实例包括PD0325901(AXONMEDCHEM - AXON 1408)、PD98059 (AXONMEDCHEM - Axon 1223)和PD184352(AXONMEDCHEM – AXON 1368)。
应当理解，ERK1/2活性的抑制也可以通过抑制其活性直接影响ERK1/2的活性的蛋白来实现。这样的蛋白被认为是MEK/ERK通路的“上游”，即蛋白(例如，A-RAF、B-RAF和C-RAF)，其抑制导致随后的ERK1/2蛋白活性的抑制。也导致ERK1/2活性的抑制的BRAF和CRAF蛋白的抑制剂的非限制性实例包括如下文进一步描述的甲苯磺酸索拉非尼(也称为BAY43-9006 AXONMEDCHEM –AXON 1397)或SB 590885 (TOCRIS #2650)。
根据本发明的一些实施方案，以以下浓度范围提供PD0325901：约0.01微M (μM)至约50 μM，例如，约0.05-45 μM，例如，约0.1-50 μM，例如，约0.1-45 μM，例如，约0.1-40 μM，例如，约0.1-35 μM，例如，约0.1-30 μM，例如，约0.1-25 μM，例如，约0.1-20 μM，例如，约0.1-15 μM，例如，约0.1-10 μM，例如，约0.2-10 μM，例如，约0.3-10 μM，例如，约0.4-10 μM，例如，约0.5-10 μM，例如，约0.6-10 μM，例如，约0.7-10 μM，例如，0.8-10 μM，例如，0.9-10 μM，例如，0.9-9 μM，例如，0.9-8 μM，例如，0.9-7 μM，例如，0.9-6 μM，例如，0.8-5 μM，例如，0.8-4 μM，例如，0.8-3 μM，例如，0.8-2 μM，例如，0.8-1.5 μM，例如，0.9-1.2 μM，例如，约1 μM。
根据本发明的一些实施方案，以以下浓度范围提供PD98059：约0.1微M (μM)至约70 μM，例如，约0.1-65 μM，例如，约0.1-55 μM，例如，约0.1-50 μM，例如，约0.1-45 μM，例如，约0.1-40 μM，例如，约0.1-35 μM，例如，约0.1-30 μM，例如，约0.1-25 μM，例如，约0.1-20 μM，例如，约0.1-15 μM，例如，约2-20 μM，例如，约5-15 μM，例如，约10 μM，例如，约0.1-10 μM，例如，约0.2-10 μM，例如，约0.3-10 μM，例如，约0.4-10 μM，例如，约0.5-10 μM，例如，约0.6-10 μM，例如，约0.7-10 μM，例如，0.8-10 μM，例如，0.9-10 μM，例如，0.9-9 μM，例如，0.9-8 μM，例如，0.9-7 μM，例如，0.9-6 μM，例如，0.8-5 μM，例如，0.8-4 μM，例如，0.8-3 μM，例如，0.8-2 μM，例如，0.8-1.5 μM，例如，0.9-1.2 μM。
根据本发明的一些实施方案，以以下浓度范围提供PD184352：约0.1微M (μM)至约70 μM，例如，约0.1-60 μM，例如，约0.1-50 μM，例如，约0.5-50 μM，例如，约0.5-45 μM，例如，约0.5-40 μM，例如，约0.1-35 μM，例如，约0.5-30 μM，例如，约0.5-25 μM，例如，约0.5-20 μM，例如，约0.5-15 μM，例如，约0.5-10 μM，例如，0.5-9 μM，例如，0.5-8 μM，例如，0.5-7 μM，例如，0.9-6 μM，例如，0.8-5 μM，例如，0.8-4 μM，例如，0.8-3 μM，例如，约3 μM，例如，0.8-2 μM，例如，0.8-1.5 μM，例如，0.9-1.2 μM。
轴蛋白破坏复合物是多蛋白“破坏复合物”，其包括肿瘤抑制基因轴蛋白和腺瘤性结肠息肉病(APC)、Ser/Thr激酶GSK-3和CK1。
GSK3b抑制剂的使用允许具有细胞质和细胞核下游功能的β-连环蛋白效应子的稳定化。稳定化轴蛋白破坏复合物的小分子连同GSK3b抑制剂的使用允许增加细胞质中的稳定化的β-连环蛋白功能，其以细胞核中发现的β-连环蛋白功能为代价。这种方法已经用于减少小鼠和人类致敏细胞中对FGF2信号传导的依赖性(Kim, H.,等, 2013. Modulationof b-catenin function maintains mouse epiblast stem cell and human embryonicstem cell self-renewal. Nature Communications 4, 1–11)。
最近，已经鉴定了稳定化破坏复合物结构和/或活性的两组化学物质(IWR-1 –Sigma Aldrich 10161；和XAV939 – TOCRIS 目录号3748或Sigma目录号X3004)(Chen等,Nat. Chem. Biol. 5：100-107, 2009;和Huang等, Nature：461：614-620, 2009)。通过阻断端锚聚合酶的PARP结构域，XAV939和IWR-1被认为改变轴蛋白2的PAR化和泛素化，导致其增加的稳定性和经典Wnt信号传导的抑制。IWR化合物通过直接相互作用诱导轴蛋白蛋白的稳定化，其是β-连环蛋白破坏复合物(由Apc、轴蛋白1/2、Ck1和Gsk3b组成)的一部分。
可以根据本发明的一些实施方案使用的其它轴蛋白稳定剂包括但不限于IWP2(可得自TOCRIS目录号3533，例如以约2μM的浓度)；溶血磷脂酸(LPA；可得自Santa Cruz, 目录号sc201053，例如，以约1-10μM的浓度)；WNT5a(可得自RnD system, 目录号645-WN-010，例如，以约1-20 ng/ml的浓度)。
根据一个具体实施方案，所述轴蛋白复合物稳定剂是小分子化合物。
根据另一个实施方案，所述轴蛋白复合物稳定剂是IWR-1。
根据本发明的一些实施方案，以以下浓度范围提供轴蛋白稳定剂(例如IWR-1)：约0.1-70 μM，例如，约0.2 μM至约70 μM，例如，约0.2-60 μM，例如，约0.2-55 μM，例如，约0.2-50 μM，例如，约0.2-45 μM，例如，约0.2-40 μM，例如，约0.2-35 μM，例如，约0.2-30 μM，例如，约0.2-25 μM，例如，约0.2-20 μM，例如，约0.2-15 μM，例如，约0.2-10 μM，例如，约0.3-10 μM，例如，约0.4-10 μM，例如，约0.5-10 μM，例如，约0.6-10 μM，例如，约0.7-10 μM，例如，0.8-10 μM，例如，0.9-10 μM，例如，0.9-9 μM，例如，1-8 μM，例如，1-7 μM，例如，1-6 μM，例如，1-5 μM，例如，约1-3 μM，例如，约2 μM，例如，约5 μM。
根据另一个实施方案，所述轴蛋白复合物稳定剂是XAV939。
根据本发明的一些实施方案，以以下浓度范围提供轴蛋白稳定剂(例如XAV939、IWP2和/或LPA)：约0.1-70 μM，例如，约0.1-20 μM，例如，约0.2 μM至约70 μM，例如，约0.2-60 μM，例如，约0.2-55 μM，例如，约0.2-50 μM，例如，约0.2-45 μM，例如，约0.2-40 μM，例如，约0.2-35 μM，例如，约0.2-30 μM，例如，约0.2-25 μM，例如，约0.2-20 μM，例如，约0.2-15 μM，例如，约0.2-10 μM，例如，约0.3-10 μM，例如，约0.4-10 μM，例如，约0.5-10 μM，例如，约0.6-10 μM，例如，约0.7-10 μM，例如，0.8-10 μM，例如，0.9-10 μM，例如，1-10 μM，例如，0.9-9 μM，例如，1-8 μM，例如，1-7 μM，例如，1-6 μM，例如，1-5 μM，例如，约1-3 μM，例如，约2 μM。
根据本发明的一些实施方案，以以下浓度范围提供轴蛋白稳定剂WNT5a：约1 ng/ml至约20 ng/ml，例如，约2-20 ng/ml，例如，约3-20 ng/ml，例如，约4-20 ng/ml，例如，约5-20 ng/ml，例如，约6-20 ng/ml，例如，约7-20 ng/ml，例如，约8-20 ng/ml，例如，约9-20ng/ml，例如，约10-20 ng/ml，例如，约10-19 ng/ml，例如，约10-18 ng/ml，例如，约10-15ng/ml，例如，约20 ng/ml。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含PKC抑制剂。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、轴蛋白稳定剂和PKC抑制剂的培养基。
如本文所使用，术语“蛋白激酶C(PKC)”是指PPKCα (alpha)、PKCβ (beta)、PKCγ(gamma)、PKCδ (delta)、PKCζ (zeta)和PKCμ (mu)蛋白同种型。
如本文所使用，术语“蛋白激酶C抑制剂”是指如通过相比于非磷酸化的PKC同种型降低磷酸化的PKC同种型的水平确定的能够抑制蛋白激酶C的活性的任何分子。
蛋白激酶C抑制剂的非限制性实例是Go6983 (CAS 133053-19-7)，蛋白激酶C(PKC)的有效的、细胞可渗透的、可逆的和ATP竞争性抑制剂，其具有广谱蛋白激酶C (PKC)抑制剂(对于PKCα、PKCβ、PKCγ、PKCδ、PKCζ和PKCμ，IC50值分别为 7、7、6、10、60和20000nM)。Go6983可得自各种供应商，诸如Calbiochem (目录号365251-500UG)和TOCRIS(目录号2285)。
根据本发明的一些实施方案，以以下浓度范围提供Go6983：约0.5-100 μM，例如，约1 μM至约100 μM，例如，约1-90 μM，例如，约1-80 μM，例如，约1-70 μM，例如，约1-60 μM，例如，约1-55 μM，例如，约1-50 μM，例如，约1-45 μM，例如，约1-40 μM，例如，约1-35 μM，例如，约1-30 μM，例如，约1-25 μM，例如，约1-20 μM，例如，约1-15 μM，例如，约1-10 μM，例如，约2-10 μM，例如，约3-10 μM，例如，约4-10 μM，例如，约4-6 μM，例如，约5 μM。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含GSK3b抑制剂。
因此，根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、轴蛋白稳定剂、PKC抑制剂和GSK3b抑制剂的培养基。
如本文所使用，术语“GSK3b”是指通过其激酶活性而具有WNT信号传导调节活性的GenBank登录号NP_002084.2 (SEQ ID NO:121)和/或NP_001139628.1 (SEQ ID NO:122)所示的的糖原合酶激酶3β蛋白。
如本文所使用，术语“GSK3b抑制剂”是指如通过特异性抑制(细胞中存在的总GSK3b中的)磷酸化的GSK3b的水平而测定的能够抑制GSK3b的活性的任何分子。
GSK3b抑制剂的非限制性实例包括CHIR99021 (AXONMEDCHEM – AXON 1386)、BIO(AXONMEDCHEM – Axon 1693)和Kenpaullone (TOCRIS – 目录号1398)。
根据本发明的一些实施方案，以以下浓度范围提供CHIR99021：约0.1-50 μM，例如，约0.2 μM至约50 μM，例如，约0.2-45 μM，例如，约0.2-50 μM，例如，约0.2-45 μM，例如，约0.2-40 μM，例如，约0.2-35 μM，例如，约0.2-30 μM，例如，约0.2-25 μM，例如，约0.2-20μM，例如，约0.2-15 μM，例如，约0.2-10 μM，例如，约0.2-10 μM，例如，约0.3-10 μM，例如，约0.4-10 μM，例如，约0.5-10 μM，例如，约0.6-10 μM，例如，约0.7-10 μM，例如，0.8-10 μM，例如，0.9-10 μM，例如，0.9-9 μM，例如，1-8 μM，例如，1-7 μM，例如，1-6 μM，例如，1-5 μM，例如，2-4 μM，例如，约3 μM。
根据本发明的一些实施方案，以以下浓度范围提供BIO：约0.1-70 μM，例如，约0.2μM至约70 μM，例如，约0.2-60 μM，例如，约0.2-55 μM，例如，约0.2-50 μM，例如，约0.2-45μM，例如，约0.2-40 μM，例如，约0.2-35 μM，例如，约0.2-30 μM，例如，约0.2-25 μM，例如，约0.2-20 μM，例如，约0.2-15 μM，例如，约0.2-10 μM，例如，约0.3-10 μM，例如，约0.4-10μM，例如，约0.5-10 μM，例如，约0.6-10 μM，例如，约0.7-10 μM，例如，0.8-10 μM，例如，0.9-10 μM，例如，0.9-9 μM，例如，1-8 μM，例如，1-7 μM，例如，1-6 μM，例如，1-5 μM，例如，约5 μM，例如，2-4 μM。
根据本发明的一些实施方案，以以下浓度范围提供Kenpaullone：约0.1-70 μM，例如，约0.2 μM至约70 μM，例如，约0.2-60 μM，例如，约0.2-55 μM，例如，约0.2-50 μM，例如，约0.2-45 μM，例如，约0.2-40 μM，例如，约0.2-35 μM，例如，约0.2-30 μM，例如，约0.2-25μM，例如，约0.2-20 μM，例如，约0.2-15 μM，例如，约0.2-10 μM，例如，约0.3-10 μM，例如，约0.4-10 μM，例如，约0.5-10 μM，例如，约0.6-10 μM，例如，约0.7-10 μM，例如，0.8-10 μM，例如，0.9-10 μM，例如，0.9-9 μM，例如，1-8 μM，例如，1-7 μM，例如，1-6 μM，例如，1-5 μM，例如，2-4 μM，例如，约5 μM。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含至少一种选自以下的试剂：ROCK抑制剂、SRC抑制剂、抗坏血酸、PKA激动剂、YAP/TAZ抑制剂、NOTCH抑制剂、SHH抑制剂、TGFβR抑制剂、BMP抑制剂、FGFR抑制剂、JNK抑制剂、ERK5抑制剂、BRAF抑制剂、CRAF抑制剂、ARAF抑制剂、p38抑制剂、GSK3b抑制剂、LSD1抑制剂、PI3K激活剂(或加强剂)、SMAD激活剂和DOT1L抑制剂。
如本文所使用，术语“ROCK”是指具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的GenBank登录号NP_005397.1 (P160ROCK；SEQ ID NO:50)；和NP_004841.2 (ROCK2；SEQ ID NO:51)所示的蛋白，其调节胞质***、平滑肌收缩、肌动蛋白应激纤维和粘着斑的形成以及c-fos血清反应元件的激活。
如本文所使用，术语“ROCK抑制剂”是指如通过ROCK磷酸化水平的抑制确定(通过蛋白质印迹分析检测)的能够抑制ROCK的活性的任何分子。
ROCK抑制剂的非限制性实例包括Y27632 (TOCRIS, 目录号1254)、Blebbistatin(TOCRIS 目录号1760)和Thiazovivin (Axon Medchem - Axon 1535)。Blebbistatin是肌球蛋白II ATP酶、ROCK通路的下游效应子的选择性抑制剂，因此有效地导致ROCK通路抑制(Chen G1, Hou Z等 Actin-myosin contractility is responsible for the reducedviability of dissociated human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 2010；7(2):240-8，其通过引用全文完全并入本文)。
根据本发明的一些实施方案，以以下浓度范围提供Y27632：约0.1-100 μM，例如，约0.1 μM至约90 μM，例如，约0.1-85 μM，例如，约0.1-80 μM，例如，约0.1-70 μM，例如，约0.1-60 μM，例如，约0.1-55 μM，例如，约0.1-50 μM，例如，约0.1-45 μM，例如，约0.1-40 μM，例如，约0.1-35 μM，例如，约0.1-30 μM，例如，约0.1-25 μM，例如，约1-20 μM，例如，约1-15 μM，例如，约1-10 μM，例如，约2-10 μM，例如，约3-10 μM，例如，约4-10 μM，例如，约4-6μM，例如，约5 μM。
根据本发明的一些实施方案，以以下浓度范围提供Blebbistatin：约0.5 μM至约10 μM，例如，约0.5 μM至约9 μM，例如，约0.5-8.5 μM，例如，约0.5-8 μM，例如，约0.5-7 μM，例如，约0.5-6 μM，例如，约0.5-5.5 μM，例如，约0.5-5 μM，例如，约0.5-4.5 μM，例如，约0.5-4 μM，例如，约0.5-3.5 μM，例如，约0.5-3 μM，例如，约0.5-2.5 μM，例如，约1-2 μM，例如，例如，约5 μM。
根据本发明的一些实施方案，以以下浓度范围提供Thiazovivin：约0.1 μM 至约5μM，例如，约0.1 μM 至约4 μM，例如，约0.1至约3 μM，例如，约0.2 μM至约2.5 μM，例如，约0.3 μM至约2 μM，例如，约0.3 μM至约1 μM，例如，约0.3至约0.8 μM，例如，0.4-0.6 μM，例如，约0.4 μM，例如，约0.5 μM。
如本文所使用，术语“SRC”是指SRC原癌基因，非受体酪氨酸激酶，其可以在胚胎发育和细胞生长的调节中起作用。由该基因编码的蛋白是酪氨酸-蛋白激酶，其活性可以通过c-SRC激酶的磷酸化来抑制。对于该基因已经发现了编码相同蛋白(GenBank登录号NP_005408.1 (SEQ ID NO:134)的两种转录物变体[GenBank登录号NM_005417.4 (SEQ ID NO:135)和NM_198291.2 (SEQ ID NO:136)]。
Src信号传导促进上皮至间质转换，并且是JNK通路的上游刺激物。已经显示SRC通路的小分子抑制支持小鼠多能细胞的扩增(Li, X.,等, 2011. Calcineurin-NFATSignaling Critically Regulates Early Lineage Specification in Mouse EmbryonicStem Cells and Embryos. Stem Cell 8, 46–58;和Shimizu, T., 等, 2012. DualInhibition of Src and GSK3 Maintains Mouse Embryonic Stem Cells, WhoseDifferentiation Is Mechanically Regulated by Src Signaling. Stem Cells 30,1394–1404)。 短语“src家族激酶抑制剂”是指实现阻碍或抑制src激酶家族的功能的任何试剂。这些试剂包括但不限于其功能是下调靶基因的表达并抑制直接和间接c-Src底物的功能的小分子、化学化合物和核酸分子，所述c-Src底物诸如粘着斑激酶、信号转导及转录激活蛋白3(STAT3)、血管内皮生长因子(VEGF)、桩蛋白、Cas、p190RhoGAP、Ras、E-钙粘蛋白、c-Jun氨基末端激酶、NEDD9等。示例性试剂包括达沙替尼、SU6656和AZD05530。Src抑制剂也可得自Wyeth，且包括例如4-[(2,4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-7-[3-(4-乙基-1-哌嗪基)丙氧基]-6-甲氧基-3-喹啉甲腈；4-[(2,4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-甲氧基-7-[2-(4-甲基-1-哌嗪基)乙氧基]-3-喹啉甲腈；4-[(2,4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-7-[2-(4-乙基-1-哌嗪基)乙氧基]-6-甲氧基-3-喹啉甲腈；4-[(2,4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-甲氧基-7-[(1-甲基哌啶-4-基)甲氧基]-3-喹啉甲腈；4-[(2,4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-甲氧基-7-[2-(1-甲基哌啶-4-基)乙氧基]-3-喹啉甲腈；4-[(2,4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-甲氧基-7-[3-(1-甲基哌啶-4-基)丙氧基]喹啉-3-甲腈；4-[(2,4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-7-[(1-乙基哌啶-4-基)甲氧基]-6-甲氧基喹啉-3-甲腈；4-[(2,4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-乙氧基-7-[3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙氧基]喹啉-3-甲腈；4-[(2,4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-乙氧基-7-[(1-甲基哌啶-4-基)甲氧基]喹啉-3-甲腈；4-[(2,4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-乙氧基-7-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)丙氧基]喹啉-3-甲腈；4-[(2,4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-乙氧基-7-[3-(1-甲基哌啶-4-基)丙氧基]喹啉-3-甲腈；4-[(2,4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-乙氧基-7-[2-(4-甲基-1-哌嗪基)乙氧基]喹啉-3-甲腈；4-[(2,4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-乙氧基-7-[2-(1-甲基哌啶-4-基)乙氧基]喹啉-3-甲腈；或4-[(2,4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-甲氧基-7-[3-(4-丙基-1-哌嗪基)丙氧基]-3-喹啉甲腈；及其药学上可接受的盐。
根据一个具体实施方案，具有针对Src家族激酶的抑制活性的试剂是小分子试剂。
根据一个具体实施方案，具有针对Src家族激酶的抑制活性的试剂是化学试剂。
具有针对非受体酪氨酸激酶的Src家族的抑制活性的合适的化合物包括国际专利申请WO 01/94341、WO 02/16352、WO 02/30924、WO 02/30926、WO 02/34744、WO 02/085895、WO 02/092577 (源自PCT/GB 02/02117)、WO 02/092578 (源自PCT/GB 02/02124)和WO 02/092579 (源自PCT/GB 02/02128)中公开的喹唑啉衍生物，WO 03/008409 (源自PCT/GB 02/03177)、WO 03/047584和WO 03/048159中描述的喹啉衍生物和欧洲专利申请02292736.2(2002年11月4日提交)和03290900.4(2003年4月10日提交)中描述的喹唑啉衍生物。
Journal Medicinal Chemistry, 2001, 44, 822-833和3965-3977中公开了某些4-苯胺基-3-氰基喹啉衍生物可用于抑制Src依赖性细胞增殖。被称为SKI 606的4-苯胺基-3-氰基喹啉Src抑制剂描述于Cancer Research, 2003, 63, 375中。
具有Src激酶抑制性质的其它化合物描述于例如国际专利申请WO 96/10028、WO97/07131、WO 97/08193、WO 97/16452、WO 97/28161、WO 97/32879和WO 97/49706。
具有Src激酶抑制性质的其它化合物描述于例如J Bone Mineral Research,1999, 14 (Suppl. 1), S487, Molecular Cell, 1999, 3, 639-647, JournalMedicinal Chemistry, 1997, 40, 2296-2303, Journal Medicinal Chemistry, 1998,41, 3276-3292和Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2002, 12, 1361和3153。
具体的Src激酶抑制剂包括以下：
(i) 4-氨基-5-(3-甲氧基苯基)-7-{(4-[2-(2-甲氧基乙基氨基)乙氧基]苯基)-}-吡咯并[2,3-d]嘧啶和4-氨基-5-(3-甲氧基苯基)-7-(4-{(2-[二-(2-甲氧基乙基)氨基]乙氧基}苯基)吡咯并[2,3-d]嘧啶，其可通过国际专利申请WO 96/10028中描述的方法获得；
(ii) 4-氨基-7-叔丁基-5-(4-甲苯基)吡唑并[3,4-d]嘧啶，其也称为PP1且描述于Molecular Cell, 1999, 3, 639-648中；
(iii) 2-(2,6-二氯苯胺基)-6,7-二甲基-1,8-二氢咪唑并[4,5-h]异喹啉-9-酮和2-(2,6-二氯苯胺基)-7-[(E)-3-二乙基氨基丙-1-烯基]-6-甲基-1,8-二氢咪唑并[4,5-h]异喹啉-9-酮，其可通过Journal Medicinal Chemistry, 2002, 45, 3394中描述的方法获得；
(iv) 1-[6-(2,6-二氯苯基)-2-(4-二乙基氨基丁基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基]-3-乙基脲，其可通过Journal Medicinal Chemistry, 1997, 40, 2296-2303和JournalMedicinal Chemistry, 2001, 44, 1915中描述的方法获得；
(v) 6-(2,6-二氯苯基)-2-[4-(2-二乙基氨基乙氧基)苯胺基]-8-甲基-8H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮，其也称为PD166285，且描述于J. Pharmacol. Exp. Ther., 1997, 283,1433-1444中；
(vi) 称为PD 162531且描述于Mol. Biol. Cell, 2000, 11, 51-64中的化合物；
(vii) 称为PD166326且描述于Biochem Pharmacol., 2000, 60, 885-898中的化合物；和
(viii) 称为PD173955且描述于Cancer Research, 1999, 59, 6145-6152中的化合物。
可具有Src激酶抑制性质的其它化合物描述于例如国际专利申请WO 02/079192、WO 03/000188、WO 03/000266、WO 03/000705、WO 02/083668、WO 02/092573、WO 03/004492、WO 00/49018、WO 03/013541、WO 01/00207、WO 01/00213和WO 01/00214。
具体的Src抑制剂包括国际专利申请WO 01/94341中提供的那些。
其它具体的Src抑制剂包括来自国际专利申请WO 02/16352、WO 02/30924、WO 02/30926和WO 02/34744的以下化合物。示例性试剂包括但不限于达沙替尼和AZD0530。
其它示例性试剂包括CGP77675 (AXON MEDCHEM 2097)、SU 6656、AZD0530、达沙替尼、博舒替尼和WH-4-023。
根据本发明的一些实施方案，以以下浓度范围提供Src家族激酶抑制剂(例如，CGP77675)：约0.1-100 μM，例如，0.1-70 μM，例如，约0.2 μM至约70 μM，例如，约0.2-60 μM，例如，约0.2-55 μM，例如，约0.2-50 μM，例如，约0.2-45 μM，例如，约0.2-40 μM，例如，约0.2-35 μM，例如，约0.2-30 μM，例如，约0.2-25 μM，例如，约0.2-20 μM，例如，约0.2-15 μM，例如，约0.2-10 μM，例如，约0.3-10 μM，例如，约0.4-10 μM，例如，约0.5-10 μM，例如，约0.6-10 μM，例如，约0.7-10 μM，例如，0.8-10 μM，例如，0.9-10 μM，例如，0.9-9 μM，例如，1-8 μM，例如，1-7 μM，例如，1-6 μM，例如，1-5 μM，例如，约1-3 μM，例如，约1.5 μM。
抗坏血酸(也称为维生素C)是具有抗氧化性质的糖酸(C6H8O6；分子量176.12克/摩尔)。本发明的一些实施方案的培养基使用的抗坏血酸可以是天然抗坏血酸、合成抗坏血酸、抗坏血酸盐(例如，抗坏血酸钠、抗坏血酸钙、抗坏血酸钾)、抗坏血酸的酯形式(例如，抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸硬脂酸酯)、其功能性衍生物(当用于本发明的培养基中时表现出相同活性/功能的衍生自抗坏血酸的分子)或其类似物(例如，表现出类似于当用于本发明的培养基中时观察到的抗坏血酸的活性的抗坏血酸的功能等价物)。可用于本发明的一些实施方案的培养基中的抗坏血酸制剂的非限制性实例包括L-抗坏血酸和抗坏血酸3-磷酸。
抗坏血酸可以获得自各种制造商诸如Sigma, St Louis, MO, USA (例如，目录号：A2218、A5960、A7506、A0278、A4403、A4544、A2174、A2343、95209、33034、05878、95210、95212、47863、01-6730、01-6739、255564、A92902、W210901)。
本公开的一些实施方案的培养基中包含的抗坏血酸的浓度是约1 μg/ml直至200μg/ml，例如，10-150 μg/ml，例如，10-100 μg/ml，例如，10-60 μg/ml，例如，20-60 μg/ml，例如，30-60 μg/ml，例如，50 μg/ml。
如本文所使用，术语“PKA”是指蛋白激酶A(PKA)，其也称为cAMP依赖性蛋白激酶，例如如GenBank登录号NP_001229786.1 (SEQ ID NO:137)、 NP_001229787.1 (SEQ ID NO:138)、NP_001229788.1 (SEQ ID NO:139)、NP_001229789.1 (SEQ ID NO:140)、NP_001229790.1 (SEQ ID NO:141)、NP_001229791.1 (SEQ ID NO:142)、NP_002722.1 (SEQID NO:143)、NP_891993.1 (SEQ ID NO:144)、NP_997461.1 (SEQ ID NO:145)、NP_002721.1 (SEQ ID NO:146)和NP_997401.1 (SEQ ID NO:147)所述。
如本文所使用的短语“PKA激动剂”是指增加PKA水平和/或活性的任何分子(例如，小分子、肽、RNA、cDNA)。例如，编码PKA蛋白(或至少其催化结构域)的RNA或cDNA可用于增加PKA的水平和/或活性。另外或可选地，PKA的激动剂也可以是环AMP(cAMP)，其结合PKA并激活PKA。另外或可选地，PKA的激动剂可以是酶腺苷酸环化酶的任何激活剂，所述酶腺苷酸环化酶催化三磷酸腺苷(ATP)转化为3',5'-环状AMP(cAMP)和焦磷酸，并因此增加cAMP水平。可用于本发明的一些实施方案的培养基中的PKA激动剂的非限制性实例包括毛喉素和AICAR。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基中包含的毛喉素的浓度是约0.1 μM至20 μM，例如，约0.5 μM至约15 μM，例如，约1 μM至约10 μM，例如，约2-8μM，例如，约4-6 μM。
如本文所使用，在本文中可互换使用的术语“YAP”或“YAP1”是指“Yes-相关蛋白1”。如本文所使用，术语“TAZ”是指Tafazzin。
如本文所使用，术语“YAP/TAZ抑制剂”是指能够抑制“YAP”和/或“TAZ”的功能的任何分子。实例包括但不限于维替泊芬(VP)，其可以以约0.1μM至约10μM的浓度包括；和9E1，其可以以约0.1μM至约5μM的浓度包括。
关于维替泊芬的进一步信息可以获得自Johnson R.和Halder G. 2014 (“Thetwo faces of Hippo：targeting the Hippo pathway for regenerative medicine andcancer treatment”. Nat. Rev. Drug Discov. 13(1):63-79. doi：10.1038/nrd4161.Epub 2013 Dec 13. Review；，其通过引用全文完全并入本文)。1型跨膜蛋白的Notch家族的成员共享结构特征，包括由多个表皮生长因子样(EGF)重复组成的胞外结构域和由多个不同结构域类型组成的胞内结构域。Notch家族成员通过控制细胞命运决定而在多种发育过程中发挥作用。Notch信号传导网络是进化上保守的细胞间信号通路，其调节物理相邻细胞之间的相互作用。在人类中，Notch家族包括notch 1 [GenBank登录号XP_011517019.1(SEQ ID NO:184)]，其在反式高尔基体网络中被切割，并作为异二聚体呈递在细胞表面上；notch 2 [GenBank登录号NP_077719.2同种型1(SEQ ID NO:185)和NP_001186930.1同种型2 (SEQ ID NO:186)]，其在反式高尔基体网络中被切割，并作为异二聚体呈递在细胞表面上；notch 3 [GenBank登录号NP_000426.2 (SEQ ID NO:187)]；和notch 4 [GenBank登录号NP_004548.3 (SEQ ID NO:188)]，其在反式高尔基体网络中被切割，并作为异二聚体呈递在细胞表面上。
NOTCH信号传导抑制剂包括但不限于以下γ分泌酶抑制剂：DAPT (Axon Medchem1484 – 0.05-50μM终浓度)、LY2886721盐酸盐(Axon Medchem 1964 – 0.05-50μM终浓度)]、DBZ (Axon Medchem – Axon 1488- 0.05-50μM终浓度)。
Sonic Hedgehog通路(SHH)蛋白[GenBank登录号NP_000184.1, SEQ ID NO:189]有助于早期胚胎的模式形成。它被认为是腹侧神经管、前后肢轴和腹侧体节的模式形成中的关键诱导信号。蛋白被制成自催化裂解的前体；N末端部分是可溶的并且含有信号传导活性，而C末端部分参与前体加工。更重要的是，C-末端产物将胆固醇部分共价连接至N-末端产物，将N-末端产物限制在细胞表面并防止其在整个正在发育的胚胎中自由扩散。
Sonic Hedgehog通路(SHH)抑制剂包括但不限于以下：GANT61 (SigmaAldrich –0.05-50μM终浓度)、RU-SKI 43 (Axon Medchem – Axon 2035 – 0.05-50μM终浓度)]。
如本文所使用，术语“转化生长因子受体(TGFR)”(也称为“TGFβR”)是指TGF-β型I受体ALK5、I型激活蛋白/淋巴细胞受体ALK4和I型节受体ALK7。
如本文所使用，术语“TGFR抑制剂(或TGFRi)”是指如通过磷酸化的ALK4、5和7确定的能够抑制TGFR表达和/或活性水平的分子。
TGFR抑制剂的非限制性实例包括SB431542和A 83-01小分子化合物。
根据本发明的一些实施方案，以以下浓度范围提供TGFR抑制剂：约0.1-30 μM，例如，约1-30 μM，例如，5-25 μM，例如，5-10 μM，例如，0.1-5 μM，例如，0.2-4 μM，例如，0.5-3μM。
BMP(骨形态发生蛋白)信号传导抑制剂包括但不限于：LDN193189 (AXON 1509 -0.01-20μM终浓度，例如0.2μM)、K02288 (Axon 2189；0.1-20μM终浓度)、盐酸多索米芬(AXON 2150 0.1-20μM终浓度)。
如本文所使用，术语“成纤维细胞生长因子受体(FGFR)”是指FGFR1、FGFR2和FGFR3。
如本文所使用，术语“FGFR抑制剂(或FGFRi)”是指如通过磷酸化的FGFR1、2和3的水平测定的能够抑制FGFR表达和/或活性水平的分子。
FGFR抑制剂的非限制性实例包括PD173074和SU5401。
根据本发明的一些实施方案，所述FGFR抑制剂 (FGFRi)是PD173074，且以以下浓度范围提供：约0.01-40 μM，例如，约0.02-40 μM，例如，约0.05-40 μM，例如，约0.1-40 μM，约0.5-40 μM，约1-40 μM，例如，约2-40 μM，约5-40 μM，约10-40 μM，例如，约0.05-5 μM，例如，约0.1-5 μM。
根据本发明的一些实施方案，所述FGFR抑制剂 (FGFRi)是SU5401，且以以下浓度范围提供：约0.1-40 μM，例如，约0.5-40 μM，约1-40 μM，例如，约2-40 μM，约5-40 μM，约10-40 μM。
如上所述，所述培养基包括ERK1/2抑制剂(ERK1/2i)。应该注意的是，ERK1/2抑制剂属于MAPK抑制剂的家族，其也包括JNK抑制剂(JNKi)，ERK5抑制剂(ERK5i；例如，BIX02189)，BRAF抑制剂(BRAFi；例如，SB590885)，ARAF抑制剂(ARAFi)，CRAF抑制剂(CRAFi)和p38抑制剂(p38i；例如，BIRB796，AXONMEDCHEM – Axon 1358)。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基还包含选自JNK抑制剂、ERK5抑制剂(例如，BIX02189)、BRAF抑制剂(例如，SB590885)、ARAFi、CRAFi和p38抑制剂(例如，BIRB796，AXONMEDCHEM – Axon 1358)的抑制剂。
如本文所使用，术语“JNK”是指GenBank登录号NP_620637.1 (同种型α2) (SEQ IDNO:46)、NP_620635.1 (同种型β2) (SEQ ID NO:47)、NP_620634.1 (同种型β1) (SEQ IDNO:48)、NP_002741.1 (同种型α1) (SEQ ID NO:49)所示的促***原活化蛋白激酶8(MAPK8)蛋白，其参与多种细胞过程诸如增殖、分化、转录调控和发育。
如本文所使用，术语“JNK抑制剂”是指如通过蛋白质印迹分析通过JNK家族成员蛋白的磷酸化确定的能够抑制JNK的活性的任何分子。实例包括但不限于SP600125 (TOCRIS– 目录号1496)和AEG3482 (AXONMEDCHEM- AXON 1291，例如，以0.1μM-10μM的浓度)。
根据本发明的一些实施方案，以以下浓度范围提供SP600125：：约0.5-100 μM，例如，约1 μM至约100 μM，例如，约1-90 μM，例如，约1-80 μM，例如，约1-70 μM，例如，约1-60μM，例如，约1-55 μM，例如，约1-50 μM，例如，约1-45 μM，例如，约1-40 μM，例如，约1-35 μM，例如，约1-30 μM，例如，约1-25 μM，例如，约1-20 μM，例如，约1-15 μM，例如，约1-10 μM，例如，约2-10 μM，例如，约3-10 μM，例如，约4-10 μM，例如，约4-6 μM，例如，约5 μM。
根据本发明的一些实施方案，以以下浓度范围提供ERK5抑制剂，例如，BIX02189：约0.5-100 μM，例如，约1 μM至约100 μM，例如，约1-90 μM，例如，约1-80 μM，例如，约1-70μM，例如，约1-60 μM，例如，约1-55 μM，例如，约1-50 μM，例如，约1-45 μM，例如，约1-40 μM，例如，约1-35 μM，例如，约1-30 μM，例如，约1-25 μM，例如，约1-20 μM，例如，约1-15 μM，例如，约1-10 μM，例如，约2-10 μM，例如，约3-10 μM，例如，约4-10 μM，例如，约4-6 μM，例如，约5 μM。
如所述，本发明的一些实施方案的培养基还可以包含RAF激酶抑制剂。
RAF激酶是在MAP激酶信号传导通路中起作用的丝氨酸/苏氨酸激酶。被本发明的一些实施方案的培养基中使用的RAF抑制剂抑制的RAF激酶蛋白包括ARAF [A-Raf原癌基因，丝氨酸/苏氨酸激酶；同种型1(GenBank登录号NP_001645.1, SEQ ID NO:190)；同种型2(GenBank登录号NP_001243125.1, SEQ ID NO:191)；和同种型3 (GenBank登录号NP_001243126.1, SEQ ID NO:192)]、BRAF [B-Raf原癌基因丝氨酸/苏氨酸激酶，GenBank登录号NP_004324.2 (SEQ ID NO:193)]和RAF1 [也称为CRAF或c-Raf；Raf-1原癌基因丝氨酸/苏氨酸激酶，GenBank登录号NP_002871.1 (SEQ ID NO:194)]。
RAF抑制剂是例如以0.05 mmol/L至大于4.0 mmol/L的IC50抑制野生型C-Raf的化合物。
示例性RAF激酶抑制剂公开于WO 00/09495和WO 05/028444中，其内容通过引用并入本文。
RAF激酶抑制剂的实例包括(4-叔丁基-苯基)-4-吡啶-4-基甲基-异喹啉-1-基)-胺；[4,7]双异喹啉基-1-基-4-(叔丁基-苯基)-胺；(4-叔丁基-苯基)-(4-喹唑啉-6-基-异喹啉-1-基)-胺；[4,7]双异喹啉基-1-基-(2-叔丁基-嘧啶-5-基)-胺。
对C-Raf更特异、但也具有对B-RAF的抑制活性的RAF抑制剂的非限制性实例是索拉非尼。
根据本发明的一些实施方案，以以下浓度范围提供索拉非尼：约0.1微M (μM)至约70 μM，例如，约0.1-60 μM，例如，约0.1-50 μM，例如，约0.5-50 μM，例如，约0.5-45 μM，例如，约0.5-40 μM，例如，约0.1-35 μM，例如，约0.5-30 μM，例如，约0.5-25 μM，例如，约0.5-20 μM，例如，约0.5-15 μM，例如，约0.5-10 μM，例如，0.5-9 μM，例如，0.5-8 μM，例如，0.5-7 μM，例如，0.9-6 μM，例如，0.8-5 μM, 例如，约5 μM，例如，0.8-4 μM，例如，0.8-3 μM，例如，0.8-2 μM，例如，0.8-1.5 μM，例如，0.9-1.2 μM。
根据本发明的一些实施方案，以以下浓度范围提供BRAFi (例如，SB590885)：约0.1-100 μM，例如，约0.1-90 μM，例如，约0.1-80 μM，例如，约0.1-70 μM，例如，约0.1-60 μM，例如，约0.1-50 μM，例如，约0.1-40 μM，例如，约0.1-30 μM，例如，约0.1-20 μM，例如，约0.1-10 μM，例如，约0.1-5 μM，例如，约0.1-2 μM，例如，约0.1-1 μM，例如，约0.5 μM。
如本文所使用，术语“p38”是指“p38α (alpha)”促***原活化蛋白激酶14(MAPK14)，其包括GenBank登录号NP_001306.1 (SEQ ID NO:39)所示的MAPK14同种型1，GenBank登录号NP_620581.1 (SEQ ID NO:40)所示的MAPK14同种型2，GenBank登录号NP_620582.1 (SEQ ID NO:41)所示的MAPK14同种型3和GenBank登录号NP_620583.1 (SEQ IDNO:42)所示的MAPK14同种型4；GenBank登录号NP_002742.3 (SEQ ID NO:43)所示的“p38β(beta)”；GenBank登录号NP_002960.2 (SEQ ID NO:44)所示的“p38γ (gamma)”(MAPK12)；和/或GenBank登录号NP_002745.1 (SEQ ID NO:45)中所示的“p38δ (delta)” (MAPK13)，它们都具有激酶活性并参与信号转导。
如本文所使用，术语“p38抑制剂”是指如通过磷酸化的p38水平的蛋白质印迹定量确定的能够抑制p38家族成员的活性的任何分子(例如，小分子或蛋白)。
p38抑制剂的非限制性实例包括SB203580 (AXONMEDCHEM – Axon 1363)和SB202190 (AXONMEDCHEM – Axon 1364)、LY 2228820 (AXONMEDCHEM- Axon 1895)、BIRB796(Axon Medchem 1358)和PD169316 (AXONMEDCHEM – Axon 1365，例如，浓度为约0.1 μM至约10 μM)。
由于BMP信号传导是p38信号传导的激活剂，p38抑制剂的实例还包括BMP抑制剂如多索米芬(AXONMEDCHEM – Axon 2150)和LDN193189 (AXON MEDCHEM AXON 1509)，或者BMP通路的其它抑制剂，例如重组NOGGIN蛋白[GenBank登录号NP_005441.1 (SEQ ID NO:118)]可用于取代BMP信号传导的小分子抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，以以下浓度范围提供SB203580：约0.5-70 μM，例如，约1 μM至约70 μM，例如，约1-60 μM，例如，约1-55 μM，例如，约1-50 μM，例如，约1-45 μM，例如，约1-40 μM，例如，约1-35 μM，例如，约1-30 μM，例如，约1-25 μM，例如，约1-20 μM，例如，约1-15 μM，例如，约1-10 μM，例如，约2-10 μM，例如，约3-10 μM，例如，约4-10 μM，例如，约4-6 μM，例如，约5 μM，例如，约10 μM。
根据本发明的一些实施方案，以以下浓度范围提供SB 202190：约0.1 μM至约50 μM，例如，约0.5 μM至约50 μM，例如，约1 μM至约50 μM，例如，约1-45 μM，例如，约1-40 μM，例如，约1-35 μM，例如，约1-30 μM，例如，约1-25 μM，例如，约1-20 μM，例如，约1-15 μM，例如，约1-10 μM，例如，约1-9 μM，例如，约1-8 μM，例如，约1-7 μM，例如，约2-7 μM，例如，约3-7 μM，例如，约4-7 μM，例如，约4-6 μM，例如，约5 μM。
根据本发明的一些实施方案，以以下浓度范围提供BIRB796：约0.05至约30 μM，例如，约0.1至约30 μM，例如，约0.2-30 μM，例如，约0.2-25 μM，例如，约0.2-20 μM，例如，约0.2-15 μM，例如，约0.2-10 μM，例如，约0.2-8 μM，例如，约0.2-6 μM，例如，约0.5-6 μM，例如，约0.5-5 μM，例如，约0.5-4 μM，例如，约0.5-3 μM，例如，约0.5-2 μM，例如，约1-3 μM，例如，约1-2.5 μM，例如，约2 μM，例如，约0.1 μM，例如，约1 μM。
如本文所使用，术语“LSD1”是指作为几种组蛋白脱乙酰酶复合物的组分的赖氨酸(K)特异性去甲基酶1A(基因ID KDM1A)核蛋白。该蛋白含有SWIRM结构域、FAD结合基序和胺氧化酶结构域，并且其通过起组蛋白去甲基酶的作用进行沉默基因。
LSD1抑制剂的非限制性实例包括但不限于约0.1μM至约10μM、例如约5μM的浓度的反苯环丙胺(TCP)。
PI3K加强剂的实例包括例如***1(IGF1；例如，范围0.1-100 ng/ml终浓度)、***II(IGFII；例如，范围0.1-100 ng/ml终浓度)、干细胞因子(SCF；例如，范围0.1-100 ng/ml终浓度)和FGF2。
术语“***1(IGF1)”是指***同种型1-4中的任一种，如GenBank登录号NP_001104753.1 (SEQ ID NO:162)、NP_001104754.1 (SEQ ID NO:164)、NP_001104755.1 (SEQ ID NO:166)和NP_000609.1 (SEQ ID NO:160)所示，其分别由GenBank登录号NM_001111283.1 (SEQ ID NO:163)、NM_001111284.1 (SEQ ID NO:165)、NM_001111285.1 (SEQ ID NO:167)和NM_000618.3 (SEQ ID NO:161)编码。
术语“***2(IGF2)”是指***II的同种型1(由变体1、2、4和5编码)和同种型2(由变体3编码)。变体1代表最主要的转录物[GenBank登录号NM_000612.5 (SEQ ID NO:169)和NP_000603.1 (SEQ ID NO:168)]。变体2含有两个替代的5'非编码外显子，因此，与变体1 [GenBank登录号NM_001007139.5 (SEQ ID NO:171)和NP_001007140.2 (SEQ ID NO:170)]相比具有不同的5' UTR。与变体1相比，变体3在5'末端含有两个替代外显子，一个非编码，另一个编码。这导致使用上游AUG(在变体1和2中未发现)和更长的同种型(2)，所述同种型(2)与同种型1相比具有不同的N-末端[GenBank登录号NM_001127598.2 (SEQ ID NO:173)和NP_001121070.1 (SEQ ID NO:172)]。变体(4)与变体1相比在5'UTR外显子中不同[GenBank登录号NM_001291861.2 (SEQ ID NO:175)和NP_001278790.1 (SEQ ID NO:174)]。该变体(5)与变体1相比在5' UTR外显子中不同[GenBank登录号NM_001291862.2 (SEQ ID NO:177)和NP_001278791.1 (SEQ ID NO:176)]。
本文可互换使用的术语“干细胞因子”或“SCF”是指由KIT基因座编码的酪氨酸-激酶受体的配体。(也称为“KIT配体”或“KITLG”)，例如由GenBank登录号NM_000899.4 (SEQID NO:157)编码的GenBank登录号NP_000890.1 (SEQ ID NO:156)中所示的kit配体同种型b前体以及由GenBank登录号NM_003994.5 (SEQ ID NO:159)编码的GenBank登录号NP_003985.2 (SEQ ID NO:158)中所示的kit配体同种型a前体。
根据一个具体实施方案，所述PI3K加强剂是FGF2。
在本文可互换使用的短语“碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)”或“FGF2”是指成纤维细胞生长因子(FGF)家族的多肽，其结合肝素，并具有广泛的促有丝***和血管生成活性。BFGF基因的mRNA含有多个多腺苷酸化位点，或者由非AUG (CUG)和AUG起始密码子翻译，产生具有不同性质的5个不同的同种型。CUG致敏的同种型位于核中，并负责胞内分泌作用，而AUG致敏形式大多是胞质的，并负责该FGF的旁分泌和自分泌作用。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基所使用的bFGF提供于GenBank登录号NP_001997 (SEQ ID NO:29)中。BFGF可获得自不同的制造商诸如Peprotech、RnD systems、Millipore。根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基所使用的bFGF由R&D Systems (目录号：233-FB)提供。
根据本发明的一些实施方案，以以下浓度范围提供bFGF：约0.5纳克/毫升(ng/ml)至约500 ng/ml，例如，约1-500 ng/ml，例如，约1-400 ng/ml，例如，约1-300 ng/ml，例如，约1-200 ng/ml，例如，约1-100 ng/ml，例如，约1-80 ng/ml，例如，约1-70 ng/ml，例如，约1-70 ng/ml，例如，约1-60 ng/ml，例如，约1-50 ng/ml，例如，约1-40 ng/ml，例如，约1-30ng/ml，例如，约1-20 ng/ml，例如，约2-20 ng/ml，例如，约2-10 ng/ml，例如，约3-10 ng/ml，例如，约4-10 ng/ml，例如，约8 ng/ml。
如本文所使用，术语“SMAD”是指由跨膜丝氨酸-苏氨酸受体激酶响应于TGF-β信号传导磷酸化和激活的蛋白的家族。应当注意，潜在的SMAD激活剂是TGFβ细胞因子。
根据本发明的一些实施方案，所述SMAD激活剂选自激活蛋白A、TGFβ1和骨形态发生蛋白4 (BMP4)。
转化生长因子(TGF)诱导剂包括例如TGFβ1、TGFβ2和激活蛋白。
根据一个具体实施方案，所述转化生长因子(TGF)诱导剂是TGF-β1。
如本文所使用，短语“TGFβ1”是指转化生长因子β的同种型beta-1 (β1) (例如智人TGFβ1，GenBank登录号NP_000651；SEQ ID NO:28，其由GenBank登录号NM_000660.5中描述的序列SEQ ID NO:31编码)。TGFβ在诱导转化中起作用，还可用作负性自分泌生长因子。TGFβ1同种型可获得自不同的商业来源，例如R&D Systems Minneapolis MN，USA。
根据本发明的一些实施方案，以以下浓度范围提供TGFβ1：约0.1纳克/毫升(ng/ml)至约500 ng/ml，例如，约0.1-400 ng/ml，例如，约0.1-300 ng/ml，例如，约0.1-200 ng/ml，例如，约0.1-100 ng/ml，例如，约0.1-50 ng/ml，例如，约0.1-30 ng/ml，例如，约0.1-20ng/ml，例如，约0.1-10 ng/ml，例如，约1-10 ng/ml, 例如，about 0.1-8 ng/ml，例如，约0.1-7 ng/ml，例如，约0.1-6 ng/ml，例如，约0.1-5 ng/ml，例如，约0.1-4 ng/ml，例如，约0.1-3 ng/ml，例如，约0.1-2 ng/ml，例如，约0.5-2 ng/ml，例如，约0.5-1.5 ng/ml，例如，约1 ng/ml。
根据本发明的一些实施方案，可使用TGF/激活蛋白途径激活因子，包括激活蛋白A(也称为抑制素βA，INHBA，Gene ID：3624；GenBank登录号NM_002192.2 (SEQ ID NO:123)，其编码GenBank登录号NP_002183.1；SEQ ID NO:117)，替代TGFβ1。
根据本发明的一些实施方案，可用重组Nodal和/或激活蛋白和/或转化生长因子β2 (TGFβ2)和/或GDF3和/或GDF-9替代TGFβ1细胞因子。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基中的激活蛋白A的浓度是约1-40 ng/ml，例如，约20 ng/ml。
如本文所使用，术语“BMP4”是指骨形态发生蛋白家族的成员[GenBank登录号001193.2 (SEQ ID NO:148)]，其是转化生长因子-β超家族的一部分。该超家族包括生长和分化因子的大家族。BMP4在人类中软骨内骨形成的发生中起重要作用，并且表达的减少已与多种骨疾病相关。
根据本发明的一些实施方案，培养基中的BMP4蛋白的浓度是约0.1 ng/ml至约20ng/ml，例如，约5-10 ng/ml。
如本文所使用，术语“DOT1L”[DOT1样组蛋白H3K79甲基转移酶蛋白；GenBank登录号NP_115871.1 (SEQ ID NO:149)]是指使组蛋白H3的赖氨酸-79甲基化的组蛋白甲基转移酶。DOT1L针对游离核心组蛋白无活性，但针对核小体显示显著的组蛋白甲基转移酶活性。
DOT1L抑制剂的非限制性实例包括但不限于SGC0946。
根据本发明的一些实施方案，培养基中的SGC0946的浓度是0.05 μM至约10 μM，例如，浓度为约0.1至约10 μM，例如，约1 μM，例如，约2 μM，例如，约5 μM。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含G9a的抑制剂[也称为“EHMT2常染色质组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶2”GenBank登录号NP_001276342.1(同种型a；SEQ ID NO:197)，NP_079532.5(同种型b；SEQ ID NO:198)，NP_001276342.1(同种型c；SEQ ID NO:199)]和/或Glp(也称为“EHMT1常染色质组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶1”GenBank登录号NP_079033.4(同种型1；SEQ ID NO:200)和NP_001138999.1(同种型2；SEQ ID NO:201)]，其形成H3K9me2 [组蛋白H3上Lys(K)9的二甲基化(me2)]的一部分(Kubicek S1, O'SullivanRJ, 等, Reversal of H3K9me2 by a small-molecule inhibitor for the G9a histonemethyltransferase. Mol Cell. 2007, 25(3):473-81；和Vedadi M1, Barsyte-LovejoyD, 等， A chemical probe selectively inhibits G9a and GLP methyltransferaseactivity in cells. Nat. Chem. Biol. 2011, 7(8):566-74；其各自通过引用全文完全并入本文)。蛋白赖氨酸甲基转移酶G9a和GLP通过组蛋白H3上的Lys9的二甲基化(H3K9me2)以及非组蛋白靶标的二甲基化来调节多种基因的转录抑制。
根据本发明的一些实施方案，所述抑制剂可以在体外选择性损伤G9a组蛋白赖氨酸甲基转移酶(HMTase)活性和/或H3K9me2的产生。
可用于本发明的一些实施方案的培养基中的G9a和/或Glp的抑制剂的非限制性实例包括例如击倒G9a和/或GLP RNA或蛋白产物的水平的siRNA或反义RNA。
可用于本发明的一些实施方案的培养基中的G9a和/或Glp的抑制剂的非限制性实例包括例如特异性抑制G9a和/或Glp的活性和/或阻止或损害H3K9me2的产生的小分子。
根据本发明的一些实施方案，抑制G9a和/或Glp和/或阻止或损害H3K9me2的产生的小分子是BIX-01294(二氮杂䓬-喹唑啉-胺衍生物)和/或UNC0638。
根据本发明的一些实施方案，抑制G9a和/或Glp和/或阻止或损害H3K9me2的产生的小分子是BIX-01294(下文也称为“BIX01294”)。
根据本发明的一些实施方案，培养基中的BIX01294的浓度是约0.05微M至约5微M，例如，0.05微M (μM)至约4 μM，例如，约0.08-3 μM，例如，约0.1-3 μM，例如，约0.1-2 μM，例如，约0.1-1 μM，例如，约0.2-1 μM，例如，约0.3-1 μM，例如，约0.4-1 μM，例如，约0.4-0.8μM，例如，约0.4-0.6 μM，例如，约0.5-0.6 μM，例如，约0.5微M。
根据本发明的一些实施方案，培养基中的BIX01294的浓度是约0.05 μM至约5 μM。
根据本发明的一些实施方案，培养基中的UNC0638的浓度是0.01 μM至约5 μM，例如，0.02-5 μM，例如，0.04-5 μM，例如，0.06-5 μM，例如，0.05微M (μM)至约4 μM，例如，约0.08-3 μM，例如，约0.08-2 μM，例如，约0.08-1 μM，例如，约0.08-0.5 μM，例如，约0.1-1 μM，例如，约0.1-0.8 μM，例如，约0.1-0.6 μM，例如，约0.1-0.4 μM，例如，约0.1-0.3 μM，例如，约0.1-0.2 μM，例如，约0.1微M。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含至少一种选自以下的试剂：碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子β1 (TGFβ1)、激活蛋白A、GSK3b抑制剂、ROCK抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、NOTCH抑制剂、SRC抑制剂、***1 (IGF1)、***II (IGFII)、骨形态发生蛋白(BMP)信号传导抑制剂、Sonic Hedgehog通路(SHH)抑制剂、ERK5抑制剂、毛喉素、Kenpaullone、BayK8644、G9a和/或Glp抑制剂 (例如，BIX01294或UNC0638)、干细胞因子(SCF)、YAP/TAZ抑制剂、L-抗坏血酸、LSD1抑制剂和DOT1L抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，培养基中的BayK8644的浓度是约0.5 μM至约10 μM。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含至少一种选自以下的试剂：转化生长因子受体(TGFR)抑制剂、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)抑制剂、激活蛋白A、GSK3b抑制剂、ROCK抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂和NOTCH抑制剂、SRC抑制剂、***1(IGF1)、***II (IGFII)、骨形态发生蛋白(BMP)信号传导抑制剂、SonicHedgehog通路(SHH)抑制剂、ERK5抑制剂、毛喉素、Kenpaullone、BayK8644、G9a和/或Glp抑制剂 (例如，BIX01294或UNC0638)、干细胞因子(SCF)、YAP/TAZ抑制剂、L-抗坏血酸、LSD1抑制剂和DOT1L抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含至少一种选自以下的试剂：激活蛋白A, 转化生长因子β1 (TGFβ1)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)抑制剂、GSK3b抑制剂、ROCK抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂和NOTCH抑制剂、SRC抑制剂、***1(IGF1)、***II (IGFII)、骨形态发生蛋白(BMP)信号传导抑制剂、SonicHedgehog通路(SHH)抑制剂、ERK5抑制剂、毛喉素、Kenpaullone、BayK8644、G9a和/或Glp抑制剂 (例如，BIX01294或UNC0638)、干细胞因子(SCF)、YAP/TAZ抑制剂、L-抗坏血酸、LSD1抑制剂和DOT1L抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含至少一种选自以下的试剂：碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子受体(TGFR)抑制剂、GSK3b抑制剂、ROCK抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、NOTCH抑制剂、SRC抑制剂、***1 (IGF1)、***II (IGFII)、骨形态发生蛋白(BMP)信号传导抑制剂、Sonic Hedgehog通路(SHH)抑制剂、ERK5抑制剂、毛喉素、Kenpaullone、BayK8644、G9a和/或Glp抑制剂 (例如，BIX01294或UNC0638)、干细胞因子(SCF)、YAP/TAZ抑制剂、L-抗坏血酸、LSD1抑制剂和DOT1L抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基是以下实施例部分的实施例5中描述的培养基(例如，培养基41-131)中的任一种。
另外或可选地，图1-2和以下实施例部分的实施例1-4证明可用于将幼稚PSC维持在“初始状态”下的额外条件，如通过OCT4-GFP+(阳性)细胞的表达所证明。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了包含ERK1/2抑制剂、STAT3激活剂和SRC抑制剂的培养基。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基还包含轴蛋白复合物稳定剂(AXINs)。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基还包含GSK3β抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基还包含p38抑制剂。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了包含ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、p38抑制剂、STAT3激活剂和至少一种选自SRC抑制剂和轴蛋白复合物稳定剂(AXINs)的试剂的培养基。
本发明的该方面的培养基可以包含Src家族激酶抑制剂，而不含轴蛋白复合物稳定剂。可选地，本发明的该方面的培养基可以包含轴蛋白复合物稳定剂，而不含Src家族激酶抑制剂。还可选地，本发明的该方面的培养基可以包含Src家族激酶抑制剂和轴蛋白复合物稳定剂。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基是化学上限定的并且不含异源物(不含动物污染物，或不含非人类污染物)。
应当注意，用SRCi和/或AXINs小分子化合物补充培养基允许在不包括动物组分的培养基(ALBUMAX1、ALBUMAX2、敲除-血清替代物-Invitrogen)中扩增人幼稚多能细胞，并且可以只依赖于使用限定的补充剂如B27(来自INVITROGEN的限定或不含异源物的B27补充剂)。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含ROCK抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含JNK抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含具有N2补充剂(例如，每500 ml培养基约5ml N2)与每500 ml培养基约5 ml的限定的脂质浓缩物、LIF(约20 ng/ml)、bFGF(约8ng/ml)、TGFβ1(约1 ng/ml)、ERK1/2i(约1μM的PD0325901)、GSK3bi(CHIR99021，约3μM)、p38i(SB203580，5μM)和JNKi (SP600125，约5-10μM)的KO-DMEM。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含具有N2补充剂(例如，每500 ml培养基约5 ml N2)与约1-2% Albumax®II、LIF(约20 ng/ml)、bFGF(约8 ng/ml)、TGFβ1(约1ng/ml)、ERK1/2i(约1μM的PD0325901)、GSK3bi(CHIR99021，约3μM)、p38i(SB203580，5μM)和JNKi (SP600125，5-约10μM)的KO-DMEM。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基包含具有N2补充剂(例如，每500 ml培养基约5 ml N2)与约15% Knockout SR (Gibco)、LIF(约20 ng/ml)、bFGF(约8 ng/ml)、TGFβ1(约1 ng/ml)、ERK1/2i(约1μM的PD0325901)、GSK3bi(CHIR99021，约3μM)、p38i(SB203580，5μM)和JNKi (SP600125，约5-10μM)的KO-DMEM。
在一个实施方案中，包含ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、p38抑制剂、STAT3激活剂和至少一种选自SRC抑制剂和轴蛋白复合物稳定剂(AXINs)的试剂的培养基还包含ROCK抑制剂。
在另一个实施方案中，包含ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、p38抑制剂、STAT3激活剂、至少一种选自SRC抑制剂和轴蛋白复合物稳定剂(AXINs)的试剂的培养基还包含ROCK抑制剂，且任选地，ROCK抑制剂还包含JNK抑制剂。
本文所述的培养基可以包含额外的信号传导优化组分。这种优化组分可包括PI3K加强剂、TGF细胞因子(或诱导剂)、形态发生素抑制剂和FGF受体抑制剂。
形态发生素抑制剂的实例包括NOTCH抑制剂、SHH抑制剂和TGFβ受体抑制剂。
本发明考虑的优化剂的特定组合包括以下试剂中的至少一种：bFGF、TGFβ1、TGFR抑制剂和FGF受体抑制剂。
根据一个具体实施方案，所述形态发生素抑制剂是TGFβ受体抑制剂。
本发明考虑的优化剂的其它组合包括以下试剂中的至少两种：bFGF、TGFβ1、TGFR抑制剂和FGF受体抑制剂。
在某些实施方案中，本发明的培养基可以包括蛋白激酶C抑制剂和/或BMP抑制剂。
在其它实施方案中，本发明的培养基不含蛋白激酶C抑制剂和/或BMP抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含至少一种选自以下的额外试剂：***1 (IGF1)、***II (IGFII)、骨形态发生蛋白(BMP)信号传导抑制剂、Sonic Hedgehog通路(SHH)抑制剂、ERK5抑制剂、毛喉素、Kenpaullone、BayK8644、G9a和/或Glp抑制剂 (例如，BIX01294或UNC0638)和干细胞因子(SCF)。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含至少一种选自以下的额外试剂：***1 (IGF1)、***II (IGFII)、骨形态发生蛋白4 (BMP4)、Sonic Hedgehog通路(SHH)抑制剂、ERK5抑制剂、毛喉素、Kenpaullone、BayK8644、G9a和/或Glp抑制剂 (例如，BIX01294或UNC0638)和干细胞因子(SCF)。
本发明预期的示例性培养基包括：
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、bFGF、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂和SRC家族激酶抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、bFGF、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂和SRC家族激酶抑制剂和BMP抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、bFGF、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂和SRC家族激酶抑制剂和PKC抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、bFGF、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂和SRC家族激酶抑制剂、BMP抑制剂和PKC抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、bFGF、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂和SRC家族激酶抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、bFGF、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、SRC家族激酶抑制剂和BMP抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、bFGF、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、SRC家族激酶抑制剂和PKC抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、bFGF、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、SRC家族激酶抑制剂、BMP抑制剂和PKC抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂和SRC家族激酶抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、SRC家族激酶抑制剂和BMP抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、SRC家族激酶抑制剂和PKC抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、RAF抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、SRC家族激酶抑制剂和PKC抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、RAF抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白抑制剂,和SRC家族激酶抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、RAF抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、SRC家族激酶抑制剂和PKC抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、RAF抑制剂、bFGF、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白抑制剂,和SRC家族激酶抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、SRC家族激酶抑制剂、PKC抑制剂和BMP抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、FGF2、TGFβ1、ROCK抑制剂和SRC家族激酶抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、FGF2、TGFβ1、ROCK抑制剂、SRC家族激酶抑制剂和BMP抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、FGF2、TGFβ1、ROCK抑制剂、SRC家族激酶抑制剂和PKC抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、FGF2、TGFβ1、ROCK抑制剂、SRC家族激酶抑制剂、PKC抑制剂和BMP抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂和SRC家族激酶抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、SRC家族激酶抑制剂和BMP抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、SRC家族激酶抑制剂和PKC抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、SRC家族激酶抑制剂、PKC抑制剂和BMP抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、ROCK抑制剂、轴蛋白抑制剂和SRC家族激酶抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、SRC家族激酶抑制剂和BMP抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、SRC家族激酶抑制剂和PKC抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、SRC家族激酶抑制剂、PKC抑制剂和BMP抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂和轴蛋白抑制剂.
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白抑制剂和BMP抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白抑制剂和PKC抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白抑制剂、PKC抑制剂和BMP抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、SRC家族激酶抑制剂和FGF受体抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、SRC家族激酶抑制剂、FGF受体抑制剂和BMP抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、SRC家族激酶抑制剂、FGF受体抑制剂和PKC抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、SRC家族激酶抑制剂、FGF受体抑制剂、PKC抑制剂和BMP抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白抑制剂和FGF受体抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、FGF受体抑制剂和BMP抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、FGF受体抑制剂和PKC抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、FGF受体抑制剂、PKC抑制剂和BMP抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、Src家族激酶抑制剂和TGF受体抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、Src家族激酶抑制剂、TGF受体抑制剂和BMP抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、Src家族激酶抑制剂、TGF受体抑制剂和PKC抑制剂的培养基。
包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、Src家族激酶抑制剂、TGF受体抑制剂、PKC抑制剂和BMP抑制剂的培养基。
另一种预期的培养基是包含ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、p38抑制剂、JNK抑制剂、STAT3激活剂、转化生长因子β受体(TGFβR)抑制剂、PKC抑制剂、p38抑制剂和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的培养基。
该培养基还可以包含选自BMP抑制剂、ROCK抑制剂、SRC抑制剂和轴蛋白复合物稳定剂(AXINs)中的至少一种、至少两种、至少三种或四种试剂。
可以根据本发明的一些实施方案使用的培养基的非限制性实例描述于以下实施例部分的实施例1(例如，培养基1-40)中。
应理解，可重组表达或生化合成本发明的一些实施方案的培养基中使用的任何蛋白质性因子(例如LIF、IL6、TGFβ1或bFGF)。另外，可使用本领域众所周知的方法，从生物样品(例如，从人血清、细胞培养物)纯化天然存在的蛋白质性因子诸如bFGF和TGFβ。
本发明的蛋白质性因子(例如，LIF、IL6、TGFβ1或bFGF)的生化合成可使用标准固相技术进行。这些方法包括专用固相合成、部分固相合成方法、片段缩合和经典溶液合成。
本发明的蛋白质性因子(例如LIF、IL6、TGFβ1或bFGF)的重组表达可使用诸如下述的重组技术产生：Bitter等(1987) Methods in Enzymol. 153:516-544；Studier等(1990)Methods in Enzymol. 185:60-89, Brisson等(1984) Nature 310:511-514；Takamatsu等(1987) EMBO J. 6:307-311；Coruzzi等(1984) EMBO J. 3:1671-1680；Brogli等(1984)Science 224:838-843；Gurley等(1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565以及Weissbach和Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY,Section VIII, 第421-463页。
例如，为了产生LIF、IL6、TGFβ1或bFGF，编码LIF、IL6、TGFβ1或bFGF的多核苷酸序列[例如SEQ ID NO:30 (LIF，GenBank登录号NM_001257135)、SEQ ID NO:31 (TGFβ1，GenBank登录号NM_000660)、SEQ ID NO:32 (BFGF，GenBank登录号NM_002006)、SEQ ID NO:111 (IL6，GenBank登录号NM_000600.3)所示的多核苷酸]优选与适于在宿主细胞[即编码精选多肽(例如LIF、IL6、TGFβ1或bFGF)的多核苷酸在其中表达的细胞]表达的核酸构建体连接。优选地，为了产生具有与天然存在的LIF、IL6、TGFβ1或bFGF相同的糖基化的量和模式的LIF、IL6、TGFβ1或bFGF，所用的宿主细胞是真核生物宿主细胞，更优选哺乳动物宿主细胞诸如人细胞或CHO细胞。下文提供了可用于产生目标多肽(例如本文所述蛋白质性因子)的核酸构建体(或表达载体)的其它描述。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含MBD3抑制剂。
如本文所使用，术语“MBD3”是指具有共阻抑物和染色质重建功能活性的GenBank登录号NP_003917.1 (SEQ ID NO:7)所示的甲基-CpG-结合结构域3蛋白。
如本文所使用，术语“MBD3抑制剂”是指能够下调MBD3的表达水平和/或活性，和/或能够干扰MBD3与OCT4，和/或MBD3与SOX2，和/或MBD3和KLF4和/或MBD3和C-Myc的相互作用，和/或抑制MBD3与核小体重建和脱乙酰酶(NuRD)的结合的任何试剂(例如分子)。可使用干扰转录和/或翻译的多种分子[例如RNA沉默剂(例如反义物、siRNA、shRNA、micro-RNA)、核酶和DNA核酶]在基因组和/或转录物水平上，或使用例如抗体(例如中和抗体)、拮抗剂例如抑制MBD3活性或与任何重编程因子(Oct4、Sox2、Klf4or c-Myc)直接相互作用的能力的小分子、切割多肽的酶等在蛋白水平上，实现MBD3的下调。
MBD3抑制剂的非限制性实例包括针对MBD3 mRNA的siRNA，诸如由Invitrogen提供的那些，mBD3HSS147581(3_RNAI) (Invitrogen):AGGUCAAGGGCAAGCCCGACCUGAA (SEQ IDNO:52)；和MBD3HSS147581(3_RNAI)(Invitrogen):UUCAGGUCGGGCUUGCCCUUGACCU (SEQ IDNO:53)。可以使用的针对MBD3 mRNA的另一种合适的siRNA是市售的MBD3 Stealth siRNA，其包括在人细胞中发现MBD3击倒（knowdown）有效的HSS147580和HSS147581组分(LifeTechnologiesTM，目录号1299001)。
根据本发明的一些实施方案，使用克罗莫结构域解旋酶DNA结合蛋白4(CHD4)抑制剂来进行抑制Mbd3与NuRD复合物的结合。
CHD4抑制剂的非限制性实例包括人CHD4 siRNA，诸如可获得自LifetechnologiesTM的CHD4stealth siRNA HSS101850，发现其在人细胞中有效地击倒CHD4。
根据本发明的一些实施方案，使用P66α卷曲-螺旋(P66α-CC)结构域来进行抑制Mbd3与NuRD复合物的结合。
将P66α-CC (SEQ ID NO:114)的肽照原样加入培养基中，或可从编码P66α-CC序列的载体(例如包含SEQ ID NO:113中所示的核苷酸序列的载体)重组表达。
根据本发明的一些实施方案，使用含有GATA锌指结构域的2A(GATAD2A)蛋白的抑制剂[也称为“转录阻遏物p66-α”；例如，同种型1，GenBank登录号NP_001287875.1(对于蛋白，SEQ ID NO:150)和NM_001300946.1(对于多核苷酸，SEQ ID NO:151)，和同种型2，GenBank登录号NP_060130.3(对于蛋白，SEQ ID NO:152)和NM_017660.3(对于多核苷酸，SEQ ID NO:153)]来抑制Mbd3与NuRD复合物的结合。这种抑制剂可以是例如小分子，针对编码GATAD2A的多核苷酸的siRNA或显性失活肽。
根据本发明的一些实施方案，使用蛋白激酶C(PKC)抑制剂(例如，使用如上所述的试剂和分子)来进行抑制Mbd3表达。
根据本发明的一些实施方案，培养基还包含增加内源ERAS和/或重组ERAS表达的试剂。
根据本发明的一些实施方案，分别与当在相同(例如相同)条件下但又无MBD3抑制剂时培育和/或培养的细胞中的MBD3 RNA和/或蛋白的表达水平相比，以足以下调细胞中MBD3 RNA和/或蛋白的表达水平达至少约30%、例如至少约35%、例如至少约40%、例如至少约45%、例如至少约50%、例如至少约55%、例如至少约60%、例如至少约65%、例如至少约70%、例如至少约75%、例如至少约80%的量提供MBD3抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，分别与当在相同(例如相同)条件下但又无MBD3抑制剂时培育和/或培养的细胞中的MBD3 RNA和/或蛋白的表达水平相比，以足以下调细胞中MBD3 RNA和/或蛋白的表达水平达约30-90%、例如约30-85%、例如约 40-85%、例如约50-85%、例如约60-85%、例如约70-85%、例如约80-85%、例如约85%的量提供MBD3抑制剂。
细胞中的MBD3的表达水平可以通过多种方法(诸如实时逆转录PCR、蛋白质印迹等)来测定。例如，当使用这种测定时，在用MBD3flox/-构建体转化的细胞中的MBD3蛋白水平存在约85％抑制(数据未显示)。
本发明考虑的额外培养基包括PCT IB 2014/060954(其全部内容通过引用并入本文)中公开的那些。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了包含细胞和本发明的一些实施方案的培养基的细胞培养物。
所述细胞可以是任何细胞，例如原核或真核细胞，例如，灵长类动物细胞，例如，哺乳动物细胞，例如，人细胞。
根据本发明的一些实施方案，所述细胞是体细胞、干细胞、致敏的多能干细胞、非幼稚多能干细胞和/或幼稚多能干细胞。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基能够将幼稚多能干细胞在幼稚状态下维持至少2代，例如，至少5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100代。
根据本发明的一些实施方案，灵长类动物多能干细胞是智人(人)、猴、黑猩猩、大猩猩、猕猴和/或狒狒。
短语“幼稚多能干细胞(PSC)”是指能够形成PSC并显示前X失活状态的细胞，因此被视为PSC的来源。
应当注意，本发明的一些实施方案的幼稚PSC(其处于前-X失活和幼稚状态)可以在分化后失活X染色体等位基因之一和甲基化XIST基因的启动子的等位基因之一。
根据本发明的一些实施方案的前-X失活状态的特征在于在雌性细胞中存在X-失活特异性转录物(XIST)基因的启动子的2个未甲基化等位基因，和在雄性细胞中存在XIST基因的启动子的1个未甲基化等位基因。
XIST基因位于人Xq13.2染色体上，且具有描述于克隆NC_000023.10(73040486.73072588，互补物，基于GenBank版本GRCh37.p10)中的序列。XIST基因具有GenBank登录号NR_001564.2 (SEQ ID NO:20)中提供的非编码RNA。
根据本发明的一些实施方案，雌性细胞中的XIST基因的启动子的2个未甲基化等位基因的存在是指具有XIST启动子中测序的CpG甲基化读数的低于约20%(即，由SEQ IDNO:70所示的XIST启动子扩增子中的CpG位点的少于20%被甲基化)，例如在XIST启动子中测序的CpG甲基化读数低于约19%、低于约18%、低于约17%、低于约16%、低于约15%、低于约14%、低于约13%、低于约12%、低于约11%、低于约10%、低于约9%、低于约8%、低于约7%、低于约6%、低于约5%、低于约4%、低于约3%、低于约2%、低于约1%，例如0% (例如完全没有)。
根据本发明的一些实施方案，雄性细胞中的XIST基因的启动子的1个未甲基化等位基因的存在是指具有XIST启动子中测序的CpG甲基化读数的低于约20%(即，由SEQ IDNO:70所示的XIST启动子扩增子中的CpG位点的少于20%被甲基化)，例如在XIST启动子中测序的CpG甲基化读数低于约19%、低于约18%、低于约17%、低于约16%、低于约15%、低于约14%、低于约13%、低于约12%、低于约11%、低于约10%、低于约9%、低于约8%、低于约7%、低于约6%、低于约5%、低于约4%、低于约3%、低于约2%、低于约1%，例如0%。
在SEQ ID NO:70所示XIST启动子扩增子中提供XIST启动子的一个非限制性实例，所述启动子包括可被甲基化或不被甲基化的CpG岛。
根据本发明的一些实施方案，雌性细胞中的XIST基因的启动子的未甲基化的等位基因包含由SEQ ID NO:70所示的XIST启动子扩增子中少于20％的CpG位点被甲基化。这种雌性幼稚多能干细胞中的XIST基因的未甲基化的等位基因的非限制性实例显示于图17A-E中。
根据本发明的一些实施方案，雄性细胞中的XIST基因的启动子的未甲基化的等位基因包含由SEQ ID NO:70所示的XIST启动子扩增子中少于20％的CpG位点被甲基化。雄性幼稚多能干细胞中的XIST基因的未甲基化的等位基因的非限制性实例显示于图17A-E中。
根据本发明的一些实施方案，与人致敏PSC中的CpG岛的甲基化水平相比，人幼稚PSC的特征在于XIST基因的启动子中的CpG岛的甲基化减少。
人幼稚ESC的特征在于各细胞中的总鸟嘌呤核苷酸中的显著低水平的总甲基化胞嘧啶(例如1-2%)，如通过液相层析法-层析法(LC-MS)定量分析所确定。
根据本发明的一些实施方案，人幼稚PSC的特征在于幼稚PSC细胞中的总鸟嘌呤核苷酸中的0-3%的总甲基化胞嘧啶。为了比较，致敏PSC或体细胞具有致敏PSC细胞中的总鸟嘌呤核苷酸中的3.5%-5%的总甲基化胞嘧啶。
因此，本发明的一些实施方案的幼稚多能干细胞处于如本文所解释的“幼稚状态”下。
因此，本发明的一些实施方案的培养基能够将幼稚PSC维持于幼稚状态下。如本文所使用，术语“分离的”是指至少部分从自然环境例如从灵长类动物(例如哺乳动物)胚胎或灵长类动物(例如哺乳动物)体中分离。
根据本发明的一些实施方案，所述非幼稚PSC选自致敏的PSC、胚胎干细胞、囊胚、诱导多能干细胞(致敏的iPSC)和体细胞。
根据本发明的一些实施方案，所述非幼稚PSC不是胚胎干细胞。
短语“胚胎干细胞”是指能够分化成所有三个胚层(即内胚层、外胚层和中胚层)的细胞或保留在未分化状态的胚胎细胞。短语“胚胎干细胞”可包括获得自在受孕后(例如胚泡)在胚胎植入前(即植入前胚泡)形成的胚胎组织的细胞、获得自植入后/原肠胚形成前期胚泡的扩展胚泡细胞(EBC) (参见WO2006/040763)和在妊娠期的任何时间，优选在妊娠10周之前获得自胎儿生殖组织的胚胎生殖(EG)细胞。
诱导多能干细胞(iPS；胚胎样干细胞)是通过赋予多能性(即能够分化成3个胚胎生殖细胞层，即内胚层、外胚层和中胚层)的成熟体细胞去分化获得的细胞。根据本发明的一些实施方案，所述细胞获得自分化组织(例如体细胞组织，诸如皮肤)并通过使细胞重编程以获得胚胎干细胞特征的遗传操作进行去分化。根据本发明的一些实施方案，通过在成体干细胞中诱导Oct-4、Sox2、Kfl4和c-Myc表达来形成诱导多能干细胞。
本发明的一些实施方案的胚胎干细胞可使用众所周知的细胞培养方法获得。例如，人胚胎干细胞可从人胚泡中分离。人胚泡通常获得自人体内植入前胚胎或体外授精(IVF)胚胎。可选地，可使单细胞人胚胎扩增至胚泡期。对于人ES细胞的分离，通过免疫外科从胚泡剥去透明带，并分离内细胞团(ICM)，其中滋养外胚层细胞被溶解并通过轻轻吸取从完整ICM中取出。
然后将ICM接种到含有能够使之增生的合适培养基的组织培养瓶中。在9-15天后，通过机械分离或通过酶促降解，将ICM衍生生长物解离成团，然后将细胞再次接种到新的组织培养基中。通过微量移液管各个选出显示未分化形态的集落，以机械方法解离成块，再次接种。每4-7天将所得ES细胞按常规分传。关于人ES细胞的制备方法的更多详情参见Thomson等[美国专利号5,843,780；Science 282：1145, 1998；Curr. Top. Dev. Biol.38：133, 1998；Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92：7844, 1995]；Bongso等[Hum Reprod 4：706, 1989]；以及Gardner等[Fertil. Steril. 69：84, 1998]。
用于制备ES细胞的另一种方法描述于Chung等, Cell Stem Cell, 第2卷, 第2期, 113-117, 7 February 2008。该方法包括在体外受精过程中从胚胎中取出单细胞。在该过程中不破坏胚胎。
应理解，还可根据本发明的一些实施方案使用市售干细胞。人ES细胞可购自NIH人胚胎干细胞登记处[Hypertext Transfer Protocol://grants(dot)nih(dot)gov/stem_cells/registry/current(dot)htm]。市售胚胎干细胞系的非限制性实例为BG01、BG02、BG03、BG04、CY12、CY30、CY92、CY10、TE03、TE32、CHB-4、CHB-5、CHB-6、CHB-8、CHB-9、CHB-10、CHB-11、CHB-12、HUES 1、HUES 2、HUES 3、HUES 4、HUES 5、HUES 6、HUES 7、HUES 8、HUES 9、HUES 10、HUES 11、HUES 12、HUES 13、HUES 14、HUES 15、HUES 16、HUES 17、HUES 18、HUES19、HUES 20、HUES 21、HUES 22、HUES 23、HUES 24、HUES 25、HUES 26、HUES 27、HUES 28、CyT49、RUES3、WA01、UCSF4、NYUES1、NYUES2、NYUES3、NYUES4、NYUES5、NYUES6、NYUES7、UCLA1、UCLA 2、UCLA 3、WA077 (H7)、WA09 (H9)、WA13 (H13)、WA14 (H14)、HUES 62、HUES 63、HUES 64、CT1、CT2、CT3、CT4、MA135、Eneavour-2、WIBR1、WIBR2、WIBR3、WIBR4、WIBR5、WIBR6、HUES 45、Shef 3、Shef 6、BJNhem19、BJNhem20、SA001、SA001。
另外，ES细胞也可获得自其它物种，包括小鼠(Mills和Bradley，2001)、金仓鼠[Doetschman等, 1988, Dev Biol. 127：224-7]、大鼠[Iannaccone等, 1994, Dev Biol.163：288-92]、兔[Giles等，1993, Mol Reprod Dev. 36：130-8；Graves和Moreadith,1993, Mol Reprod Dev. 1993, 36：424-33]、几种驯养动物物种[Notarianni等, 1991, JReprod Fertil Suppl. 43：255-60；Wheeler 1994, Reprod Fertil Dev. 6：563-8；Mitalipova等, 2001, Cloning. 3：59-67]和非人灵长类动物物种(猕猴和绒猴)[Thomson等, 1995, Proc Natl Acad Sci U S A. 92：7844-8；Thomson等, 1996, BiolReprod. 55：254-9]。
扩展胚泡细胞(EBC)可获得自在受精后至少9天在原肠胚形成之前阶段的胚泡。在培养胚泡前，消化透明带[例如通过Tyrode酸性溶液(Sigma Aldrich，St Louis，MO，USA)]，使得暴露内细胞团。然后在受精后，使用标准胚胎干细胞培养方法，将胚泡作为完整胚胎体外培养至少9天，但不超过14天(即在原肠胚形成事件之前)。
使用本领域任何技术人员已知的实验室技术，从获得自妊娠约8-11周的胎儿(在人胎儿的情况下)的原始生殖细胞中制备EG细胞。使生殖脊解离，并切成小块，之后通过机械分离将其分解成细胞。然后使EG细胞在含合适培养基的组织培养瓶中生长。随着每日更换培养基，培养细胞直到观察到与EG细胞一致的细胞形态，通常在7-30天或1-4次传代后。关于制备人EG细胞的方法的其它详情参见Shamblott等[Proc. Natl. Acad. Sci. USA95：13726, 1998]和美国专利号6,090,622。
可通过体细胞的遗传操作，例如通过体细胞(诸如成纤维细胞、肝细胞、胃上皮细胞)用转录因子(诸如Oct-3/4、Sox2、c-Myc和KLF4)进行逆转录病毒转导，从体细胞产生诱导多能干细胞(iPS) (胚胎样干细胞) [Yamanaka S, Cell Stem Cell. 2007, 1(1):39-49；Aoi T等, Generation of Pluripotent Stem Cells from Adult Mouse Liver andStomach Cells. Science. 2008 Feb 14. (印刷前的电子出版物)；IH Park, Zhao R,West JA等，Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with definedfactors. Nature 2008;451:141-146；K Takahashi, Tanabe K, Ohnuki M等，Inductionof pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors .Cell 2007;131:861-872]。可通过核转移到***中、与胚胎干细胞融合或核转移到合子中(如果受体细胞在有丝***中停止)来产生其它胚胎样干细胞。
在本文所述的培养基中培养细胞可以在任何囊泡(例如，板、室、生物反应器等)中进行。
可以根据本发明的方法选择和/或培养的细胞的数目可以是任何数目，包括小批次(例如，100 x104个细胞)至较大批次(例如，100 x106或100 x 107个细胞)。
可以在生物反应器(或多级工业烧瓶)中培养细胞，所述生物反应器的尺寸根据所培养的细胞数目来选择。
如本文所使用，术语“生物反应器”是指其中在监测和控制的环境和操作条件(例如pH、温度、压力、营养物供应和废物去除)下发生生物和/或生物化学过程的任何装置。根据本发明的一个实施方案，适用于本发明的生物反应器的基本类型的生物反应器包括静态生物反应器、搅拌式烧瓶生物反应器、旋转壁生物反应器、中空纤维生物反应器和直接灌注生物反应器。
根据一个具体实施方案，在粘附表面上培养(即扩增)细胞。
下文中提供这样的表面的实例。
1. 层粘连蛋白/纤连蛋白包被的板。纤连蛋白的来源：Sigma Aldrich牛纤连蛋白F1141或人纤连蛋白Millipore FC010。层粘连蛋白的来源：Sigma Aldrich Ewing肉瘤衍生的层粘连蛋白L2020，人Biolaminin 511或人Biolaminin 511(Biolamina INC)。例如，可以通过将层粘连蛋白和纤连蛋白以2μg/ml的终浓度混合，并在37℃下将板孔包被至少2小时以获得层粘连蛋白/纤连蛋白包被的板来制备这样的表面。
2. 细胞可以在明胶和玻连蛋白包被的板(例如，0.2％明胶和1μg/ ml玻连蛋白包被的板)上扩增。例如，可以通过将明胶溶液与玻连蛋白混合并使用混合物在37℃下包被孔至少1小时来制备这样的表面。应当注意，包被的板可以在37℃下放置长达4天，并且仍然可以用于细胞。
3. 细胞可以在包被有0.2％明胶/辐照的小鼠或人成纤维细胞饲养细胞的板上扩增。
4. 人幼稚细胞可以在仅用0.2％明胶包被的板包被的板上扩增。
5. 人幼稚细胞可以在仅用Matrigel或geltrex (BD Biosciences)包被的板上扩增。例如，这样的表面可以通过将板与MatrigelRTM (Corning Life Sciences)溶液在37℃下培育1小时来制备。
本申请中描述的培养基可以用于多种目的。
根据一个具体实施方案，培养基用于扩增(即，增加细胞数)细胞，例如扩增幼稚PSC。
应注意，培养幼稚PSC涉及每24-48小时将培养基用“新鲜”培养基(具有相同组成)更换，并每3-5天将各培养皿(例如板)传代至2或3个培养皿(例如板)。因此，当培养中的细胞达到约60-90%汇合度时，弃去上清液，洗涤培养皿[例如用磷酸缓冲盐水(PBS)]，并且使用例如胰蛋白酶消化(0.25%或0.05%胰蛋白酶 + EDTA)，从培养皿酶促分离细胞，直到例如单细胞或细胞块彼此分离。
应注意，由本发明人发现的培养条件使得能够维持人PSC诸如人iPSC处于幼稚PSC状态而无需Oct4、Sox2、Klf4和/或c-Myc因子的进一步外源表达。这与所有之前产生幼稚人PSC的尝试形成鲜明对比，之前的尝试需要Oct4、Sox2、Klf4和/或c-Myc因子的外源表达，当在撤出这些因子后，幼稚PSC自发地分化，不能维持未分化和多能干细胞(参见例如HannaJ，2010b)。
因此，根据另一个方面，本文所述的培养基用于产生幼稚多能干细胞。
更具体地，根据本发明的另一个方面，提供了产生幼稚多能干细胞(PSC)的方法，其包括：
在本文所述的培养基中的任一种中培育非幼稚PSC细胞，所述培养基允许从非幼稚PSC产生幼稚PSC，其中：
(i) 当幼稚PSC是雌性PSC时，则幼稚雌性PSC具有X染色体失活特异性转录因子(XIST)基因的启动子的两个未甲基化等位基因；和
(ii) 当幼稚PSC是雄性PSC时，则幼稚雄性PSC具有XIST基因的启动子的一个未甲基化等位基因；和/或
幼稚PSC中的转录因子E3(TFE3)的表达水平的特征在于如通过免疫染色测定法确定的等于或高于1的细胞核与细胞质表达比率；和/或
幼稚PSC的特征在于幼稚PSC的细胞表面上的C-KIT (CD117) 的阳性表达，
由此产生幼稚PSC。
因此，本发明的幼稚PSC的特征在于幼稚状态。这例如在图17A-E和图22A-B中证明，其显示所有测试的培养基都能够保留表征幼稚PSC的独特的前-X失活状态。因此，图17A-E显示了如XIST启动子(SEQ ID NO:70中所示的扩增子)中确定的这种非甲基化等位基因的实例。这些结果结论性地证明，在所有测试的培养基上培养的雄性和雌性幼稚hESCs/iPSC在各种WIS-NHSM条件下保持独特的前-X失活状态。
相比之下，图17F和22C显示了非幼稚细胞的实例，其中雄性细胞中的XIST基因的启动子被完全甲基化(即，XIST启动子中的大多数CpG位点被甲基化)，并且XIST基因的启动子的一个等位基因在雌性细胞中被甲基化。
如上所述，本发明的一些实施方案的幼稚PSC的特征在于转录因子E3(TFE3)的独特表达水平。因此，所述幼稚PSC中的TFE3的表达水平的特征在于如通过免疫染色测定法所确定的等于或高于1的细胞核与细胞质表达比率。
随后的实施例部分的实施例5中的表1显示，所有测试的培养基都能够将幼稚PSC维持在幼稚状态下，其特征在于细胞核和细胞质TFE3富集之间高于1的比率。
如上所述，并且如图25A-C中所示，本发明的一些实施方案的幼稚PSC的特征在于C-KIT蛋白(也称为CD117)的PSC的细胞表面上的阳性表达。应当注意，致敏的PSC完全不表达C-KIT，更不用说在细胞的细胞表面上。图25A-C中所示的结果支持C-KIT是人幼稚、但未致敏的PSC的新标志物的结论。
C-KIT，原癌基因c-kit的人同源物，首先被鉴定为猫肉瘤病毒致癌基因v-kit的细胞同源物。该蛋白是MGF(肥大细胞生长因子，也称为“干细胞因子”)的3型跨膜受体。C-KIT蛋白的序列提供于GenBank登录号NP_000213.1(同种型1前体的SEQ ID NO:202)和NP_001087241.1(同种型2前体的SEQ ID NO:203)。
可以通过任何免疫染色测定法，诸如使用流式细胞术(例如，FACS分析)和/或通过免疫荧光技术，例如使用荧光显微镜，和/或通过放射性标记的抗体，确定幼稚PSC细胞上的C-KIT的表达。
用于从非幼稚多能干细胞产生幼稚多能干细胞的示例性培养基包括：
1. 包含KO-DMEM, N2补充剂、B27补充剂、LIF、ERK1/2抑制剂、GSK3b抑制剂、p38抑制剂和SRC抑制剂的培养基；
2. 包含DMEM-F12/ NEURObasal (GIBCO) 1:1混合物、N2补充剂、B27补充剂、LIF、ERK1/2抑制剂、GSK3b抑制剂、p38抑制剂和SRC抑制剂的培养基；或
3. 包含DMEM-F12、N2补充剂、B27补充剂、LIF、ERK1/2抑制剂、GSK3b抑制剂、p38抑制剂和SRC抑制剂的培养基。
4. 包含KO-DMEM、N2补充剂(Gibco)、B27补充剂、LIF、ERK1/2抑制剂、PKC抑制剂和轴蛋白稳定剂的培养基。
5. 包含DMEM-F12/ NEURObasal (GIBCO) 1:1混合物、N2补充剂(Gibco)、B27补充剂(GIBCO)、LIF (STAT3激活剂)、ERK1/2抑制剂、PKC抑制剂和轴蛋白稳定剂的培养基。
6. 包含DMEM-F12、N2补充剂(Gibco)、B27补充剂、LIF (STAT3激活剂)、ERK1/2抑制剂、PKC抑制剂和轴蛋白稳定剂的培养基。
7. 包含KO-DMEM、N2补充剂(Gibco)、B27补充剂、LIF、ERK1/2抑制剂、GSK3b抑制剂、PKC抑制剂和轴蛋白稳定剂的培养基。
8. 包含DMEM-F12/ NEURObasal (GIBCO) 1:1混合物、N2补充剂(Gibco)、B27补充剂(GIBCO)、LIF (STAT3激活剂)、ERK1/2抑制剂、GSK3b抑制剂、PKC抑制剂和轴蛋白稳定剂的培养基。
9. 包含DMEM-F12、N2补充剂(Gibco)、B27补充剂、LIF (STAT3激活剂)、ERK1/2抑制剂、GSK3b抑制剂、PKC抑制剂和轴蛋白稳定剂的培养基。
10. 包含a STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂和轴蛋白稳定剂的培养基。
11. 包含a STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、轴蛋白稳定剂和PKC抑制剂的培养基。
12. 包含a STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、轴蛋白稳定剂、PKC抑制剂和GSK3b抑制剂的培养基。
13. 包含ERK1/2抑制剂、STAT3激活剂和SRC抑制剂的培养基。
14. 包含ERK1/2抑制剂、STAT3激活剂、SRC抑制剂和轴蛋白复合物稳定剂(AXINs)的培养基。
15. 包含ERK1/2抑制剂、STAT3激活剂、SRC抑制剂、轴蛋白复合物稳定剂(AXINs)和GSK3β抑制剂的培养基。
16. 包含ERK1/2抑制剂、STAT3激活剂、SRC抑制剂、轴蛋白复合物稳定剂(AXINs)、GSK3β抑制剂和p38抑制剂的培养基。
17. 包含ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、p38抑制剂、STAT3激活剂和至少一种选自SRC抑制剂和轴蛋白复合物稳定剂(AXINs)的试剂的培养基。
18. 包含ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、p38抑制剂、JNK抑制剂、STAT3激活剂、转化生长因子β受体(TGFβR)抑制剂、PKC抑制剂、p38抑制剂和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的培养基。
19. 下面实施例部分中的实施例1(培养基1-40)、实施例5(培养基41-131)和实施例6(培养基132-147)中描述的任何培养基。
根据本发明的一些实施方案，在没有饲养细胞的培养条件下，即在无饲养层条件下(例如，在Matrigel、层粘连蛋白和/或纤连蛋白-包被表面上)进行培养基中培育非幼稚PSC细胞。
根据本发明的一些实施方案，在培养条件下进行培养基中培养非幼稚PSC细胞，其包括在支持多能干细胞的生长的饲养细胞诸如成纤维细胞[例如，小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)]上培养。
根据本发明的一些实施方案，其中当非幼稚PSC衍生自体细胞时，则所述方法还包括使体细胞经历去分化条件，从而获得诱导多能干细胞。
根据本发明的一些实施方案，去分化条件包括在体细胞内外源表达选自以下的至少两种，例如至少三种、至少四种或更多种生长因子：OCT4 [GenBank登录号NP_002692.2(SEQ ID NO:54)和NM_002701.4 (SEQ ID NO:55)]，SOX2 [GenBank登录号NP_003097.1(SEQ ID NO:56)和NM_003106.3 (SEQ ID NO:57)]，KLF4 [GenBank登录号NP_004226.3(SEQ ID NO:58)和NM_004235.4 (SEQ ID NO:59)]，c-Myc [GenBank登录号NP_002458.2(SEQ ID NO:60)，和NM_002467.4 (SEQ ID NO:61)]，ESRRB***相关受体βGenBank登录号NM_004452.3 ( SEQ ID NO：124)和NP_004443.3 (SEQ ID NO:125)，Kruppel样受体2，KLF2，[GenBank登录号：NP_057354.1 (SEQ ID NO:126)和NM_016270.2 (SEQ ID NO:127)]TBX3 [GenBank登录号：NP_005987.3 NP_057653.3 (SEQ ID NO:128和129) _NM_005996.3NM_016569.3 (SEQ ID NO:130和SEQ ID NO:131)]，ERAS [GenBank登录号：NP_853510.1(SEQ ID NO:132)和NM_181532.3 (SEQ ID NO:133)和Kruppel-样受体17，KLF17 [GenBank登录号：NP_775755.3 (SEQ ID NO:154)和NM_173484.3 (SEQ ID NO:155，编码KLF17蛋白的转录物)]。
如本文所使用，短语“外源表达”是指可不在细胞内天然表达或需要在细胞中过表达的异源核酸序列的表达。可以稳定或瞬时方式将外源多核苷酸导入细胞，使得产生核糖核酸(RNA)分子和/或多肽分子。应注意，外源多核苷酸可包括与细胞的内源核酸序列相同或部分同源的核酸序列。
根据本发明的又另一个方面，提供了改善从体细胞产生诱导多能干细胞(iPSC)的方法，其包括：
(a) 在体细胞内表达选自Nanog、ESRRB、KLF2、TBX3、ERAS和KLF17的第一因子和选自Nanog、ESRRB、KLF2、TBX3、ERAS、Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc和KLF17的第二因子，其中第一和第二生长因子是不同的；和
(b) 抑制体细胞中的Mbd3和/或Gatad2a表达和/或活性，由此改善从体细胞产生iPSC。
根据本发明的一些实施方案，使用所述因子的DNA转染进行表达所述因子。
DNA转染至哺乳动物细胞中的方法是本领域已知的，并且包括参考文献(Mansour等，2012)中描述的方法，其通过引用以其整体并入本文。下文提供了制备表达载体和将其施用于细胞中的方式的进一步描述。
根据本发明的一些实施方案，使用生长因子的RNA转染进行生长因子的表达。
RNA转染于哺乳动物细胞中的方法是本领域已知的，包括例如参考文献中描述的方法(Warren等，2010)，其通过引用以其整体并入本文。
一旦获得，则将细胞在培养基(例如，本文上面公开的那些)中培养并连续传代。
根据本发明的一些实施方案，在培养中，因子的外源表达进行一段有限的时间，诸如不超过10天，例如不超过1次传代。
根据本发明的一些实施方案，一旦幼稚iPSC从体细胞中产生，则在没有通过幼稚iPSC的Nanog、ESRRB、KLF2、TBX3、ERAS Oct4、Sox2、Klf4c-Myc因子的外源表达且未将分离的Nanog、ESRRB、KLF2、TBX3、ERAS Oct4、Sox2、Klf4c-Myc因子加入培养基的情况下，将其在本发明的一些实施方案的培养基(例如WIS-NHSM培养基)中培养。
如本文所使用，短语“分离的…因子”是指可在宿主细胞(例如细菌)中自表达载体重组表达、经生化合成或从生物样品(例如血清或细胞)分离的因子。
与使用Nanog、ESRRB、KLF2、TBX3、ERAS Oct4、Sox2、Klf4c-Myc因子在体细胞中表达而无Mbd3表达进一步抑制而从体细胞产生iPSC(例如，使用本文上面公开的培养基)相比，本发明的一些实施方案的方法可用来改善iPSC从体细胞中的产生。
例如，当使用人体细胞时，可以使用包含白血病抑制因子(LIF)、ERK1/2抑制剂、GSK3b抑制剂、p38抑制剂、JNK抑制剂、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子-β1(TGFβ1)和MBD3抑制剂和任选还有ROCK抑制剂的培养基实施该方法。与当在体细胞中使用DNA转染而不进一步抑制Mbd3表达的表达Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc时获得的iPSC的产量相比，在使用生长因子(例如Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的至少两种)的DNA转染对体细胞进行去分化时，则该方法产生至少约30%、例如至少约40%、至少约50%、例如至少约60%、至少约70%、例如至少约80%、至少约90%、例如至少约95%、至少约99%、例如100%更多的iPSC。
例如，当使用人体细胞时，可以使用包含白血病抑制因子(LIF)、ERK1/2抑制剂、GSK3b抑制剂、p38抑制剂、JNK抑制剂、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子-β1(TGFβ1)和MBD3抑制剂和任选还有ROCK抑制剂的培养基，实施该方法。与当在体细胞使用RNA转染而不进一步抑制Mbd3表达的表达Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc时获得的iPSC的产量相比，当使用生长因子(例如Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的至少两种)的RNA转染对体细胞进行去分化时，则该方法产生至少约5%、例如至少约10%、至少约20%、例如至少约30%、至少约40%、例如至少约50%、至少约60%、例如至少约75%、至少约99%、例如100%更多的iPSC。此外，虽然现有技术方法(无MBD3抑制且无本发明的一些实施方案的培养基)采用10-20轮RNA转染以实现人体细胞的去分化，但本发明的一些实施方案的方法采用1-4轮RNA转染以实现人体细胞的去分化，因此远更有效和较少耗时。
本发明人已发现，多能干细胞中ERAS的过表达或内源人ERAS的活化可用于诱导多能干细胞的幼稚状态。
根据本发明的一些实施方案，所述方法还包括外源表达ES细胞表达的Ras (ERAS)编码序列(例如SEQ ID NO:109)或激活体细胞中ERAS的内源表达。
根据本发明的一些实施方案，通过除去内源ERAS基因(SEQ ID NO:108)的成熟前多腺苷酸化位点，例如Kameda等，Stem Cells 2005;23:1535-1540 (其完全全文通过引用并入本文)图3中例如A-1、A2或A-3加框序列，进行激活ER的内源表达。
根据本发明的一些实施方案，表达进行至少48小时，使得抑制Mbd3达到表达前Mbd3的水平的10-30%。
根据本发明的一些实施方案，表达进行约48小时，而抑制在约48小时进行。
应注意，当在48小时后进行Mbd3的抑制时，抑制可具有MBD3活性的表达水平的100%。
根据本发明的一些实施方案，iPSC是鼠iPSC。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供产生分化细胞的方法，所述方法包括使根据本发明的一些实施方案的方法产生的幼稚多能干细胞或根据本发明的一些实施方案的方法产生的iPSC经历分化条件，从而产生分化细胞。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的幼稚PSC或iPSC可用于产生谱系特异性细胞。
如本文所使用，短语“产生谱系特异性细胞”是指培养中的细胞与主要显示与特定谱系表型关于的至少一个特征的细胞的混合群的富集。应理解，所有细胞谱系均来源于三个胚层。因此，例如，肝细胞和胰腺细胞来源于胚胎的内胚层；骨组织、软骨组织、有弹性的纤维性***、yachts、心肌细胞、骨髓细胞、血管细胞(即内皮和平滑肌细胞)和造血细胞自胚胎的中胚层分化；神经、视网膜和表皮细胞来源于胚胎的外胚层。
可通过将扩增的未分化幼稚PSC直接引入适于特定细胞谱系分化的培养条件中，来获得谱系特异性细胞。
以下是用于诱导EB至谱系特异性细胞的分化的多个程序和方法的非限制性描述。应当理解，本发明考虑用于本文所述的细胞的离体分化的额外方案，其不通过产生EB起作用。
神经前体细胞
为了使本发明的一些实施方案的EB分化成神经前体细胞，使4日龄EB在包括含5 mg/ml胰岛素、50 mg/ml转铁蛋白、30 nM氯化硒和5 mg/ml纤连蛋白的DMEM/F-12培养基的组织培养皿中培养5-12天(Its medium, Okabe, S.等, 1996, Mech. Dev. 59：89-102)。可进一步移植所得的神经前体细胞以体内产生神经细胞(Bristle, O.等, 1997. In vitro-generated neural precursors participate in mammalian brain development. Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 94：14809-14814)。应理解，在其移植前，将神经前体细胞胰蛋白酶消化，并在0.1% DNA酶存在的情况下研磨成单细胞悬液。
少突胶质细胞和髓鞘细胞
通过在改良的SATO培养基，即含牛血清白蛋白(BSA)、丙酮酸盐、孕酮、腐胺、甲状腺素、三碘甲状腺原氨酸、胰岛素、转铁蛋白、***钠、氨基酸、神经营养蛋白3、睫状神经营养因子和Hepes的DMEM中培养细胞，本发明的一些实施方案的EB可分化成少突胶质细胞和髓鞘细胞(Bottenstein, J. E.和Sato, G. H., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76,514-517；Raff, M. C., Miller, R. H.和Noble, M., 1983, Nature 303：390-396]。简言之，使用0.25%胰蛋白酶/EDTA (在37℃下5分钟)将EB解离，并研磨成单细胞悬液。将悬浮的细胞接种到含有补充5%马血清和5%胎牛血清(FCS)的SATO培养基的培养瓶中。在培养4天后，轻轻摇动烧瓶以使贴壁细胞(主要为少突胶质细胞)松散悬浮，同时星形细胞仍保持粘附在培养瓶上，进一步产生条件培养基。将原生少突胶质细胞转移到含有SATO培养基的新的培养瓶中再过2天。在培养共6天后，使寡球体(oligosphere)部分解离并重新悬浮于SATO培养基中用于细胞移植，或完全解离并接种在来源于之前的摇动步骤的寡球体条件培养基中[Liu, S.等(2000). Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytesand myelinate in culture and after spinal cord transplantation. Proc. Natl.Acad. Sci. USA. 97：6126-6131]。
肥大细胞
对于肥大细胞分化，将本发明的一些实施方案的2周龄EB转移到包括补充10% FCS、2mM L-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素、100 mg/ml链霉素、20% (v/v) WEHI-3细胞条件培养基和50 ng/ml重组大鼠干细胞因子(rrSCF, Tsai, M.等, 2000. In vivo immunologicalfunction of mast cells derived from embryonic stem cells：An approach for therapid analysis of even embryonic lethal mutations in adult mice in vivo .Proc Natl Acad Sci USA. 97：9186-9190)的DMEM培养基的组织培养皿中。每周通过将细胞转移到新的培养瓶中并更换一半培养基来扩增培养物。
血液淋巴细胞
为了从本发明的一些实施方案的EB中产生血液淋巴细胞，使用具有可调节氧含量的培养箱，将2-3日龄EB转移到7.5% CO2和5% O2存在下的可透气培养皿中。在分化15天后，通过用胶原酶(0.1单位/mg)和分散酶(0.8单位/mg)温和消化来收获并分离细胞，两种酶可获得自F. Hoffman-La Roche Ltd, Basel, Switzerland。如Potocnik, A.J.等(ImmunologyHemato-lymphoid in vivo reconstitution potential of subpopulations derivedfrom in vitro differentiated embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 1997, 94：10295-10300)中所述，使用抗CD45单克隆抗体(mAb) M1/9.3.4.HL.2和与山羊抗大鼠免疫球蛋白缀合的顺磁微珠(Miltenyi)，分离CD45-阳性细胞。可使用在MACS柱(Miltenyi)上的单次传代来进一步富集分离的CD45-阳性细胞。
应理解，由于EB是复杂结构，所以EB分化成特定的分化细胞、组织或器官可能需要从EB分离谱系特异性细胞。
可通过经由荧光激活细胞分选仪(FACS)分选EB的细胞或EB内所含的细胞、组织和/或组织样结构的机械分离来实现所述分离。
通过FACS分析分离EB衍生的分化细胞的方法是本领域已知的。根据一种方法，使用胰蛋白酶和EDTA (分别为0.025%和0.01%)的溶液分解EB，用含5%胎牛血清(FBS)的磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤，在冰上与荧光标记的针对特定细胞谱系特有的细胞表面抗原的抗体一起培育30分钟。例如，如Levenberg, S.等(Endothelial cells derived from humanembryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. 99：4391-4396)中所述，通过连接针对血小板内皮细胞粘附分子-1 (PECAM1)的抗体，诸如可获得自PharMingen荧光标记的PECAM1抗体(30884X) (PharMingen，Becton Dickinson Bio Sciences，SanJose，CA，USA)，来分离内皮细胞。使用荧光标记的抗体诸如CD34-FITC、CD45-PE、CD31-PE、CD38-PE、CD90-FITC、CD117-PE、CD15-FITC、I类-FITC、可获得自PharMingen的所述IgG1的全部、CD133/1-PE (IgG1) (可获得自Miltenyi Biotec，Auburn，CA)和血型糖蛋白A-PE(IgG1) (可获得自Immunotech (Miami，FL))，来分离造血细胞。在FACScan (BectonDickinson Bio Sciences)中通过使用碘化丙锭以PC-LYSIS或CELLQUEST软件分析活的细胞(即未固定)以排除死细胞。应理解，可如Kaufman, D.S.等(Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 2001, 98：10716-10721)中所述，使用磁标记的第二抗体和磁分离柱(MACS，Miltenyi)，进一步富集分离细胞。
来自EB的搏动心肌细胞的机械分离的一个实例公开于Xu等的美国专利申请号20030022367。简言之，将本发明的一些实施方案的4日龄EB转移到明胶包被板或腔室载玻片上，并允许贴壁和分化。对从分化第8天观察到的自发收缩的细胞进行机械分离，收集进入含有低钙培养基或PBS的15-mL管中。根据胶原酶活性，使用胶原酶B在37℃下消化60-120分钟，解离细胞。然后将解离的细胞重新悬浮于分化KB培养基(缓冲至pH 7.2的85 mM KCI、30 mM K2HPO4、5 mM MgSO4、1 mM EGTA、5 mM肌酸、20 mM葡萄糖、2 mM Na2ATP、5 mM丙酮酸盐和20 mM牛磺酸，Maltsev等, Circ. Res. 75:233, 1994)中，并在37℃下培育15-30分钟。在解离后，将细胞接种到腔室载玻片上，在分化培养基中培养以产生能够搏动的单心肌细胞。
应理解，适于分离的谱系特异性细胞分化和扩增的培养条件包括各种组织培养基、生长因子、抗生素、氨基酸等，并且在本领域技术人员确定为了扩增和分化特定细胞类型和/或细胞谱系可应用的条件的能力范围内[综述于Fijnvandraat AC等, CardiovascRes. 2003；58：303-12；Sachinidis A等, Cardiovasc Res. 2003；58：278-91；StavridisMP和Smith AG, 2003；Biochem Soc Trans. 31(Pt 1)：45-9]。
除了谱系特异性原始培养以外，本发明的EB可用来产生能够在培养中无限扩增的谱系特异性细胞系。
可通过本领域已知方法，包括例如在细胞中表达端粒酶基因(Wei, W.等, 2003.Mol Cell Biol. 23：2859-2870)或将细胞与NIH 3T3 hph-HOX11逆转录病毒生产细胞一起共培养(Hawley, R.G.等, 1994. Oncogene 9：1-12)，通过使EB衍生细胞永生化，来产生本发明的一些实施方案的细胞系。
下面是适于从本发明的一些实施方案的幼稚PSC或iPSC分化和/或扩增谱系特异性细胞的培养条件的非限制性实例。应注意，对于诱导幼稚PSC或iPSC分化成分化细胞，用于维持细胞处于幼稚未分化的多能状态的培养基应用合适的分化培养基更换。
基本上如Trivedi P和Hematti P. Exp Hematol. 2008, 36(3):350-9中所述，可通过机械增加幼稚hPSC在培养物中形成的成纤维细胞样分化细胞的部分，从幼稚PSC产生作为CD73-阳性和SSEA-4-阴性的间充质基质细胞。简言之，为了诱导hESC分化，将培养基改变之间的间隔延长至3-5天，且在幼稚PSC集落周围的细胞变成梭形成纤维细胞样细胞。在这些条件下9-10天后，当约40-50%的培养中的细胞获得成纤维细胞样外观，以物理方法除去幼稚PSC集落的未分化部分，使其余的分化细胞在相同条件下在新的培养板上传代。
为了诱导幼稚hPSC分化成多巴胺能(DA)神经元，可将细胞可与小鼠基质细胞系PA6或MS5一起共培养，或与基质细胞衍生因子1 (SDF-1/CXCL12)、多效营养因子(PTN)、***2 (IGF2)和肝配蛋白B1 (EFNB1)的组合一起培养，基本上按Vazin T等,PLoS One. 2009 Aug 12;4(8):e6606；以及Elkabetz Y.等, Genes Dev. 2008 January15；22：152-165所述。
为了产生中脑多巴胺(mesDA)神经元，可对幼稚hPSC进行遗传修饰以表达转录因子Lmx1a (例如使用含PGK启动子和Lmx1a的慢病毒载体)，基本上如Friling S.等, ProcNatl Acad Sci U S A. 2009, 106：7613-7618中所述。
为了从幼稚hPSC产生肺上皮细胞(II型肺细胞)，可在市售细胞培养基(SmallAirway Growth Medium；Cambrex，College Park，MD)存在下，或可替代地，在自肺细胞细胞系(例如549人肺腺癌细胞系)收获的条件培养基存在下，培养幼稚PSC，如Rippon HJ.等,Proc Am Thorac Soc. 2008；5：717-722中所述。
为了将幼稚hPSC细胞分化成神经细胞，可在补充TGF-b抑制剂(SB431542，Tocris；例如10 nM)和Noggin (R&D；例如500 ng/ml)的血清替代培养基存在下，将多能干细胞培养约5天，之后在500 ng/mL Noggin存在下，将细胞用增量(例如25%、50%、75%，每两天更换)的N2培养基(Li XJ.等, Nat Biotechnol. 2005, 23:215-211)培养，基本如Chambers SM.等, Nat Biotechnol. 2009, 27：275-280中所述。
本发明根据其一些实施方案，考虑采用本领域已知的任何分化方案，使用从本发明的幼稚多能干细胞产生的细胞、组织和器官。
应理解，因为根据本发明的一些实施方案的教导获得的谱系特异性细胞或细胞系通过类似于人胚胎中天然存在的分化过程发育，所以它们可进一步用于基于人细胞的疗法和组织再生。
因此，根据其一些实施方案，本发明预期使用扩增和/或分化的谱系特异性细胞或本发明的一些实施方案的细胞系用于治疗需要细胞替代疗法的病症。
例如，目前预期通过PSC或PSC衍生细胞的治疗性移植可治疗的疾病包括帕金森病、心脏梗塞、幼年型糖尿病和白血病(Gearhart J. Science 1998, 282:1061；Rossant和Nagy, Nature Biotech. 1999, 17:23)。
例如，少突胶质细胞前体可用于治疗髓鞘病症(Repair of myelin disease：Strategies and progress in animal models. Molecular Medicine Today. 1997. 第554-561页)，软骨细胞或间充质细胞可用于治疗骨和软骨缺陷(美国专利号4,642,120)，且上皮谱系的细胞可用于伤口或烧伤的皮肤再生(美国专利号5,716,411)。
对于某些病症，诸如其中缺失特定基因产物的遗传紊乱[例如囊性纤维化患者中CFTR基因产物的缺乏(Davies JC, 2002. New therapeutic approaches for cysticfibrosis lung disease. J. R. Soc. Med. 95 Suppl 41:58-67)]，优选在将其施用于个体之前对PSC衍生细胞进行操作以过表达突变基因。应理解，对于其它病症，应操作PSC衍生细胞以排除某些基因。
可使用敲入和/或敲除构建体，实现基因的过表达或排除[参见例如Fukushige,S. 和Ikeda, J. E.: Trapping of mammalian promoters by Cre-lox site-specificrecombination. DNA Res 3 (1996) 73-50; Bedell, M. A., Jerkins, N. A.和Copeland, N. G.: Mouse models of human disease. Part I: Techniques andresources for genetic analysis in mice. Genes and Development 11 (1997) 1-11;Bermingham, J. J., Scherer, S. S., O'Connell, S., Arroyo, E., Kalla, K. A.,Powell, F. L.和Rosenfeld, M. G.: Tst-1/Oct-6/SCIP regulates a unique step inperipheral myelination and is required for normal respiration. Genes Dev 10(1996) 1751-62]。
除了细胞替代疗法外，本发明的一些实施方案的谱系特异性细胞还可用于制备cDNA文库。mRNA通过标准技术自谱系特异性细胞制备，并进一步逆转录形成cDNA。可通过本领域已知技术，将cDNA制备物减去来自胚胎成纤维细胞和不需要的特异性的其它细胞的核苷酸，以产生消减cDNA文库。
本发明的一些实施方案的谱系特异性细胞可用于筛选影响谱系前体分化成最终的分化细胞的因子(诸如小分子药物、肽、多核苷酸等)或条件(诸如培养条件或操作)。例如，可通过将其加入培养基中，来测试影响生长的物质、毒素或可能的分化因子。
如本文所述产生的幼稚多能干细胞可以用作用于产生原始细胞的起始材料。
因此，根据本发明的一些实施方案的另一个方面，提供产生原始生殖细胞的方法，所述方法包括在所选择的能够将灵长类动物幼稚多能干细胞诱导成为原始生殖细胞的培养基中培养灵长类动物幼稚多能干细胞。
根据一个具体实施方案中，培养基包含Rho激酶(ROCK)抑制剂和骨形态发生蛋白4(BMP4)。
根据本发明的一些实施方案，灵长类动物幼稚多能干细胞包含：
未甲基化X-染色体失活特异性转录物(XIST)基因，其中：
(i) 当幼稚PSC是雌性PSC时，则幼稚雌性PSC具有XIST基因的启动子的两个未甲基化等位基因；和
(ii) 当幼稚PSC是雄性PSC时，则幼稚雄性PSC具有XIST基因的启动子的一个未甲基化等位基因；和/或
特征在于核与胞质表达比等于或高于1的转录因子E3 (TFE3)的表达水平，如通过免疫染色测定法确定。
根据本发明的一些实施方案，原始生殖细胞的特征在于CD61 (整联蛋白β3)阳性表达模式。
根据本发明的一些实施方案，原始生殖细胞的特征在于CD61+/SSEA4+表达模式(表达签名)。
根据本发明的一些实施方案，所选择的能够将灵长类动物幼稚多能干细胞诱导成为原始生殖细胞的培养基还包含选自以下的至少一种试剂：白血病抑制因子(LIF)、干细胞因子(SCF)和表皮生长因子(EGF)。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供包含根据本发明的一些实施方案的方法产生的灵长类动物原始生殖细胞的分离的灵长类动物原始生殖细胞群。
根据本发明的一些实施方案，分离的灵长类动物原始生殖细胞群包含至少约50%、例如至少约60%、例如至少约70%、例如至少约80%、例如至少约90%、例如至少约95%、例如至少约99%、例如100%的特征在于CD61+/SSEA4+表达模式的原始生殖细胞。
应注意，可将本发明的一些实施方案的分离的原始生殖细胞(PGC)注射到成年人睾丸或卵巢中以完成其成熟，并产生***或卵。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括将本发明的一些实施方案的原始生殖细胞施用于受试者的性腺组织，从而治疗有需要的受试者。
术语“受试者”是指动物，例如灵长类动物，优选患病的任何年龄的人。
术语“治疗”是指抑制、预防或停止病理(疾病、病症或病况)的发展和/或引起病理的减轻、缓解或消退。本领域技术人员应理解，不同的方法和测定法可用于评价病理的发展，类似地，不同的方法和测定法可用于评价病理的减轻、缓解或消退。
根据本发明的一些实施方案，受试者患有不育症。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供包含本发明的一些实施方案的灵长类动物原始生殖细胞和用于治疗不育症的药物的试剂盒。
试剂盒还可包括合适的缓冲剂和防腐剂用于改善试剂盒的保质期。
试剂盒可包括表明FDA批准用于治疗受试者，诸如治疗受试者的不育症的合适的使用说明书和标签。
可以使用本发明的一些实施方案的分离的幼稚PSC用于产生嵌合人-小鼠生物，并促进体内小鼠胚胎的发育，基本上如别处所述(Gafni等，Nature 2013；Dec 12;504(7479):282-6. doi：10.1038/nature12745. Epub 2013 Oct 30，其完全通过引用并入本文)。
本发明人已经发现，供体细胞的(例如，本发明的一些实施方案的分离的幼稚多能干细胞，致敏的PSC或本发明的一些实施方案的原始生殖细胞)的特定遗传修饰可以改善产生嵌合动物的效率。例如，选自C-MYC、N-MYC、L-MYC、EDAR(外胚层发育异常蛋白A受体)、MDM2和ERAS的致癌蛋白的过表达和/或选自P53和NFκB抑制剂α的肿瘤抑制蛋白的下调可以改善嵌合动物的产生。
因此，根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了分离的幼稚多能干细胞，其经遗传修饰以过表达选自C-MYC、N-MYC、L-MYC、EDAR(外胚层发育异常蛋白A受体)、MDM2和ERAS的致癌蛋白，和/或下调选自P53和NFκB抑制剂α的肿瘤抑制蛋白。
例如，如实施例8中所述和图24A中所示，本发明人能够通过将LIS 38 EGFP hTP53C2天然人iPS细胞(其用作人供体细胞)显微注射至小鼠桑椹胚(其用作宿主细胞)中来产生跨种嵌合人源化小鼠。
致癌蛋白的过表达可以通过上调细胞中的致癌蛋白的内源表达(例如，添加和/或替代启动子和/或增强子元件，和/或引入增加致癌基因的内源表达的分子，例如小分子)，和/或通过使用如下文进一步描述的核酸构建体(或表达载体)表达编码至少下文所述的致癌蛋白的功能部分的异源多核苷酸来进行。
如本文所使用，术语“C-MYC”(也称为MRTL；MYCC；c-Myc；bHLHe39)是指致癌蛋白，其为来自智人的v-myc禽类骨髓母细胞瘤病毒致癌基因同源物(Gene ID 4609)，例如，由GenBank登录号NP_002458.2 (SEQ ID NO:204)所示的蛋白。c-MYC的过表达可以通过表达包含由GenBank登录号NG_007161.1 (SEQ ID NO:213)所述的核酸序列或其功能部分、例如编码GenBank登录号NP_002458.2 (SEQ ID NO:204)的氨基酸1-454的核酸序列的异源多核苷酸来进行。
如本文所使用，术语“N-MYC”(也称为MYCN，NMYC；ODED；MODED；N-myc；bHLHe37)是指来自智人的致癌蛋白v-myc禽类骨髓母细胞瘤病毒致癌基因神经母细胞瘤衍生的同源物(Gene ID 4613)，例如，由GenBank登录号NP_001280157.1 (SEQ ID NO:205)所示的蛋白。N-MYC的过表达可以通过表达包含由GenBank登录号NG_007457.1 (SEQ ID NO:214)所述的核酸序列或其功能部分、例如编码GenBank登录号NP_001280157.1 (SEQ ID NO:205)的氨基酸1-464的核酸序列的异源多核苷酸来进行。
如本文所使用，术语“L-MYC”(也称为LMYC；L-Myc；MYCL1；bHLHe38)是指来自智人的致癌蛋白v-myc禽类骨髓母细胞瘤病毒致癌基因肺癌衍生的同源物(Gene ID 4610)，例如，由NP_001028253.1同种型1 (SEQ ID NO:206)所示的蛋白。L-MYC的过表达可以通过表达包含由GenBank登录号NM_001033081.2 (SEQ ID NO:215)所示的核酸序列或其功能部分、例如编码GenBank登录号NP_001028253.1同种型1 (SEQ ID NO:206)的氨基酸1-365的核酸序列的异源多核苷酸来进行。
如本文所使用，术语“EDAR”(也称为DL；ED3；ED5；ED1R；EDA3；HRM1；EDA1R；ECTD10A；ECTD10B；EDA-A1R)是指来自智人的致癌蛋白外胚层发育异常蛋白A受体(Gene ID10913)，例如，由GenBank登录号NP_071731.1 (SEQ ID NO:207)所示的蛋白。EDAR的过表达可以通过表达包含由GenBank登录号NG_008257.1 (SEQ ID NO:216)所示的核酸序列或其功能部分、例如编码GenBank登录号NP_071731.1 (SEQ ID NO:207)的氨基酸1-484的核酸序列的异源多核苷酸来进行。
如本文所使用，术语“MDM2”(也称为HDMX；hdm2；ACTFS)是指来自智人的原癌基因E3泛素蛋白连接酶(Gene ID 4193；GenBank:GQ848196.1)，例如，由GenBank登录号ACX31156.1 (SEQ ID NO:208)所示的蛋白。MDM2的过表达可以通过表达包含由GenBank登录号GQ848196.1 (SEQ ID NO:217)所示的核酸序列或其功能部分、例如编码GenBank登录号ACX31156.1 (SEQ ID NO:208)的氨基酸1-466的核酸序列的异源多核苷酸来进行。
如本文所使用，术语“ERAS”(也称为HRAS2；HRASP)是指来自智人的ES细胞表达的Ras(Gene ID 3266)，例如，由GenBank登录号NP_853510.1 (SEQ ID NO:209)所示的蛋白。ERAS的过表达可以通过表达包含由GenBank登录号NM_181532.3 (SEQ ID NO:218)所示的核酸序列或其功能部分、例如编码GenBank登录号NP_853510.1 (SEQ ID NO:209)的氨基酸1-233的核酸序列的异源多核苷酸来进行。
肿瘤抑制蛋白的下调可以通过各种模式来实现。
如本文所使用，术语“P53”(也称为TP53；BCC7；LFS1；TRP53)是指肿瘤蛋白P53(Gene ID:7157)，诸如GenBank登录号BAC16799.1 (SEQ ID NO:210)所示的蛋白。
如本文所使用，术语“NFκB抑制剂α”(NFKBIA，也称为IKBA；MAD-3；NFKBI)是指来自智人的B-细胞抑制剂α中的κ轻多肽基因增强子的核因子(Gene ID:4792)，例如，GenBank登录号NP_065390.1 (SEQ ID NO:211)所示的蛋白。
可以使用干扰转录和/或翻译的多种分子[例如，RNA沉默剂(例如，反义、siRNA、shRNA、微RNA)、核酶和DNA酶或使用显性失活突变体]在基因组和/或转录物水平上实现本发明的一些实施方案的肿瘤抑制蛋白(例如，P53和/或NFκB抑制剂α)的下调。应当注意，下调可以是蛋白产生的完全不存在和/或蛋白活性的完全抑制，或者其可以是蛋白生产和/或活性的部分抑制。此外，应当注意，下调可以是永久的或短暂的，这取决于下调发生的细胞和下调的目的，和/或肿瘤抑制蛋白下调对细胞或产生的嵌合动物的作用。下文提供了下调剂的描述。
P53显性失活突变体被描述为突变小鼠或人p53蛋白，其通过与野生型小鼠或人p53形成混合四聚体，并因此减少p53与其靶基因中的p53-反应性元件的结合而以显性失活方式抑制内源性p53活性(描述于de Vries等, 2002. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.99(5):2948-53；Willis等, 2004 (Oncogene 23, 2330–2338，其各自通过引用以其整体并入本文)。
可以用于下调本发明的一些实施方案的细胞中的P53的P53显性失活突变体的非限制性实例包括：
A). GenBank:AAA39883.1 (SEQ ID NO:212)所示的小鼠P53蛋白中的R172H显性失活突变体，其基本上如de Vries等, 2002 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99(5):2948-53)；Willis等, 2004 (Oncogene, 23, 2330–2338)中所述。应当注意，根据用于遗传突变的公认命名法，“R172H”是指在GenBank:AAA39883.1 (SEQ ID NO:212)中所述的序列的位置172处的“R”氨基酸(即，精氨酸)被“H”氨基酸(即，组氨酸)取代。
B). GenBank登录号BAC16799.1 (SEQ ID NO:210)所示的人P53蛋白中的R175H、G245S、R248W、R249S、R273H或R282W显性失活突变体，基本上描述于Petitjean等, HumMutat. 2007 Jun;28(6):622-9.” Impact of mutant p53 functional properties onTP53 mutation patterns and tumor phenotype：lessons from recent developmentsin the IARC TP53 database“;和Freed-Pastor WA等, Genes Dev. 2012 Jun 15;26(12):1268-86. “Mutant p53：one name, many proteins”)，其各自完全其整体通过引用并入本文。
通过将S32和S36氨基酸残基两者改变为D(天冬氨酸-Asp)或E(谷氨酸-Glu)来制备用作癌基因并抑制P53功能的NF-κB抑制剂α的显性失活突变体(Zhou M.等, 2003.“Transfection of a dominant-negative mutant NF-kB inhibitor (IkBm) repressesp53-dependent apoptosis in acute lymphoblastic leukemia cells：interaction ofIkBm and p53.“ Oncogene. 22(50):8137-44)。
根据本发明的一些实施方案，可以用于下调本发明的一些实施方案的细胞中的NFκB抑制剂α的NFκB抑制剂α显性失活突变体包含SEQ ID NO:211中所示的人NF-κB抑制剂α蛋白中的S32D和S36D突变[意指位置32处的“S”(丝氨酸)氨基酸被“D”(天冬氨酸)氨基酸取代和位置36处的“S”氨基酸被“D”氨基酸取代]。
根据本发明的一些实施方案，可以用于下调本发明的一些实施方案的细胞中的NFκB抑制剂α的NFκB抑制剂α显性失活突变体包含SEQ ID NO:211中所示的人NF-κB抑制剂α蛋白中的S32E和S36E突变[意指位置32处的“S”(丝氨酸)氨基酸被“E”(谷氨酸)氨基酸取代和位置36处的“S”氨基酸被“E”氨基酸取代]。
根据本发明的一些实施方案，可以用于下调本发明的一些实施方案的细胞中的NFκB抑制剂α的NFκB抑制剂α显性失活突变体包含SEQ ID NO:211中所示的人NF-κB抑制剂α蛋白中的S32D和S36E突变[意指位置32处的“S”(丝氨酸)氨基酸被“D”(天冬氨酸)氨基酸取代和位置36处的“S”氨基酸被“E”(谷氨酸)取代]。
根据本发明的一些实施方案，可以用于下调本发明的一些实施方案的细胞中的NFκB抑制剂α的NFκB抑制剂α显性失活突变体包含SEQ ID NO:211中所示的人NF-κB抑制剂α蛋白中的S32E和S36D突变[意指位置32处的“S”(丝氨酸)氨基酸被“E”(谷氨酸)氨基酸取代和位置36处的“S”氨基酸被“D”氨基酸取代]。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的遗传修饰的分离的幼稚多能干细胞的特征在于如下：
其中
(i) 当所述幼稚PSC是雌性PSC时，则所述幼稚雌性PSC具有X染色体失活特异性转录因子(XIST)基因的启动子的两个未甲基化等位基因；和
(ii) 当所述幼稚PSC是雄性PSC时，则所述幼稚雄性PSC具有所述XIST基因的所述启动子的一个未甲基化等位基因，
和/或
所述幼稚PSC中的转录因子E3(TFE3)的表达水平的特征在于如通过免疫染色测定法确定的等于或高于1的细胞核与细胞质表达比率，
和/或
所述幼稚PSC的特征在于幼稚PSC的细胞表面上的C-KIT (CD117) 的阳性表达。
根据本发明的一些实施方案，所述遗传修饰的幼稚多能干细胞是灵长类动物细胞。
根据本发明的一些实施方案，所述遗传修饰的幼稚多能干细胞是人细胞。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了产生嵌合动物的方法，其包括将本发明的一些实施方案的分离的幼稚多能干细胞或本发明的一些实施方案的原始生殖细胞引入宿主动物的胚胎，由此产生嵌合动物。
根据本发明的一些实施方案，将用于产生嵌合动物的分离的幼稚多能干细胞遗传修饰，以过表达选自C-MYC、N-MYC、L-MYC、EDAR(外胚层发育异常蛋白A受体)、MDM2和ERAS的致癌蛋白，和/或下调选自P53和NFκB抑制剂α的肿瘤抑制蛋白。
如本文所使用，短语“嵌合动物”是指包含至少两个遗传不同的个体的细胞的动物。
注意，嵌合动物可以由属于两个不同物种或属于相同物种的两个不同个体的细胞组成。
根据本发明的一些实施方案，分离的幼稚多能干细胞或原始生殖细胞对于宿主动物是同种异体的。
如本文所使用，术语“同种异体的”是指相同物种的至少两个遗传不同的个体。
根据本发明的一些实施方案，分离的幼稚多能干细胞或原始生殖细胞对于宿主动物是异种的。
如本文所使用，术语“异种的”是指至少两个不同物种的个体。
根据本发明的一些实施方案，所述宿主动物是灵长类动物，例如哺乳动物。
根据本发明的一些实施方案，所述宿主动物是小鼠。
根据本发明的一些实施方案，所述宿主动物是猪。
根据本发明的一些实施方案，所述宿主动物是猴。
根据本发明的一些实施方案，所述宿主动物是黑猩猩。
根据本发明的一些实施方案，所述宿主动物不是人。
根据本发明的一些实施方案，所述胚胎是植入前胚胎。
如本文所使用，术语“植入前胚胎”是指处于8细胞期胚胎、16细胞期胚胎、早期桑椹胚、晚期桑椹胚、早期囊胚和/或晚期囊胚的胚胎。
应当注意，由于将分离的幼稚多能干细胞或原始生殖细胞引入植入前胚胎，它们可能形成正常胚胎。
根据本发明的一些实施方案，所述植入前胚胎包含至少4个细胞。
根据本发明的一些实施方案，所述植入前胚胎包含不多于128个细胞。
根据本发明的一些实施方案，将供体细胞引入宿主动物在体内进行。
将细胞体内施用于动物的桑葚胚的方法是本领域众所周知的，诸如Gafni O,Weinberger L, Mansour AA, Manor YS, Chomsky E, Ben-Yosef D, Kalma Y, ViukovS, Maza I, Zviran A, Rais Y, Shipony Z, Mukamel Z, Krupalnik V, Zerbib M,Geula S, Caspi I, Schneir D, Shwartz T, Gilad S, Amann-Zalcenstein D,Benjamin S, Amit I, Tanay A, Massarwa R, Novershtern N, Hanna JH. Nature.2013 Dec 12;504 (7479):282-6. doi：10.1038/nature12745. Epub 2013 Oct 30.；和Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual, Fourth Edition. By RichardBehringer；Marina Gertsenstein；Kristina Vintersten Nagy；Andras Nagy，其各自完全通过引用并入本文。
根据本发明的一些实施方案，将供体细胞(例如，本发明的一些实施方案的分离的幼稚多能干细胞或本发明的一些实施方案的原始生殖细胞)引入宿主动物的胚胎是通过将供体细胞显微注入宿主早期植入前胚胎来进行。
根据本发明的一些实施方案，所述桑椹胚包含至少4个细胞。
根据本发明的一些实施方案，所述桑椹胚包含不多于128个细胞。
根据本发明的一些实施方案，所述引入在体外或离体进行。
根据本发明的一些实施方案，通过直接注射或与正在发育的宿主胚胎的聚集在体外或离体进行引入细胞。
根据本发明的一些实施方案，将供体细胞(例如，本发明的一些实施方案的分离的幼稚多能干细胞或本发明的一些实施方案的原始生殖细胞)引入宿主动物的胚胎是通过供体细胞与宿主植入前胚胎聚集(例如，几个小时或过夜)来进行。
根据本发明的一些实施方案，所述方法还包括允许所述植入前胚胎离体或体内生长。
根据本发明的一些实施方案，所述方法还包括测试嵌合动物中的嵌合的水平。
一旦形成，嵌合动物中的嵌合的水平可以通过在宿主细胞内追踪供体细胞的各种方式来评估。这可以通过如下来实现：例如遗传修饰的供体细胞(在将其引入宿主动物之前)以表达可追踪标记(报告蛋白)，诸如以表达荧光蛋白[例如，红色荧光蛋白(RFP) (SEQID NO:222 (对于DNA)和SEQ ID NO:221 (对于蛋白))、绿色荧光蛋白(GFP) (SEQ ID NO:220 (对于DNA)和SEQ ID NO:219 (对于蛋白))等，其序列是众所周知的并且可通过NCBI网站(ncbi (.) nlm (.) nih (.) gov得到]，其可以使用荧光显微镜观察到。参见例如，本文的图24A-B。
如本文所使用，遗传修饰细胞以表达目标蛋白(例如，荧光蛋白)的方法是本领域已知的，并且在本文中进一步描述。
因此，可以容易地评估嵌合动物的产生效率。简言之，在将供体细胞引入宿主动物之后，可以使用荧光显微镜观察正在发育的胚胎，并且从注射的胚胎的总数中计数荧光标记的胚胎。
此外，在每个胚胎中，计数每个嵌合动物的供体细胞(例如，用GFP标记)的数目。
应当注意，使用具有下调的P53(由于显性失活P53)的本发明的一些实施方案的遗传修饰的幼稚PSC，本发明人能够以至少20％的成功率获得嵌合动物，其中每个嵌合动物内的供体细胞的平均百分比在约10％至约49％之间(图24A-B和未显示的数据)。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了包含本发明的一些实施方案的分离的遗传修饰的幼稚多能干细胞和培养基的细胞培养物。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基能够将所述多能干细胞在幼稚状态下维持至少5代，例如，至少约10、15、20、25、30、40、50、100、200、500、1000代，例如，3000代。
根据本发明的一些实施方案，本发明的细胞培养物中包括的培养基是本文所述的培养基中的任一种。
根据本发明的一些实施方案，本发明的细胞培养物中包括的培养基是本发明的一些实施方案的培养基。
根据本发明的一些实施方案，本发明的细胞培养物中包括的培养基是培养基1-147中的任一种。
根据本发明的一些实施方案，本发明的细胞培养物中包括的培养基是WO2014/174470中所述的培养基中的任一种，其通过引用全文完全并入本文。
根据本发明的一些实施方案，本发明的细胞培养物中包括的培养基包含ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、p38抑制剂、JNK抑制剂、STAT3激活剂和至少一种选自碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子β1 (TGFβ1)、蛋白激酶C (PKC)抑制剂、ROCK抑制剂和NOTCH抑制剂的试剂。
根据本发明的一些实施方案，本发明的细胞培养物中包括的培养基包含ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、p38抑制剂、JNK抑制剂、STAT3激活剂和至少一种选自转化生长因子受体(TGFR)抑制剂、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)抑制剂、蛋白激酶C (PKC)抑制剂、ROCK抑制剂和NOTCH抑制剂的试剂。
根据本发明的一些实施方案，所述STAT3激活剂选自白血病抑制因子(LIF)和白介素6 (IL6)。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含至少一种选自以下的额外试剂：***1 (IGF1)、***II (IGFII)、骨形态发生蛋白(BMP)信号传导抑制剂、Sonic Hedgehog通路(SHH)抑制剂、ERK5抑制剂、毛喉素、Kenpaullone、BayK8644、Bix01294和干细胞因子(SCF)。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含至少一种选自以下的额外试剂：***1 (IGF1)、***II (IGFII)、骨形态发生蛋白4 (BMP4)、Sonic Hedgehog通路(SHH)抑制剂、ERK5抑制剂、毛喉素、Kenpaullone、BayK8644、Bix01294和干细胞因子(SCF)。
根据本发明的一些实施方案，所述STAT3激活剂包含LIF，且其中所述至少一种试剂包含PKC抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述STAT3激活剂包含LIF，且其中所述至少一种试剂包含TGFβ1和蛋白激酶C抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含FGFR抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含TGFR抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述STAT3激活剂包含LIF，且其中所述至少一种试剂包含TGFβ1和蛋白激酶C抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含FGFR抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述STAT3激活剂包含LIF，且其中所述至少一种试剂包含bFGF和TGFβ1。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含ROCK抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含蛋白激酶C抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述STAT3激活剂包含LIF，且其中所述至少一种试剂包含bFGF、ROCK抑制剂、骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂、NOTCH抑制剂和转化生长因子受体(TGFR)抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含Sonic Hedgehog通路(SHH)抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述STAT3激活剂包含LIF，且其中所述至少一种试剂包含NOTCH抑制剂和成纤维细胞生长因子受体(FGFR)抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，所述培养基还包含选自***II(IGFII)、干细胞因子(SCF)和转化生长因子β1 (TGFβ1)的试剂。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了包含白血病抑制因子(LIF)、ERK1/2抑制剂、GSK3b抑制剂、p38抑制剂、JNK抑制剂和蛋白激酶C抑制剂的培养基。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基还包含FGFR抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基还包含TGFR抑制剂。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了包含白血病抑制因子(LIF)、ERK1/2抑制剂、GSK3b抑制剂、p38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1和蛋白激酶C抑制剂的培养基。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基还包含FGFR抑制剂。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了包含白血病抑制因子(LIF)、ERK1/2抑制剂、GSK3b抑制剂、p38抑制剂、JNK抑制剂、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子-β1 (TGFβ1)的培养基。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基还包含ROCK抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基还包含蛋白激酶C抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基还包含选自以下的因子：骨形态发生蛋白4 (BMP4)、IGF1, IGFII、毛喉素、FGFR抑制剂、TGFR抑制剂、Kenpaullone, BayK8644、Bix01294和干细胞因子(SCF)。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基还包含BMP I型受体(ALK2、3、6)抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基还包含抗坏血酸。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基还包含油酸。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基还包含亚油酸。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基还包含2-哌啶酸。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基不含动物血清。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的培养基还包含血清替代物。
应注意，一旦嵌合动物形成，并允许生长，则嵌合动物的细胞可用于细胞疗法。例如，基于本发明的一些实施方案在嵌合动物中产生的成熟分化细胞(例如造血干细胞、肝脏肝细胞、产胰岛素的β细胞)可用于成年人中的移植或生物医学应用。
因此，根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供从本发明的一些实施方案的嵌合动物分离分化的细胞、细胞谱系、组织或器官的方法。
分离这样的分化的细胞、组织或器官的方法是本领域众所周知的，上文也进行了描述。
因此，在用于形成嵌合动物的幼稚PSC是人细胞的情况下，这些细胞可从所形成的嵌合动物中进一步分离，并用于治疗人类受试者。
根据本发明的一些实施方案，所述方法还包括从嵌合动物中分离来源于人的(起源于人的)细胞或组织。
使用这样的起源于人的细胞、组织或器官的非限制性实例包括基于细胞的疗法、组织置换、器官或组织植入。
下面是表达载体和将其施用于可用于在细胞中表达目标多肽(例如上文所述任何蛋白，例如OCT4、c-MYC、SOX2、KLF4、LIF、bFGF、TGFβ1、致癌蛋白诸C-MYC、N-MYC、L-MYC、EDAR(外胚层发育异常蛋白A受体)、MDM2和ERAS，报道蛋白诸如GFP或RFP)的细胞的方式的非限制性描述。
为了在哺乳动物细胞中表达外源蛋白，优选将编码目标多肽的多核苷酸序列连接至适于哺乳动物细胞表达的核酸构建体中。所述核酸构建体包括用于在细胞中以组成型或诱导型方式指导多核苷酸序列转录的启动子序列。
本发明的一些实施方案的核酸构建体(本文也称为“表达载体”)包括使载体适于在原核生物、真核生物或优选两者(例如穿梭载体)中复制和整合的其它序列。另外，典型的克隆载体还可含有转录和翻译起始序列、转录和翻译终止子和多腺苷酸化信号。举例来说，所述构建体通常可包括5' LTR、tRNA结合位点、包装信号、第二链DNA合成起点和3' LTR或其部分。
本发明的一些实施方案的核酸构建体通常包括用于从肽位于其中的宿主细胞中分离肽的信号序列。优选用于该目的的信号序列是本发明的一些实施方案的哺乳动物信号序列或多肽变体的信号序列。
真核生物启动子通常含有两种类型的识别序列，TATA框和上游启动子元件。位于转录起始位点上游25-30碱基对的TATA框被认为参与指导RNA聚合酶开始RNA合成。其它上游启动子元件确定开始转录的速率。
与连接的同源或异源启动子相比，增强子元件可刺激转录高达1,000倍。增强子当置于转录起始位点的下游或上游时是有活性的。来源于病毒的许多增强子元件具有广大的宿主范围，并且在多种组织中是有活性的。例如，SV40早期基因增强子适于许多细胞类型。适于本发明的一些实施方案的其它增强子/启动子组合包括来源于多瘤病毒、人或鼠巨细胞病毒(CMV)的那些、来自不同逆转录病毒诸如鼠白血病病毒、鼠或Rous肉瘤病毒和HIV的长末端重复序列。参见Enhancers and Eukaryotic Expression, Cold Spring HarborPress, Cold Spring Harbor, N.Y. 1983，其通过引用并入本文。
在构建表达载体时，启动子优选以距异源转录起始位点的距离与其天然设置中距转录起始位点的距离大致相同地定位。然而，如本领域已知，可适应该距离中的某种变化而不丧失启动子功能。
也可将多腺苷酸化序列添加至表达载体中，以提高mRNA翻译的效率。对于准确和有效的多腺苷酸化需要两个不同的序列元件：位于多腺苷酸化位点下游的富含GU或U的序列和位于11-30个核苷酸上游的6个核苷酸AAUAAA的高度保守的序列。适于本发明的一些实施方案的终止和多腺苷酸化信号包括来源于SV40的那些。
除了已描述的元件以外，本发明的一些实施方案的表达载体通常可含有欲提高克隆的核酸的表达水平或有利于鉴定携带重组DNA的细胞的其它专用元件。例如，多种动物病毒含有在允许细胞类型中促进病毒基因组的染色体外复制的DNA序列。携带这些病毒复制子的质粒以附加形式复制，只要合适的因子通过质粒所携带的基因或随宿主细胞的基因组提供。
载体可包括或不包括真核生物复制子。如果真核生物复制子存在，则使用合适的选择标记，载体在真核生物细胞是可扩增的。如果载体不包含真核生物复制子，则附加型扩增是不可能的。反而，重组DNA整合到工程改造的细胞的基因组中，在其中启动子指导所需核酸的表达。
本发明的一些实施方案的表达载体还可包括允许例如从单一mRNA诸如内部核糖体进入位点(IRES)翻译几种蛋白的额外多核苷酸序列和用于启动子-嵌合多肽的基因组整合的序列。
应理解，表达载体中所包含的各个元件可以多种构型排列。例如增强子元件、启动子等，甚至编码目标蛋白的多核苷酸序列可以“头-尾”构型排列，可作为反向互补序列存在，或可呈互补构型，作为反向平行链。虽然用表达载体的非编码元件更可出现这样的各种构型，但也预期表达载体内编码序列的替代构型。
哺乳动物表达载体的实例包括但不限于可得自Invitrogen的pcDNA3、pcDNA3.1(+/-)、pGL3、pZeoSV2(+/-)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1、pSinRep5、DH26S、DHBB、pNMT1、pNMT41、pNMT81；可得自Promega的pCI；可得自Strategene的pMbac、pPbac、pBK-RSV和pBK-CMV；可得自Clontech的pTRES 及其衍生物。
还可使用含有来自真核生物的病毒(诸如逆转录病毒)的调节元件的表达载体。SV40载体包括pSVT7和pMT2。来源于牛***瘤病毒的载体包括pBV-1MTHA，来源于EpsteinBar病毒的载体包括pHEBO和p2O5。其它示例性载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE和在SV-40早期启动子、SV-40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺瘤病毒启动子、Rous肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或对在真核生物细胞中的表达显示有效的其它启动子的指导下允许蛋白表达的其它任何载体。
如上所述，病毒是极特化的感染原，在许多情况下进化以躲避宿主防御机制。通常，病毒在特定细胞类型中感染和繁殖。病毒载体的靶向特异性利用其天然特异性以明确靶向预定的细胞类型，从而将重组基因导入受感染的细胞。因此，本发明的一些实施方案所用的载体类型将取决于所转化的细胞类型。依照所转化的细胞类型选择合适载体的能力尽在普通技术人员的能力范围内，因此本文不提供选择考虑事项的普通描述。例如，可使用人T细胞白血病病毒I型(HTLV-I)靶向骨髓细胞，并可使用存在于杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)的异源启动子靶向肾细胞，如Liang CY等, 2004 (Arch Virol. 149：51-60)中所述。
重组病毒载体可用于体内表达目标蛋白，因为它们提供优势，诸如横向感染和靶向特异性。横向感染在例如逆转录病毒的生命周期中是固有的，是单一受感染的细胞籍以产生散出并感染邻近细胞的许多子代病毒粒子的过程。其结果是大面积变得被快速感染，其大部分最初不被原始病毒颗粒感染。这与其中感染原仅通过子代传播的垂直感染类型不同。还可产生不能横向传播的病毒载体。如果所需目的是将指定基因只导入有限数目的靶中细胞时，该特征可能是有用的。
可使用各种方法将本发明的一些实施方案的表达载体导入干细胞中。这样的方法一般描述于Sambrook等, Molecular Cloning：A Laboratory Manual, Cold SpringsHarbor Laboratory, New York (1989, 1992)；Ausubel等, Current Protocols inMolecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989)；Chang等,Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995)；Vega等, GeneTargeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995)；Vectors：A Survey of MolecularCloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988)及Gilboa等[Biotechniques 4 (6)：504-512, 1986]，包括例如稳定或瞬时转染、脂转染、电穿孔和用重组病毒载体感染。另外，对于阳性-阴性选择方法，参见美国专利号5,464,764和5,487,992。
通过病毒感染导入核酸提供优于其它方法(诸如脂转染和电穿孔)的几个优势，因为由于病毒的感染性质，可获得较高的转染效率。
目前优选的体内核酸转移技术包括用病毒或非病毒构建体(诸如腺病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒I型或腺伴随病毒(AAV))和基于脂质的***转染。用于基因的脂质介导的转移的有用脂质为例如DOTMA、DOPE和DC-Chol [Tonkinson等, Cancer Investigation, 14(1)：54-65 (1996))]。用于基因疗法的最优选的构建体为病毒，最优选腺病毒、AAV、慢病毒或逆转录病毒。病毒构建体(诸如逆转录病毒构建体)包括至少一个转录启动子/增强子或基因座限定元件或通过其它方式(诸如可变剪接、核RNA输出或信使的翻译后修饰)控制基因表达的其它元件。这样的载体构建体还包括包装信号、长末端重复序列(LTR)或其部分和对所用病毒是合适的正链和负链引物结合位点，除非已存在于病毒构建体中。另外，这样的构建体通常包括用于肽从其所在宿主细胞中分泌的信号序列。优选用于该目的的信号序列是哺乳动物信号序列或本发明的一些实施方案的多肽变体的信号序列。任选构建体还可包括指导多腺苷酸化的信号以及一个或多个限制位点和翻译终止序列。举例来说，这样的构建体通常可包括5' LTR、tRNA结合位点、包装信号、第二链DNA合成起点和3' LTR或其部分。可使用不是病毒的其它载体，诸如阳离子脂质、聚赖氨酸和树枝状大分子。
除含有所***的编码序列的转录和翻译的必需元件以外，本发明的一些实施方案的表达构建体还可包括经工程改造以提高表达肽的稳定性、产量、纯化、收率或毒性的序列。例如，可对包含本发明的一些实施方案的目标多肽和异源蛋白的融合蛋白或可裂解融合蛋白的表达进行工程改造。可设计这样的融合蛋白，使得通过亲和层析可容易地分离融合蛋白例如通过在对异源蛋白有特异性的柱上固定。当在目标蛋白和异源蛋白之间进行改造加入切割位点时，可通过用破坏该切割位点的合适的酶或试剂处理，从层析柱上释放目标蛋白[例如参见Booth等(1988) Immunol. Lett. 19:65-70；以及Gardella等(1990) J.Biol. Chem. 265:15854-15859]。
如上文所提及，多种原核细胞或真核细胞可被用作宿主表达***以表达本发明的一些实施方案的多肽。这些包括但不限于微生物，诸如用含有编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或黏粒DNA表达载体转化的细菌；用含有编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母；用于重组病毒表达载体(例如花椰菜嵌合体病毒CaMV；烟草嵌合体病毒TMV)感染或用含有编码序列的重组质粒表达载体(诸如Ti质粒)转化的植物细胞***。哺乳动物表达***也可用来表达本发明的一些实施方案的多肽。
细菌构建体的实例包括大肠杆菌表达载体的pET系列[Studier等(1990) Methodsin Enzymol. 185:60-89]。
在酵母中，可使用含有组成型或诱导型启动子的多种载体，如美国专利申请号5,932,447中所公开。可选地，可使用促进外源DNA序列整合入酵母染色体的载体。
在使用植物表达载体的情况下，可通过多个启动子驱动编码序列的表达。例如，可使用病毒启动子诸如CaMV的35S RNA和19S RNA启动子[Brisson等(1984) Nature 310:511-514]或TMV的外壳蛋白启动子[Takamatsu等(1987) EMBO J. 6:307-311]。可选地，可使用植物启动子，例如RUBISCO的小亚基[Coruzzi等(1984) EMBO J. 3:1671-1680和Brogli等(1984) Science 224:838-843]或热休克启动子，例如大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B [Gurley等(1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565]。可使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电穿孔和本领域技术人员众所周知的其它技术，将这些构建体导入植物细胞中。参见例如Weissbach和Weissbach, 1988, Methods for PlantMolecular Biology, Academic Press, NY, 第VIII部, 第421-463页。
本发明的一些实施方案还可使用本领域众所周知和下文进一步描述的其它表达***，诸如昆虫和哺乳动物宿主细胞***。
将转化细胞在有效条件下培养，所述条件允许表达大量的重组目标多肽(例如LIF、TGFβ1、bFGF、OCT4、c-myc、SOX2、KLF-4)。在培养预定的时间后，进行重组多肽的回收。如本文所使用，短语“重组多肽的回收”是指收集含有多肽的整个发酵培养基，不必包含分离或纯化的额外步骤。
因此，目标多肽可采用多种标准蛋白纯化技术纯化，诸如但不限于亲和层析法、离子交换层析法、过滤、电泳、疏水相互作用层析法、凝胶过滤层析法、反向层析法、伴刀豆球蛋白A层析法、层析聚焦和差异溶解。
目标多肽优选以“基本上纯的”形式回收。
如本文所使用，短语“基本上纯的”是指允许在培养的同时保持人胚胎干细胞呈未分化状态时有效应用的目标多肽(例如LIF、TGFβ1、bFGF)的纯度。
以下是可以根据本发明的一些实施方案使用的下调剂的非限制性描述。
如本文所使用，短语“RNA沉默”是指由RNA分子介导的一组调节机制[例如，RNA干扰(RNAi)、转录基因沉默(TGS)、转录后基因沉默(PTGS)、抑制(quelling)、共抑制、和翻译阻遏]，所述RNA分子导致相应的蛋白编码基因表达的抑制或“沉默”。已在包括植物、动物和真菌的许多生物类型中观察到RNA沉默。
如本文所使用，短语“RNA沉默剂”是指能够特异性抑制或“沉默”靶基因表达的RNA。在某些实施方案中，所述RNA沉默剂能够通过转录后沉默机制阻止mRNA分子的完全加工(例如完整翻译和/或表达)。RNA沉默剂包括非编码RNA分子，例如包含成对链的RNA双链体、以及前体RNA(自其可以产生这种小的非编码RNA)。示例性的RNA沉默剂包括dsRNs诸如siRNA、miRNA和shRNA。在一个实施方案中，RNA沉默剂能够诱导RNA干扰。在另一个实施方案中，RNA沉默剂能够介导翻译阻遏。
RNA干扰是指在动物中的由短的干扰RNA (siRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默的过程。在植物中的相应过程通常称为转录后基因沉默或RNA沉默，而在真菌中也称为抑制(quelling)。认为转录后基因沉默的过程是进化上保守的细胞防御机制，用于阻止外源基因表达并由多种植物区系和门所共享。免于外源基因表达的这种保护可能是在响应双链RNA (dsRNA)的产生而进化的：所述双链RNA来源于病毒感染或来源于转座子元件通过细胞反应而随机整合到宿主基因组中，所述细胞反应特异性地破坏同源单链RNA或病毒基因组RNA。
在细胞中的长dsRNA的存在刺激核糖核酸酶III酶(称为切酶（Dicer）)的活性。切酶参与将dsRNA加工成小片dsRNA，称为短的干扰RNA (siRNA)。来源于切酶活性的短干扰RNA通常长度为约21至约23个核苷酸并且包含约19个碱基对双链体。RNAi反应的特征还在于内切核酸酶复合物，通常称为RNA-诱导的沉默复合物(RISC)，其介导具有与siRNA双链体的反义链互补的序列的单链RNA的切割。靶RNA的切割发生在与siRNA双链体的反义链互补的区域的中部。
因此，本发明的一些实施方案考虑了使用dsRNA以下调自mRNA的蛋白表达。
根据一个实施方案，所述dsRNA大于30 bp。长dsRNA (即大于30 bp的dsRNA)的使用非常有限，因为认为双链RNA的这些较长区将导致干扰素的诱导和PKR反应。然而，使用长dsRNA可提供许多优势，因为细胞可选择最佳沉默序列，减少对测试大量siRNA的需求；长dsRNA将允许沉默文库具有比siRNA所需要的更低的复杂度；并且，也许最重要的是，当用作治疗药时，长dsRNA能阻止病毒逃逸突变。
多项研究表明长dsRNA可用于沉默基因表达，而不诱导应激反应或导致明显的脱靶效应-参见例如[Strat等, Nucleic Acids Research, 2006, 第34卷,第13期, 3803–3810；Bhargava A等 Brain Res. Protoc. 2004；13:115–125；Diallo M.,等,Oligonucleotides. 2003；13:381–392；Paddison P.J.,等, Proc. Natl Acad. Sci.USA. 2002；99:1443–1448；Tran N.,等, FEBS Lett. 2004；573:127–134]。
具体而言，本发明根据其一些实施方案考虑了在细胞中引入长dsRNA (超过30个碱基转录物)用于基因沉默，在所述细胞中干扰素途径未被激活(例如胚胎细胞和***)，参见例如Billy等, PNAS 2001, 卷98, 第14428-14433页和Diallo等,Oligonucleotides, 2003 年 10 月 1 日, 13(5)：381-392. doi:10.1089/154545703322617069。
本发明根据其一些实施方案也考虑了引入长dsRNA用于下调基因表达，所述长dsRNA经特别设计而不会诱导干扰素和PKR途径。例如，Shinagwa和Ishii [Genes & Dev.17 (11)：1340-1345，2003]已经开发出一种载体，称为pDECAP，以便自RNA聚合酶II (PolII)启动子表达长的双链RNA。因为自pDECAP的转录缺乏促进ds-RNA输出到胞质的5'-帽结构和3'-聚(A)尾两者，所以来自pDECAP的长ds-RNA不诱导干扰素反应。
在哺乳动物***中逃避干扰素和PKR途径的另一方法是通过经由转染或内源表达而引入小的抑制性RNA (siRNA)。
术语“siRNA”是指诱导RNA干扰(RNAi)途径的小的抑制性RNA双链体(通常为18-30个碱基对)。通常地，siRNA经化学合成为21聚体，具有中心的19bp双链体区和在末端的对称的2-碱基3'-突出端，虽然最近已经描述了与在相同位置的21聚体相比，经化学合成的25-30个碱基长度的RNA双链体在效力上可具有多达100倍的增加。使用较长的RNAs所得到的在触发RNAi方面所观察到的效力增加据推论是由于给切酶提供底物(27聚体)而非产物(21聚体)，并且这改善了siRNA双链体进入RISC的速率或效率。
已经发现3'-突出端的位置影响siRNA的效力并且在反义链上具有3'-突出端的不对称双链体通常比在有义链上具有3'-突出端的那些更有效(Rose等，2005)。这可归因于加载到RISC的不对称的链，因为当靶向反义转录物时观察到相反的功效模式。
双链干扰RNA(例如siRNA)的链可以连接在一起，以形成发夹或茎环结构(例如shRNA)。因此，正如所述，本发明的一些实施方案的RNA沉默剂也可以是短发夹RNA(shRNA)。
如本文所使用，术语“shRNA”是指具有茎-环结构的RNA试剂，其包含互补序列的第一和第二区，所述区域的互补程度和取向足以使这些区域之间发生碱基配对，第一和第二区通过环区连接，该环由环区内的核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺乏碱基配对所导致。环内的核苷酸数量介于并包括3-23、或5-15、或7-13、或4-9、或9-11的数量。环内的一些核苷酸可以参与与环内的其它核苷酸的碱基对相互作用。可用于形成环的寡核苷酸序列的实例包括5'-UUCAAGAGA-3'(Brummelkamp, T. R.等 (2002) Science 296: 550)和5'-UUUGUGUAG-3' (Castanotto, D.等 (2002) RNA 8:1454)。本领域技术人员将认识到，所得单链寡核苷酸形成茎环或发夹结构，其包含能够与RNAi机构相互作用的双链区。
适用于本发明的一些实施方案的RNA沉默剂的合成可以如下进行。首先，在AUG起始密码子下游扫描肿瘤抑制mRNA序列的AA二核苷酸序列。记录每个AA和3'邻近的19个核苷酸的出现作为潜在的siRNA靶位点。优选地，siRNA靶位点选自可读框，因为非翻译区(UTR)在调节蛋白结合位点中较丰富。UTR-结合蛋白和/或翻译起始复合物可能干扰siRNA内切酶复合物的结合[Tuschl ChemBiochem. 2:239-245]。但可以理解，针对非翻译区的siRNA也可为有效的，但正如对于GAPDH所证明的那样，其中针对5' UTR的siRNA介导细胞GAPDHmRNA的约90%降低并完全消除蛋白水平(ambion (.) com/techlib/tn/91/912 (.) html)。
第二，使用任何序列比对软件，诸如可得自NCBI服务器(ncbi (.) nlm (.) nih(.) gov/BLAST/)的BLAST软件，将潜在靶位点与合适的基因组数据库(例如人、小鼠、大鼠等)相比较。过滤掉与其它编码序列具有明显同源性的推定的靶位点。
选择合格的靶序列作为siRNA合成的模板。优选的序列是包含低G/C含量的那些，因为它们已被证明在介导基因沉默中比G/C含量高于55%的那些更有效。优选地沿着用于评价的靶基因长度，选择几种靶位点。为了更好地评估所选siRNA，优选结合使用阴性对照。阴性对照siRNA优选地包括与siRNA相同的核苷酸组成，但缺乏与基因组的明显同源性。因此，优选使用siRNA的杂乱核苷酸序列，只要它不表现出与任何其它基因的任何明显同源性。
应理解，本发明的一些实施方案的RNA沉默剂不必限制在仅含RNA的那些分子，而是进一步包括经化学修饰的核苷酸和非核苷酸。
在一些实施方案中，本文提供的RNA沉默剂可与细胞渗透肽在功能上相关。如本文所使用的“细胞渗透肽”是包含短的(约12-30个残基)氨基酸序列或功能性基序的肽，所述氨基酸序列或功能性基序赋予膜渗透性复合物跨越细胞质膜和/或核膜的运输相关的能量独立的(即非-内吞的)转位性质。用于本发明的一些实施方案的膜渗透性复合物的细胞渗透肽优选地包含至少一个无功能的半胱氨酸残基，其是游离或经衍生，以与双链核糖核酸形成二硫键，所述双链核糖核酸已针对这样的键进行修饰。赋予这样的性质的代表性氨基酸基序在美国专利号6,348,185中已列举，其内容通过引用明确并入本文。本发明的一些实施方案的细胞渗透肽优选地包括但不限于penetratin、transportan、pIsl、TAT (48-60)、pVEC、MTS和MAP。
根据另一个实施方案，RNA沉默剂可为miRNA。
术语“微RNA”、“miRNA”和“miR”同义并且是指长度约19-28个核苷酸，调节基因表达的非编码单链RNA分子的集合。在各种生物(viruses.fwdarw.humans)中发现miRNA并且已经显示在发育、体内稳态和疾病病因学上起作用。
下面是对miRNA活性机制的简单描述。
编码miRNA的基因被转录，导致称为pri-miRNA的miRNA前体的生成。pri-miRNA通常是包含多个pri-miRNA的多顺反子RNA的一部分。pri-miRNA可与茎和环形成发夹。茎可能包含错配碱基。
pri-miRNA的发夹结构由作为RNA酶III核酸内切酶的Drosha识别。Drosha通常识别pri-miRNA中的末端环并且将约两个螺旋转角切割成茎以生成称为pre-miRNA的60-70个核苷酸的前体。Drosha以RNA酶III核酸内切酶典型的交错切口切割pre-miRNA，产生具有5'磷酸酯和~2个核苷酸3'突出端的pre-miRNA茎环。据估计茎(~10个核苷酸)伸出Drosha切割位点的约一个螺旋转角对有效加工必不可少。然后pre-miRNA通过Ran-GTP和输出受体输出蛋白-5从细胞核主动运输到细胞质。
然后pre-miRNA的双链茎由也作为RNA酶III核酸内切酶的切酶识别。切酶也可识别在茎环基部的5'磷酸酯和3'突出端。然后切酶切割掉末端环，两个螺旋转角离开茎环基部，留下另外的5'磷酸酯和~2个核苷酸的3'突出端。所生成的可能包含错配的siRNA样双链体包含成熟miRNA和称为miRNA*的相似大小的片段。miRNA和miRNA*可能源自pri-miRNA和pre-miRNA的相对臂。可在克隆miRNA文库中找到miRNA*序列，但通常频率比miRNA更低。
虽然最初与miRNA*一起作为双链种类存在，但是miRNA最终作为单链RNA并入称为RNA诱导沉默复合物(RISC)的核糖核蛋白复合物中。各种蛋白均可形成RISC，其可导致对miRNA/miRNA*双链体的特异性、靶基因结合位点、miRNA活性(阻遏或激活)和miRNA/miRNA*双链体的哪一条链载入RISC的方面的可变性。
当miRNA:miRNA*双链体的miRNA链载入RISC时，去除并降解miRNA*。miRNA:miRNA*双链体中载入RISC的链是其5'末端配对不太牢固的链。在miRNA:miRNA*的两端具有大致相当的5'配对的情况下，miRNA和miRNA*可能都具有基因沉默活性。
RISC基于miRNA和mRNA之间的高互补性水平，特别是通过miRNA的核苷酸2-7识别靶核酸。
许多研究已着眼于为实现翻译的有效抑制，miRNA及其mRNA靶标之间的碱基配对要求(综述于Bartel 2004，Cell 116-281)。在哺乳动物细胞中，miRNA的前8个核苷酸可能很重要(Doench & Sharp 2004 GenesDev 2004-504)。然而，微RNA的其它部分也可能参与mRNA结合。而且，3’处足够的碱基配对可补偿5’处的配对不足(Brennecke等，2005 PLoS 3-e85)。分析全基因组上miRNA结合的计算研究已经表明在靶标结合中对miRNA的5’处的碱基2-7的特定作用，但是也公认了通常发现为“A”的第一个核苷酸的作用(Lewis等2005 Cell120-15)。类似地，Krek等使用核苷酸1-7或2-8鉴定和验证靶标(2005, Nat Genet 37-495)。
mRNA中的靶位点可能在5' UTR、3' UTR或编码区内。有趣的是，多个miRNA可通过识别相同或多个位点调节相同mRNA靶标。大多数基因识别靶标中多个miRNA结合位点的存在可能表明多个RISC的协同作用提供了最有效的翻译抑制。
miRNA可指示RISC通过两种机制中的任一种下调基因表达：mRNA切割或翻译阻遏。如果mRNA与miRNA有一定程度的互补性，则miRNA可指定mRNA的切割。当miRNA指导切割时，切口通常介于与miRNA的残基10和11的核苷酸配对之间。可选地，如果miRNA与miRNA没有必要程度的互补性，则miRNA可阻遏翻译。翻译阻遏可能在动物中更普遍，因为动物可能在miRNA和结合位点之间具有更低程度的互补性。
应注意的是，在任一对miRNA和miRNA*的5’和3’末端可能存在可变性。这种可变性可能是由于Drosha和切酶对于切割位点酶促加工的可变性。miRNA和miRNA*的5’和3’末端的可变性也可能是由于pri-miRNA和pre-miRNA茎结构中的错配。茎链的错配可能产生一群不同的发夹结构。茎结构的可变性也可能导致Drosha和切酶切割产物的可变性。
术语“微RNA模拟物”是指能够进入RNAi途径并调节基因表达的合成非编码RNA。miRNA模拟物模仿内源微RNA(miRNA)的功能并且可设计成成熟、双链分子或模拟物前体(例如，pre-miRNA)。miRNA模拟物可由经修饰或未经修饰的RNA、DNA、RNA-DNA杂交体或替代核酸化学物质(例如，LNA或2'-O,4'-C-乙烯-桥接核酸(ENA))构成。对于成熟、双链miRNA模拟物而言，双链体区的长度可在13-33、18-24或21-23个核苷酸之间变化。miRNA也可包含总计至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。miRNA的序列也可能是pre-miRNA的前13-33个核苷酸。miRNA的序列也可能是pre-miRNA的后13-33个核苷酸。
从上文提供的描述应理解，可以许多方式实现多能干细胞与miRNA接触：
1. 用成熟双链miRNA瞬时转染多能干细胞；
2. 用编码成熟miRNA的表达载体稳定或瞬时转染多能干细胞。
3. 用编码pre-miRNA的表达载体稳定或瞬时转染多能干细胞。pre-miRNA序列可包含45-90、60-80或60-70个核苷酸。pre-miRNA序列可能包含如本文所述的miRNA和miRNA*。pre-miRNA序列也可能是从pri-miRNA的5’和3’末端排除0-160个核苷酸的pri-miRNA序列。
4. 用编码pri-miRNA的表达载体稳定或瞬时转染多能干细胞。pri-miRNA序列可包含45-30,000、50-25,000、100-20,000、1,000-1,500或80-100个核苷酸。pri-miRNA序列可包含如本文所述的pre-miRNA、miRNA和miRNA*及其变体。
miRNA模拟物的制备可通过化学合成方法或通过重组方法实现。
能够下调本发明的一些实施方案的肿瘤抑制蛋白(例如，P53和/或NF-κB抑制剂α)的另一试剂是能够特异性切割肿瘤抑制蛋白的mRNA转录物或DNA序列的DNA核酶分子。DNA核酶是单链多核苷酸，其能够切割单链和双链靶序列两者(Breaker, R.R.和Joyce, G.Chemistry and Biology 1995；2:655；Santoro, S.W. & Joyce, G.F. Proc. Natl,Acad. Sci. USA 1997；943:4262)。已经提出了DNA核酶的通用模型(“10-23”模型)。“10-23”DNA核酶具有15个脱氧核糖核苷酸的催化域，侧接两个底物识别域，其各自具有7-9个脱氧核糖核苷酸。该类DNA核酶可在嘌呤:嘧啶连接处有效切割其底物RNA (Santoro, S.W. &Joyce, G.F. Proc. Natl, Acad. Sci. USA 199；对于DNA核酶的综述参见Khachigian,LM [Curr Opin Mol Ther 4:119-21 (2002)]。
识别单链和双链靶切割位点的合成的、经工程改造的DNA核酶的构建和扩增的实例已经公开于美国专利号6,326,174 (授予Joyce等)。近期已经观察到针对人尿激酶受体的类似设计的DNA核酶抑制尿激酶受体表达，并且成功地体内抑制了结肠癌细胞转移(Itoh等，2002，Abstract 409，Ann Meeting Am Soc Gen Ther www.asgt.org)。在另一应用中，与bcr-abl癌基因互补的DNA核酶已经成功地抑制了在白血病细胞中的癌基因表达，和在CML和ALL的病例中在自体骨髓移植中降低了复发率。
通过使用与编码肿瘤抑制蛋白的mRNA转录物特异性地杂交的反义多核苷酸，也可实现本发明的一些实施方案的肿瘤抑制蛋白(例如，P53和/或NF-κB抑制剂α)的下调。
当考虑对反义方法而言重要的两方面时，必须进行可用于有效下调肿瘤抑制蛋白的反义分子的设计。第一方面是将寡核苷酸递送到合适细胞的细胞质中，而第二方面是设计寡核苷酸，所述寡核苷酸以抑制其翻译的方式特异性地结合细胞内的指定mRNA。
现有技术教导了许多递送策略，其可用于将寡核苷酸有效地递送到多种多样的细胞类型中[参见例如，Luft J Mol Med 76：75-6 (1998)；Kronenwett等 Blood 91：852-62(1998)；Rajur等 Bioconjug Chem 8：935-40 (1997)；Lavigne等 Biochem Biophys ResCommun 237：566-71 (1997)和Aoki等 (1997) Biochem Biophys Res Commun 231：540-5(1997)]。
另外，用于基于解释靶mRNA和寡核苷酸两者中的结构改变的能量学的热力学循环，鉴定对其靶mRNA具有最高的预测结合亲和力的那些序列的算法也是可用的[参见例如，Walton等Biotechnol Bioeng 65：1-9 (1999)]。
这样的算法已经成功地用于在细胞中实施反义方法。例如，由Walton等开发的算法使科学家们能够成功地设计反义寡核苷酸，用于兔β-珠蛋白(RBG)和小鼠肿瘤坏死因子-α(TNFα)转录物。同一研究小组新近已经报告，如通过动力PCR技术评价的在细胞培养中针对3个模型靶mRNA (人乳酸脱氢酶A和B和大鼠gp130)的合理选择的寡核苷酸的反义活性，证明了在几乎所有情况中都是有效的，包括在两种细胞类型中用磷酸二酯和硫代磷酸寡核苷酸化学物针对3个不同靶的测试。
另外，也发表了用于使用体外***的设计和预测特定寡核苷酸功效的几种方法(Matveeva等, Nature Biotechnology 16：1374 - 1375 (1998)]。
几项临床试验已经证明反义寡核苷酸的安全性、可行性和活性。例如，已经成功使用了适合于治疗癌症的反义寡核苷酸[Holmund等，Curr Opin Mol Ther 1:372-85(1999)]，而经由靶向c-myb基因、p53和Bcl-2的反义寡核苷酸治疗血液恶性肿瘤已进入临床试验并且已经证实患者耐受[Gerwitz Curr Opin Mol Ther 1:297-306 (1999)]。
最近，已经报道在小鼠模型中反义介导的人乙酰肝素酶基因表达抑制，抑制了人癌细胞的胸膜种植转移[Uno等，Cancer Res 61:7855-60 (2001)]。
因此，目前的共识是在如上所述，已导致产生高度精确的反义设计算法和各种寡核苷酸递送***的反义技术领域的最新发展，使得普通技术人员能够设计并实现适合下调已知序列的表达，而无需采取不当试验和错误实验的反义方法。
能够下调本发明的一些实施方案的肿瘤抑制蛋白(例如，P53和/或NF-κB抑制剂α)的另一试剂是能够特异性地切割编码肿瘤抑制蛋白的mRNA转录物的核酶分子。核酶被越来越多地用于通过切割编码目标蛋白的mRNA进行的基因表达的序列特异性抑制[Welch等，Curr Opin Biotechnol. 9:486-96 (1998)]。设计核酶以切割任何特异性靶RNA的可能性使其成为基础研究和治疗应用两者的有价值的工具。在治疗领域，核酶已被用于在感染性疾病中靶向病毒RNA，在癌症中靶向显性癌基因，在遗传障碍中靶向特定体细胞突变[Welch等，Clin Diagn Virol. 10:163-71 (1998)]。最显著的是，用于HIV患者的几种核酶基因治疗方案已经处于1期试验。新近，核酶已被用于转基因动物研究、基因靶证实和途径的阐明。几种核酶处于不同临床试验期。ANGIOZYME是进行人体临床试验研究的首个经化学合成的核酶。ANGIOZYME特异性地抑制VEGF-r (血管内皮生长因子受体)的形成，VEGF-r是血管生成途径中的一种关键组分。Ribozyme Pharmaceuticals, Inc.以及其它公司已经证明抗血管生成治疗药在动物模型中的重要性。已经发现HEPTAZYME(经设计用于选择性地破坏丙肝病毒(HCV) RNA的一种核酶)在细胞培养测定中有效减少丙肝病毒RNA (RibozymePharmaceuticals, Incorporated - WEB主页)。
调节本发明的一些实施方案的肿瘤抑制蛋白(例如，P53和/或NF-κB抑制剂α)在细胞中的表达的一种额外方法是经由三链体形成寡核苷酸(TFO)。近期研究已经证明可以设计TFO，其可以序列特异性方式识别双链螺旋DNA中的多聚嘌呤/多聚嘧啶区并与之结合。这些识别法则概述于Maher III, L. J.,等, Science,1989；245:725-730；Moser, H. E.,等, Science,1987；238:645-630；Beal, P. A.,等, Science,1992；251:1360-1363；Cooney, M.,等, Science,1988；241:456-459；和Hogan, M. E.,等, EP公开号375408。对寡核苷酸的修饰例如引入嵌入剂和主链取代，以及结合条件(pH和阳离子浓度)的优化，有助于克服TFO活性的固有障碍，例如电荷排斥和不稳定性，并且近来已经证明可将合成的寡核苷酸靶向特定序列(关于的近期综述参见Seidman和Glazer, J Clin Invest 2003；112:487-94)。
一般而言，三链体形成寡核苷酸具有下列序列对应性：
。
然而，已经证实A-AT和G-GC三链体具有最大三重螺旋稳定性(Reither和Jeltsch,BMC Biochem, 2002年9月12日, Epub)。相同作者已经证明根据A-AT和G-GC法则而设计的TFO不形成非特异性三链体，表明三链体形成确实是序列特异性的。
因此对于肿瘤抑制基因调节区中的任何给定序列，都可设计三链体形成序列。三链体形成寡核苷酸的长度优选是至少15、更优选25、再更优选30或更多个核苷酸，至多50或100 bp。
使用TFO转染细胞(例如经由阳离子脂质体)并与靶DNA形成三重螺旋结构，诱导了空间和功能变化，阻断转录起始和延长，使得在内源性DNA中引入所需序列变化并导致基因表达的特异性下调。在使用TFO处理的细胞中基因表达的这样的抑制的实例包括哺乳动物细胞中的附加体supFG1和内源性HPRT基因的敲除(Vasquez等,Nucl Acids Res. 1999；27:1176-81,和Puri,等, J Biol Chem, 2001；276:28991-98)，和在***癌病因中重要的Ets2转录因子表达的序列特异性和靶特异性下调(Carbone,等, Nucl Acid Res. 2003；31:833-43)，以及促炎ICAM-I基因表达的序列特异性和靶特异性下调(Besch等, J BiolChem, 2002；277:32473-79)。另外，Vuyisich和Beal最近表明序列特异性TFO可结合dsRNA，抑制dsRNA依赖性酶诸如RNA依赖性激酶的活性(Vuyisich和Beal, Nuc. Acids Res 2000；28:2369-74)。
另外，根据上述原理设计的TFO可诱导定向诱变，所述定向诱变能够实现DNA修复，因此提供内源性基因表达的下调和上调两者(Seidman和Glazer, J Clin Invest 2003；112:487-94)。有效TFO的设计、合成以及施用的详细说明可见于美国专利申请号2003017068和2003 0096980 (Froehler等)，和2002 0128218和2002 0123476 (Emanuele等)和美国专利号5,721,138 (Lawn)。
如本文所使用，术语“约”是指± 10%。
术语“包含（comprises）”、“包含（comprising）”、“包括（includes）”、“包括（including）”、“具有”及其词形变化意指“包括但不限于”。
术语“由……组成”意指“包括并限于”。
术语“基本由……组成”意味着组成、方法或结构可包括其它成分、步骤和/或部分，但只要其它成分、步骤和/或部分不实质性地改变所要求保护的组成、方法或结构的基本和新的特征。
如本文所使用，单数形式“一个/种”和“所述/该”包括复数指代物，除非文中另有明确规定。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括其混合物。
在整个本申请中，本发明的不同的实施方案可以范围形式呈现。应理解，范围形式的描述仅出于方便和简洁，不应解释为本发明范围的不可变更的限制。因此，范围的描述应视为具体公开了所有可能的子范围以及该范围的各个数值。例如，范围诸如1-6的描述应视为具体公开了诸如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等子范围，以及该范围的各个数，例如1、2、3、4、5和6。其不论范围宽度均适用。
每当本文规定数值范围时，均意指包括该指定范围内的任何所述的数值(分数或整数)。短语第一标示数字和第二标示数字“之间的范围”和“从”第一标示数字“到”第二标示数字“的范围”在本文互换使用，意指包括第一标示数字和第二标示数字和期间的所有分数和整数。
如本文所使用，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物、生物化学和医学领域从业人员已知或容易由他们从已知的方式、手段、技术和程序开发的方式、手段、技术和程序。
如本文所使用，术语“治疗”包括去除、基本上抑制、减缓或逆转病况的进展，基本上改善病况的临床或审美症状(aesthetical symptom)或基本上防止病况的临床或审美症状的出现。
应理解，为了清楚起见，在各个实施方案的背景下描述的本发明的某些特征，也可在单一实施方案中组合提供。相反，出于简洁起见，在单一实施方案的背景下描述的本发明的不同特征，也可单独提供或以任何合适的亚组合提供或适用于本发明的任何其它描述的实施方案。在不同实施方案的情况下描述的某些特征不视为所述实施方案的必需特征，除非该实施方案在无所述要素时是无效的。
在下面的实施例中，提供对上文描述和随附权利要求书部分要求保护的本发明的不同实施方案和方面的实验支持。
实施例
现在参照以下实施例，连同上文的描述，其以非限制性方式说明本发明的一些实施方案。
一般而言，本文使用的命名和本发明中利用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物和重组DNA技术。文献中全面阐释了这样的技术。参见例如"Molecular Cloning：Alaboratory Manual" Sambrook等(1989)；"Current Protocols in Molecular Biology"第I-III卷, Ausubel, R. M.编辑(1994)；Ausubel等, "Current Protocols inMolecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)；Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988)；Watson等, "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York；Birren等(编辑) "Genome Analysis：A Laboratory Manual Series", 第1-4卷, Cold Spring HarborLaboratory Press, New York (1998)；美国专利号4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057给出的方法；"Cell Biology：A Laboratory Handbook", 第I-III卷,Cellis, J. E.编辑(1994)；“Culture of Animal Cells – A Manual of BasicTechnique” by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994)第三版；"Current Protocols inImmunology" 第I-III卷, Coligan J. E.编辑(1994)；Stites等(编辑), "Basic andClinical Immunology" (第8版), Appleton和Lange, Norwalk, CT (1994)；Mishell和Shiigi (编辑), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman andCo., New York (1980)；可得的免疫测定法大量描述于专利和科学文献中，参见例如美国专利号3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521，"Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J.编辑(1984)；“NucleicAcid Hybridization" Hames, B. D.和Higgins S. J., 编辑(1985)；"Transcriptionand Translation" Hames, B. D.和Higgins S. J.编辑(1984)；"Animal Cell Culture"Freshney, R. I.编辑(1986)；"Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986)；"A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984)以及"Methods inEnzymology" 第1-317卷, Academic Press；"PCR Protocols：A Guide To Methods AndApplications", Academic Press, San Diego, CA (1990)；Marshak等, "Strategiesfor Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual"CSHL Press (1996)；其全部通过引用并入，如同在本文完全阐述一样。在整个文件中提供其它一般参考文献。其中的程序被视为是本领域中众所周知的，并且为了方便读者而提供。其中所含的全部信息通过引用并入本文。
实施例1
材料和方法
基础培养基
Neurobasal培养基(Invitrogen 21103-049)和DMEM/F12 (Biological Industries06-1170-50-1A )的1:1混合物 – 总共475 ml，Pen-strep 5 ml (Biological Industries03-033-1B)，L-谷氨酰胺，5 ml 200 mM溶液(以2 mM终浓度)(Biological Industries -02-022-1B)，非必需氨基酸(NEAA) – 5 ml (Biological Industries 01-340-1B)，50 μl50 mM储备β-巯基乙醇(1 vile)，5 ml B27补充剂(Invitrogen 17504-044)，胰岛素(SigmaI-1882；12.5-25 μg/ml终浓度)，脱铁运铁蛋白(Sigma T-1147；100 μg/ml终浓度)，孕酮(Sigma P8783，0.02 μg/ml终浓度)，腐胺(SigmaP5780；16 μg/ml终浓度)，***钠(SigmaS5261；以3 nM的终浓度)，L-抗坏血酸2-磷酸盐(Sigma A8960；50 μg/ml终浓度)，牛血清白蛋白(BSA) (100X级分V 7.5%溶液Gibco 15260-037)。注意，胰岛素、脱铁运铁蛋白、孕酮、腐胺和***钠是N2混合物的组分。
补充剂
培养基1：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、FGF2 (8 ng/ml)、TGFβ1 (2 ng/ml)、ROCKi (Y27632 10 μM)、AXINs (IWR1, 2 μM)和SRCi (CGP77675, 1.5 μM)。
培养基2：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、FGF2 (8 ng/ml)、TGFβ1 (2 ng/ml)、ROCKi (Y27632 10 μM)、AXINs (IWR1, 2 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)、BMPi(LDN-193189 0.2 μM)。
培养基3：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、FGF2 (8 ng/ml)、TGFβ1 (2 ng/ml)、ROCKi (Y27632 10 μM)、AXINs (IWR1, 2 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)和PKCi(Go6983 0.5 μM)。
培养基4：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、FGF2 (8 ng/ml)、TGFβ1 (2 ng/ml)、ROCKi (Y27632 10 μM)、AXINs (IWR1, 2 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)、BMPi(LDN-193189 0.2 μM)和PKCi (Go6983 0.5 μM)。
培养基5：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、FGF2 (8 ng/ml)、TGFβ1 (2 ng/ml)、ROCKi (Y27632 10 μM)、AXINs (IWR1, 2 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)。
培养基6：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、FGF2 (8 ng/ml)、TGFβ1 (2 ng/ml)、ROCKi (Y27632 10 μM)、AXINs (IWR1, 2 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)、BMPi (LDN-193189 0.2 μM)。
培养基7：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、FGF2 (8 ng/ml)、TGFβ1 (2 ng/ml)、ROCKi (Y27632 10 μM)、AXINs (IWR1, 2 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)和PKCi (Go6983 0.5 μM)。
培养基8：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、FGF2 (8 ng/ml)、TGFβ1 (2 ng/ml)、ROCKi (Y27632 10 μM)、AXINs (IWR1, 2 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)、BMPi (LDN-193189 0.2 μM)和PKCi(Go6983 0.5 μM)。
培养基9：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、TGFβ1 (2 ng/ml)、ROCKi (Y2763210 μM)、AXINs (IWR1, 2 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)。
培养基10：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021,3 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、TGFβ1 (2 ng/ml)、ROCKi(Y27632 10 μM)、AXINs (IWR1, 2 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)、BMPi (LDN-1931890.2 μM)。
培养基11：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021,3 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、TGFβ1 (2 ng/ml)、ROCKi(Y27632 10 μM)、AXINs (IWR1, 2 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)和PKCi (Go6983 0.5 μM)。
培养基12：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021,3 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、TGFβ1 (2 ng/ml)、ROCKi(Y27632 10 μM)、AXINs (IWR1, 2 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)、BMPi (LDN-1931890.2 μM)和PKCi (Go6983 0.5 μM)。
培养基13：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021,3 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、FGF2 (8 ng/ml)、TGFβ1 (2 ng/ml)、ROCKi (Y27632 10 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)。
培养基14：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021,3 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、FGF2 (8 ng/ml)、TGFβ1 (2 ng/ml)、ROCKi (Y27632 10 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)、BMPi (LDN-193189 0.2 μM)。
培养基15：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021,3 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、FGF2 (8 ng/ml)、TGFβ1 (2 ng/ml)、ROCKi (Y27632 10 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)和PKCi (Go6983 0.5 μM)。
培养基16：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021,3 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、FGF2 (8 ng/ml)、TGFβ1 (2 ng/ml)、ROCKi (Y27632 10 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)、BMPi (LDN-193189 0.2 μM)和PKCi (Go6983 0.5 μM)。
培养基17：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021,3 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、TGFβ1 (2 ng/ml)、ROCKi(Y27632 10 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)。
培养基18：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021,3 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、TGFβ1 (2 ng/ml)、ROCKi(Y27632 10 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)、BMPi (LDN-193189 0.2 μM)。
培养基19：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021,3 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、TGFβ1 (2 ng/ml)、ROCKi(Y27632 10 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)和PKCi (Go6983 0.5 μM)。
培养基20：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021,3 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、TGFβ1 (2 ng/ml)、ROCKi(Y27632 10 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)、BMPi (LDN-193189 0.2 μM)和PKCi (Go69830.5 μM)。
培养基21：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021,3 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、ROCKi (Y27632 10 μM)、AXINs(IWR1, 2 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)。
培养基22：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021,3 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、ROCKi (Y27632 10 μM)、AXINs(IWR1, 2 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)、BMPi (LDN-193189 0.2 μM)。
培养基23：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021,3 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、ROCKi (Y27632 10 μM)、AXINs(IWR1, 2 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)和PKCi (Go6983 0.5 μM)。
培养基24：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021,3 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、ROCKi (Y27632 10 μM)、AXINs(IWR1, 2 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)、BMPi (LDN-193189 0.2 μM)和PKCi (Go69830.5 μM)。
培养基25：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021,3 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、TGFβ1 (2 ng/ml)、ROCKi(Y27632 10 μM)、AXINs (IWR1, 2 μM)。
培养基26：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021,3 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、TGFβ1 (2 ng/ml)、ROCKi(Y27632 10 μM)、AXINs (IWR1, 2 μM)、BMPi (LDN-193189 0.2 μM)。
培养基27：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021,3 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、TGFβ1 (2 ng/ml)、ROCKi(Y27632 10 μM)、AXINs (IWR1, 2 μM)和PKCi (Go6983 0.5 μM)。
培养基28：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021,3 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、TGFβ1 (2 ng/ml)、ROCKi(Y27632 10 μM)、AXINs (IWR1, 2 μM)、BMPi (LDN-193189 0.2 μM)和PKCi (Go6983 0.5μM)。
培养基29：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021,3 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、TGFβ1 (2 ng/ml)、ROCKi(Y27632 10 μM)、AXINs (IWR1, 2 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)、FGFRi (PD173074 0.1μM)。
培养基30：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021,3 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、TGFβ1 (2 ng/ml)、ROCKi(Y27632 10 μM)、AXINs (IWR1, 2 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)、FGFRi (PD173074 0.1μM)、BMPi (LDN-193189 0.2 μM)。
培养基31：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021,3 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、TGFβ1 (2 ng/ml)、ROCKi(Y27632 10 μM)、AXINs (IWR1, 2 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)、FGFRi (PD173074 0.1μM)和PKCi (Go6983 0.5 μM)。
培养基32：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021,3 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、TGFβ1 (2 ng/ml)、ROCKi(Y27632 10 μM)、AXINs (IWR1, 2 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)、FGFRi (PD173074 0.1μM)、BMPi (LDN-193189 0.2 μM)和PKCi (Go6983 0.5 μM)。
培养基33：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021,3 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、TGFβ1 (2 ng/ml)、ROCKi(Y27632 10 μM)、AXINs (IWR1, 2 μM)、FGFRi (PD173074 0.1 μM)。
培养基34：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021,3 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、TGFβ1 (2 ng/ml)、ROCKi(Y27632 10 μM)、AXINs (IWR1, 2 μM)、FGFRi (PD173074 0.1 μM)、BMPi (LDN-1931890.2 μM)。
培养基35：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021,3 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、TGFβ1 (2 ng/ml)、ROCKi(Y27632 10 μM)、AXINs (IWR1, 2 μM)、FGFRi (PD173074 0.1 μM)和PKCi (Go6983 0.5 μM)。
培养基36：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021,3 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、ROCKi (Y27632 10 μM)、AXINs(IWR1, 2 μM)、FGFRi (PD173074 0.1 μM)、BMPi (LDN-193189 0.2 μM)和PKCi (Go69830.5 μM)。
培养基37：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021,3 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、TGFβ1 (2 ng/ml)、ROCKi(Y27632 10 μM)、AXINs (IWR1, 2 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)、TGFRi (SB431542 2 μM)。
培养基38：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021,3 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、ROCKi (Y27632 10 μM)、AXINs(IWR1, 2 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)、TGFRi (SB431542 2 μM)、BMPi (LDN-1931890.2 μM)。
培养基39：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021,3 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、ROCKi (Y27632 10 μM)、AXINs(IWR1, 2 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)、TGFRi (SB431542 2 μM)和PKCi (Go6983 0.5μM)。
培养基40：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、GSK3βi (CHIR99021,3 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、ROCKi (Y27632 10 μM)、AXINs(IWR1, 2 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)、TGFRi (SB431542 2 μM)、BMPi (LDN-1931890.2 μM)和PKCi (Go6983 0.5 μM)。
细胞：携带Oct4-GFP报道分子的WIBR3 hESC系(描述于Gafni等 Nature 2013；Dec12;504(7479):282-6. doi：10.1038/nature12745. Epub 2013 Oct 30)。
携带deltaPEOct4-GFP报道分子的WIBR3 hESC系(描述于Gafni等 Nature 2013；Dec 12;504(7479):282-6. doi：10.1038/nature12745. Epub 2013 Oct 30)。
将细胞在5% O2中在明胶/ DR4包被的板上扩增至多21代。
分析：通过FACS分析评估细胞的OCT4-GFP+报道分子或deltaPEOct4-GFP报告分子。
结果
图1是说明携带Oct4-GFP报道分子的WIBR3 hESC系的FACS分析的图。结果显示细胞在所述条件下维持其多能性。
图2是说明携带deltaPEOct4-GFP报道分子的WIBR3 hESC系的FACS分析的图。结果显示细胞在所述条件下维持其多能性。
实施例2
材料和方法
基础培养基
Neurobasal培养基(Invitrogen 21103-049)和DMEM/F12 (Biological Industries06-1170-50-1A)的1:1混合物 – 总共475 ml，Pen-strep 5 ml (Biological Industries03-033-1B)，L-谷氨酰胺5 ml (Biological Industries - 02-022-1B)，NEAA – 5 ml(Biological Industries 01-340-1B)，50 μL 50 mM储备β-巯基乙醇(1 vile)，5 ml B27补充剂(Invitrogen 17504-044)，胰岛素(Sigma I-1882 - 12.5微克/ml胰岛素)，脱铁运铁蛋白(Sigma T-1147，100 μg/ml终浓度)，孕酮(Sigma P8783，0.02 μg/ml终浓度)，腐胺(SigmaP5780，16 μg/ml终浓度)，***钠(Sigma S5261，每500 ml培养基添加5 μl 3 mM储备溶液)，L-抗坏血酸2-磷酸盐(Sigma A8960) (50 μg/ml终浓度)，BSA (100X级分V7.5%溶液Gibco 15260-037)。
补充剂
如实施例1中。
细胞：WIS2 hESC系
将细胞在5% O2中在玻连蛋白包被的板上扩增12代和20代。
分析：通过显微镜评估细胞。
结果
图3A-F是在所示选择条件下在P12的多能细胞集落的代表性图像。图3A - 条件1；图3B- 条件2；图3C - 条件3；图3D - 条件4；图3E - 条件9；图3F - 条件11。
图4A-D是在所示选择条件下在P20的多能细胞集落的代表性图像。图4A - 条件9；图4B - 条件10；图4C - 条件11；图4D - 条件4。
实施例3
材料和方法
基础培养基
Neurobasal培养基(Invitrogen 21103-049)和DMEM/F12 (Biological Industries06-1170-50-1A)的1:1混合物 – 总共475 ml，Pen-strep 5 ml (Biological Industries03-033-1B)，L-谷氨酰胺5 ml (Biological Industries - 02-022-1B)，NEAA – 5 ml(Biological Industries 01-340-1B)，50 μL 50 mM储备β-巯基乙醇(1 vile)，5 ml B27补充剂(Invitrogen 17504-044)，胰岛素(Sigma I-1882 - 12.5微克/ml胰岛素)，脱铁运铁蛋白(Sigma T-1147，100 μg/ml终浓度)，孕酮(Sigma P8783，0.02 μg/ml终浓度)，腐胺(SigmaP5780，16 μg/ml终浓度)，***钠(Sigma S5261，每500 ml培养基添加5 μl 3 mM储备溶液)，L-抗坏血酸2-磷酸盐(Sigma A8960) (50 μg/ml终浓度)，BSA (100X级分V7.5%溶液Gibco 15260-037 - 每500ml培养基瓶0.16ml)。
补充剂
如实施例1中。
细胞：WIS2 hESC系
将细胞在5% O2中在明胶/ DR4包被的板上扩增18-20代。
分析：将细胞针对碱性磷酸酶干细胞标志物(AP)染色并用显微镜评估。
结果
图5A-C是在所示选择条件下在P18-20的多能细胞集落的代表性图像。图5A - 条件9；图5B - 条件10；图5C - 条件4。
实施例4
材料和方法
基础培养基
Neurobasal培养基(Invitrogen 21103-049)和DMEM/F12 (Biological Industries06-1170-50-1A)的1:1混合物 – 总共475 ml，Pen-strep 5 ml (Biological Industries03-033-1B)，NEAA – 5 ml (Biological Industries 01-340-1B)，50 μL 50 mM储备β-巯基乙醇(1 vile)，5 ml B27补充剂(Invitrogen 17504-044)，胰岛素(Sigma I-1882 -12.5微克/ml胰岛素)，脱铁运铁蛋白(Sigma T-1147，100 μg/ml终浓度)，孕酮(SigmaP8783，0.02 μg/ml终浓度)，腐胺(SigmaP5780，16 μg/ml终浓度)，***钠(Sigma S5261，每500 ml培养基添加5 μl 3 mM储备溶液)，L-抗坏血酸2-磷酸盐(Sigma A8960) (50 μg/ml终浓度)，BSA (100X级分V 7.5%溶液Gibco 15260-037 - 每500ml培养基瓶0.16ml)。
补充剂
如实施例1中。
细胞：将FX71人iPSC系在5% O2中在明胶/ DR4饲养细胞包被的板上扩增。
分析：将细胞针对碱性磷酸酶干细胞标志物(AP)染色并用显微镜评估。
结果
图6A-F是在无L-谷氨酰胺的具体条件下扩增的人幼稚ESCs/iPSC的图像。图6A - 条件1；图6B - 条件2；图6C - 条件3；图6D - 条件4；图6E - 条件9；图6F - 条件11。显示了在不同的WIS-NHSM条件下的细胞的代表性图像，表明在这些条件下没有外源性L-谷氨酰胺补充的集落的扩增。
实施例5
材料和方法
基础培养基
Neurobasal培养基(Invitrogen 21103-049)和DMEM/F12 (Biological Industries06-1170-50-1A)的1:1混合物 - 总共475 ml。可选地，475 ml DMEM/F12 (无HEPES的Biological Industries 06-1170-50-1A)。培养基补充有：Pen-strep 5 ml (BiologicalIndustries 03-033-1B)，L-谷氨酰胺，5 ml 200 mM溶液(以2 mM终浓度) (BiologicalIndustries - 02-022-1B)，非必需氨基酸(NEAA；Biological Industries 01-340-1B) –5 ml X100溶液至总共500 ml培养基[X100溶液的组成:L-丙氨酸0.89克/升；L-天冬酰胺·H2O 1.50克/升；L-天冬氨酸1.33克/升；L-谷氨酸1.47克/升；甘氨酸0.75克/升；L-脯氨酸1.15克/升；和L-丝氨酸1.05克/升]，50 μl 50 mM储备β-巯基乙醇(1 vile)，10 ml B27补充剂(Invitrogen 17504-044)或不含异源物的B27 (Invitrogen A14867-01)，胰岛素(Sigma I-1882；12.5 μg/ml终浓度)，脱铁运铁蛋白(Sigma T-1147；100 μg/ml终浓度)，孕酮(Sigma P8783, 0.02 μg/ml终浓度)，腐胺(Sigma P5780；16 μg/ml终浓度)，***钠(Sigma S5261；每500 ml培养基5 μl 3 mM储备溶液，导致3 nM的终浓度)，人血清白蛋白(来自Biological Industries 05-720-1B的10 %溶液，每500 ml培养基瓶添加2 ml，导致0.4％人血清白蛋白的终浓度)或牛血清白蛋白(BSA) (100X级分V 7.5%溶液Gibco 15260-037，每500 ml培养基瓶添加0.16 ml，导致0.0024% BSA的终浓度)。
注意，根据本发明的一些实施方案的基础培养基不包括抗坏血酸，并且可以如下所示在一些培养基中补充抗坏血酸。
图7示意性说明本发明的一些实施方案的培养基的组成。
图8-12提供了添加至上文所述的基础培养基(实施例5中)的培养基补充剂的非限制性实例(条件41-131)，如下：
补充剂
培养基41：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)和PKCi (Go6983 2 μM)。
培养基42：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983 2 μM)和L-抗坏血酸(50 μg/ml)。
培养基43：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983 2 μM)和GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)。
培养基44：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)和L-抗坏血酸(50 μg/ml)。
培养基45：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)和ROCKi(Y27632 2 μM)。
培养基46：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632 2 μM)和SRCi (CGP77675, 1.5 μM)。
培养基47：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)和P38i(BIRB796, 1 μM)。
培养基48：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632 2 μM)和P38i (BIRB796, 1 μM)。
培养基49：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)和SRCi(CGP77675, 1.5 μM)。
培养基50：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632 2 μM)和RAFi (SB590885, 0.5 μM)。
培养基51：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 2.5 μM)、PKCi (Go6983 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)和RAFi(SB590885, 0.5 μM)。
培养基52：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 2.5 μM)、PKCi (Go6983 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632 2 μM)和P38i (BIRB796, 0.1 μM)。
培养基53：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 2.5 μM)、PKCi (Go6983 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、SRCi(CGP77675, 1.5 μM)和RAFi (SB590885, 0.5 μM)。
培养基54：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 2.5 μM)、PKCi (Go6983 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632 2 μM)、RAFi (SB590885, 0.5 μM)和SRCi (CGP77675, 1.5 μM)。
培养基55：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、RAFi(SB590885, 0.5 μM)和P38i (BIRB796, 0.1 μM)。
培养基56：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632 2 μM)、P38i (BIRB796, 0.1 μM)和SRCi (CGP77675, 1.5 μM)。
培养基57：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、SRCi(CGP77675, 1.5 μM)、RAFi (SB590885, 0.5 μM)和BMPi (LDN-193189, 0.2 μM)。
培养基58：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632 2 μM)、RAFi (SB590885, 0.5 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)和BMPi (LDN-193189 0.2 μM)。
培养基59：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、RAFi(SB590885, 0.5 μM)、P38i (BIRB796, 0.1 μM)和BMPi (LDN-193189 0.2 μM)。
培养基60：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632 2 μM)、P38i (BIRB796, 0.1 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)和BMPi (LDN-193189 0.2 μM)。
培养基61：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、SRCi(CGP77675, 1.5 μM)和BMP4 (5 ng/ml)。
培养基62：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632, 2 μM)、RAFi (SB590885, 0.5 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)和BMP4 (5 ng/ml)。
培养基63：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、RAFi(SB590885, 0.5 μM)、P38i (BIRB796, 0.1 μM)和BMP4 (5 ng/ml)。
培养基64：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632, 2 μM)、P38i (BIRB796, 0.1 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)和BMP4 (5 ng/ml)。
培养基65：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632, 2 μM)和BMP4 (5 ng/ml)。
培养基66：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)和BMP4 (5ng/ml)。
培养基67：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632, 2 μM)和BMP4 (5 ng/ml)。
培养基68：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、P38i(BIRB796, 0.1 μM)、ROCKi (Y27632, 2 μM)和BMP4 (5 ng/ml)。
培养基69：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632, 2 μM)和BMPi (LDN-193189, 0.2 μM)。
培养基70：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)和BMPi(LDN-193189, 0.2 μM)。
培养基71：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632, 2 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)和BMPi (LDN-193189, 0.2 μM)。
培养基72：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632, 2 μM)、P38i (BIRB796, 0.1 μM)和BMPi (LDN-193189, 0.2 μM)。
培养基73：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632, 2 μM)和FGFRi (PD173074, 0.1 μM)。
培养基74：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)和FGFRi(PD173074, 0.1 μM)。
培养基75：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632, 2 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)和FGFRi (PD173074, 0.1 μM)。
培养基76：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632, 2 μM)、P38i (BIRB796, 0.1 μM)和FGFRi (PD173074, 0.1 μM)。
培养基77：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、SRCi(CGP77675, 1.5 μM)和FGFRi (PD173074, 0.1 μM)。
培养基78：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632, 2 μM)、P38i (BIRB796, 0.1 μM)和FGFRi (PD173074, 0.1 μM)。
培养基79：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、P38i(BIRB796, 0.1 μM)和FGFRi (PD173074, 0.1 μM)。
培养基80：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、SRCi(CGP77675, 1.5 μM)、FGFRi (PD173074, 0.1 μM)和P38i (BIRB796, 1 μM)。
培养基81：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、SRCi(CGP77675, 1.5 μM)、RAFi (SB590885, 0.5 μM)和激活蛋白 A (20 ng/ml)。
培养基82：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632, 2 μM)、RAFi (SB590885, 0.5 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)和激活蛋白 A(20 ng/ml)。
培养基83：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、RAFi-SB590885, 0.5 μM, P38i (BIRB796, 0.1 μM)和激活蛋白 A (20 ng/ml)。
培养基84：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632, 2 μM)、P38i (BIRB796, 0.1 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)和激活蛋白 A (20ng/ml)。
培养基85：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901 1 μM)、AXINs (IWR1 2.5 μM)、PKCi (Go6983 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632 2 μM)和激活蛋白 A (20 ng/ml)。
培养基86：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)和激活蛋白A (20 ng/ml)。
培养基87：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632, 2 μM)和激活蛋白 A (20 ng/ml)。
培养基88：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、P38i(BIRB796, 0.1 μM)、ROCKi (Y27632, 2 μM)和激活蛋白 A (20 ng/ml)。
培养基89：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632, 2 μM)和TGFRi (SB431542, 2 μM)。
培养基90：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)和TGFRi(SB431542, 2 μM)。
培养基91：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632, 2 μM)、SRCi (CGP77675, 1.5 μM)、TGFRi (SB431542, 2 μM)。
培养基92：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632, 2 μM)、P38i (BIRB796, 0.1 μM)和TGFRi (SB431542, 2 μM)。
培养基93：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632, 2 μM)、FGFRi (PD173074, 0.1 μM)和TGFRi (SB431542, 2 μM)。
培养基94：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、FGFRi(PD173074, 0.1 μM) 和 TGFRi (SB431542, 2 μM)。
培养基95：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632, 2 μM)、FGFRi (PD173074, 0.1 μM)、TGFRi (SB431542, 2 μM)和SRCi(CGP77675, 1.5 μM)。
培养基96：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632, 2 μM)、P38i (BIRB796, 0.1 μM)、FGFRi (PD173074, 0.1 μM)和TGFRi(SB431542, 2 μM)。
培养基97：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、SRCi(CGP77675, 1.5 μM)、FGFRi (PD173074, 0.1 μM)和TGFRi (SB431542, 2 μM)。
培养基98：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632, 2 μM)、RAFi (SB590885, 0.5 μM)、FGFRi (PD173074, 0.1 μM)和TGFRi(SB431542, 2 μM)。
培养基99：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、SRCi(CGP77675, 1.5 μM)、FGFRi (PD173074, 0.1 μM)、TGFRi (SB431542, 2 μM) 和P38i(BIRB796, 0.1 μM)。
培养基100：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 4 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3 μM)和L-抗坏血酸(50 μg/ml)。
培养基101：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 4 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml) 和ROCKi(Y27632, 2 μM)。
培养基102：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 4 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml) 和P38i(BIRB796, 2 μM)。
培养基103：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 4 μM)、GSK3βi (CHIR99021 3 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632, 2 μM) 和P38i (BIRB796, 2 μM)。
培养基104：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 4 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、P38i(BIRB796, 2 μM) 和JNKi (SP600125, 5 μM)。
培养基105：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 4 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632, 2 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM) 和JNKi (SP600125, 5 μM)。
培养基106：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 4 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、P38i(BIRB796, 2 μM)和ERK5i (BIX02189, 5 μM)。
培养基107：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 4 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632, 2 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)和ERK5i (BIX02189, 5 μM)。
培养基108：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 4 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)和TGFRi(SB431542, 2 μM)。
培养基109：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 4 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632, 2 μM)和TGFRi (SB431542, 2 μM)。
培养基110：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 4 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)和FGFRi(PD173074, 0.1 μM)。
培养基111：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 4 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632, 2 μM)和FGFRi (PD173074, 0.1 μM)。
培养基112：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 4 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、P38i(BIRB796, 2 μM)和TGFRi (SB431542, 2 μM)。
培养基113：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 4 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632, 2 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)和TGFRi (SB431542, 2 μM)。
培养基114：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 4 μM)、 GSK3βi (CHIR99021, 3 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、P38i(BIRB796, 2 μM)和FGFRi (PD173074, 0.1 μM)。
培养基115：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 4 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632, 2 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)和FGFRi (PD173074, 0.1 μM)。
培养基116：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 4 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)和LSDi(TCP, 5 μM)。
培养基117：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 4 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632, 2 μM)和LSDi (TCP, 5 μM)。
培养基118：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 4 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、P38i(BIRB796, 2 μM)和LSDi (TCP, 5 μM)。
培养基119：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 4 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、P38i(BIRB796, 2 μM)和LSDi (TCP, 5 μM)。
培养基120：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 4 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)和毛喉素(5 μM)。
培养基121：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 4 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632, 2 μM)和毛喉素 (5 μM)。
培养基122：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 4 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、P38i(BIRB796, 2 μM)和毛喉素 (5 μM)。
培养基123：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 4 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632 2, μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)和毛喉素 (5 μM)。
培养基124：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 4 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)和DOT1Li(SGC0946, 5 μM)。
培养基125：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 4 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632, 2 μM)和DOT1Li (SGC0946, 5 μM)。
培养基126：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 4 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、P38i(BIRB796, 2 μM)和DOT1Li (SGC0946, 5 μM)。
培养基127：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 4 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632, 2 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)和DOT1Li (SGC0946, 5 μM)。
培养基128：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 4 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、P38i(BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125 5 μM)和ERK5i (BIX02189, 5 μM)。
培养基129：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 4 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632, 2 μM)、P38i (BIRB796, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)和ERK5i (BIX02189, 5μM)。
培养基130：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 4 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)和ERK5i(BIX02189, 5 μM)。
培养基131：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 4 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 3 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、ROCKi(Y27632, 2 μM)和ERK5i (BIX02189, 5 μM)。
如所提及，本发明的一些实施方案的培养基能够将幼稚PSC维持于幼稚状态下，其中：
(i) 当幼稚PSC是雌性PSC时，则幼稚雌性PSC具有X染色体失活特异性转录因子(XIST)基因的启动子的两个未甲基化等位基因；和
(ii) 当幼稚PSC是雄性PSC时，则幼稚雄性PSC具有XIST基因的启动子的一个未甲基化等位基因，
和/或
所述幼稚PSC中的转录因子E3(TFE3)的表达水平的特征在于如通过免疫染色测定法确定的等于或高于1的细胞核与细胞质表达比率。
图17A-E显示了如XIST启动子(SEQ ID NO:70中所示的扩增子)中确定的这种非甲基化等位基因的实例。这些结果结论性地证明，在所有测试的培养基上培养的雄性和雌性幼稚hESCs/iPSC在各种WIS-NHSM条件下保持独特的前-X失活状态。
相比之下，图17F显示了非幼稚细胞的实例，其中雄性细胞中的XIST等位基因被完全甲基化(即，XIST启动子中的大多数CpG位点被甲基化)，并且XIST基因的启动子的一个等位基因在雌性细胞中被甲基化。
此外，下文表1概述了本发明的一些实施方案的培养基中培养的幼稚PSC中的相对细胞核/细胞质TFE3富集(平均值)。
表1
相对细胞核/细胞质TFE3富集(平均值) 培养基包含：
1.4 Srci 1 μM, ERK1/2i 1 μM, LIF 20 ng/ml
1.4 AXINs 5 μM, ERK1/2i 1 μM, LIF 20 ng/ml
1.7 AXINs 5 μM, ERK1/2i 1 μM, LIF 20 ng/ml, PKCi 4 μM, GSK3i 1.5 μM
1.7 AXINs 5 μM, ERK1/2i 1 μM, LIF 20 ng/ml, PKCi 4 μM, GSK3i 1.5 μM, P38i 2 μM, JNKi 5 μM
1.7 AXINs 5 μM, ERK1/2i 1 μM, LIF 20 ng/ml, PKCi 4 μM, GSK3i 1.5 μM, P38i 2 μM, JNKi 5 μM, SRCi 1 μM
表1：将幼稚PSC在指定培养基中在DR4照射MEF细胞和0.2％明胶包被的板上在5% O2条件下、在37℃下扩增14天。所有培养基都包括L-抗坏血酸(以50 μg/ml的终浓度)。小分子缩写的关键：LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901 1 μM), AXINs (IWR1 5 μM), PKCi(Go6983 4 μM), GSK3βi (CHIR99021 1.5 μM), P38i (BIRB796 2 μM), JNKi (SP6001255 μM), SRCi (CGP77675 1 μM)。
如上表1中所示，所有测试的培养基都能够将幼稚PSC维持在幼稚状态下，其特征在于细胞核和细胞质TFE3富集之间高于1的比率。
实施例6
材料和方法
基础培养基
Neurobasal培养基(Invitrogen 21103-049)和DMEM/F12 (Biological Industries06-1170-50-1A)的1:1混合物 - 总共475 ml。可选地，475 ml DMEM/F12 (无HEPES的Biological Industries 06-1170-50-1A)。培养基补充有：Pen-strep 5 ml (BiologicalIndustries 03-033-1B)，L-谷氨酰胺，5 ml 200 mM溶液(以2 mM终浓度) (BiologicalIndustries - 02-022-1B)，非必需氨基酸(NEAA；Biological Industries 01-340-1B) –5 ml X100溶液至总共500 ml培养基[X100溶液的组成:L-丙氨酸0.89克/升；L-天冬酰胺·H2O 1.50克/升；L-天冬氨酸1.33克/升；L-谷氨酸1.47克/升；甘氨酸0.75克/升；L-脯氨酸1.15克/升；和L-丝氨酸1.05克/升]，50 μl 50 mM储备β-巯基乙醇(1 vile)，10 ml B27补充剂(Invitrogen 17504-044)或不含异源物的B27 (Invitrogen A14867-01)，胰岛素(Sigma I-1882；12.5 μg/ml终浓度)，脱铁运铁蛋白(Sigma T-1147；100 μg/ml终浓度)，孕酮(Sigma P8783, 0.02 μg/ml终浓度)，腐胺(Sigma P5780；16 μg/ml终浓度)，***钠(Sigma S5261；每500 ml培养基5 μl 3 mM储备溶液，导致3 nM的终浓度)，人血清白蛋白(来自Biological Industries 05-720-1B的10 %溶液，每500 ml培养基瓶添加2 ml，导致0.4％人血清白蛋白的终浓度)或牛血清白蛋白(BSA) (100X级分V 7.5%溶液Gibco 15260-037，每500 ml培养基瓶添加0.16 ml，导致0.0024% BSA的终浓度)。
注意，根据本发明的一些实施方案的基础培养基不包括抗坏血酸，并且可以如下所示在一些培养基中补充抗坏血酸。
图18示意性说明本发明的一些实施方案的培养基的组成。
图19提供了添加至上文所述的基础培养基(实施例6中)的培养基补充剂的非限制性实例(图19中的条件132-147)，如下：
补充剂
培养基132：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、SRCi (CGP77675, 0.5 μM)、P38i (BIRB796, 0.25 μM)、G9ai (BIX01294,0.5 μM)和ROCKi (Y27632, 2 μM)。
培养基133：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、SRCi (CGP77675, 0.5 μM)、P38i (BIRB796, 0.25 μM)和G9ai(BIX01294, 0.5 μM)。
培养基134：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、SRCi(CGP77675, 0.5 μM)、P38i (BIRB796, 0.25 μM)、G9ai (BIX01294, 0.5 μM)和ROCKi(Y27632, 2 μM)。
培养基135：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、SRCi (CGP77675, 0.5 μM)、P38i (BIRB796, 0.25 μM)和ROCKi(Y27632, 2 μM)。
培养基136：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、SRCi (CGP77675, 0.5 μM)、G9ai (BIX01294, 0.5 μM)和ROCKi(Y27632, 2 μM)
培养基137：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、SRCi (CGP77675, 0.5 μM)和G9ai (BIX01294, 0.5 μM)。
培养基138：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、SRCi(CGP77675, 0.5 μM)、G9ai (BIX01294, 0.5 μM)和ROCKi (Y27632, 2 μM)。
培养基139：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、SRCi (CGP77675, 0.5 μM)和ROCKi (Y27632, 2 μM)。
培养基140：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、SRCi (CGP77675, 0.5 μM)、P38i (BIRB796, 0.25 μM)、G9ai(BIX01294, 0.5 μM)、ROCKi (Y27632, 2 μM)和RAFi (SB590885, 0.25 μM)。
培养基141：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、SRCi (CGP77675, 0.5 μM)、P38i (BIRB796, 0.25 μM)、G9ai(BIX01294, 0.5 μM)和RAFi (SB590885, 0.25 μM)、
培养基142：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、SRCi(CGP77675, 0.5 μM)、P38i (BIRB796, 0.25 μM)、G9ai (BIX01294, 0.5 μM)、ROCKi(Y27632, 2 μM)和RAFi (SB590885, 0.25 μM)
培养基143：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、SRCi (CGP77675, 0.5 μM)、P38i (BIRB796, 0.25 μM)、ROCKi (Y27632, 2μM)和RAFi (SB590885, 0.25 μM.
培养基144：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、SRCi (CGP77675, 0.5 μM)、P38i (BIRB796, 0.25 μM)、G9ai (BIX01294,0.5 μM)、ROCKi (Y27632, 2 μM)和SCF (20 ng/ml)
培养基145：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、SRCi (CGP77675, 0.5 μM)、P38i (BIRB796, 0.25 μM)、G9ai (BIX01294,0.5 μM)和SCF (10 ng/ml)、
培养基146：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、SRCi(CGP77675, 0.5 μM)、P38i (BIRB796, 0.25 μM)、G9ai (BIX01294, 0.5 μM)、ROCKi(Y27632, 2 μM)和SCF (10 ng/ml)。
培养基147：LIF (20 ng/ml)、ERK1/2i (PD0325901, 1 μM)、AXINs (IWR1, 5 μM)、PKCi (Go6983, 2 μM)、JNKi (SP600125, 5 μM)、GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM)、L-抗坏血酸(50 μg/ml)、SRCi (CGP77675, 0.5 μM)、P38i (BIRB796, 0.25 μM)、ROCKi(Y27632, 2 μM)和SCF (10 ng/ml)。
实验结果
图20-21证明，上文所述的培养基(培养基132-147)中的任一种将人多能干细胞维持在幼稚未分化和多能状态下。
图22A-C显示了幼稚和致敏的多能干细胞的XIST启动子(SEQ ID NO:70中所示的扩增子)的甲基化测定的实例。图22A-B的这些结果结论性地证明，在所有测试的培养基上培养的雄性和雌性幼稚hESCs/iPSC在各种WIS-NHSM条件下保持独特的前-X失活状态。
相比之下，图22C显示了非幼稚细胞的实例，其中雄性细胞中的XIST等位基因被完全甲基化(即，XIST启动子中的大多数CpG位点被甲基化)，并且XIST基因的启动子的一个等位基因在雌性细胞中被甲基化。
为了测试本发明的一些实施方案的培养基维持幼稚PSC状态的能力，在细胞的细胞核和细胞质中测量TFE3的水平，并确定相对比率。将WIBR3 hESC在指定的条件下在Matrigel包被的板上在5% O2中在37℃下扩增14天。所有培养基都包括L-抗坏血酸(50 μg/ml)。
下文的表2概述了本发明的一些实施方案的培养基中培养的幼稚PSC中的相对细胞核/细胞质TFE3富集(平均值)。
表2
相对细胞核/细胞质TFE3 富集(平均值) 培养基包含：
1.8 AXINs 5μM, ERK1/2i 1μM, LIF 20 ng/ml, PKCi 2 μM,GSK3i 1.5 μM, P38i 0.25 μM,JNKi 5 μM, SRCi 0.5 μM
1.9 AXINs 5 μM, ERK1/2i 1 μM, LIF 20 ng/ml, PKCi 2 μM, GSK3i 1.5 μM, P38i 0.25 μM,JNKi 5 μM, SRCi 0.5 μM, G9ai 0.5 μM
0.6 作为阴性对照的致敏的WIBR3 ESC的条件：(由Stem Cell Technologies)在mTESRTM (FGF2/TGFbeta1)条件下扩增的致敏的细胞
表 2：将幼稚PSC在指定培养基中在DR4照射MEF细胞和0.2％明胶包被的板上在5% O2条件下、在37℃下扩增14天。所有培养基都包括L-抗坏血酸(以50 μg/ml的终浓度)。小分子缩写的关键：小分子缩写的关键：LIF (20ng/ml), ERK1/2i (PD0325901 1μM)，AXINs(IWR1 5μM)，PKCi (Go6983 2μM)，GSK3βi (CHIR99021 1.5μM)，P38i (BIRB796 0.25μM)，JNKi (SP600125 5μM)，SRCi (CGP77675 0.5 μM)和G9ai (BIX01294 0.5 μM)。
如上表2中所示，幼稚hESCs/iPSC保留优先的TFE3细胞核定位。因此，所有测试的幼稚条件的培养基都能够将幼稚PSC维持在幼稚状态下，其特征在于细胞核和细胞质TFE3富集之间高于1的比率。相比之下，当使用致敏的PSC的条件(例如，mTESRTM (FGF2/TGFbeta1)条件(由Stem Cell Technologies))时，细胞核与细胞质TFE3之间的比率低于1。
实施例7
之前描述的缺乏内源DNA甲基转移酶1(DNMT1)等位基因并在Tet-Off启动子下保留外源DNMT1等位基因的HUES64细胞系(Liao J, 等 2015.“Targeted disruption of DNMT1,DNMT3A and DNMT3B in human embryonic stem cells”.Nat Genet.2015 May;47(5):469-78.doi:10.1038/ng.3258.Epub 2015 Mar 30；其作为引用完全并入本文)用于以下实验中。将细胞在指定的条件(表3)下在有或没有多西环素的情况下在明胶/DR4包被的板上扩增10代(P10)，并且在存活细胞中将培养物针对OCT4多能性标志物进行免疫染色。在mTESRTM中扩增的致敏的细胞不耐受通过在这些工程改造细胞上添加DOX诱导的DNMT1表达的损失。在本发明的一些实施方案的培养基(培养基138和136)中扩增的细胞保留其多能性，如通过高百分比的OCT4阳性细胞(93％和97％)所指示，虽然在工程改造的***中丢失DNMT1表达(上面两个实例)。这些结果表明虽然DNMT1表达丢失，人幼稚、但不是致敏的多能细胞可以维持它们的多能性。
表3
表3：小分子缩写的关键：LIF (20 ng/ml)，ERK1/2i (PD0325901 1μM)，AXINs (IWR1 5μM)，PKCi (Go6983 2 μM)，GSK3βi (CHIR99021 1.5 μM)
P38i (BIRB796 0.25 μM)，JNKi (SP600125 5 μM)，SRCi (CGP77675 0.5 μM)，G9ai(BIX01294 0.5 μM)，ROCKi (Y27632 2 μM)。
实施例8
本发明的幼稚PSC可用于产生相同或跨物种的嵌合体
由于各种原因，将来自一种物种幼稚PSC的注入另一个物种的早期胚胎中可能胜出，所述原因包括：细胞周期进程的差异，对宿主形态发生的反应性降低，妊娠时机的差异等。为了增加宿主动物中嵌合体的效率，本发明人已经发现，可以在跨物种嵌合测定中采用“细胞欺骗”或“细胞竞争”的原理。为了该目的，本发明人采用维持“幼稚状态”并将其遗传工程改造为表现出降低水平的P53的分离的幼稚人PSC。将具有降低的p53表达的分离的遗传改造的幼稚PSC进一步注入宿主小鼠胚胎中，并分析正在发育的胚胎的嵌合水平。如下所示，虽然显示野生型(WT)幼稚PSC能够有助于发育成小鼠胚胎，但“欺骗”P53耗竭的幼稚PSC产生嵌合水平显著更高的贡献效率。
实验方法：
LIS38 tg-pTrip lck EGFP p53 crispr C2克隆的产生 -
本发明人已经应用CRISPR/CAS9技术来产生P53蛋白耗竭的突变体。设计靶向人P53的外显子3的sgRNA(单链指导RNA)序列，并且建立并验证该区域具有缺失的幼稚PSC的p53蛋白水平的耗竭。这些细胞系在跨物种嵌合测定中用作“超级竞争剂”，因为它们被显微注入E2.5小鼠胚胎中，并允许其进一步发育以测试正在发育的小鼠胚胎中的人(GFP+)细胞检测。
实验结果
将LIS 38 EGFP hTP53 C2幼稚人iPS细胞显微注入小鼠桑椹胚产生跨物种嵌合人源化 小鼠
图23A-D描述了LIS38 tg-pTrip lck EGFP p53 crispr C2克隆的产生，以及该克隆的PSC细胞中的p53表达的不存在。
如图24A-B中所示，用LIS 38 EGFP hTP53 C2幼稚人iPS细胞注入小鼠桑椹胚的胚胎产生跨物种嵌合人源化小鼠。显示了代表性图像，其证明GFP-标记的人幼稚iPS衍生的细胞广泛整合入E9.5小鼠胚胎的不同位置。Hoechst和CellTracker用于复染。
这些结果结论性地显示，P53耗竭和/或过表达显性失活P53突变体、c-MYC、n-MYC、L-MYC、EDAR或ERAS的幼稚人或非人灵长类动物iPSCs/ESC(Dejosez M等, 2013, Science.2013 Sep 27;341(6153):1511-4;和Clavería C.,等, 2013, Nature. 500(7460):39-44)，当注入相同或不同物种的宿主植入前胚胎(囊胚，桑椹胚)以产生相同物种或跨物种嵌合体时，可以用作竞争细胞。
虽然结合其具体实施方案描述了本发明，但显然，许多替代方案、修改和变化对于本领域技术人员而言将是显而易见的。因此，旨在包括落入随附权利要求书的精神和宽大范围内的所有这样的替代方案、修改和变化。
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用全文并入本说明书，其程度就像各个出版物、专利或专利申请具体且单独指明通过引用并入本文一样。另外，本申请中任何参考文献的引用或鉴定不应解释为承认这样的参考文献可作为本发明的现有技术获得。在使用章节标题的程度上，它们不应解释为必要限制性的。
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Claims (50)

1.培养基，其包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂和轴蛋白稳定剂。
2.权利要求1的培养基，其还包含PKC抑制剂。
3.培养基，其包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、轴蛋白稳定剂和PKC抑制剂。
4.权利要求1、2或3的培养基，其还包含至少一种选自以下的试剂：ROCK抑制剂、SRC抑制剂、抗坏血酸、PKA激动剂、YAP/TAZ抑制剂、NOTCH抑制剂、SHH抑制剂、TGFβR抑制剂、BMP抑制剂、FGFR抑制剂、JNK抑制剂、ERK5抑制剂、BRAF抑制剂、ARAFi、CRAFi、p38抑制剂、GSK3b抑制剂、LSD1抑制剂、PI3K激活剂、SMAD激活剂和DOT1L抑制剂。
5.权利要求4的培养基，其中所述SMAD激活剂选自：激活蛋白A、TGFβ1和BMP4。
6.权利要求1-5中任一项的培养基，其还包含GSK3b抑制剂。
7.培养基，其包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、轴蛋白稳定剂、PKC抑制剂和GSK3b抑制剂。
8.权利要求1-7中任一项的培养基，其还包含至少一种选自以下的试剂：碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子受体(TGFR)抑制剂、GSK3b抑制剂、ROCK抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、NOTCH抑制剂、SRC抑制剂、***1 (IGF1)、***II (IGFII)、骨形态发生蛋白(BMP)信号传导抑制剂、Sonic Hedgehog通路(SHH)抑制剂、ERK5抑制剂、毛喉素、Kenpaullone、BayK8644、G9a的抑制剂、Glp的抑制剂、干细胞因子(SCF)、YAP/TAZ抑制剂、L-抗坏血酸、LSD1抑制剂和DOT1L抑制剂。
9.培养基，其包含ERK1/2抑制剂、STAT3激活剂和SRC抑制剂。
10.权利要求9的培养基，其还包含轴蛋白复合物稳定剂(AXINs)。
11.权利要求9或10的培养基，其还包含GSK3β抑制剂。
12.权利要求9-11中任一项的培养基，其还包含p38抑制剂。
13.培养基，其包含ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、p38抑制剂、STAT3激活剂和至少一种选自SRC抑制剂和轴蛋白复合物稳定剂(AXINs)的试剂。
14.权利要求9-13中任一项的培养基，其还包含ROCK抑制剂。
15.权利要求9-14中任一项的培养基，其还包含JNK抑制剂。
16.权利要求9-14中任一项的培养基，还包含TGF诱导物，其中所述TGF诱导物选自转化生长因子β1(TGFβ1)、转化生长因子β2(TGFβ2)和激活蛋白。
17.权利要求9-16中任一项的培养基，其还包含蛋白激酶C(PKC)抑制剂和/或BMP抑制剂。
18.权利要求9-17中任一项的培养基，其还包含至少一种选自以下的额外试剂：***1 (IGF1)、***II (IGFII)、骨形态发生蛋白4 (BMP4)、SonicHedgehog通路(SHH)抑制剂、ERK5抑制剂、毛喉素、Kenpaullone、BayK8644、G9a的抑制剂、Glp的抑制剂和干细胞因子(SCF)。
19.权利要求9-13中任一项的培养基，其包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、bFGF、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂和SRC家族激酶抑制剂。
20.权利要求9-13中任一项的培养基，其包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、SRC家族激酶抑制剂和PKC抑制剂。
21.权利要求9-13中任一项的培养基，其包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、SRC家族激酶抑制剂和PKC抑制剂。
22.权利要求9-13中任一项的培养基，其包含STAT3激活剂、ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、TGFβ1、ROCK抑制剂、轴蛋白稳定剂、SRC家族激酶抑制剂、FGF受体抑制剂和PKC抑制剂。
23.培养基，其包含ERK1/2抑制剂、GSK3β抑制剂、p38抑制剂、JNK抑制剂、STAT3激活剂、转化生长因子β受体(TGFβR)抑制剂、PKC抑制剂、p38抑制剂和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
24.权利要求23的培养基，其还包含至少一种选自以下的试剂：BMP抑制剂、ROCK抑制剂、SRC抑制剂和轴蛋白复合物稳定剂(AXINs)的试剂。
25.细胞培养物，其包含细胞和权利要求1-24中任一项的培养基。
26.产生幼稚多能干细胞(PSC)的方法，其包括：
在权利要求1-24中任一项的培养基中培育非幼稚PSC细胞，其允许从所述非幼稚PSC产生幼稚PSC，其中：
(i) 当所述幼稚PSC是雌性PSC时，则所述幼稚雌性PSC具有X染色体失活特异性转录因子(XIST)基因的启动子的两个未甲基化等位基因；和
(ii) 当所述幼稚PSC是雄性PSC时，则所述幼稚雄性PSC具有所述XIST基因的所述启动子的一个未甲基化等位基因，
和/或
所述幼稚PSC中的转录因子E3(TFE3)的表达水平的特征在于如通过免疫染色测定法确定的等于或高于1的细胞核与细胞质表达比率，
和/或
幼稚PSC的特征在于所述幼稚PSC的细胞表面上的C-KIT (CD117)的阳性表达，
由此产生幼稚PSC。
27.权利要求26的方法，其中所述培养基还包含MBD3抑制剂。
28.权利要求26-27中任一项的方法，其中所述培养基还包含克罗莫结构域解旋酶DNA结合蛋白4(CHD4)抑制剂。
29.权利要求26-28中任一项的方法，其中所述培养基还包含P66α卷曲-螺旋结构域或p66α抑制剂。
30.改善从体细胞产生诱导多能干细胞(iPSC)的方法，其包括：
(a) 在体细胞内表达选自Nanog、ESRRB、KLF2、TBX3、ERAS和KLF17的第一因子和选自Nanog、ESRRB、KLF2、TBX3、ERAS、Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc和KLF17的第二因子，其中第一和第二因子是不同的；和
(b) 抑制所述体细胞中的Mbd3和/或Gatad2a表达和/或活性，
由此改善从体细胞产生iPSC。
31.权利要求30的方法，其中所述抑制所述Mbd3活性通过抑制所述Mbd3与核小体重塑和脱乙酰酶(NuRD)复合物的结合来进行，其中所述抑制所述Mbd3与NuRD复合物的所述结合使用P66 α卷曲-螺旋结构域来进行。
32.权利要求30的方法，其还包括在所述体细胞中外源表达ES细胞表达的Ras(ERAS)编码序列或激活所述ERAS的内源表达。
33.权利要求30的方法，其中所述表达进行至少48小时，使得将所述抑制所述Mbd3实现至所述表达之前的所述Mbd3的水平的10-30％。
34.权利要求30-33中任一项的方法，其中当所述iPSC是鼠iPSC时，所述方法还包括在包含LIF、ERK1/2抑制剂、GSK3b抑制剂的培养基中培养所述鼠iPSC。
35.权利要求34的方法，其中所述培养基还包含选自SRC抑制剂和轴蛋白复合物稳定剂(AXINs)的试剂。
36.权利要求30-33中任一项的方法，其中当所述iPSC是人iPSC时，所述方法还包括：
(c) 在包含LIF、ERK1/2抑制剂、GSK3b抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子-β1(TGFβ1)的培养基中培养所述人iPSC。
37.权利要求36的方法，其中所述培养基还包含ROCK抑制剂。
38.权利要求36或37的方法，其中所述培养基还包含SRC抑制剂和轴蛋白复合物稳定剂(AXINs)。
39.权利要求36或37的方法，其中步骤(c)在从步骤(a)的所述表达起约48小时后进行。
40.权利要求8和18中任一项的培养基、权利要求25的细胞培养物或权利要求26-29中任一项的方法，其中所述G9a的所述抑制剂和/或所述Glp的所述抑制剂选自：BIX01294和UNC0638。
41.分离的幼稚多能干细胞，其经遗传修饰以过表达选自C-MYC、N-MYC、L-MYC、EDAR(外胚层发育异常蛋白A受体)、MDM2和ERAS的致癌蛋白，和/或下调选自P53和NFκB抑制剂α的肿瘤抑制蛋白。
42.权利要求41的分离的幼稚多能干细胞，其中所述肿瘤抑制基因的下调通过将所述肿瘤抑制蛋白的显性失活突变体引入细胞来进行。
43.权利要求42的分离的幼稚多能干细胞，其中所述肿瘤抑制蛋白的所述显性失活体包含 SEQ ID NO:150中所示的NFκB抑制剂α蛋白中的NFκB抑制剂αS32D和S36D突变、S32E和S36E突变、S32D和S36E突变和/或S32E和S36D突变。
44.权利要求41的分离的幼稚多能干细胞，其中
(i) 当所述幼稚PSC是雌性PSC时，则所述幼稚雌性PSC具有X染色体失活特异性转录因子(XIST)基因的启动子的两个未甲基化等位基因；和
(ii) 当所述幼稚PSC是雄性PSC时，则所述幼稚雄性PSC具有所述XIST基因的所述启动子的一个未甲基化等位基因，
和/或
所述幼稚PSC中的转录因子E3(TFE3)的表达水平的特征在于如通过免疫染色测定法确定的等于或高于1的细胞核与细胞质表达比率，
和/或
所述幼稚PSC的特征在于幼稚PSC的细胞表面上的C-KIT (CD117) 的阳性表达。
45.产生嵌合动物的方法，其包括将权利要求41-44中任一项的分离的幼稚多能干细胞引入宿主动物的胚胎中，由此产生所述嵌合动物。
46.权利要求45的方法，其中所述胚胎是植入前胚胎。
47.权利要求45的方法，其还包括测试所述嵌合动物中的嵌合的水平。
48.细胞培养物，其包含权利要求41-44中任一项的分离的幼稚多能干细胞和培养基。
49.权利要求48的细胞培养物，其中所述培养基能够将所述多能干细胞在幼稚状态下维持至少5代。
50.权利要求48或49的细胞培养物，其中所述培养基是权利要求1-24中任一项的培养基。
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Shahbazi et al. Narges Zare Mehrjardi, 3 Patrick Günther, 4 Angelika Lampert, 5, 6 Kristian Händler, 4 Firuze Fulya Hatay, 3 Diana Schmidt, 5, 7 Marek Molcanyi, 3 Jürgen Hescheler, 3 Joachim L. Schultze, 4 Tomo Saric, 3,* and Hossein Baharvand
Chong Defining the origin of adult cardiac multipotent colony forming stem cells

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