CN108235708B - 扩增造血干细胞和/或造血祖细胞的培养体系及其方法、造血干细胞以及造血祖细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种扩增造血干细胞和/或造血祖细胞的培养体系及其方法、造血干细胞以及造血祖细胞。所述培养体系包括：基础培养基，该基础培养基适于干细胞扩增；以及JNK信号通路抑制剂。本发明提供的培养体系能够在体外扩增造血干细胞，其扩增效果明显，能够将CD34+CD45RA‑标记的造血干细胞扩增近100倍。
Description
技术领域
本发明主要涉及生物技术与医学领域，具体涉及扩增造血干细胞和/或造血祖细胞的培养体系及其方法、造血干细胞以及造血祖细胞。
背景技术
造血干细胞是一类具备自我更新能力和多向分化潜能并且能够在体内完成长期(至少4个月)造血重建的血液干细胞。造血祖细胞相比于造血干细胞，其重建能力较弱，无法长期维持体内重建水平，一般2个月之内，其重建细胞会逐渐丢失。1961年，科学家采用小鼠体内脾结节的方法第一次证明了造血干细胞的存在。之后，美国的Weissman等多个实验室通过对造血干细胞表面标记蛋白的研究和功能验证，拓展了人们对造血干细胞的认识。当前，CD34+CD45RA-表面蛋白标记的细胞可以初步判断富集了造血干祖细胞(即造血干细胞和造血祖细胞)，CD34+CD38-CD90+CD45RA-CD49f+标记的细胞被认为是具备长期造血重建能力的造血干细胞(LT-HSC)。
临床上治疗白血病等血液疾病最有效的方式就是移植造血干细胞，而骨髓配型困难等因素造成约40％病人无法配型成功。虽然脐带血中的造血干细胞具备免疫原性低等诸多优势，但是脐带血中有限的造血干细胞数量限制了其临床应用。因此，如何在体外高效地扩增脐带血来源的造血干细胞具备重大的科学研究价值和临床应用价值。
c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)家族是促***原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)超家族成员之一。目前在哺乳动物细胞中发现的编码JNK的基因包括jnk1、jnk2和jnk3，其相应的编码产物JNK1和JNK2表达广泛，JNK3则主要表达于神经***。以JNK为中心的JNK信号通路是MAPK(mitogen-activatedprotein kinase，丝裂原活化蛋白激酶)通路的一个重要分支，1991年被发现后，受到科学家广泛关注，不过相比于MAPK通路的另外两种亚型：P38和ERK，其相关研究较少。JNK信号通路在细胞分化、细胞凋亡、应激反应等多种细胞调控方面起着至关重要的作用，大量实验证实其与许多疾病有着密切的联系，因此，抑制JNK信号通路成为了治疗多种疾病的一种手段。JNK信号通路抑制剂主要用于各种癌细胞的研究，据报道JNK抑制剂能够抑制小鼠模型中膀胱癌和肺癌细胞的增生，并且可以观察到明显肿瘤萎缩现象。JNK信号通路抑制剂同时在调控多潜能干细胞自我更新和分化方面也发挥了重要的作用。2014年，自然杂志报道的Jacob Hanna实验室利用化学小分子组合(其中包括JNK抑制剂SP600125)将多潜能干细胞保持在更加原始的状态，提高了胚胎嵌合能力。但是，目前，利用JNK小分子抑制剂扩增人的造血干细胞的研究尚未见报道。
小分子化合物是一类分子量小于1000道尔顿的天然分子产物或人工合成化合物，具备一定的生物学功能。由于小分子具有细胞渗透性高、合成简单、不破坏细胞基因组等优点，在临床研究中备受关注。2010年，嘌呤衍生物StemRegenin(SR1)化合物是第一个被发现的能够在体外大量扩增造血干祖细胞的小分子物质，SR1通过抑制AHR信号通路，扩增了CD34+细胞，在免疫缺陷型小鼠体内检测到的外源造血细胞提高了17倍。2014年，加拿大的研究团队通过小分子高通量筛选平台，发现嘧啶吲哚分子UM171能够有效扩增LT-HSC，并维持重建造血功能长达6个月，拓展了脐带血造血干细胞在临床上的应用价值和范围。然而，小分子化合物的作用靶点广泛，其作用信号通路不够单一，可能会限制其临床应用规模。
发明内容
本发明的目的在于提供扩增造血干细胞和/或造血祖细胞的培养体系及其方法、造血干细胞以及造血祖细胞。
本发明提供了一种扩增造血干细胞和/或造血祖细胞的培养体系，其特征在于，包括：基础培养基，所述基础培养基适于干细胞扩增；以及JNK信号通路抑制剂。所述JNK信号通路抑制剂优选为小分子化合物。
优选地，根据前述的培养体系，其中，所述JNK信号通路抑制剂选自JNK1抑制剂、JNK2抑制剂和JNK3抑制剂中的一种或多种。
优选地，根据前述的培养体系，其中，所述JNK信号通路抑制剂选自SP600125、AS601245和AEG-3482中的一种或多种。
其中，SP600125的化学结构式如下：
AS601245的化学结构式如下：
AEG-3482的化学结构式如下：
或优选地，根据前述的培养体系，所述JNK信号通路抑制剂为如下JNK-IN-1至JNK-IN-12中任一所示的化合物：
上述JNK信号通路抑制剂根据Tinghu Zhang等(Chem Biol.2012January 27；19(1):140–154)进行构建。
更优选地，根据前述培养体系，其中，所述基础培养基包括stemspan基础培养基(stemspan)1-100ml；重组人干细胞因子(SCF)10-500ng/ml；Flt3配体(FL)10-100ng/ml，优选为50-100ng/ml；重组人血小板生成素(TPO)5-100ng/ml，优选为5-50ng/ml；低密度脂蛋白(LDL)2-10μg/ml和JNK信号通路抑制剂0.5-10uM，优选为0.5-5μM。
本发明还提供了一种扩增造血干细胞和/或造血祖细胞的方法，其中，在JNK信号通路抑制剂的存在下，将造血干细胞和/或造血祖细胞在体外进行培养。
优选地，根据前述的方法，其中，所述JNK信号通路抑制剂选自JNK1抑制剂、JNK2抑制剂和JNK3抑制剂中的一种或多种。
优选地，根据前述的方法，其中，所述JNK信号通路抑制剂选自SP600125、AS601245和AEG-3482中的一种或多种。
优选地，根据前述的方法，其中，所述JNK信号通路抑制剂为如下JNK-IN-1至JNK-IN-12中任一所示的化合物：
或优选地，根据前述的方法，其中，伴有stemspan基础培养基、重组人干细胞因子、Flt3配体、重组人血小板生成素和低密度脂蛋白的添加。
更优选地，根据前述的方法，其中，所述造血干细胞和/或造血祖细胞来源于骨髓、肝脏、脾脏、外周血或脐带血。
本发明还提供了一种造血干细胞，其中，所述造血干细胞通过上述培养体系扩增而得，或采用上述方法扩增而得。具体为来自脐带血的CD34+细胞通过上述培养体系扩增或采用上述方法扩增制备所述造血干细胞。
本发明还提供了一种造血祖细胞，其中，所述造血祖细胞通过上述培养体系扩增而得，或采用上述方法扩增而得。具体为来自脐带血的CD34+细胞通过上述培养体系扩增或采用上述方法扩增制备所述造血祖细胞。
本发明提供的培养体系能够在体外扩增造血干细胞，其扩增效果明显，能够将CD34+CD45RA-标记的造血干细胞扩增近100倍。
本发明提供的培养体系及其扩增方法采用作用靶点明确的化学小分子，临床使用更加安全。
采用本发明提供的培养体系扩增的造血干细胞和/或造血祖细胞具备较好的体内重建能力，与不加小分子化合物的实验组相比，体内重建效果提高了10倍。
附图说明
图1为实施例1培养到第7天，检测的CD34+CD45RA-细胞相对于原代细胞扩增倍数；
图2为实施例1体内移植实验的骨髓重建比例；
图3为实施例1体内移植实验的外周血重建比例；
图4为实施例2培养到第7天，检测的CD34+CD45RA-细胞相对于原代细胞扩增倍数；
图5为实施例2体内移植实验的骨髓重建比例；
图6为实施例2体内移植实验的外周血重建比例；
图7为实施例3培养到第7天，检测的CD34+CD45RA-细胞相对于原代细胞扩增倍数；
图8为实施例3体内移植实验的骨髓重建比例；
图9为实施例3体内移植实验的外周血重建比例；
图10为实施例4培养到第7天，检测的CD34+CD45RA-细胞相对于原代细胞扩增倍数；
图11为实施例4体内移植实验的骨髓重建比例；
图12为实施例4体内移植实验的外周血重建比例；
图13为实施例5培养到第7天，检测的CD34+CD45RA-细胞相对于原代细胞扩增倍数；
图14为实施例5体内移植实验的骨髓重建比例；
图15为实施例5体内移植实验的外周血重建比例；
图16为实施例6培养到第7天，检测的CD34+CD45RA-细胞相对于原代细胞扩增倍数；
图17为实施例6体内移植实验的骨髓重建比例；
图18为实施例6体内移植实验的外周血重建比例；
图19为实施例7培养到第7天，检测的CD34+CD45RA-细胞相对于原代细胞扩增倍数；
图20为实施例7体内移植实验的骨髓重建比例；
图21为实施例7体内移植实验的外周血重建比例；
附图标记：
DMSO为对照组；Y1为实验组。
具体实施方式
以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。
为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。
另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
以下通过实施例进一步说明本发明的内容。如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆实验指南(第3版)》(科学出版社)、《微生物学实验(第4版)》(高等教育出版社)以及相应仪器和试剂的厂商说明书。
stemspan基础培养基是一种基础培养基，由STEMCELL公司生产。
化学小分子由Tocris、sellecker等多家生物试剂公司制备。
材料来源于公司提供的脐带血废弃物，通过磁珠分选的方法(MACS)分离获得脐带血来源的CD34+细胞作为下述实施例被培养的材料。
表1实施例培养基组分及浓度
实施例1
本实施例采用本发明提供的培养体系培养CD34+细胞。
参照表1培养条件培养CD34+细胞，分为实验组(化学小分子为SP600125)和对照组(用DMSO替代化学小分子，DMSO:培养基的体积比为1：10000)，放在37℃，5％二氧化碳浓度细胞培养箱中，每2天半量换液。
培养到第7天，检测CD34+CD45RA-细胞比例，并计数计算扩增倍数。结果如图1所示，其中实验组CD34+CD45RA-的扩增倍数约为15倍，对照组CD34+CD45RA-的扩增倍数约为5倍。
培养到第7天，同时开展体内移植实验，将实验组和对照组扩增后的CD34+细胞通过骨髓移植的方式分别接种到免疫缺陷小鼠体内，每组接种8只小鼠，5000颗原始CD34+扩增后的细胞量接种1只小鼠，4个月后检测免疫缺陷型小鼠外周血和骨髓中人源细胞的重建比例。结果见图2和图3。实验组小鼠中，骨髓重建人源血细胞比例(CD45+细胞)达到50％左右，外周血中重建人源血细胞达到5％左右。对照组小鼠中，骨髓重建人源血细胞比例达到20％左右，外周血中重建人源血细胞达到1％左右。综合比较。实验组重建效果超过对照组4倍左右。
以上实验证明，本发明提供的培养体系可高效扩增造血干细胞，采用该培养体系体外培养的造血干细胞具有更好的体内重建能力。
实施例2
本实施例采用本发明提供的培养体系培养CD34+细胞。
参照表1培养条件培养CD34+细胞，分为实验组(化学小分子为SP600125)和对照组(用DMSO替代化学小分子，DMSO:培养基的体积比为1：10000)，放在37℃，5％二氧化碳浓度细胞培养箱中，每2天半量换液。
培养到第7天，检测CD34+CD45RA-细胞比例，并计数计算扩增倍数。结果如图4所示，其中实验组CD34+CD45RA-细胞扩增量是对照组CD34+CD45RA-细胞扩增量的2.5倍。
培养到第7天，开展体内移植实验，将实验组和对照组扩增后的CD34+细胞通过骨髓移植的方式分别接种到免疫缺陷小鼠体内，每组接种8只小鼠，5000颗原始CD34+细胞扩增后的细胞量接种1只小鼠，4个月后检测免疫缺陷型小鼠外周血和骨髓中人源细胞的重建比例。结果见图5和图6。实验组小鼠中，骨髓重建人源血细胞比例(CD45+细胞)达到约70％，外周血中重建人源血细胞达到约9％。对照组小鼠中，骨髓重建人源血细胞比例达到约15％，外周血中重建人源血细胞达到约1％。综合比较。实验组重建效果超过对照组6倍。
以上实验证明，本发明提供的培养体系可高效扩增造血干细胞，采用该培养体系体外培养的造血干细胞具有更好的体内重建能力。
实施例3
本实施例采用本发明提供的培养体系培养CD34+细胞。
参照表1培养条件培养CD34+细胞，分为实验组(化学小分子为SP600125)和对照组(用DMSO替代化学小分子，DMSO:培养基的体积比为1：10000)，放在37℃，5％二氧化碳浓度细胞培养箱中，每2天半量换液。
培养到第7天，检测CD34+CD45RA-细胞比例，并计数计算扩增倍数。结果见图7，其中实验组CD34+CD45RA-细胞扩增量是对照组CD34+CD45RA-细胞扩增倍数量的2倍。
培养到第7天，开展体内移植实验，将实验组和对照组扩增后的CD34+细胞通过骨髓移植的方式分别接种到免疫缺陷小鼠体内，每组接种8只小鼠，5000颗原始CD34+细胞扩增后的细胞量接种1只小鼠，4个月后检测免疫缺陷型小鼠外周血和骨髓中人源细胞的重建比例。结果见图8和图9。实验组小鼠中，骨髓重建人源血细胞比例(CD45+细胞)达到约40％，外周血中重建人源血细胞达到约4％。对照组小鼠中，骨髓重建人源血细胞比例达到约10％，外周血中重建人源血细胞达到约1％。综合比较。实验组重建效果超过对照组约4倍。
以上实验证明，本发明提供的培养体系可高效扩增造血干细胞，采用该培养体系体外培养的造血干细胞具有更好的体内重建能力。
实施例4
本实施例采用本发明提供的培养体系培养CD34+细胞。
参照表1培养条件培养CD34+细胞，分为实验组(化学小分子为AEG-3482)和对照组(用DMSO替代化学小分子，DMSO:培养基的体积比为1：10000)，放在37℃，5％二氧化碳浓度细胞培养箱中，每2天半量换液。
培养到第7天，检测CD34+CD45RA-细胞比例，并计数计算扩增倍数。结果见图10，其中实验组CD34+CD45RA-细胞扩增量是对照组CD34+CD45RA-细胞扩增量的2.3倍。
培养到第7天，开展体内移植实验，将实验组和对照组扩增后的CD34+细胞通过骨髓移植的方式分别接种到免疫缺陷小鼠体内，每组接种8只小鼠，5000颗原始CD34+细胞扩增后的细胞量接种1只小鼠，4个月后检测免疫缺陷型小鼠外周血和骨髓中人源细胞的重建比例。结果见图11和图12。实验组小鼠中，骨髓重建人源血细胞比例(CD45+细胞)达到约35％，外周血中重建人源血细胞达到约3.5％。对照组小鼠中，骨髓重建人源血细胞比例达到约15％，外周血中重建人源血细胞达到约1.5％。综合比较。实验组重建效果超过对照组约2.5倍。
以上实验证明，本发明提供的培养体系可高效扩增造血干细胞，采用该培养体系体外培养的造血干细胞具有更好的体内重建能力。
实施例5
本实施例采用本发明提供的培养体系培养CD34+细胞。
参照表1培养条件培养CD34+细胞，分为实验组(化学小分子为JNK-IN-7)和对照组(用DMSO替代化学小分子，DMSO:培养基的体积比为1：10000)，放在37℃，5％二氧化碳浓度细胞培养箱中，每2天半量换液。
培养到第7天，检测CD34+CD45RA-细胞比例，并计数计算扩增倍数。结果见图13，其中实验组CD34+CD45RA-细胞扩增量是对照组CD34+CD45RA-细胞扩增量的2.5倍。
培养到第7天，开展体内移植实验，将实验组和对照组扩增后的CD34+细胞通过骨髓移植的方式分别接种到免疫缺陷小鼠体内，每组接种8只小鼠，5000颗原始CD34+细胞扩增后的细胞量接种1只小鼠，4个月后检测免疫缺陷型小鼠外周血和骨髓中人源细胞的重建比例。结果见图14和图15。实验组小鼠中，骨髓重建人源血细胞比例(CD45+细胞)达到58％，外周血中重建人源血细胞达到约8.5％。对照组小鼠中，骨髓重建人源血细胞比例达到17％，外周血中重建人源血细胞达到约1.5％。综合比较。实验组重建效果超过对照组约5倍。
以上实验证明，本发明提供的培养体系可高效扩增造血干细胞，采用该培养体系体外培养的造血干细胞具有更好的体内重建能力。
实施例6
本实施例采用本发明提供的培养体系培养CD34+细胞。
参照表1培养条件培养CD34+细胞，分为实验组(化学小分子为JNK-IN-11)和对照组(用DMSO替代化学小分子，DMSO:培养基的体积比为1：10000)，放在37℃，5％二氧化碳浓度细胞培养箱中，每2天半量换液。
培养到第7天，检测CD34+CD45RA-细胞比例，并计数计算扩增倍数。结果见图16，其中实验组CD34+CD45RA-细胞扩增量是对照组CD34+CD45RA-细胞扩增量的2.8倍。
培养到第7天，开展体内移植实验，将实验组和对照组扩增后的CD34+细胞通过骨髓移植的方式分别接种到免疫缺陷小鼠体内，每组接种8只小鼠，5000颗原始CD34+细胞扩增后的细胞量接种1只小鼠，4个月后检测免疫缺陷型小鼠外周血和骨髓中人源细胞的重建比例。结果见图17和图18。实验组小鼠中，骨髓重建人源血细胞比例(CD45+细胞)达到约78％，外周血中重建人源血细胞达到约12.5％。对照组小鼠中，骨髓重建人源血细胞比例达到约15％，外周血中重建人源血细胞达到约1.5％。综合比较，实验组重建效果超过对照组约8倍。
以上实验证明，本发明提供的培养体系可高效扩增造血干细胞，采用该培养体系体外培养的造血干细胞具有更好的体内重建能力。
实施例7
本实施例采用本发明提供的培养体系培养CD34+细胞。
参照表1培养条件培养CD34+细胞，分为实验组(化学小分子为SP600125)和对照组(用DMSO替代化学小分子，DMSO:培养基的体积比为1：10000)，放在37℃，5％二氧化碳浓度细胞培养箱中，每2天半量换液。
培养到第7天，检测CD34+CD45RA-细胞比例，并计数计算扩增倍数。结果见图19，其中实验组CD34+CD45RA-细胞扩增量是对照组CD34+CD45RA-细胞扩增量的2.3倍。
培养到第7天，开展体内移植实验，将实验组和对照组扩增后的CD34+细胞通过骨髓移植的方式分别接种到免疫缺陷小鼠体内，每组接种8只小鼠，5000颗原始CD34+细胞扩增后的细胞量接种1只小鼠，4个月后检测免疫缺陷型小鼠外周血和骨髓中人源细胞的重建比例。结果见图20和图21。实验组小鼠中，骨髓重建人源血细胞比例(CD45+细胞)达到约58％，外周血中重建人源血细胞达到约7.5％。对照组小鼠中，骨髓重建人源血细胞比例达到约16％，外周血中重建人源血细胞达到约1.2％。综合比较。实验组重建效果超过对照组约5.5倍。
以上实验证明，本发明提供的培养体系可高效扩增造血干细胞，采用该培养体系体外培养的造血干细胞具有更好的体内重建能力。
最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
Claims (6)
1.一种扩增造血干细胞和/或造血祖细胞的培养体系，其特征在于，包括：基础培养基，所述基础培养基适于干细胞扩增；以及JNK信号通路抑制剂，所述JNK信号通路抑制剂选自SP600125和AEG-3482中的一种或两种；或
所述JNK信号通路抑制剂为如下JNK-IN-7或JNK-IN-11所示的化合物：
所述基础培养基包括stemspan基础培养基1-100ml、重组人干细胞因子10-500ng/ml、Flt3配体10-100ng/ml、重组人血小板生成素5-100ng/ml、低密度脂蛋白2-10μg/ml。
2.根据权利要求1所述培养体系，其特征在于，所述JNK信号通路抑制剂0.5-10μM。
3.一种扩增造血干细胞和/或造血祖细胞的方法，其特征在于，在JNK信号通路抑制剂的存在下，将造血干细胞和/或造血祖细胞在体外进行培养，所述JNK信号通路抑制剂选自SP600125和AEG-3482中的一种或两种；或
所述JNK信号通路抑制剂为如下JNK-IN-7或JNK-IN-11所示的化合物：
伴有stemspan基础培养基1-100ml、重组人干细胞因子10-500ng/ml、Flt3配体10-100ng/ml、重组人血小板生成素5-100ng/ml、低密度脂蛋白2-10μg/ml的添加。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述造血干细胞和/或造血祖细胞来源于骨髓、肝脏、脾脏、外周血或脐带血。
5.一种造血干细胞，其特征在于，所述造血干细胞通过权利要求1或2所述培养体系扩增而得，或采用权利要求3或4所述方法扩增而得。
6.一种造血祖细胞，其特征在于，所述造血祖细胞通过权利要求1或2所述培养体系扩增而得，或采用权利要求3或4所述方法扩增而得。
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