CN108025009A - 喹喔啉基-哌嗪酰胺的使用方法 - Google Patents

喹喔啉基-哌嗪酰胺的使用方法 Download PDF

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Abstract

所公开的主题提供了使用式(I)化合物或其药用盐的方法以及包含式(I)化合物或其药用盐的试剂盒。

Description

喹喔啉基-哌嗪酰胺的使用方法
1.优先权
本申请要求2015年9月4日提交的美国临时申请号62/214,678以及2016年2月1日提交的美国临时申请号62/289,820的优先权，它们的内容通过引用整体并入本文。
2.发明内容
提供以下概要仅用于说明的目的，并且不应该用于限制所要求保护的主题的范围。
通过引用将其整体并入本文的美国专利号8,314,100(2012年11月20日授权)公开了式(I)的化合物
在别处也被称为RX-5902、4-(3,5-二甲氧基苯基)-N-(7-氟-3-甲氧基喹喔啉-2-基)哌嗪-1-羧酰胺、1-[(6-氟-2-甲氧基喹喔啉-3-基)氨基羰基]-4-(3,5-二甲氧基苯基)哌嗪和1-(3,5-二甲氧基苯基)-4-[(6-氟-2-甲氧基喹喔啉-3-基)氨基羰基]哌嗪。
美国专利号8,598,173(2013年12月3日授权)和美国公开申请号2015/0004234(2015年1月1日授权)描述了RX-5902的其它方面，它们两者均通过引用以其整体并入本文。
本公开的一个方面提供了一种***的方法，其通过向需要其的受试者给予包含式(I)化合物或其药用盐的固体口服剂型，其中该固体口服剂型在单次给药后提供了约800-15,000hr·ng/mL的AUC0-t(0-24小时)。在一个实施方案中，该固体口服剂型在单次给药后提供约2,500-9,300hr·ng/mL的AUC0-t(0-24小时)。在一个实施方案中，该固体口服剂型在单次给药后提供约2,500-9,500hr·ng/mL的AUC0-t(0-24小时)。在一个实施方案中，该固体口服剂型在单次给药后可提供约200-1,200ng/mL的Cmax。
本公开的另一方面提供一种***的方法，其通过以约100-1,200mg/天、每周1-7天、至多约2,800mg/周的剂量向需要其的受试者给予包含式(I)化合物或其药用盐的固体口服剂型。在一个实施方案中，该剂量可以为约150-400mg/天，每周3-7天。在一个实施方案中，该剂量可以为约150-400mg/天，每周5-7天。在一个实施方案中，该固体口服剂型可以是片剂或胶囊。
在任何实施方案中，受试者可以是人。在任何实施方案中，肿瘤可以选自皮肤癌、结直肠癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌和肾癌。在实施方案中，肿瘤可以是三阴性(TN)乳腺癌。在实施方案中，肿瘤可以是铂耐性或难治性卵巢癌。
本公开的另一方面，***的方法进一步包括向受试者给予辐射或抗肿瘤剂。在本公开的另一方面，***的方法进一步包括向受试者给予选自抗代谢物、DNA片段化剂、DNA交联剂、嵌入剂、蛋白合成抑制剂、拓扑异构酶I毒素、拓扑异构酶II毒素、微管导向剂、激酶抑制剂、多酚、激素、激素拮抗剂、死亡受体激动剂、免疫检查点抑制剂、抗程序性细胞死亡1(PD-1)受体抗体和抗程序性细胞死亡配体1(PD-L1)抗体的抗肿瘤剂。在一个实施方案中，该方法包括向受试者给予PD-L1抗体或PD-1抗体。
本公开的另一方面提供一种在需要其的受试者中***的方法，包括以下步骤：(a)确定受试者是否正在经受CYP3A4或CYP3A5抑制剂或诱导剂的治疗；和(b)如果受试者没有经受CYP3A4或CYP3A5抑制剂或诱导剂的治疗，则向受试者给予有效量的式(I)化合物或其药用盐。在实施方案中，该方法进一步包括以下步骤：(c)监测受试者的不良事件。
本公开的另一方面提供一种抑制Y593磷酸化的p68的β-连环蛋白依赖性ATP酶活性的方法，其通过向需要其的受试者给予有效量的式(I)化合物或其药用盐。
本公开的另一方面提供一种用于测试式(I)化合物或其药用盐在***中的潜在功效的试剂盒，其包括确定肿瘤是否表达Y593磷酸化的p68的测定。
本公开的另一方面提供一种在需要其的受试者中***的方法，其通过以下步骤进行：(a)从受试者收集肿瘤的样品；(b)确定肿瘤是否表达Y593磷酸化的p68；和(c)如果肿瘤表达Y593磷酸化的p68，那么向受试者给予有效量的式(I)化合物或其药用盐。
本公开的另一方面提供一种用于在商业规模上如在一个或多个固定反应器中制备4-(3,5-二甲氧基苯基)-N-(7-氟-3-甲氧基喹喔啉-2-基)哌嗪-1-羧酰胺(RX-5902)的方法。在实施方案中，RX-5902在商业规模上的制备可以包括以下步骤：在碱的存在下在有机溶剂中使3-氨基-6-氟-2-甲氧基喹喔啉与氯甲酸乙酯反应以形成混合物；在添加乙酸乙酯的同时蒸馏混合物以形成悬浮液；过滤该悬浮液以分离乙基-N-(6-氟-2-甲氧基喹喔啉-3-基)碳酸酯；和在第二碱的存在下在第二有机溶剂中使乙基-N-(6-氟-2-甲氧基喹喔啉-3-基)碳酸酯与1-(3,5-二甲氧基苯基)哌嗪盐酸盐反应。在实施方案中，商业规模生产可进一步包括以下步骤：在碱的存在下在有机溶剂中使3-氨基-2-氯-6-氟喹喔啉与甲醇钠反应以形成混合物；向该混合物中加入水以形成溶液；将该溶液冷却至约15-20℃的温度以形成悬浮液；和过滤该悬浮液以分离3-氨基-6-氟-2-甲氧基喹喔啉。在实施方案中，有机溶剂中的一种或多种可以是二氯甲烷。在实施方案中，碱可以是吡啶。在实施方案中，蒸馏步骤的一个或多个可以在大气压力下进行。在实施方案中，过滤可以通过真空过滤进行。在实施方案中，第二有机溶剂可以是四氢呋喃。在实施方案中，第二碱可以是1,8-二氮杂双环十一碳-7-烯(DBU)。
还已发现提供改善的RX-5902口服生物利用度的新型纳米制剂。本发明涉及使用式(I)化合物及其纳米制剂的新用途和方法。本发明还提供了一种减少杂质并显著降低制造成本的改进方法，除了别的之外，是通过使用蒸馏和过滤最终产物以除去溶剂。本发明还提供了用于RX-5902改善的生物利用度的新型纳米制剂。此外，本发明提供了用于在受试者中使用式(I)化合物及其纳米制剂的剂量和暴露水平。本公开的另一方面提供一种用于在足以提供悬浮液的条件下制备式(I)化合物或其药用盐的颗粒混合物的方法。在一个实施方案中，该悬浮液可以通过研磨工艺制成。在一个实施方案中，研磨工艺可以是高能搅拌器研磨或辊研磨。在一个实施方案中，研磨工艺是高能搅拌器研磨。在一个实施方案中，悬浮液可具有约200nm或更小的D50粒度。
该方法的实施方案可以包括喷雾干燥悬浮液以形成粉末。
本公开的一个方面提供了一种通过由本文描述的工艺制备RX-5902的方法制备的产品。
3.附图说明
图1是显示在禁食条件下以不同剂量单次口服给予RX-5902后，具有晚期实体瘤或转移性实体瘤的受试者中RX-5902的血浆浓度的图。
图2是显示在每周5天以50mg/kg和70mg/kg口服给予RX-5902后，具有人肾肿瘤(Caki-1)异种移植物的小鼠中的平均肿瘤体积的图。
图3是显示在持续21天每天以60mg/kg口服给予舒尼替尼以及持续四周每周一次以20、40、80和160mg/kg口服给予RX-5902后，具有人肾肿瘤(Caki-1)异种移植物的小鼠中的平均肿瘤体积的图。
图4是显示RX-5902与MDA-MB-231细胞相互作用的Western印迹，特别是具有约60kDa移动性的条带免受蛋白酶切割。
图5是显示由针对p68 RNA解旋酶的抗体识别的图4的保护条带的Western印迹。
图6是确认p68在酪氨酸残基上被磷酸化的Western印迹。
图7是显示过滤结合测定中结合到3H-标记的RX-5902的磷酸化的-p68和未磷酸化的p68的百分比图。Kd估计为与RX-5902结合的p68的50％。
图8是显示在0至20μM RX-5902以及从2μ及酵母中提取的总RNA的存在下，p68的RNA-依赖性ATP酶活性的柱状图。
图9是显示在0至20μM RX-5902以及1μgβ-连环蛋白的存在下，p68的β-连环蛋白-依赖性ATP酶活性的柱状图。
图10是显示RX-5902抑制磷酸化-p68的β-连环蛋白依赖性ATP酶活性的IC50测定的图。IC50被确定为61±7.1nM。
图11是显示RX-5902抑制细胞周期蛋白D1、c-Myc和p-c-Jun的表达的Western印迹。
图12是显示与持续三周每周两次以5mg/kg静脉内给予相比，在持续三周每周一次以160mg/kg、320mg/kg和600mg/kg口服给予RX-5902后，具有人乳腺癌(MDA-MB-231)异种移植物的小鼠中的平均肿瘤体积的图。
图13是显示与持续三周每周两次以5mg/kg静脉内给予相比，在持续三周每周一次以160mg/kg、320mg/kg和600mg/kg口服给予RX-5902后，具有人乳腺癌(MDA-MB-231)异种移植物的小鼠中的Kaplan-Meier存活曲线的图。这些数据来自图12所示的同一研究。
图14是显示搅拌器研磨的纳米悬浮液的粒度分布的图。
图15是提取的RX-5902纳米颗粒的DSC。
图16是喷雾干燥的RX-5902纳米悬浮液的粒度分布。
图17显示了喷雾干燥的RX-5902(1000X放大率，正常光)。
图18显示了喷雾干燥的RX-5902(1000X放大率，偏振光)。
图19显示了RX-5902的1H NMR光谱。
图20显示了RRT 0.975杂质的1H NMR光谱。
图21显示了RRT 0.975杂质(上)和RX-5902(下)的1H NMR光谱的重叠。
图22显示了RRT 0.975杂质(上部曲线)和RX-5902(底部曲线)的1H NMR光谱的7.0-8.0ppm区域的重叠。
图23显示了RX-5902的13C NMR光谱。
图24显示了RRT 0.975杂质的13C NMR光谱。
图25显示了RX-5902(上部曲线)和RRT 0.975杂质(底部曲线)的13C NMR光谱的重叠。
图26显示了RX-5902(上部曲线)和RRT 0.975杂质(底部曲线)的13C NMR光谱的108-150ppm区域。
图27显示了RX-5902的19F NMR光谱。
图28显示了RRT 0.975杂质的19F NMR光谱。
图29显示了RX-5902(实线)和RRT 0.975杂质(虚线)的紫外-可见吸光度数据。
图30显示了对应于主RX-5902产物的17.9min峰的液相色谱-质谱(LC-MS)。
图31显示了对应于RRT 0.975杂质的17.2min峰的LC-MS。
图32显示了具有恰好464[M+Na]+质量的RX-5902和RRT 0.975杂质。
图33为结晶RX-5902纳米制剂的X射线粉末衍射(XRPD)。
图34为RX-5902API的详细XRPD图谱。
图35A和35B是用于XRPD数据采集的结晶批料(左)和晶体(右)的光学显微照片。
图36显示了RX-5902纳米制剂和RX-5902 API的XRPD图案重叠。
4.具体实施方式
下面详细讨论本发明的实施方案。在描述实施方案时，为了清楚起见采用了特定的术语。然而，本发明不旨在限于如此选择的特定术语。尽管讨论了具体的示例性实施方案，但应该理解，这仅仅是为了说明的目的而进行的。相关领域的技术人员将认识到，可以使用其它组件和配置，而不偏离本发明的精神和范围。
4.1定义
除非另有说明，本文使用的以下术语具有下面所示的含义。这些含义旨在补充而不是改变本领域中所理解的这些术语的含义。
“Cmax”指的是观察到的最大血浆浓度。
“Tmax”指的是达到Cmax的时间。
“T1/2”指的是药物的血浆浓度达到其原始值的一半所需的时间。“末端T1/2”指的是末期中的T1/2。
“AUC0-t”指从时间零到时间t的血浆浓度-时间曲线下面积(AUC)，其中“t”是具有可测量浓度的最后一个采样时间点。例如，AUC0-24或AUC0-t(0-24小时)指的是指时间零至24小时的AUC，而AUC0-48或AUC0-t(0-48小时)指的是从时间零至48小时的AUC。
“口服剂型”是指配制用于口服给药的药物组合物。口服剂型可以配制成提供立即、持续、延长、延迟或控制释放。口服剂型的实例包括片剂、胶囊、颗粒剂和凝胶帽。
“有效量”是基于功效和潜在毒性参数以及本领域技术人员的知识，产生所需效果(如治疗或预防病症)的化合物或药物组合物的量。可以以一个或多个剂量给予有效量。
“接触”是指直接或间接地使化合物和细胞足够接近以产生所需效果，例如，诱导细胞凋亡或调节蛋白激酶。接触可以在体外或体内进行。例如，使细胞与化合物接触可包括使用已知技术将化合物直接递送到细胞中，已知技术如显微注射、向携带该细胞的受试者给予该化合物或者将该细胞在包含该化合物的培养基中温育。
“治疗”是指获得有益的或期望的结果，例如临床结果。在一些实施方案中，有益的或期望的结果是以下中的任何一个或多个：抑制或压制病症的发作或发展、降低病症的严重程度、降低与病症相关症状的数量或严重性、提高患有这该病症的受试者的生活质量、减少治疗该病症所需的另一种药物的剂量、增强受试者正在服用的另一种药物对该病症的效果、和延长患有该病症的受试者的存活。
“预防”是指降低受试者发生受试者不具有但有发展风险的病症的可能性。“有风险”表示受试者具有一个或多个风险因素，这些因素是与病症的发展相关的可测量的参数，并且是本领域已知的。具有一个或多个风险因素的受试者比没有这种风险因素的受试者具有更高的发展该病症的可能性。
“受试者”是指动物如哺乳动物，包括但不限于人。因此，本文公开的方法可用于人治疗和兽医应用。在一个实施方案中，受试者是哺乳动物。在另一个实施方案中，受试者是人。
“禁食的”指在治疗前已经至少8小时禁食的受试者。
“CYP3A4或CYP3A5抑制剂或诱导剂”分别是指使细胞色素P450 3A4(CYP3A4)或P450 3A5(CYP3A5)酶的底物的血浆AUC值增加或降低至少约30％的试剂。CYP3A4或CYP3A5抑制剂或诱导剂的实例包括：安普那韦、阿瑞吡坦、阿扎那韦、巴比妥酸盐(barbiturate，巴比妥类药物)、波普瑞韦、波生坦、卡马西平、氯霉素、环丙沙星、克拉霉素、科比司他、考尼伐坦、达芦那韦、地尔硫卓、依非韦伦、埃替拉韦、红霉素、依曲韦林、氟康唑、福沙那韦、葡萄柚汁、伊马替尼、茚地那韦、伊曲康唑、酮康唑、洛匹那韦、米贝拉地尔、***、萘夫西林、奈法唑酮、奈非那韦、苯妥英、泊沙康唑、利福平、利托那韦、沙奎那韦、圣约翰草、替拉瑞韦、泰利霉素、替诺福韦、替拉那韦、维拉帕米和伏立康唑。
“不良事件”是指与使用化合物或药物组合物相关的任何不期望的事件。不良事件可根据国家癌症研究所不良事件通用术语标准(NCI-CTCAE)4.03版进行评估和分级。不良事件的例子包括发热性中性粒细胞减少症、贫血、血小板减少症、与临床出血相关的凝血异常、腹泻、疲劳、恶心和呕吐。
“增敏”是指增加细胞对细胞凋亡信号的敏感性、或降低细胞对细胞凋亡信号响应的耐性。
“修改”治疗或给药是指减少或增加活性剂的剂量、停止向受试者给予活性剂、或用不同活性剂替代该活性剂。
“抑制”是指相对于在不存在药剂(如式(I)的化合物)下的表达水平(如基因)或活性(如酶)，在该药剂的存在下，表达水平或活性降低。例如，降低可以是5％或更高、10％或更高、20％或更高、25％或更高、30％或更高、40％或更高、50％或更高、60％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、90％或更高、或95％或更高。表达水平或活性可以如本文描述或通过本领域通常已知的技术来测量。
“肿瘤细胞”是指来源于肿瘤的细胞。
“肿瘤”是指组织或细胞的异常生长，无论是良性的还是恶性的。实例包括在***、肺、脑、乳腺、肾、肝、肺、肠、淋巴、肌肉、骨、骨髓、子宫、卵巢、***、外阴、胰腺、肾上腺、中枢神经***、外周神经***、子宫颈、膀胱、子宫内膜、咽喉、食道、喉、甲状腺、血液、***、睾丸、胸腺、皮肤、脊柱、胃、胆管、小肠、肝胆道、结直肠、结肠、直肠、***、内分泌、眼睛和胆囊中发现的肿瘤。
“癌症”是指恶性肿瘤。癌细胞可能或可能不侵入周围组织，因此可能或可能不转移到新的身体部位。癌症包括癌(carcinomas，细胞癌)，其是上皮细胞的癌症；癌包括鳞状细胞癌、腺癌、黑素瘤和肝细胞瘤。癌症还包括肉瘤，它们是间充质来源的肿瘤；肉瘤包括成骨肉瘤、白血病和淋巴瘤。癌症可能涉及一种或多种肿瘤细胞类型。
“抗肿瘤剂”是指用于治疗或预防肿瘤的任何药剂。抗肿瘤剂的实例包括下文药物组合物中的活性剂。在实施方案中，除了RX-5902之外，抗肿瘤剂还选自抗代谢物、DNA片段化剂(DNA-fragmenting agent，DNA断裂剂)、DNA交联剂、嵌入剂、蛋白合成抑制剂、拓扑异构酶I毒素、拓扑异构酶II毒素、微管导向剂、激酶抑制剂、多酚、激素、激素拮抗剂、死亡受体激动剂、免疫检查点抑制剂、抗程序性细胞死亡1(PD-1)受体抗体和抗程序性细胞死亡配体1(PD-L1)抗体。在其他实施方案中，另外的抗肿瘤剂是PD-1受体抗体。在其他实施方案中，另外的抗肿瘤剂是派姆单抗(pembrolizumab)。在其他实施方案中，另外的抗肿瘤剂是纳武单抗(nivolumab)。在其他实施方案中，另外的抗肿瘤剂是度伐单抗(duryalumab)。在其他实施方案中，另外的抗肿瘤剂是纳武单抗和派姆单抗的组合。
“辐射”是指用于治疗或预防肿瘤的任何辐射。辐射的例子包括X射线、γ射线和带电粒子。辐射可以通过任何形式的放射疗法来递送，如外束放疗(EBRT、XBRT或远距离治疗)、近距离放射治疗(内部放射治疗或密封源治疗)、术中放疗或全身放疗。
“Y593磷酸化的p68”或“Y593磷酸化-p68”是指在酪氨酸593残基处磷酸化的p68RNA解旋酶(DDX5)。
“p68 RNA解旋酶”，也称为“ATP依赖性RNA解旋酶DDX5”或“DEAD盒蛋白5”，指的是在人体中由DDX5基因编码的酶。
“商业规模”是指会以适合于制造销售和配送给公众的数量来制备产品。商业规模不同于实验室或工作台规模，实验室或工作台规模中的产量适合于研究目的。在使用试剂和方法上，商业规模也不同于实验室或工作台规模合成，商业规模最大限度减少有害物质的使用或浪费，从而最大限度地减少处理和清理成本。在某些实施方案中，本文公开的商业规模方法产生至少约0.5kg、1.0kg或1.5kg的单批量。
“反应”是指在适当的条件(例如，温度、压力、pH、浓度)下组合两种或更多种试剂以产生所需产物。所需产物可能不一定直接来自两种或更多种试剂的组合；即可以生产一种或多种最终导致形成所需产物的中间体。
“蒸馏(Distillation)”或“蒸馏(distilling)”是指基于化合物的不同挥发性而分离化合物，例如通过蒸发或随后的冷凝。
“过滤(filtration)”或“过滤(filtering)”是指从液体中分离固体，例如，通过真空、重力或压力。“真空过滤”是指从液体混合物中提取固体的技术，其中施加真空抽吸以迫使混合物通过过滤器，例如布氏漏斗中的滤纸。
“大气压力”是指敞开的空气压力，而不是真空或封闭室内的压力。大气压力通常约为760托，但是尤其可以根据制造设备的评估等而变化。
“真空过滤”是指从液体混合物中提取固体的技术，其中施加真空抽吸以迫使混合物通过过滤器，例如，布氏漏斗中的滤纸。
“固定反应器”是指固定在适当的位置且不能移动的反应器。
“粒度”是指通过本领域中已知的任何粒度测量技术确定的活性药物成分(API)(如式(I)化合物或其药用盐)的颗粒尺寸。此种技术的非限制性例子包括例如使用可从Malvern、Sympatec、Microtac或Horiba获得的分析仪进行的激光衍射、动态光散射和图像分析。
“D10”是指累积分布中10％的粒度，意味着10％的粒子具有小于D10的粒度，并且90％的粒子具有大于D10的粒度。“D50”是指中值粒度或累积分布中50％的粒度，意味着50％的粒子具有小于D50的粒度，并且50％的粒子具有大于D50的粒度。“D90”是指中值粒度或累积分布中90％的粒度，意味着90％的粒子具有小于D90的粒度，并且10％的粒子具有大于D90的粒度。累积分布可以基于颗粒的体积、质量、数量或表面积。除非另有说明，累积分布基于颗粒的体积。
“冻干”是指使用冷冻干燥工艺通过冷冻产物然后降低周围压力以使产物中的冷冻溶剂直接从固相升华为气相从产物中大体除去一种或多种溶剂。
“喷雾干燥”是指通过用热气体快速干燥而从液体或浆料生产干粉的方法。
“如”具有与“如但不限于”的相同含义。类似地，“包括(include)”具有与“包括但不限于”的相同含义，同时“包括(including)”具有与“包括但不限于”的相同含义。
单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数指代，除非上下文另有指明。因此，例如，提及“一种化合物”可以包括一种或多种化合物和/或其等同物。
除非另外指明，否则本文公开的任何数值范围包括上限和下限以及每个中间值。
除了在工作例中或另有说明的情况，说明书和权利要求书中使用的数值(如表示成分的量、反应条件的数值)通过术语“约”来修饰。因此，除非有相反的说明，否则这些数值是近似值，其可以根据想要获得的所需性质而变化。至少，而不是试图限制权利要求范围的等同原则的应用，每个数值参数应该根据有效数字的量和普通的四舍五入技术来解释。
尽管阐述所公开主题的范围的数字参数是近似值，但是尽可能精确地报告在工作例中列出的数值。然而，任何数值固有地含有必然由其相应的测试测量中发现的标准偏差导致的某些误差。
除非另有定义，本文使用的技术和科学术语的含义是所公开的主题所属领域的普通技术人员通常理解的那些。
4.2治疗或预防肿瘤的方法
本公开的一个方面提供了一种治疗或预防肿瘤的方法，在需要其的受试者禁食至少约8小时后，向该受试者给予有效量的式(I)化合物或其药用盐。在另一实施方案中，受试者在给药后继续禁食至少约3小时。
本公开的另一方面提供了一种治疗或预防肿瘤的方法，其通过向需要其的受试者给予包括式(I)化合物或其药用盐的固体口服剂型，其中固体口服剂型在单次给药后提供约800-15,000hr·ng/mL的AUC0-t(0-24小时)。
本公开的另一方面提供了一种治疗或预防肿瘤的方法，其包含向需要其的受试者给予包括式(I)化合物或其药用盐的固体口服剂型，其中该固体口服剂型在给药一周、每周1-7天后，提供约1,000-70,000hr·ng/mL的AUC0-t(0-168小时；即一周)。
本公开的另一方面提供了一种治疗或预防肿瘤的方法，其通过以约100-1,200mg/天、每周1-7天的剂量向需要其的受试者给予包括式(I)化合物或其药用盐的固体口服剂型。在实施方案中，式(I)化合物或其药用盐可以至多约3,000mg/周的量给药。在实施方案中，式(I)化合物或其药用盐可以至多约2,800mg/周的量给药。在一个实施方案中，剂量为约100-500mg/天，每周3-7天。在另一实施方案中，剂量为约100-500mg/天，每周5-7天。在另一实施方案中，剂量为约150-400mg/天，每周3-7天。在另一实施方案中，剂量为约150-400mg/天，每周5-7天。
本公开的另一方面提供了一种在需要其的受试者中治疗或预防肿瘤的方法，通过：(a)确定受试者是否正在经受CYP3A4或CYP3A5抑制剂或诱导剂的治疗；和(b)如果受试者没有经受CYP3A4或CYP3A5抑制剂或诱导剂的治疗，则向受试者给予有效量的式(I)化合物或其药用盐。在一个实施方案中，受试者正在经受CYP3A4或CYP3A5抑制剂的治疗。在另一实施方案中，受试者正在经受CYP3A4或CYP3A5诱导剂的治疗。
本公开的另一方面提供了一种在需要其的受试者中治疗或预防肿瘤的方法，通过：(a)确定受试者是否正在经受CYP3A4或CYP3A5抑制剂或诱导剂的治疗；(b)如果受试者正在经受CYP3A4或CYP3A5抑制剂或诱导剂的治疗，则向受试者给予有效量的式(I)化合物或其药用盐；和(c)监测受试者的不良事件。在另一实施方案中，该方法进一步包含：如果检测到不良事件，则用CYP3A4或CYP3A5抑制剂或诱导剂或者给予式(I)化合物或其药用盐来修改治疗。在一个实施方案中，受试者正在经受CYP3A4或CYP3A5抑制剂的治疗。在另一实施方案中，受试者正在经受CYP3A4或CYP3A5诱导剂的治疗。
例如，修改治疗可以包括减少或增加CYP3A4或CYP3A5抑制剂或诱导剂的剂量、或者减少或增加RX-5902的剂量。在一些实施方案中，修改包括以下中的一项或多项：减少CYP3A4或CYP3A5抑制剂的剂量；增加CYP3A4或CYP3A5诱导剂的剂量；如果受试者正在经受CYP3A4或CYP3A5抑制剂的治疗，则增加RX-5902的剂量；和如果受试者正在经受CYP3A4或CYP3A5诱导剂的治疗，则减少RX-5902的剂量。
在一个实施方案中，CYP3A4或CYP3A5抑制剂或诱导剂是巴比妥酸盐、波生坦、卡马西平、依非韦伦、依曲韦林、***、萘夫西林、苯妥英、利福平、圣约翰草、糖皮质激素、奈韦拉平、奥卡西平、***、吡格列酮、利福布丁、曲格列酮和葡萄柚汁。在另一实施方案中，CYP3A4或CYP3A5抑制剂或诱导剂是葡萄柚汁。在另一实施方案中，CYP3A4或CYP3A5抑制剂或诱导剂是圣约翰草。
本公开的另一方面提供了一种在需要其的受试者中***的方法，其包括以下步骤：
(a)从受试者采集肿瘤的样品；
(b)确定肿瘤是否表达Y593磷酸化的p68；和
(c)如果肿瘤表达Y593磷酸化的p68，则向受试者给予有效量的式(I)化合物或其药用盐。
下面描述了本文所公开的方法的另外的实施方案。
在一个实施方案中，每周给予5-7天式(I)化合物或其药用盐。在另一实施方案中，每周给予5-7天式(I)化合物或其药用盐，持续连续4周，或者持续连续3周，随后的1个非治疗周之内不给予式(I)化合物或其药用盐。在另一实施方案中，给予至多12个剂量周期的式(I)化合物或其药用盐，其中每个剂量周期由3个连续治疗周和随后1个非治疗周组成或由连续4个治疗周组成。
在另一实施方案中，式(I)化合物或其药用盐被配制为固体口服剂型。在另一实施方案中，固体口服剂型是片剂。在另一实施方案中，固体口服剂型是胶囊。在另一实施方案中，口服固体剂量是包含式(I)化合物或其药用盐的纳米颗粒的片剂或胶囊。
在另一实施方案中，在受试者禁食至少约8小时后，给予固体口服剂型，式(I)化合物或其药用盐。在另一实施方案中，受试者在给药后禁食至少约3小时。在另一实施方案中，固体口服剂型，式(I)化合物或其药用盐与食物一起给予。
在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供约1-6小时的Tmax。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供约2-6小时的Tmax。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供约2小时的Tmax。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供约3小时的Tmax。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供约4小时的Tmax。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供约5小时的Tmax。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供约6小时的Tmax。
在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供约90-1,200ng/mL的Cmax。在一个实施方案中，固体口服剂型在单次给药后可提供约200-1200ng/mL的Cmax。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供约200-800ng/mL的Cmax。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供约300-700ng/mL的Cmax。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供约200-300ng/mL的Cmax。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供约300-400ng/mL的Cmax。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供约400-500ng/mL的Cmax。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供约500-600ng/mL的Cmax。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供约600-700ng/mL的Cmax。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供约700-800ng/mL的Cmax。
在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的AUC0-t(0-24小时)为约800-15,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的AUC0-t(0-24小时)为约2,000-15,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的AUC0-t(0-24小时)为约2,000-8,500hr·ng/mL。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的AUC0-t(0-24小时)为约2,000-10,000hr·ng/mL。在一个实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的AUC0-t(0-24小时)为约2,500-9,500hr·ng/mL。在一个实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的AUC0-t(0-24小时)为约2,500-9,300hr·ng/mL。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的AUC0-t(0-24小时)为约3,000-7,500hr·ng/mL。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的AUC0-t(0-24小时)为约3,500-7,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的AUC0-t(0-24小时)为约3,000-5,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的AUC0-t(0-24小时)为约4,000-6,500hr·ng/mL。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的AUC0-t(0-24小时)为约4,500-6,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的AUC0-t(0-24小时)为约2,000-3,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的AUC0-t(0-24小时)为约3,000-4,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的AUC0-t(0-24小时)为约4,000-5,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的AUC0-t(0-24小时)为约5,000-6,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的AUC0-t(0-24小时)为约6,000-7,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的AUC0-t(0-24小时)为约7,000-8,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的AUC0-t(0-24小时)为约8,000-9,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的AUC0-t(0-24小时)为约9,000-10,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的AUC0-t(0-24小时)为约10,000-11,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的AUC0-t(0-24小时)为约11,000-12,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的AUC0-t(0-24小时)为约12,000-13,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的AUC0-t(0-24小时)为约13,000-14,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的AUC0-t(0-24小时)为约15,000-16,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的AUC0-t(0-24小时)为约4,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的AUC0-t(0-24小时)为约4,500hr·ng/mL。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的AUC0-t(0-24小时)为约5,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的AUC0-t(0-24小时)为约5,500hr·ng/mL。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的AUC0-t(0-24小时)为约6,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的AUC0-t(0-24小时)为约6,500hr·ng/mL。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的Cmax为约90-1100ng/mL且AUC0-t(0-24小时)为约800-15,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的Cmax为约200-1,200ng/mL且AUC0-t(0-24小时)为约2,500-9,500hr·ng/mL。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的Cmax为约200-1,200ng/mL且AUC0-t(0-24小时)为约2,500-9,300hr·ng/mL。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的Cmax为约200-800ng/mL且AUC0-t(0-24小时)为约2,000-15,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的Cmax为约200-300ng/mL且AUC0-t(0-24小时)为约2,000-4,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的Cmax为约300-400ng/mL且AUC0-t(0-24小时)为约4,000-7,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的Cmax为约400-500ng/mL且AUC0-t(0-24小时)为约5,000-6,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的Cmax为约600-700ng/mL且AUC0-t(0-24小时)为约14,000-15,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，固体口服剂型在单次给药后提供的Cmax为约700-800ng/mL且AUC0-t(0-24小时)为约10,000-11,000hr·ng/mL。
在另一实施方案中，在每周1-7天、给药一周后，固体口服剂型提供的AUC0-t(0-168小时)为约1,000-70,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，在每周3-7天、给药一周后，固体口服剂型提供的AUC0-t(0-168小时)为约10,000-70,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，在每周3-7天、给药一周后，固体口服剂型提供的AUC0-t(0-168小时)为约20,000-60,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，在每周5-7天、给药一周后，固体口服剂型提供的AUC0-t(0-168小时)为约20,000-70,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，在每周5-7天、给药一周后，固体口服剂型提供的AUC0-t(0-168小时)为约30,000-60,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，在每周一天、给药一周后，固体口服剂型提供的AUC0-t(0-168小时)为约4,000-10,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，在每周一天、给药一周后，固体口服剂型提供的AUC0-t(0-168小时)为约6,000-8,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，在每周一天、给药一周后，固体口服剂型提供的AUC0-t(0-168小时)为约6,500-7,500hr·ng/mL。在另一实施方案中，在每周一天、给药一周后，固体口服剂型提供的AUC0-t(0-168小时)为约7,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，在每周3天、给药一周后，固体口服剂型提供的AUC0-t(0-168小时)为约10,000-35,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，在每周3天、给药一周后，固体口服剂型提供的AUC0-t(0-168小时)为约15,000-30,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，在每周3天、给药一周后，固体口服剂型提供的AUC0-t(0-168小时)为约20,000-25,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，在每周5天、给药一周后，固体口服剂型提供的AUC0-t(0-168小时)为约20,000-60,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，在每周5天、给药一周后，固体口服剂型提供的AUC0-t(0-168小时)为约25,000-55,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，在每周5天、给药一周后，固体口服剂型提供的AUC0-t(0-168小时)为约30,000-50,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，在每周7天、给药一周后，固体口服剂型提供的AUC0-t(0-168小时)为约30,000-75,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，在每周7天、给药一周后，固体口服剂型提供的AUC0-t(0-168小时)为约35,000-70,000hr·ng/mL。在另一实施方案中，在每周7天、给药一周后，固体口服剂型提供的AUC0-t(0-168小时)为约40,000-65,000hr·ng/mL。
在另一实施方案中，式(I)的化合物或其药用盐以约100-1,200mg/天、每周1-7天、至多约3,000mg/周的剂量给药。在另一实施方案中，剂量为约100-1,200mg/天，每周1-7天，至多约2,800mg/周。在另一实施方案中，剂量为约100-1,200mg/天，每周1-7天，至多约2,000mg/周。在另一实施方案中，剂量为约100-600mg/天，每周1-7天。在另一实施方案中，剂量为约100-600mg/天，每周3-7天。在另一实施方案中，剂量为约100-600mg/天，每周5-7天。在另一实施方案中，剂量为约100-600mg/天，每周3天。在另一实施方案中，剂量为约100-600mg/天，每周4天。在另一实施方案中，剂量为约100-600mg/天，每周5天。在另一实施方案中，剂量为约100-600mg/天，每周6天。在另一实施方案中，剂量为约100-600mg/天，每周7天。
在另一实施方案中，剂量为约200-500mg/天，每周1-7天。在另一实施方案中，剂量为约200-500mg/天，每周3-7天。在另一实施方案中，剂量为约200-500mg/天，每周5-7天。在另一实施方案中，剂量为约200-500mg/天，每周3天。在另一实施方案中，剂量为约200-500mg/天，每周4天。在另一实施方案中，剂量为约200-500mg/天，每周5天。在另一实施方案中，剂量为约200-500mg/天，每周6天。在另一实施方案中，剂量为约200-500mg/天，每周7天。
在另一实施方案中，剂量为约150-400mg/天，每周1-7天。在另一实施方案中，剂量为约150-400mg/天，每周3-7天。在另一实施方案中，剂量为约150-400mg/天，每周5-7天。在另一实施方案中，剂量为约150-400mg/天，每周3天。在另一实施方案中，剂量为约150-400mg/天，每周4天。在另一实施方案中，剂量为约150-400mg/天，每周5天。在另一实施方案中，剂量为约150-400mg/天，每周6天。在另一实施方案中，剂量为约150-400mg/天，每周7天。
在另一实施方案中，剂量为约200mg/天，每周1-7天。在另一实施方案中，剂量为约200mg/天，每周3-7天。在另一实施方案中，剂量为约200mg/天，每周5-7天。在另一实施方案中，剂量为约200mg/天，每周3天。在另一实施方案中，剂量为约200mg/天，每周4天。在另一实施方案中，剂量为约200mg/天，每周5天。在另一实施方案中，剂量为约200mg/天，每周6天。在另一实施方案中，剂量为约200mg/天，每周7天。
在另一实施方案中，剂量为约250mg/天，每周1-7天。在另一实施方案中，剂量为约250mg/天，每周3-7天。在另一实施方案中，剂量为约250mg/天，每周5-7天。在另一实施方案中，剂量为约250mg/天，每周3天。在另一实施方案中，剂量为约250mg/天，每周4天。在另一实施方案中，剂量为约250mg/天，每周5天。在另一实施方案中，剂量为约250mg/天，每周6天。在另一实施方案中，剂量为约250mg/天，每周7天。
在另一实施方案中，剂量为约300mg/天，每周1-7天。在另一实施方案中，剂量为约300mg/天，每周3-7天。在另一实施方案中，剂量为约300mg/天，每周5-7天。在另一实施方案中，剂量为约300mg/天，每周3天。在另一实施方案中，剂量为约300mg/天，每周4天。在另一实施方案中，剂量为约300mg/天，每周5天。在另一实施方案中，剂量为约300mg/天，每周6天。在另一实施方案中，剂量为约300mg/天，每周7天。
在另一实施方案中，剂量为约350mg/天，每周1-7天。在另一实施方案中，剂量为约350mg/天，每周3-7天。在另一实施方案中，剂量为约350mg/天，每周5-7天。在另一实施方案中，剂量为约350mg/天，每周3天。在另一实施方案中，剂量为约350mg/天，每周4天。在另一实施方案中，剂量为约350mg/天，每周5天。在另一实施方案中，剂量为约350mg/天，每周6天。在另一实施方案中，剂量为约350mg/天，每周7天。
在另一实施方案中，剂量为约400mg/天，每周1-7天。在另一实施方案中，剂量为约400mg/天，每周3-7天。在另一实施方案中，剂量为约400mg/天，每周5-7天。在另一实施方案中，剂量为约400mg/天，每周3天。在另一实施方案中，剂量为约400mg/天，每周4天。在另一实施方案中，剂量为约400mg/天，每周5天。在另一实施方案中，剂量为约400mg/天，每周6天。在另一实施方案中，剂量为约400mg/天，每周7天。
每日剂量是基于重量或体重为约60-80kg的成年人。因此，对于约100-1,200mg/天的范围，剂量范围可以从约1-20mg/kg/天至至多约50mg/kg/周。基于受试者重量的附加剂量可以容易地从这些值计算得到。类似地，本领域技术人员将能够基于已知的与人剂量的相关性来计算其他物种的剂量。
总的每日剂量可以以一个或多个剂量给药。在一个实施方案中，口服剂型每日给药一次。在另一实施方案中，口服剂型每日给药两次。在另一实施方案中，口服剂型每日给药三次。在另一实施方案中，口服剂型每日给药四次。
在实施方案中，口服剂型以至多约12,000mg/月的剂量给药。总的每月剂量可以每周1-7天，给药三周，然后休息一周，或者给药四周而不休息。对于每周的治疗，口服剂型可以每周1-7天给药。在一个实施方案中，口服剂型给药三周，然后休息一周。在另一实施方案中，口服剂型每周3-7天，给药三周，然后休息一周。在另一实施方案中，口服剂型每周5-7天，给药三周，随后休息一周。在另一实施方案中，口服剂型每日给药持续三周，随后休息一周。在另一实施方案中，口服剂型每日给药，持续28天。每个给药周期由3周治疗随后1周休息组成，或者由连续4周的治疗组成。如本领域技术人员所确定的，给药周期可按需要重复进行。在一个实施方案中，口服剂型给药长达12个给药周期。在一个实施方案中，口服剂型给药长达6个给药周期。
在任何实施方案中，肿瘤选自胃肠癌、泌尿生殖***癌、皮肤癌、结直肠癌(结肠癌或直肠癌)、卵巢癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌和肾癌。在另一个实施方案中，肿瘤是胃肠癌。在一些实施方案中，肿瘤是泌尿生殖***癌。在另一个实施方案中，肿瘤是皮肤癌。在另一个实施方案中，肿瘤是黑色素瘤。在另一个实施方案中，肿瘤是结直肠癌。在另一个实施方案中，肿瘤是结肠癌。在另一个实施方案中，肿瘤是直肠癌。在另一实施方案中，肿瘤是K-Ras突变结肠癌。在另一个实施方案中，肿瘤是卵巢癌。在另一实施方案中，肿瘤是铂耐性或难治性(例如，耐顺铂或耐卡铂)卵巢癌。在另一个实施方案中，肿瘤是肺癌。在另一实施方案中，肿瘤是非小细胞肺癌。在另一个实施方案中，肿瘤是乳腺癌。在另一个实施方案中，肿瘤是三阴性(TN)乳腺癌。在另一个实施方案中，肿瘤是转移性乳腺癌。在另一个实施方案中，肿瘤是胰腺癌。在另一个实施方案中，肿瘤是胃癌。在另一个实施方案中，肿瘤是肾癌。
在另一个实施方案中，受试者是哺乳动物。在另一个实施方案中，受试者是人。
4.3抑制Y593磷酸化的p68的β-连环蛋白依赖性ATP酶活性的方法
本公开的另一方面提供一种抑制Y593磷酸化的p68的β-连环蛋白依赖性ATP酶活性的方法，包含向在需要其的受试者给予有效量的式(I)化合物或其药用盐。
4.4预测治疗功效的方法
本公开的另一方面提供一种预测使用式(I)化合物或其药用盐治疗需要其的受试者的功效的方法，包括：
(a)从受试者采集肿瘤的样品；
(b)确定肿瘤是否表达Y593磷酸化的p68。
在一个实施方案中，该方法还包括，如果肿瘤表达Y593磷酸化的p68，向受试者给予式(I)化合物或其药用盐。
在另一实施方案中，该方法还包括确定式(I)化合物或其药用盐是否抑制Y593磷酸化的p68的β-连环蛋白依赖性ATP酶活性。在另一实施方案中，该方法包括：如果检测到β-连环蛋白依赖性ATP酶活性的抑制和Y593磷酸化的p68的表达，则向受试者给予式(I)化合物或其药用盐。
在另一实施方案中，该方法还包括以下步骤：确定式(I)的化合物或其药用盐是否抑制Y593磷酸化的p68的RNA-依赖性ATP酶活性。在另一实施方案中，该方法包括：仅在没有检测到RNA-依赖性ATP酶活性的抑制时，向受试者给予式(I)化合物或其药用盐。
在另一实施方案中，该方法还包括：确定式(I)化合物或其药用盐是否抑制β-连环蛋白向肿瘤细胞核中的易位。在另一实施方案中，该方法包括：确定式(I)化合物或其药用盐是否降低细胞内β-连环蛋白的水平。在另一实施方案中，该方法包括：确定式(I)化合物或其药用盐是否抑制由β-连环蛋白调节的一种或多种基因的表达。在另一实施方案中，该方法还包括：仅在检测到由β-连环蛋白调节的一个或多个基因的表达的抑制时，向受试者给予式(I)化合物或其药用盐。在另一实施方案中，该方法还包括：仅在检测到β-连环蛋白-TCF-4介导的转录活性的抑制时，向受试者给予式(I)化合物或其药用盐。在另一实施方案中，该方法还包括：仅在检测到Wnt信号活性的抑制时，向受试者给予式(I)化合物或其药用盐。在另一实施方案中，一个或多个基团选自细胞周期蛋白D1、c-Myc、Axin2、Surviv1和p-c-Jun。
在实施方案中，受试者是哺乳动物。在另一实施方案中，受试者是人。
在任何实施方案中，肿瘤选自胃肠癌、泌尿生殖***癌、皮肤癌、结直肠癌(结肠癌或直肠癌)、卵巢癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌和肾癌。在另一个实施方案中，肿瘤是胃肠癌。在一些实施方案中，肿瘤是泌尿生殖***癌。在另一个实施方案中，肿瘤是皮肤癌。在另一个实施方案中，肿瘤是黑素瘤。在另一个实施方案中，肿瘤是结直肠癌。在另一个实施方案中，肿瘤是结肠癌。在另一个实施方案中，肿瘤是直肠癌。在另一实施方案中，肿瘤是K-Ras突变结肠癌。在另一个实施方案中，肿瘤是卵巢癌。在另一实施方案中，肿瘤是铂耐性或难治性(例如，耐顺铂或耐卡铂)卵巢癌。在另一个实施方案中，肿瘤是肺癌。在另一实施方案中，肿瘤是非小细胞肺癌。在另一个实施方案中，肿瘤是乳腺癌。在另一个实施方案中，肿瘤是三阴性(TN)乳腺癌。在另一个实施方案中，肿瘤是转移性乳腺癌。在另一个实施方案中，肿瘤是胰腺癌。在另一个实施方案中，肿瘤是胃癌。在另一个实施方案中，肿瘤是肾癌。
4.5用于测试治疗功效的试剂盒
本公开的另一方面提供了一种用于测试式(I)化合物或其药用盐***的潜在功效的试剂盒，其中该试剂盒包括确定肿瘤是否表达Y593磷酸化的P68的测定。
在一个实施方案中，试剂盒还包括检测Y593磷酸化的p68的β-连环蛋白依赖性ATP酶活性的抑制的测定。在另一实施方案中，试剂盒进一步包括检测β-连环蛋白的细胞内水平(例如，胞质和核水平)的测定。在另一实施方案中，试剂盒包括检测由β-连环蛋白调节的一种或多种基因的表达的抑制的测定。在另一实施方案中，一种或多种基因选自细胞周期蛋白D1、c-Myc和p-c-Jun。
4.6药物组合物
在本文提供的任何方法和试剂盒中，式(I)化合物或其药用盐可以处于药物组合物中。这种药物组合物可以制备成任何适当的单位剂型。例如，药物组合物可以配制成以固体或液体形式给药，包括适用于以下的那些：(1)口服给药，例如，兽用顿服药(drench)、片剂(如针对口腔、舌下和全身吸收的那些，包括过度封装片剂)、胶囊(如硬胶囊、软胶囊、干填充胶囊、液体填充胶囊、明胶胶囊、非明胶胶囊或过度封装胶囊)、囊片、大丸药(bolus)、散剂、药囊、颗粒剂、膏剂、口喷剂、含片、糖淀、丸剂、糖浆剂、悬浮剂、酏剂、液体、脂质体、乳剂和微乳剂；或(2)通过如皮下注射、肌内注射、静脉内注射或硬膜外注射如无菌溶液或悬浮液进行肠胃外给药。此外，药物组合物可配制成立即释放、持续释放、延长释放、延迟释放或控制释放。
在一个实施方案中，药物组合物被配制用于口服给药。在另一实施方案中，药物组合物是固体口服剂型。在另一实施方案中，药物组合物是固体口服剂型，其提供如本文所描述的Tmax、Cmax、AUC0-t或它们的组合(参见第4.2节)。在另一实施方案中，药物组合物是片剂或胶囊。在另一实施方案中，药物组合物是片剂。在另一实施方案中，药物组合物是胶囊。在另一实施方案中，片剂或胶囊被配制用于立即释放。在另一实施方案中，片剂或胶囊被配制用于持续、延长、延迟或控制释放。
在另一实施方案中，片剂或胶囊还包含至少一种药用载体。载体包括可与药物组合物一起给药的任何物质，它们的预期目的是促进、协助或帮助药物组合物的给药或其它递送和/或改善药物组合物的生物利用度。载体可以包括任何液体、固体、半固体、凝胶气溶胶或其他物质，这些物质可以与药物组合物组合以帮助其给药。这样的载体可以进一步包括粘合剂如乙基纤维素、羧甲基纤维素、微晶纤维素或明胶；赋形剂如淀粉、乳糖或葡聚糖；崩解剂如海藻酸、海藻酸钠、羧甲基淀粉钠(Primogel)和玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotex；助流剂如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；调味剂如薄荷、水杨酸甲酯或橙香料，或着色剂。载体的其它实例可以包括聚乙二醇、环糊精、油或可配制到胶囊中的任何其它类似液体载体。合适载体的例子可以包括稀释剂、佐剂、赋形剂、水、脂质配制品和油如石油、动物油、植物油或合成油。合适的赋形剂可以包括水不溶性表面活性剂、水溶性表面活性剂和亲水助溶剂。合适的油可以包括甘油三酯、甘油二酯或甘油单酯。
在另一实施方案中，可以制备RX-5902的纳米颗粒并配制成悬浮剂、片剂、胶囊或其他剂型，如美国专利公开号US20150004234(2015年1月1日公开)中所公开的。在一个实施方案中，纳米颗粒具有的中值粒度(D50)小于约1,000nm。在另一实施方案中，纳米颗粒具有的中值粒度(D50)小于约500nm。在另一实施方案中，将RX-5902的纳米颗粒配制成悬浮剂。在另一实施方案中，如通过冻干干燥悬浮剂以形成粉末。在另一实施方案中，将粉末与一种或多种药用赋形剂组合。在另一实施方案中，将粉末封装入胶囊中。
胶囊的组成和制备在本领域中是公知的。例如，可以由以下制备胶囊：明胶(例如，A型、B型)、角叉菜胶(例如，κ、ι、λ)和/或改性纤维素(例如，羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、乙酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素)以及可选的一种或多种赋形剂如油(例如，鱼油、橄榄油、玉米油、大豆油、椰子油、甘油三酯、甘油二酯和甘油单酯)、增塑剂(例如，甘油、丙三醇、山梨糖醇、聚乙二醇、柠檬酸、柠檬酸酯如柠檬酸三乙酯、多元醇)、助溶剂(例如，三乙酸甘油酯、碳酸丙二酯、乳酸乙酯、丙二醇、油酸、二甲基异山梨醇、硬脂醇、鲸蜡醇、鲸蜡硬脂醇、山嵛酸甘油酯、棕榈酰硬脂酸甘油酯)、表面活性剂、缓冲剂、润滑剂、湿润剂(humectant，保湿剂)、防腐剂、着色剂和调味剂。胶囊可以是硬的或软的。硬胶囊的例子包括可从获得的DRcapsTM、DUOCAPTM、和Plus胶囊。例如，硬胶囊可以通过以下制备：形成两个套管式胶囊半部，用包含式(I)化合物或其药用盐的填充物填充其中一个半部，并将胶囊半部密封在一起。填充物可以是任何合适的形式，例如，干粉、颗粒、悬浮液或液体。软胶囊的例子包括软明胶(也叫软凝胶或软弹性)胶囊如例如，软胶囊可以通过旋转模具、板、往复式模具或机器方法来制备。在实施方案中，胶囊可以是液体填充的硬胶囊或软明胶胶囊。
片剂可以通过压缩或模制制备，可选地使用一种或多种辅助成分。可以在适合的机器中，通过压缩可选地混合有粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂的自由流动形式(如粉末或颗粒)的式(I)化合物或其药用盐制备压缩片剂。可以通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物制备模制片剂。片剂可以可选地被包衣或刻痕，并且可以被配制以提供持续释放、延长释放、延迟释放或控制释放。配制此种持续释放、延长释放、延迟释放或控制释放组合物的方法是本领域已知的并且公开于授权美国专利中，包括但不限于美国专利号4,369,174、4,842,866以及其中引用的参考文献中。包衣如肠溶衣可用于将化合物递送到肠中(参见如美国专利号6,638,534、5,217,720、6,569,457和其中引用的参考文献)。除了片剂之外，也可配制其他剂型如胶囊、颗粒剂和凝胶帽以提供持续释放、延长释放、延迟释放、或控制释放。
在另一个实施方案中，药物组合物配制用于肠胃外给药。适用于肠胃外给药的药物组合物的实例包括水性无菌注射液和非水性无菌注射液，其各自含有如抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和/或使配制品与预期接受者的血液等渗的溶质；和水性无菌悬浮液和非水性无菌悬浮液，其各自含有如悬浮剂和/或增稠剂。配制品可以存在于单剂量或多剂量容器中，例如，密封的安瓿或小瓶，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，仅需在即将使用之前加入无菌液体载体如水。在一个实施方案中，药物组合物配制用于静脉内给药。
在实施方案中，药物组合物还包含药用赋形剂。药用赋形剂可以是本身不是治疗剂的任何物质，其用作用于向患者递送治疗剂的载体、稀释剂、佐剂、粘合剂和/或载体，或者添加到药物组合物中以改善其处理或储存性能或者以允许或有助于将化合物或药物组合物形成为用于给药的单位剂型。药用赋形剂在制药领域是已知的并且例如公开于Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版(Lippincott Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2005)中。如本领域技术人员所知，药用赋形剂可以提供多种功能并且可以被描述为润湿剂、缓冲剂、悬浮剂、润滑剂、乳化剂、崩解剂、吸收剂、防腐剂、表面活性剂、着色剂、调味剂和甜味剂。药用赋形剂的实例包括但不限于：(1)糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、乙酸纤维素、羟丙基甲基纤维素和羟丙基纤维素；(4)粉末状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂如可可脂和栓剂蜡；(9)油如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇如丙二醇；(11)多元醇如丙三醇、山梨醇、甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；和(22)药物配制品中使用的其它无毒的相容性物质。
在实施方案中，药物组合物可以包括至少一种附加活性剂。该活性剂可以是抗肿瘤剂、化学治疗剂、细胞毒剂、免疫调节剂、放射治疗剂，或者是能够诱导细胞凋亡、使细胞对凋亡敏感、调节蛋白激酶或治疗赘生物、肿瘤或癌症的任何其它药剂。活性剂的实例包括：(1)抗代谢物，如阿糖胞苷、氟达拉滨、5-氟-2′-脱氧尿苷、吉西他滨、4-氨基-1-((1S,4R,5S)-2-氟-4,5-二羟基-3-羟甲基-环戊-2-烯基)-1H-嘧啶-2-酮(RX-3117)、羟基脲或氨甲喋呤；(2)DNA片段化剂如博莱霉素；(3)DNA交联剂如苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺和氮芥；(4)嵌入剂如阿霉素(多柔比星)和米托蒽醌；(5)蛋白合成抑制剂如L-天冬酰胺酶、放线菌酮、嘌呤霉素和白喉毒素；(6)拓扑异构酶I毒素如喜树碱和拓扑替康；(7)拓扑异构酶II毒素如依托泊苷(VP-16)和替尼泊苷；(8)微管导向剂如秋水仙胺、秋水仙碱、紫杉醇、长春碱和长春新碱；(9)激酶抑制剂如夫拉平度(flavopiridol)、星形孢菌素和7-羟基星形孢菌素；(10)酶聚ADP核糖聚合酶(PARP)抑制剂如奥拉帕尼、维利帕尼、瑞卡帕布(rucaparib)、尼拉帕尼(niraparib)和Talazoparib；(11)多酚如槲皮素、白藜芦醇、白皮杉醇、表没食子儿茶素没食子酸酯、茶黄素、黄烷醇、原花青素、桦木酸及其衍生物；(12)激素如糖皮质激素和芬维A胺；(13)激素拮抗剂如它莫昔芬、非那雄胺和LHRH拮抗剂；(14)死亡受体激动剂如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、肿瘤坏死因子β(TNF-β)、LT-β(淋巴毒素-β)、TRAIL(Apo2L，DR4配体)、CD95(Fas，APO-1)配体、TRAMP(DR3，Apo-3)配体、DR6配体和片段；(15)免疫检查点抑制剂；(16)抗程序性细胞死亡1(PD-1)受体抗体或抗程序性细胞死亡配体1(PD-L1)抗体；(17)免疫检查点抑制剂(CTLA-4)；以及它们的衍生物。
在另一实施方案中，式(I)化合物或其药用盐在药物组合物中的量为按重量计约0.1％至约5％。在另一实施方案中，量为按重量计约0.5％至约2.5％。
4.7给药方法
在本文提供的任何方法中，化合物或药物组合物的给药可以通过本领域已知的任何可接受的模式如口服或肠胃外。术语“肠胃外”包括但不限于皮下、静脉内、肌内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内、颅内、通过骨内注射和通过输注技术。在一个实施方案中，口服给予化合物或药物组合物。在另一实施方案中，肠胃外给予化合物或药物组合物。在另一实施方案中，静脉内给予化合物或药物组合物。在另一实施方案中，肿瘤内给予化合物或药物组合物。
在一个实施方案中，以本文公开的(如第4.2节)的剂量口服给予化合物或药物组合物。
对于静脉内给药可以调整剂量水平。在此种情况下，可以约0.01μg/kg/min至约100μg/kg/min的量给予化合物或药物组合物。
4.8联合疗法
在任何本文提供的治疗或预防肿瘤的方法中，该方法还可以包括给予受试者一种或多种另外的抗肿瘤剂或辐射的步骤。在一个实施方案中，该方法包括给予受试者辐射。在另一实施方案中，该方法进一步包括给予受试者一种或多种另外的抗肿瘤剂。
可以在给予式(I)化合物或其药用盐之前、之后或过程中给予另外的抗肿瘤剂或辐射。在一个实施方案中，在给予式(I)化合物或其药用盐之前给予另外的抗肿瘤剂或辐射。在另一实施方案中，在给予式(I)化合物或其药用盐之后给予另外的抗肿瘤剂或辐射。在另一实施方案中，在给予式(I)化合物或其药用盐的过程中给予另外的抗肿瘤剂或辐射。在另一实施方案中，另外的抗肿瘤剂和式(I)化合物或其药用盐被配制为药物组合物用于同时给药。
如本文所用，术语“抗肿瘤剂”是指用于治疗或预防肿瘤的任何药剂。抗肿瘤剂的实例包括在第4.6节中描述的活性剂。在一个实施方案中，另外的抗肿瘤剂选自抗代谢物、DNA片段化剂、DNA交联剂、嵌入剂、蛋白合成抑制剂、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、微管导向剂、激酶抑制剂(例如，酪氨酸激酶抑制剂)、多酚、激素、激素拮抗剂、死亡受体激动剂、酶聚ADP核糖聚合酶(PARP)抑制剂、免疫检查点抑制剂、抗程序性细胞死亡1(PD-1)受体抗体和抗程序性细胞死亡配体1(PD-L1)抗体。在另一实施方案中，另外的抗肿瘤剂是PD-1受体抗体。在另一实施方案中，另外的抗肿瘤剂是派姆单抗。在另一实施方案中，另外的抗肿瘤剂是纳武单抗。在另一实施方案中，另外的抗肿瘤剂是曲美母单抗(tremelimumab)。在另一实施方案中，另外的抗肿瘤剂是伊匹单抗(ipilinumab)。在另一实施方案中，另外的抗肿瘤剂是纳武单抗和伊匹单抗的组合。在另一实施方案中，另外的抗肿瘤剂是派姆单抗和曲美母单抗的组合。
4.9制备RX-5902的方法
美国专利8,314,100公开了一种通过中间体3-氨基-6-氟-2-甲氧基喹喔啉和N-(6-氟-2-甲氧基喹喔啉-3-基)氨基甲酸乙酯，以3步将3-氨基-2-氯-6-氟喹喔啉转化为RX-5902的方法。
在小批量反应方法过程中，检测到了去甲基化的杂质(基于质谱数据)并且需要纯化将其去除。此外，小批量方法需要将中间体浓缩至干燥。因此，该方法是不能令人满意的用于商业规模生产。因此，有必要提供一种改进的方法，可以在固定设备中扩大规模，以便进行有效的商业生产。例如，通过去除浓缩至干燥、用非卤化溶剂取代一些卤化溶剂和通过改进小批量生产过程中体积低效的化合物1的再结晶改进该方法。
下面详细介绍RX-5902的小批量生产和改进的生产方法。
4.9.1 1.5kg RX-5902药物的小批量生产
方案1.用于生产RX-5902的小批量合成方法
方案1
本发明提供了一种在商业规模上制备式(I)化合物或其药用盐的方法，
通过：(a)在有机溶剂中在碱存在下使3-氨基-6-氟-2-甲氧基喹喔啉与氯甲酸乙酯反应以形成混合物；(b)加入乙酸乙酯的同时蒸馏该混合物以形成悬浮液；(c)过滤该悬浮液以分离乙基-N-(6-氟-2-甲氧基喹喔啉-3-基)碳酸酯；和(d)在第二有机溶剂中在第二碱的存在下使乙基-N-(6-氟-2-甲氧基喹喔啉-3-基)碳酸酯与1-(3,5-二甲氧基苯基)哌嗪盐酸盐反应。
进行了4-(3,5-二甲氧基苯基)-N-(7-氟-3-甲氧基喹喔啉-2-基)哌嗪-1-羧酰胺(RX-5902)的1.5kg规模的当前良好生产规范(cGMP)生产。初始生产得到1.318kg的RX-5902。然而，当进行释放测试时，发现超出了规范的RRT 0.57的一个未指定的杂质(结果：0.82％对限制≤0.50％)。该杂质后来通过质谱鉴定为对应于被认为是去甲基化的RX-5902。成功地开发并实施了碱洗返工程序，最终得到1.128kg(指定为批次35444A)。
该方法的实施方案可以包括：(e)在有机溶剂中在碱的存在下使3-氨基-2-氯-6-氟喹喔啉与甲醇钠反应以形成混合物；(f)向步骤(e)的混合物中加入水以形成溶液；(g)将该溶液冷却到约15-20℃的温度以形成悬浮液；和(h)过滤步骤(g)的悬浮液以分离3-氨基-6-氟-2-甲氧基喹喔啉。
在实施方案中，步骤(a)中的有机溶剂可以是二氯甲烷。在实施方案中，步骤(a)中的碱可以是吡啶。在实施方案中，蒸馏步骤(b)可以在大压气下进行。在实施方案中，步骤(c)可以是通过真空过滤。在实施方案中，步骤(d)中的第二有机溶剂可以是四氢呋喃。在实施方案中，步骤(d)中的第二碱可以是1,8-二氮杂双环十一碳-7-烯。在实施方案中，这些步骤可以在一个或多个固定反应器中进行。
4.9.211 kg RX-5902的大规模合成生产
本发明提供了一种制备RX-5902的改进方法，其对于大规模生产是商业可行的。该方法改进了RX-5902的小批量生产方法，允许在固定设备中扩大规模以用于商业规模生产，以显著降低生产成本。本发明的方法去除了浓缩至干燥的步骤、替换了一些卤代溶剂并且改进了在小批量生产方法中体积效率低下的化合物1的重结晶。
方案2示出了用于固定反应器/大规模生产RX-5902的改进方法。如方案2所示，该方法的实施方案可以包括通过以下制备RX-5902：在有机溶剂中在碱存在下，使乙基-N-(6-氟-2-甲氧基喹喔啉-3-基)碳酸酯(化合物3)与1-(3,5-二甲氧基苯基)哌嗪盐酸盐反应，直到HPLC指示反应完成。在一个实施方案中，有机溶剂可以是四氢呋喃。在一个实施方案中，碱可以是1,8-二氮杂双环十一碳-7-烯(DBU)。
该方法的实施方案可以包括在有机溶剂中在碱存在下使化合物2与氯甲酸乙酯反应以形成化合物3。在一个实施方案中，可以有碱的存在下将化合物2溶解于有机溶剂中，然后将氯甲酸乙酯缓慢地添加到溶液中。在一个实施方案中，可以用DI水萃取有机相并且可以在大气压下蒸馏有机相以除去有机溶剂。在一个实施方案中，在蒸馏过程中可以添加乙酸乙酯。在一个实施方案中，可以通过真空过滤收集固体形式的化合物3并且用乙酸乙酯洗涤和干燥。在一个实施方案中，有机溶剂可以是二氯甲烷。在一个实施方案中，碱可以是吡啶。
该方法的实施方案可以包括在四氢呋喃中，用甲醇钠将化合物1转化为3-氨基-6-氟-2-甲氧基喹喔啉(化合物2)，直到反应完全。在一个实施方案中，可以向溶液混合物中加入水。在一个实施方案中，可以将溶液冷却到约15-20℃的温度。在一个实施方案中，可以通过常压蒸馏浓缩反应混合物以除去四氢呋喃并将体积减少到不到一半。在一个实施方案中，化合物2可以用水洗涤并通过过滤收集。
该方法的实施例可以包括使用1,2-二氨基-4-氟苯作为起始原料制备RX-5902的六步工艺。在一个实施方案中，该工艺利用固定设备进行适合cGMP生产RX-5902的放大工艺。
该方法的实施方案可以包括通过使1,2-二氨基-4-氟苯与草酸反应以将1,2-二氨基-4-氟苯转化成6-氟-1,4-二氢喹喔啉-2,3-二酮(化合物A)。可以通过真空过滤沉淀和收集化合物A。
该方法的实施方案可以包括通过在氯仿中使化合物A与过量的亚硫酰氯回流直至完成以将化合物A转化为2,3-二氯-6-氟喹喔啉(化合物B)。在一个实施方案中，该反应可以用氢氧化钠淬灭并搅拌，直到剩余的亚硫酰氯被分解。在一个实施方案中，可以通过常压蒸馏蒸馏除去氯仿。在一个实施方案中，可以在蒸馏过程中加入庚烷。在一个实施方案中，可以将化合物B过滤，用庚烷洗涤并真空干燥。在一个实施方案中，可在真空下蒸馏滤液(即母液)以回收额外的化合物B。
该方法的实施方案可以包括使用氢氧化铵将化合物B转化为3-氨基-2-氯-6-氟喹喔啉(化合物1)，直至完成。在一个实施方案中，可以通过在温暖即45±5℃的升高的温度下过滤反应混合物纯化化合物1。
方案2
特别地，本发明的方法改进除去了步骤2、4和5中的浓缩至干燥的操作(分别用于化合物B、化合物2和化合物3的生产)并且改进了化合物1纯化的体积效率。本发明还用非氯代溶剂代替了步骤2、4和5中的氯代溶剂。
如下所详细描述的，该程序避免浓缩至干燥是成功的。
对于步骤2，蒸馏除去大部分氯仿，然后用庚烷替代，这得到了可过滤的化合物B的悬浮液。
对于步骤3，还改进了化合物1的纯化。具体地，通过温热(45±5℃)过滤反应混合物来完成纯化，与使用小批量方法的产率62％相比，这得到了72.6％的改进产率。另外，意外地将不希望的区域异构体降低到了可接受的水平(参见表1)。
表1.RX-5902的各个批次中的区域异构体杂质水平
批次35444A和35686A是通过以下实施例13中描述的现有小批量方法制得的，并且批次35921A是通过以下实施例14中描述的改进的固定反应器/大规模方法制备的。
NT*-未测试
ND**-未检出
对于步骤4，在制造化合物2时实现了两个改进。首先，通过在水中淬灭反应，然后蒸馏除去四氢呋喃，接着过滤产物，实现了浓缩至干燥步骤的去除。这一新的处理还减少了卤代溶剂。该处理避免了在产物萃取中二氯甲烷的使用。
对于步骤5，通过常压蒸馏二氯甲烷并用乙酸乙酯原位替代二氯甲烷，去除了浓缩至干燥的步骤。溶剂交换提供了另一种易于过滤的浆液，以高纯度和更好的收率分离所需产物。
4.10 RX-5902的纳米配制品
本发明提供了具有改善的口服生物利用度的新型RX-5902纳米配制品和制备RX-5902纳米配制品的方法。例如，本发明提供了一种用于在足以提供悬浮液的条件下减小式(I)化合物或其药用盐的粒度的方法。在实施方案中，可以通过研磨工艺来制备悬浮液。在实施方案中，研磨工艺可以是低能研磨工艺如辊磨。在实施方案中，研磨工艺可以是高能研磨工艺如高能搅拌器研磨。在实施方案中，研磨工艺可以是高能搅拌器研磨或辊磨。在实施方案中，研磨工艺可以是高能搅拌器研磨。在实施方案中，悬浮液可以具有约200nm或更小的D50粒度。在实施方案中，该方法可以包括冻干悬浮液以形成粉末。在实施方案中，该方法可以包括喷雾干燥悬浮液以形成粉末。
4.10.1通过低能研磨和冻干再加工RX-5902纳米悬浮液
来自先前制备的RX-5902纳米悬浮液的再加工可用于产生用于非-GLP使用的RX-5902的纳米悬浮液。在处理之前，分析纳米悬浮液以确定延长的储存是否已经不利地影响活性药物成分(API)(在本例中为RX-5902，颗粒)的化学性质或物理性质。通过辊磨处理悬浮液，以将观察到的附聚减少至更可接受的粒度分布，然后冻干以产生干粉。
老化的悬浮液的再加工成功地产生了具有与临床浴相当的粒度分布的干粉，临床浴是由未加工的API研磨并立即冻干得到的。先前制造的批料能够被研磨成更均匀的粒度分布而没有附聚，这表明再加工的纳米悬浮液的老化可能会不利影响研磨效率。例如，已经用于制备临床批料的研磨材料已经被减少到单峰亚微米分布，其中D90为约200nm；然而，再加工的材料的D90具有～800nm的下限。
冻干条件似乎也在干粉的最终粒度分布中起作用。与临床批次或再加工批次相比，使用具有-80℃冷凝器的冻干机干燥的研发批次产生了更有利的粒度分布。临床批次或再加工批次均用-53℃的冷凝器干燥。临床批次或再加工批次也是以比研究材料更大的量制造的，这可以表明冷冻时间也与干粉配制品中聚集体的形成有关。
4.10.2 RX-5902高能纳米研磨工艺开发和喷雾干燥的可行性
在RX-5902纳米悬浮液的研磨和干燥中都测试了替代技术，以提高最终干燥粉末生产的效率和可扩展性。先前制备的纳米悬浮液可以通过高能研磨可替换地被再加工，并且使用冻干或喷雾干燥干燥。可使用高能搅拌器研磨代替辊磨以制备起始纳米悬浮液。可以使用喷雾干燥替代冻干以制备干粉。只需对悬浮液配制品进行微小的调整，搅拌器研磨即可产生类似的纳米粒度分布。没有观察到明显的API降解。喷雾干燥产生了微米尺寸范围内的窄粒度分布，但似乎没有在物理上或化学上影响API纳米颗粒。
RX-5902似乎可被修改用于搅拌器研磨和冻干或喷雾干燥，并且不存在可归因于各工艺引起的明显分解或损失。将纳米悬浮液制剂转移至搅拌器研磨所需的唯一重大改变是起始制剂的稀释。预计这对干粉生产没有任何有害的影响，因为稀释的搅拌器-研磨的材料中的API浓度大于从原始辊磨工艺获得的最终浓度。如有必要，应允许进一步稀释以便有效地从介质中萃取API。
原始干粉配制品是使用10％RX-5902开发的，其已经通过添加泊洛沙姆而被修饰以在冷冻干燥过程中提供防止聚集的保护。使用喷雾干燥产生最终粉末允许省略该过程的稀释、测定和泊洛沙姆添加步骤。虽然喷雾干燥粉末的粒度分布明显大于冻干材料的粒度分布，但是测量反映的是微球的大小而不是纳米晶体的大小，其似乎不受工艺的影响。
4.10.3可替换的RX-5902纳米配制品和工艺
在1.5kg RX-5902纳米配制品的制造过程中，延长的研磨时间引起起泡。通过在生产过程中间歇冷却子批次来减少泡沫。延长的研磨时间和间歇冷却产生了与小规模批次生产相同品质的RX-5902纳米配制品。
4.10.4用于RX-5902的研磨操作
由于粒度降低是RX-5902生物利用度的关键参数，因此可以利用并优化各种降低粒度的方法。这些方法包括微粉化、机械研磨、低温研磨、湿研磨法(搅拌器和轧制机)、微流化和高压均质化。湿研磨法之后可以是冷冻干燥或喷雾干燥法，以提供固体形式。
也可以使用通过包括Holt熔体挤出、喷雾干燥具有赋形剂存在的分散体和喷雾凝结的方法制备的无定形制剂。所有这些方法都可以形成预期具有改善的生物利用度的无定形形式。
还可以使用RX-5902的脂质配制品。脂质配制品可以有益于RX-5902，提供在油相中预溶解或预悬浮的API。预计基于脂质的配制品也具有改善的生物利用度。
4.11 RX-5902晶体结构
4.11.1 RX-5902晶体的XRPD研究
RX-5902晶体的X射线粉末衍射(XRPD)分析提供了表2所示的主要峰。在工作例中提供了峰和其他参数的完整列表。
表2.RX-5902的XRPD中的主要峰
如上所示，RX-5902的结晶形式(指定为形式1)具有由在8.56、15.57、15.85、18.14、21.48、23.66、24.85和27.47处的峰表征的特征峰(度2θ)。形式1 RX-5902可以进一步表征为在8.56、14.35、15.33、15.57、15.85、16.97、18.14、21.48、21.83、23.66、24.41、24.85和27.47处的峰(度2θ)。形式1 RX-5902的XRPD的特征还在于具有10.33、5.69、5.59、4.89、4.14、3.76、3.58和3.25的d-间距的迹线。形式1 RX-5902的XRPD进一步特征在于具有10.33、6.17、5.78、5.69、5.59、5.22、4.89、4.14、4.07、3.76、3.65、3.58和3.25的d-间距的迹线。
4.11.2多晶型研究
通过各种固态技术表征RX-5902批次。所提供的材料是结晶固体，表示为形式1。这种材料是非吸湿性的，暴露在潮湿环境中是稳定的，并且代表了进一步开发的可行形式。含有RX-5902的配制品的XRPD分析显示出与形式1一致的峰，这表明在配制过程中没有发生形式改变。
使用晶体和无定形RX-5902进行的多晶型物筛选实验鉴定了API的多种晶体形式。这些中的许多实际上结晶性较差，并且难以重现以进行全面评价。这些形式中一些的XRPD衍射图显示出相似性，这表明它们在结构上是相关的，同时存在的不同量的溶剂提高了这些是通道溶剂化物类型结构的可能性。
在重新制备各种观察到的固体时遇到的困难意味着不可能获得RX-5902多晶型景观的全面理解。API以不同形式结晶的倾向意味着将需要严格的结晶方案以确保可靠地制备形式1。旨在确定适用于该程序的溶剂的研究表明***、2-甲基-1-丙醇、乙醇和MIBK作为良好的候选物。
实施例
以下实施例是为了说明目的而提供的，并且不应该用来限制所公开的主题的范围。
实施例1：对RX-5902的体外代谢研究
进行了两项体外研究，以检查特定的细胞色素P450(CYP450)同工酶在RX-5902的体外代谢中的参与。在第一项研究中，在使用表达的CYP450同工酶(1A2、2A6、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6、3A4和3A5)温育后，测量RX-5902的损失。结果表明在使用CYP 3A4(87％损失)和CYP 3A5(54％损失)温育30分钟后的RX-5902的损失，但是用任何其它CYP同工酶损失很小。在第二项研究中，在CYP450同工酶-选择性化学抑制剂存在下，用汇集的人肝微粒体温育RX-5902。所测试的抑制剂对1A2、2A6、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6和3A4/5具有选择性。在CYP3A4/5-选择性抑制剂(酮康唑)的存在下观察到了RX-5902代谢的显著抑制，但使用其它同工酶的抑制剂未观察到显著抑制。这些研究一起表明，CYP450-介导的RX-5902的代谢主要是由于CYP3A4/5同工酶引起的，通过其它CYP450同工酶代谢很少。
该数据表明，RX-5902代谢和暴露可能对与改变CYP3A4/5活性的药物的药物-药物相互作用特别敏感。因此，RX-5902与CYP3A4/5抑制剂的共同给药可能提高RX-5902的血浆浓度，而与CYP3A4/5诱导剂的共同给药可能减少RX-5902的血浆浓度。因此，存在以下潜力：接受CYP3A4/3A5抑制剂的受试者可能对RX-5902具有过度的药理学或毒性反应，或者接受CYP3A4诱导剂的受试者可能具有降低的RX-5902活性。
实施例2：RX-5902在人体内的药代动力学、安全性和耐受性
在剂量范围研究中，评价了RX-5902在各个口服剂量下的药代动力学(PK)、安全性和耐受性。以RX-5902的25-775mg每日剂量每周一次、250-300mg每日剂量每周三次、150-300mg每日剂量每周五次、或300-350mg每日剂量每周七次，向患有晚期或转移性实体瘤的受试者给予含有RX-5902的胶囊，持续至多6个给药周期。每个周期由持续3周每周1-5个剂量RX-5902和随后1周休息组成，或者由持续4周每周5-7个剂量RX-5902且在每4-周周期间无任何休息组成。除了一位受试者外，所有的受试者在给药前至少8小时禁食。一位受试者在进食状态下接受300mg RX-5902。使用经验证的LC MS/MS测定，在第1天和第15天测量血浆浓度持续48小时，并且Phoenix WinNonlin，版本6.4计算非房室药代动力学参数。
药代动力学(PK)
图1(对于受试者#1-11)和表3给出了单次给药后的初步PK数据。
表3.人PK数据
与在禁食状态下给予300mg的受试者相比，在进食状态下给予300mg的受试者中观察到显著更高的暴露(表3)。
RX-5902有时显示一个明显的短暂的滞后时间(0.25小时)，通常随后是急剧上升的血浆阶段。在给药后1至6小时观察到Tmax有所变化。Tmax之后，经常观察到一个短暂的分布阶段，接着是明显的末期阶段。通常，到24小时观察到超过75％的AUC0-t(0-48小时)。表观末端T1/2在5.8至27.6小时的范围内，但大多数个体值接近13.0小时的平均值。Cmax和AUC0-t(0-48小时)相当地随剂量增加而线性增加。AUClast总体上以与剂量成比例的方式增加，但是Cmax以不太成比例的方式增加。表3示出了对于各种剂量和给药频率的临床Cmax和AUC范围。
安全性和耐受性
最频繁报告的不良事件是轻微的恶心、呕吐和疲劳。该结果显示，在测试的剂量水平下，RX-5902是良好耐受的。
实施例3：用于在癌症的异种移植模型中评估RX-5902功效的协议
检查了RX-5902在人癌症异种移植小鼠模型中的功效。在研究的第1天体重(BW)范围为15-30g的9-10周大的雌性裸鼠(nu/nu,Harlan或CRL:NU(NCr)-Foxn1nu,CharlesRiver)，随意喂食水(反渗透,1ppm Cl)和由18.0％粗蛋白质、5.0％粗脂肪和5.0％粗纤维组成的NIH 31改良和辐照的实验室(NIH 31 Modified and Irradiated Lab)。在12小时光周期的静态微型隔离器中在20-22℃(68-72°F)和40-60％湿度下，将小鼠置于辐照的Enrich-o’cobsTM实验动物垫料上。该研究符合实验动物管理和使用指南关于约束、饲养、手术过程、饲料和流体调节以及兽医护理的建议。
根据ATCC的用法说明，培养各种人肿瘤细胞系(例如，HCT116、HT29、H460、H69、Caki-1、CaSki、MiaPaca2、BxPC3和Colo 205细胞[ATCC,Manassas,VA,USA])。在37℃的潮湿培养箱中，在5％CO2和95％空气的气氛中，在组织培养瓶中培养肿瘤细胞。
在指数生长期间收获细胞并用磷酸盐缓冲盐水重新悬浮。每只测试动物在右侧接受皮下(s.c.)注射5×106个肿瘤细胞，并且当平均肿瘤大小接近80-300mm3的目标范围时，监测肿瘤生长。当肿瘤达到目标大小时，将小鼠随机分成几组(n＝10-20)并且开始使用RX-5902的各种治疗方案或阳性对照(例如，吉西他滨)或阴性对照(例如，载体、盐水)治疗。定期测量肿瘤和体重，直到研究结束。
使用卡尺在两个维度上测量肿瘤，并使用下式计算体积：
其中w＝肿瘤宽度且l＝肿瘤长度，以mm计。可以通过假设1mg相当于1mm3的肿瘤体积来估计肿瘤重量。
在第1天，在具有特定细胞系建立的皮下肿瘤的八组小鼠(n＝10-20/组)中开始治疗。每组按照研究设计治疗。所有剂量均按每个体重调整。为功效和采样目的对每组中的动物进行划分。还有一些组指定为用于采样目的的载体对照且未治疗。
在研究的第1天，所有来自未治疗组的动物均进行肿瘤和全血采样。此外，在第一次给药后的2、8和24小时以及第二次给药后的24小时对来自其他组中的四只动物进行采样。在异氟烷麻醉下通过末端心脏穿刺处死小鼠。将全血量收集到含有肝素锂抗凝血剂的管中。为了血浆，使用肝素锂作为用于PBMC的抗凝血剂单独处理每个血液样品。收集肿瘤并分成两半，其中一部分在10％中性缓冲的***(NBF)中固定24小时，然后转移到70％乙醇中，并且将另一半速冻。将血浆和肿瘤冷冻样品储存在-80℃下。
使用来自第15天的数据确定治疗功效。对于动物数量n，确定每组在第15天的MTV(n)、中值肿瘤体积。肿瘤生长抑制百分比(％TGI)定义为指定对照组(载体给药)的MTV与药物治疗组的MTV之间的差，表示为对照组的MTV的百分比：
％TGI＝[1-(MTV药物治疗/MTV对照)]x 100
除了由于治疗相关(TR)或非治疗相关(NTR)原因导致死亡的那些动物之外，TGI分析的数据集包括一组中的所有动物。在该测定中产生至少60％TGI的药剂被认为具有潜在的治疗活性。
单独监测动物的肿瘤生长，直到第71天。研究方案详细说明了肿瘤生长延迟测定法，其基于在治疗组与对照组中的距终点中值时间(TTE)。当其肿瘤达到2000mm3体积终点时，为了肿瘤进展(TP)每只动物被处于安乐死。用以下等式计算每只小鼠的距终点时间(TTE)：
其中b是通过log-转换的肿瘤生长数据集的线性回归获得的线的截距且m是斜率。数据集由超过研究终点体积的第一个观察值和紧接达到终点体积之前的三个连续观察值组成。任何未达到终点的动物在研究结束时被处于安乐死，并且指定等于研究的最后一天(71天)的TTE值。在log-转换的计算的TTE在达到终点的前一天或者超过达到肿瘤体积终点的那一天的情况下，执行线性插值以近似TTE。确定为死于治疗相关(TR)原因的任何动物均被分配等于死亡日的TTE值。死于非治疗相关(NTR)原因的任何动物都被排除在TTE分析之外。
在第71天，MTV(n)被定义为存活到最后一天且其肿瘤尚未达到体积终点的动物数n的中值肿瘤体积。确定为死于治疗相关(TR)原因的任何动物被分配等于死亡日的TTE值。死于非治疗相关(NTR)原因的任何动物都被排除在分析之外。由肿瘤生长延迟(TGD)评估治疗结果，其被定义为与对照组相比，治疗组的中值TTE的增加：
TGD＝T–C
以天数表示，或表示为对照组中值TTE的百分比：
其中T＝治疗组的中值TTE，以及C＝对照组的中值TTE。
也由回归响应的数量确定治疗效果。治疗可能导致动物中肿瘤的部分消退(PR)或完全消退(CR)。在PR响应中，在研究过程中三次连续测量的肿瘤体积是其D1体积的50％或更少，并且这三次测量中的一次或多次等于或大于13.5mm3。在CR响应中，在研究过程中，三次连续测量的肿瘤体积小于13.5mm3。在研究的最后一天具有CR响应的任何动物均被另外地分类为无肿瘤存活者。
为了毒性评估，在研究的前五天每天对动物称重，之后每周两次。经常观察小鼠的任何不良的治疗相关副作用的明显迹象，并且在观察到时记录毒性的临床迹象。
可接受的毒性定义为在研究期间小于20％的组平均体重损失，并且在10只治疗动物中不超过一只治疗相关的(TR)死亡。导致更大毒性的任何给药方案被认为是高于最大耐受剂量(MTD)。如果死亡是归因于由临床迹象和/或尸体解剖证明的治疗副作用，或者如果死亡在给药期间或最后一次给药的十四天内由不明原因引起，那么将该死亡被归类为TR。如果没有证据表明死亡与治疗副作用有关，则死亡被归类为非治疗相关(NTR)。
将用于Windows的Prism 6.05(GraphPad)用于统计和图形分析。将多个组的MTV值与非参数Kruskal-Wallis检验和事后Dunn多重比较检验进行比较。在P＝0.05进行双尾统计分析。Prism将结果报告为：P>0.05，不显著(ns)；0.01<P≤0.05，显著(用“*”表示)；0.001<P≤0.01，非常显著(“**”)；和P≤0.001，极显著(“***”)。因为统计检验是显著性检验并且不提供组间差异大小的估计，所以在这一报告的正文中，将所有的显著性水平描述为显著或不显著。
基于TTE值，通过Kaplan-Meier方法分析存活率。基于TTE值，对数秩(Mantel-Cox)和Gehan-Breslow-Wilcoxon检验确定了两组总体存活经验(存活曲线)之间差异的显著性。Kaplan-Meier图和统计检验共享相同的数据集，并且排除记录为NTR死亡的任何动物。按组构建散点图以显示个体小鼠的TTE值；此图显示了NTR死亡，其被排除在所有其他附图之外。绘制组平均肿瘤体积作为时间函数的曲线。当动物由于肿瘤大小或TR死亡而退出研究时，其最终记录的肿瘤体积被包括在用于计算随后时间点的中值体积的数据中。在同一组发生两次TR死亡后，肿瘤生长曲线被截断。在研究过程中的组平均体重(BW)变化被绘制为相对D1的百分比变化，±SEM。在一组中多于一半的可评估小鼠退出研究之后，肿瘤生长和BW变化曲线被截断。
实施例4：RX-5902在肾细胞癌异种移植模型中的功效
遵循实施例3中描述的协议，检查了RX-5902在具有人肾肿瘤异种移植物(Caki-1)的小鼠中对肿瘤生长的影响。肿瘤生长延迟被测量为与载体治疗组相比，治疗组中至终点中值时间的肿瘤体积增加。使用两种不同的给药模式确定RX-5902的功效：持续4周，每周给药20-160mg/kg(图3)，或持续3周，每天50-70mg/kg(5天给药/2天停药)(图2)。以160mg/kg每周给予RX-5902产生75％TGD(P<0.001)(图3)。每日给予RX-5902产生剂量依赖性TGI(80和96％；第21天)和TGD(68和104％，P<0.001)(图2)并且两种剂量下均延长了动物的总体存活率(P<0.0001)(数据未示出)。在70mg/kg的每日剂量下，6/10动物表现出部分肿瘤消退并且1/10完全肿瘤消退。在给药方案中任一种中，RX-5902没有导致体重增加的减少、治疗相关的死亡或临床观察。舒尼替尼(本研究中的阳性对照；60mg/kg；每天持续21天)在两个体内研究中产生了TGD，验证了本文的Caki-1模型。这些数据支持RX-5902在肾细胞癌中的潜在治疗活性并且延长了生存期。该结果还表明，在人中，对于RX-5902，以较低的每日剂量更频繁地给药可能是肾癌的更有效给药方案。
表4中总结了异种移植研究的结果(描述于实施例4-9中)。
表4.小鼠中口服给予RX-5902的抗肿瘤活性
^表示TGD％；*表示TGI％。在某些情况下，报告了两个值。
实施例5：RX-5902在胰腺癌异种移植模型中的功效
遵循实施例3中描述的协议，检查了RX-5902在具有人胰腺肿瘤异种移植物(MiaPaca-2)的小鼠中对肿瘤生长的影响。相比于载体治疗组，测量治疗组中的肿瘤生长。结果显示每周5天给予50或70mg/kg RX-5902具有显著的功效(参见表4)，这表明对于RX-5902在人中每日给药可能是胰腺癌的有效治疗方案。
实施例6：RX-5902在结直肠癌异种移植模型中的功效
遵循实施例3中描述的协议，检查了RX-5902在具有人结直肠肿瘤异种移植物(Colo205)的小鼠中对肿瘤生长的影响。相比于载体治疗组，测量治疗组中的肿瘤生长。结果显示每周给予320和600mg/kg RX-5902具有显著的功效(参见表4)，这表明RX-5902可能是结直肠癌的有效疗法。
实施例7：RX-5902在乳腺癌异种移植模型中的功效和磷酸化的P68的作用
遵循实施例3中描述的协议，检查了RX-5902在具有人乳腺肿瘤异种移植物(MDA-MB-231)的小鼠中对肿瘤生长的影响。相比于载体治疗组，测量治疗组中的肿瘤生长。结果显示每周给予160、320和600mg/kg RX-5902的显著功效(参见表4；图12)，并且延长了治疗小鼠的生存期(图13)。这些结果表明，RX-5902可有效治疗乳腺癌并延长生存期。
通过敲掉p68还确定了Tyr593上磷酸化的p68是否在RX-5902抑制癌细胞生长的能力中起关键作用。p68-siRNA有效地下调了三阴性(TN)乳腺癌细胞系MDA-MB-231中Tyr593上磷酸化的p68以及p68的表达。将p68-siRNA-转染的细胞暴露于IC50浓度的RX-5902保护了MDA-MB-231细胞不受RX-5902细胞毒性作用，这表明Tyr593上磷酸化的p68是RX-5902细胞毒性作用的关键分子。
实施例8：RX-5902在耐顺铂卵巢癌异种移植模型中的功效
遵循实施例3中描述的协议，检查了RX-5902在具有人卵巢肿瘤异种移植物(A-2780)的小鼠中对肿瘤生长的影响。相比于载体治疗组，测量治疗组中的肿瘤生长。结果显示每周给予160、320和600mg/kg RX-5902的显著功效(参见表4)。在卵巢肿瘤异种移植物(SK-OV3)的另一模型中，每日给予40和70mg/kg RX-5902获得了类似结果(表4)。这些结果表明，RX-5902可能是人卵巢癌的有效疗法。
实施例9：RX-5902在非小细胞肺癌异种移植模型中的功效
遵循实施例3中描述的协议，检查了RX-5902在具有人非小细胞肺肿瘤异种移植物(A549)的小鼠中对肿瘤生长的影响。相比于载体治疗组，测量治疗组中的肿瘤生长。结果显示每周给予160、320和600mg/kg RX-5902的功效，这表明RX-5902可能是肺癌的有效疗法。
实施例10：RX-5902在同源MC38鼠结肠癌异种移植模型中的功效
遵循以下描述的方法，检查了RX-5902在使用具有MC38鼠结肠癌的雌性C57BL/6小鼠的同源模型中对肿瘤生长的影响。相比于对照(载体治疗)组，测量治疗组中的肿瘤生长(参见以下表5的给药方案和治疗方案)。这些结果表明，向程序性死亡受体1(PD-1)抑制剂RMP1-14中加入RX-5902对抑制肿瘤生长具有加和效应(单独的RX-5902为90％，单独的RMP1-14为93％，相比于两种药剂的组合为99％[与对照组相比，P<0.01])。两种药剂的组合还导致更高数目的小鼠(6只小鼠)具有部分消退和完全消退，其中4只动物显示出无肿瘤存活，与此相比，在单独的RMP1-14组中，4只动物具有部分消退和完全消退，其中2只显示出无肿瘤的存活。在组合组中，获得的所有结果均对小鼠没有任何副作用。这项研究表明，RX-5902和PD-1抑制剂的组合导致肿瘤生长显著减少，在小鼠中没有任何不利事件的情况下产生了部分和完全响应以及无肿瘤存活。
表5.药物和治疗时间表：
#-对照组
*-μg/动物
本研究由五组(n＝10/组)雌性C57BL/6小鼠组成，小鼠在研究给药开始时的当天(D1)携带有皮下MC38肿瘤(平均肿瘤体积范围：66-68mm3)。口服给予(p.o.)赋形剂。以84.34mg/kg(70mg/kg活性剂量)口服给予RX-5902。以100μg/动物腹腔内(i.p.)给予抗-PD-1(RMP1-14)。将第1组小鼠用作对照并且持续三个周期，五天给药两天停药((5/2)x 3)接受PBS(载体)。第2组接受RX-5902(5/2)x 3。第3组接受抗-PD-1，每周两次，持续两周(biwk x2)。第4组接受RX-5902(5/2)x 3和抗-PD-1biwk x 2。研究终点为1500mm3的肿瘤体积或45天，以先到者为准。每周两次进行肿瘤测量，直到第45天，单个动物在达到肿瘤体积终点时退出研究。
部分治疗结果基于百分比肿瘤生长抑制(％TGI)，定义为选定用于TGI分析的第28天，治疗小鼠中值肿瘤体积(MTV)和对照小鼠中值肿瘤体积(MTV)之间的百分比差异。对结果进行分析，并且在P≤0.05时被视为是统计学显著的。产生至少60％TGI的治疗被视为具有潜在的治疗活性。此外，由肿瘤生长延迟(TGD)确定功效，肿瘤生长延迟(TGD)是相比于对照组，治疗组中距终点中值时间(TTE)增加的量度。基于研究幸存者的数量、部分消退(PR)和完全消退(CR)响应、以及存活率差异的对数秩显著性，额外地评估响应。通过体重(BW)测量及经常观察的临床症状和治疗相关(TR)副作用，评估各种治疗的耐受性。
在第28天，对照组1中的中值肿瘤体积为1226mm3，个体肿瘤范围为14至1800mm3。对照组1中七个肿瘤达到了体积终点，中值TTE为29.7天，在45天研究中，建立的最大T-C为15.3天(52％TGD)。对照TTE范围为26.9至45.0天。对照组的易变性(variability)降低了达到统计学显著性的可能性。三个幸存者的MTV为14mm3并且存在两个PR。
给予RX-5902导致了显著的90％TGI(P<0.05,Mann-Whitney)。该疗法产生44.8天的中值TTE或非显著的51％TGD。五只动物在D45天保持14mm3的MTV并且存在三个PR。使用抗-PD-1的治疗导致显著的93％TGI(P<0.05,Mann-Whitney)。该疗法导致6名幸存者以及分配的45.0天的TTE和最大可能的52％TGD。结果并不显著。D45的MTV为14mm3并且具有一个PR和三个CR；具有后者的两只动物作为无肿瘤幸存者(TFS)而结束了研究。
使用RX-5902和抗-PD-1的联合疗法导致了99％TGI。这一结果与对照组相比是显著的(P<0.01,Mann-Whitney)，但与抗-PD-1单药疗法无显著差异。这种双重疗法被分配了45.0天的中值TTE或最大可能的52％TGD。所有十只动物均幸存下来，MTV为14mm3。存在一个PR和五个CR，其中的四个是TFS。当与对照(P<0.01，对数秩)以及单药疗法(对于两个比较，P<0.05，对数秩)，结果是显著的。
实施例11：RX-5902对Y593磷酸化的P68的β-连环蛋白依赖性ATP酶活性以及由β-连环蛋白调节的基因的表达的影响
材料和方法
细胞培养和抗体
从ATCC(Manassas，VA，USA)获得MDA-MB-231、SK-MEL-28和WI-38细胞并且根据供应商的说明进行培养。抗-p68抗体和抗Y593-p68抗体分别购自Cell Signaling(Danvers，MA)和Abcam(Cambridge，MA)。针对β-肌动蛋白、细胞周期蛋白D1、p-c-Jun和c-Myc的抗体购自Santa Cruz(Dallas，TX)。抗磷酸化酪氨酸抗体和HRP缀合的GAPDH抗体获自CellSignaling(Danvers，MA)。重组β-连环蛋白和p68蛋白分别购自Creative Biomart(Shirley，NY)和Origene(Rockville，MD)。
重组蛋白
使用重组β-连环蛋白而未经进一步处理，而重组的p68蛋白被用作p68或被c-Abl磷酸化以用于过滤结合测定。重组c-Abl获自Abcam(Cambridge，MA)。
药物治疗
将RX-5902溶于DMSO中以制备2mM的储备溶液。将储备溶液存储在-20℃下并且用培养基稀释以制备工作浓度。
RX-5902结合蛋白的鉴定
将MDA-MB-231细胞装在6孔板上并用不同浓度(0、0.1、1和10μM)的RX-5902处理一小时。在冰上用含有蛋白酶/磷酸酶抑制剂的p-MER缓冲液裂解细胞。在RT下使用嗜热菌蛋白酶(1:1,500比率)将细胞裂解物处理10min并且通过添加0.5M EDTA溶液终止反应。在通过考马斯染色可视化的10％SDS-PAGE上将反应混合物分离。由质谱测序分析鉴定了几种候选蛋白质之后，通过Western印迹分析确认了与RX-5902相互作用的蛋白质。
过滤结合分析
先前已在别处描述过过滤结合研究(Coombs et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75:5291-5295(1978))。简言之，将有/无酪氨酸磷酸化的重组p68RNA解旋酶添加到具有PBS的3H-标记的RX-5902(10Ci/mmol)中。3H-标记的RX-5902是由Quotient Bioresearch(Cardiff，UK)合成的。在室温下温育30分钟后，将结合混合物加载到硝酸纤维素膜上。用PBS将膜洗涤5次，然后真空干燥。通过3H闪烁计数确定结合到有/无p68磷酸化的p68的RX-5902的量。使用单独的3H-标记的RX-5902而不添加p68 RNA解旋酶以及单独的样品p68 RNA解旋酶而不添加3H-标记的RX-5902进行相同的程序，作为背景3H闪烁计数。计算p68与化合物的结合百分比并且相对于浓度作图。通过与RX-5902结合的p68的50％浓度估计并且通过线性回归分析计算解离常数(Kd)。
ATP酶测定
通过在ATP水解期间使用直接比色测定法测量释放的无机磷酸盐来确定ATP酶活性(Shin et al.,Cancer Res.,67:7572-7578(2007)；Yanget.al.,Cell,127:139-155(2006))。典型的ATP酶测定是在含有20mM Tris-HCl pH7.5、200mM NaCl、1mM MgCl2、5mMDTT、～1-2μg适当底物、4mM ATP和10μl解旋酶的50μl反应体积中进行的。将ATP酶反应在37℃下温育30分钟。温育后，将1ml孔雀石绿-钼试剂加入到反应混合物中，并且将反应在室温下再温育恰好5分钟。然后测量630nm处的吸收(A)。通过将A630nm的标准曲线中的A630nm与已知磷酸盐浓度进行匹配，以确定无机磷酸盐的浓度。用于该测定的蛋白质p68或磷酸化p68是以类似于先前报道的程序(Yang et al.,Protein Expr.Purif.,35:327-333(2004))内部制备的。通过将不具有RX-5902的磷酸化p68的ATP酶活性定义为零百分比抑制计算抑制百分比，并且使用Kaledia Graph软件程序(Synergy Software,Reading,PA)通过非线性回归分析计算RX-5902的IC50。
Western印迹
通过SDS-PAGE分离蛋白质混合物或细胞裂解物并转移至PVDF膜上。在室温下通过封闭缓冲液(1x含有5％BSA的TBST)将膜封闭1小时。简单洗涤后，在4℃下在封闭缓冲液中用初级抗体将膜温育过夜。在初级抗体中温育后，使用1x TBST将膜洗涤三次，随后在室温下在封闭缓冲液中用HRP缀合的二级抗体温育1小时。再次将膜洗涤三次并且通过ECL***(Thermo Scientific,Rockford,IL)可视化。
结果
使用良好建立的靶识别方法DARTS测定法(Lomenick et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,106:21984-21989(2009))寻找会与癌细胞中RX-5902相互作用的靶蛋白。DARTS方法表明，在与RX-5902相互作用时，具有约60kDa迁移率的条带被保护免受蛋白酶切割(图4)。为了识别这种受保护的蛋白，将与对照的条带一起切除，并且由ProtTech(Phoenixville，PA)使用LC-MS/MS进行分析。使用针对来自LC-MS/MS分析在SDS-PAGE中具有相似的迁移率的几种潜在候选物的抗体进行Western印迹分析，以确定由RX-5902治疗保护的蛋白。显然，这一受保护的条带被针对p68 RNA解旋酶的抗体所识别(图5)，这表明RX-5902可以与细胞中的p68 RNA解旋酶相互作用并且保护p68不被嗜热菌蛋白酶降解。为了验证RX-5902与p68的相互作用，使用了3H-标记的RX-5902。通过过滤结合测定(Coombs et al.,supra)探测3H-标记的RX-5902与重组p68蛋白和体外酪氨酸磷酸化的重组p68蛋白的相互作用。通过Western印迹分析，证实p68在酪氨酸残基上是磷酸化的(图6)。过滤结合测定清楚地显示与Y593磷酸化p68相互作用的RX-5902，估计的Kd约为19nM，但RX-5902在过滤结合研究中未与未磷酸化的p68相互作用(图7；正方形和三角形表示重复的实验)。
研究了RX-5902对p68 ATP酶活性的影响。为此，测量了在RX-5902和从酵母中提取的总RNA的存在下重组p68的ATP酶活性。RX-5902在0.2μM和甚至在高浓度例如20μM下不影响p68 RNA解旋酶的RNA-依赖性ATP酶活性，RNA-依赖性ATP酶活性受到低于30％的抑制(图8)，这表明RX-5902对P68的RNA-依赖性ATP酶活性的影响很小。这一数据可以证实RX-5902在过滤结合测定中不与未磷酸化的p68相互作用(图7)。
该结果表明，在0.2μM RX-5902存在下，磷酸化p68的β-连环蛋白依赖性ATP酶活性被大大减少(图9)。在较低浓度的RX-5902下重复实验以计算IC50。用于抑制β-连环蛋白依赖性ATP酶活性的RX-5902的IC50计算为61nM(图10)，这表明RX-5902潜在地破坏了磷酸化p68/β-连环蛋白的相互作用。
由于RX-5902直接结合Y593磷酸化p68，因此假设用RX-5902处理细胞会干扰磷酸化p68/β-连环蛋白的相互作用并因此影响受磷酸化p68/β-连环蛋白相互作用调节的多种生长相关基因(包括p-c-Jun、c-Myc和细胞周期蛋白D)的表达。因此，分析了使用RX-5902处理的细胞中细胞周期蛋白D1和c-Myc表达以及c-Jun的磷酸化。使用了癌细胞系SK-MEL-28和MDA-MB-231以及正常胎儿肺成纤维细胞WI-38。尽管20nM RX-5902不改变蛋白质水平，但是70nM RX-5902导致SK-MEL-28中细胞周期蛋白D1和c-Myc两者的表达降低以及c-Jun磷酸化的降低，而不改变总p68蛋白质水平。在MDA-MB-231中用20nM和70nM RX-5902均检测到类似的蛋白质水平变化。RX-5902在WI-38细胞中没有导致细胞周期蛋白D1或c-Myc表达或者c-Jun磷酸化的任何显著变化(图11)，特别是在70nM下。该结果表明，用RX-5902处理癌细胞导致已知受β-连环蛋白途径调节的某些基因(如c-Myc、细胞周期蛋白D1和p-c-Jun)表达的下调。因此，该研究表明，通过RX-5902与Y593磷酸化p68 RNA解旋酶的直接结合抑制Y593磷酸化p68解旋酶-β-连环蛋白的相互作用可能有助于该化合物的抗癌活性。
实施例12：RX-5902在人体中的功效、安全性和耐受性
评估了RX-5902在各种剂量和频率下的功效、安全性和耐受性。在研究的1期部分中，招收患有晚期实体瘤恶性肿瘤的受试者。在研究的1期部分期间，确定了最大耐受剂量(MTD)或推荐的2期剂量(RP2D)和时间表，并且在合格受试者中表征RX-5902的药代动力学。向患有晚期恶性肿瘤的患者给予含有RX-5902的胶囊，剂量为125-1050mg/天，每周1、3、5或7天，在每4周周期期间，持续3周，停药1周，或者在4周周期期间连续4周，无停药周。剂量递增从加速设计开始，每剂量治疗1个受试者(Simon et al.,J.Natl.Cancer Inst.,89(15):1138-47(1997))，随后是在发生单一相关2级或更大的不良事件后，使用改进的Fibonacci序列的标准3+3设计。
在2期部分，受试者参加2个诊断组中的1个：三阴性乳腺癌或铂耐性/难治性/复发性卵巢癌。研究的2期部分使用在1期中确定的剂量和时间表并且遵循2-阶段设计。当每个肿瘤适应症中被纳入10个响应可评估受试者并且有机会完成至少4个疗法的周期或由于进行性疾病已经停止疗法时，进行中期分析。在2期的第2阶段，如果在纳入疾病组的前10名响应可评估的患者内观察到至少2个响应，则进行疾病组的登记。每个疾病适应征大约有40个额外的受试者参加。在2期的第二阶段，在超出第一阶段继续进行的疾病组中进一步评价总体响应率和无进展生存率。表6总结了潜在的剂量和时间表，但是这一时间表可能会根据安全性和耐受性数据而改变。
表6.给药时间表
*表示4-周周期中的给药周数
实施例13：RX-5902的小规模生产(制备批次35444A)
实施例13A化合物A的生产
向100-L反应器中装入1,2-二氨基-4-氟苯(1.75kg，13.8mol，ChemiK)、草酸(1.25kg，13.9mol)、11.4kg水和3.8kg浓盐酸(3M HCl溶液，3.28当量HCl)。将黑色混合物加热回流(95-100℃)～25h。取出等分试样(1mL)同时搅拌并使用饱和NaHCO3溶液(30mL)中和到pH 8。HPLC分析显示起始材料被完全消耗。
将混合物移去加热，使其冷却到室温，然后加入冷水(14kg)。沉淀并通过真空过滤收集黑色固体。滤饼用冷水(12kg)洗涤，随后用异丙醇(IPA，9.4kg)洗涤。然后在真空烘箱(50℃)将湿结块(3.4kg)干燥过夜，得到2.38kg(96％摩尔收率)的6-氟-1,4-二氢喹喔啉-2,3-二酮(化合物A)，为蓝灰色固体，HPLC纯度为97.0％。
实施例13B化合物B的生产
向100-L反应器中加入化合物A(2.38kg，13.2mol)、二甲基甲酰胺(DMF，0.25kg)和CHCl3(37.0kg)。然后，加入亚硫酰氯(SOCl2，4.9kg，41.2mol)，保持温度<25℃。然后使混合物在55-60℃下回流。23h后，取出样品用于HPLC分析。HPLC分析显示起始原料完全消耗，但除了98％2,3-二氯-6-氟喹喔啉(化合物B)之外，似乎还有～2％中间体。加入附加量的SOCl2(494g)和DMF(25g)，并且再将混合物回流另外1h。HPLC没有变化，所以将反应混合物冷却到室温并且向反应混合物中缓慢地加入去离子(DI)水(8.8kg)，这导致热量和气体逸出。随后缓慢加入0.5M NaOH(8kg)。将整个淬灭物搅拌13h以促进分解过量的SOCl2。使用4×8kg水洗涤有机层，随后用8×16kg水洗涤。
使用40g活性炭处理有机相(在50L反应器中)并且搅拌35分钟。通过过滤除去活性炭并将该批料浓缩至干燥。所得固体在真空烘箱(46℃)中干燥得到2.62kg(94％摩尔收率)化合物B，HPCL纯度为98.0％。
实施例13C化合物1的生产
向100-L反应器中加入2,3-二氯-6-氟喹喔啉(化合物B，1.30kg，6.00mol)、乙腈(32.0kg)和氢氧化铵(11.9kg)。在50℃将混合物搅拌28h。观察到大约有4％的未反应的化合物B。加入另外1.2kg氢氧化铵并且再在50℃下将混合物搅拌另外20h。HPLC分析显示无残留的起始材料。将批料冷却到20℃并且使用布氏过滤器真空过滤出固体，使用ACN/水冲洗并且在真空烘箱中在50℃下干燥过夜，得到972g粗制3-氨基-2-氯-6-氟喹喔啉(化合物1)。第二次以相同的规模重复该反应，得到954g粗制化合物1。将合并的产物(1.92kg)在27kg水中浆化30min，然后过滤并且在真空中在50℃下干燥～40h，得到1.90kg脱盐的粗制化合物1。将一部分材料(0.63kg)通过溶解于75-80℃的乙腈(55kg)中并且冷却至环境温度以进行重结晶。通过过滤分离滤饼，并在5℃的真空烘箱中干燥～20h。获得0.286kg纯化的化合物1部分(HPLC：98.9％，1.0％区域异构体)。在反应器中留下较大比例的固体以用于下一次重结晶过程。从0.63kg粗料再次开始，并且这次利用76kg乙腈(考虑到来自第一部分的固体)，获得0.686kg回收物(HPLC：98.8％，0.9％区域异构体)。最后，从55kg乙腈如先前那样对最后的一部分(0.63kg)进行重结晶，得到0.505kg分离产物(HPLC：98.8％，0.9％区域异构体)。总产量为1.48kg(62％总收率)化合物1。
实施例13D化合物2的生产
向100-L圆底烧瓶中加入3-氨基-2-氯-6-氟喹喔啉(化合物1，1.48kg，7.49mol)和THF(26.7kg)。然后加入处于MeOH中的25wt％NaOCH3(12.1kg，56.0mol，7.5当量)，以保持20±10℃的温度。在室温下将混合物搅拌2h。HPLC显示起始材料被消耗掉。减压下将溶液浓缩至约21L，然后在二氯甲烷(DCM，34kg)和水(34kg)之间分配过夜。分离水层，然后用另一部分DCM(34kg)进一步稀释有机层。用水洗涤有机层直到水层的pH达到5(4×19kg洗涤)。浓缩有机层得到固体。将固体在DCM(2.1kg)中浆化，过滤并使用DCM(1×5kg)洗涤湿饼。湿饼在44℃下真空干燥过夜，得到1.06kg(73.3％收率)3-氨基-6-氟-2-甲氧基喹喔啉(化合物2)，HPLC：97.0％(0.7％区域异构体)。
实施例13E化合物3的生产
向100-L反应器中加入3-氨基-6-氟-2-甲氧基喹喔啉(化合物2，1.06kg，5.48mol)、DCM(21.4kg)和吡啶(0.63kg，7.97mol)。在室温下搅拌混合物，然后缓慢地加入氯甲酸乙酯(872g，8.0mol，1.46当量)同时将温度保持低于30℃。在室温下18.5h之后，发现反应不完全。加入更多的氯甲酸乙酯(174g，1.6mol)和吡啶(126g，1.6mol)。然后，在室温下搅拌另外28.5h后，借助HPLC分析反应完全。使用去离子水萃取有机相直到获得5.8的pH(4×16.1kg)。有机层用硫酸镁干燥(970g)，过滤并且浓缩至干。然后装入乙酸乙酯(3.2kg)并通过真空过滤收集得到的固体。用乙酸乙酯(1.3kg)洗涤湿饼，并且在43℃下真空干燥过夜，得到乙基-N-(6-氟-2-甲氧基喹喔啉-3-基)碳酸酯(化合物3)(HPLC纯度为100％，1.116kg，76.7％收率)。
实施例13F RX-5902的生产
向100-L反应器中加入1-(3,5-二甲氧基苯基)哌嗪HCl(DMPP，1.588，6.14mol)、乙基-N-(6-氟-2-甲氧基喹喔啉-3-基)碳酸酯(化合物3，1.12kg，4.22mol)和THF(30.6kg)。将混合物在环境温度下搅拌15分钟并且加入1,8-二氮杂双环十一碳-7-烯(DBU，2.444kg，14.7mol)。将混合物在回流(～66℃)下混合～4h，然后取样以确定反应完成(HPLC结果：残留1.1％化合物3)。认为反应完成。将混合物真空浓缩至～11L的体积。使用DCM(20.2kg)稀释溶液并且用～12kg 1M HCl洗涤。进一步使用4×10kg水部分洗涤有机层直到含水废物层的pH为5-6。有机层用无水硫酸镁(1.2kg)干燥并通过布氏漏斗过滤。滤饼用5kg DCM冲洗并且将滤液真空浓缩至6L的最终体积。然后加入庚烷(0.868kg)并且在10-15℃下将浆液混合～16h。将浆液过滤并用庚烷(2.62kg)洗涤。然后在真空烘箱中干燥湿饼(2.45kg)。在66℃下～48h后，IP(过程中)测试显示THF(4506ppm)和DCM(3250ppm)均超出限制。在66℃下另外96h后，仅THF(1141ppm)仍高于限制。在66℃下另外24小时后，残留的THF降低到770ppm。最后，在67℃下另外24小时后，THF水平降至合格水平(679ppm)。然后从烘箱中取出该物质，得到作为灰白色固体RX-5902(1.514kg，81.2％收率)。HPLC：RRT 0.57杂质为0.82％，高于规格限制NMT 0.50％。
通过质谱确定的RRT 0.57被认为对应于RX-5902的去甲基化形式。
实施例13G RX-5902的纯化
向100-L反应器中加入来自实施例13F的RX-5902(1.318kg，2.99mol)和DCM(17.5kg)。使用～7kg 0.5M NaOH(水溶液)洗涤溶液。进一步使用4×5.3kg水部分洗涤有机层直到含水废物层的pH为5-6。有机层用无水硫酸镁(0.6kg)干燥，然后通过布氏漏斗过滤。使用2kg DCM冲洗滤饼，并且将滤液真空浓缩至4L的最终体积。加入庚烷(2.70kg)并且在10-15℃下将浆液混合～15h。将浆液过滤并用庚烷(1.86kg)洗涤。然后将湿饼在真空烘箱中干燥。在55℃下～48小时后，IP(过程中)测试显示所有溶剂均达到合格水平。从烘箱中取出该物质，得到作为灰白色固体的RX-5902(1.14kg，86.5％回收率)。
实施例14：固定反应器/RX-5902的大规模生产(制备批次35921A)
下面详述了10.96kg cGMP批次RX-5902的生产，其是使用固定的35、100、124、200和300加仑玻璃、不锈钢和哈氏合金(Hastelloy)衬里反应器以及不锈钢或哈氏合金Aurara过滤器在以下改进的工艺条件下进行的。
实施例14A化合物A的生产
向35加仑反应器中装入1,2-二氨基-4-氟苯(7.50kg，59.46mol，ChemiK)、草酸(5.35kg，59.42mol)和3M HCl溶液(95.8kg水和37.8kg浓盐酸)。将黑色混合物加热回流(100±5℃)～21h。取出等分试样(1mL)，同时搅拌并使用饱和NaHCO3溶液(30mL)中和至pH8。HPLC分析显示起始材料被完全消耗掉。
将混合物移去加热，使其冷却至环境温度，然后加入冷水(55kg)。沉淀并通过真空过滤收集黑色固体。滤饼用冷水(50.0kg)洗涤，随后用异丙醇(IPA，39.14kg)洗涤。然后在真空烘箱(50±5℃)中将湿饼(11.43kg)干燥过夜，得到10.3kg(96％摩尔收率)的6-氟-1,4-二氢喹喔啉-2,3-二酮(化合物A)，为蓝灰色固体，HPLC纯度>99％。以相同的规模重复该过程，得到9.95kg(>99％)。
实施例14B化合物B的生产
向200加仑反应器中加入6-氟-1,4-二氢喹喔啉-2,3-二酮(化合物A，20.25kg，112.41mol)、DMF(2.20kg)和氯仿(310.3kg)。加入亚硫酰氯(40.95kg)同时将温度保持<25℃。在50-55℃下将混合物回流。21h后，采取样口用于HPLC分析。HPLC分析显示起始材料完全消耗，得到97.7％(按面积)的化合物B。将反应混合物冷却至环境温度(25±5℃)并且向反应混合物中缓慢地加入DI水(64.7kg)，这导致热量和气体逸出。随后，缓慢地加入0.5MNaOH(64.7kg)。将整个淬灭物搅拌13h以促进分解过量的SOCl2。使用8×32.8kg水洗涤有机层。
通过常压蒸馏浓缩有机相(在200加仑反应器中)，直到剩余约3加仑。随着蒸馏进行，向蒸馏锅中加入庚烷(69.5kg)。继续蒸馏直至锅温超过70℃(70.3℃)。将锅冷却到10-15℃并且搅拌12h。将浆液过滤并用庚烷(2×16.0kg)洗涤。在未加热下在真空烘箱中将所得的湿固体(20.65kg)在45±5℃下干燥25h，得到14.80kg(64.5％收率)2,3-二氯-6-氟喹喔啉(化合物B)，HPLC纯度为97.7％。
由于产率较低，将母液进行再加工。在真空下蒸馏母液，直到除去大约30加仑(～12加仑留在锅中)。将夹套设定为40℃。一旦完成蒸馏，将悬浮液冷却至10-15℃(实际13.2℃)并且搅拌超过3h。将浆液过滤并用庚烷(2×16.0kg)洗涤。在真空烘箱中在45±5℃下将得到的湿固体(10.50kg)干燥超过18h，得到3.62kg 2,3-二氯-6-氟喹喔啉(化合物B，第二批)，HPLC纯度为98.4％。总收率为75.5％(18.45kg)。
实施例14C化合物1的生产
向200加仑反应器中加入2,3-二氯-6-氟喹喔啉(化合物B，18.45kg，85.01mol)、乙腈(448.60kg)和氢氧化铵(169.80kg)。将混合物在50℃下搅拌约24h。HPLC分析显示没有剩余的起始材料。将批料冷却至45±5℃并搅拌约25h。真空过滤出固体，用水(2×14.0kg)和乙腈(2×36.1kg)洗涤。在真空烘箱中在50℃下将湿饼(16.70kg)干燥49h，得到3-氨基-2-氯-6-氟喹喔啉(化合物1，12.20kg，72.7％收率)。获得化合物1(HPLC：97.86％，1.83％区域异构体)。
实施例14D化合物2的生产
向200加仑玻璃衬里的反应器中加入3-氨基-2-氯-6-氟喹喔啉(化合物1，12.10kg，61.23mol)和THF(212.20kg)，随后加入处于MeOH中的25wt％NaOCH3(91.80kg)，以将温度保持在20±10℃。在环境温度下将混合物搅拌～4h。HPLC显示起始材料被消耗。加入水(43.50加仑)同时将内部温度保持<35℃。通过常压蒸馏浓缩溶液直到剩余～55加仑(除去～63加仑)。将溶液温度冷却到15-20℃并且搅拌～18h。将浆液过滤并用水(2×8.0加仑)洗涤。将得到的湿固体在真空烘箱中在50±5℃干燥约96h，得到7.40kg(62.6％收率)3-氨基-6-氟-2-甲氧基喹喔啉(化合物2)，HPLC纯度为99.1％；未检测到区域异构体。
实施例14E化合物3的生产
向100加仑反应器中加入3-氨基-6-氟-2-甲氧基喹喔啉(化合物2，7.40kg，38.30mol)、DCM(144.6kg)和吡啶(3.6kg)。在环境温度下搅拌该混合物，然后缓慢地加入氯甲酸乙酯(6.9kg，63.58mol)同时保持温度<30℃。在环境温度下21.5h之后，发现反应已经完成。用DI水洗涤有机相直至得到pH 5.8(3×16.4加仑)。在常压下蒸馏有机层直到残留～16加仑。在蒸馏过程中加入乙酸乙酯(47.4kg)。将悬浮液冷却至10-15℃并搅拌22h。通过真空过滤收集固体并用乙酸乙酯(2×8.3kg)洗涤，在真空中在40±5℃下干燥(7.8kg湿饼)过夜，得到乙基-N-(6-氟-2-甲氧基喹喔啉-3-基)碳酸酯化合物3(7.30kg，71.8％收率)。HPLC：100％；未检测到区域异构体。
由于回收率较低，因此将来自上述的母液在真空下浓缩至其原始体积的一半(17L)。过滤固体并用乙酸乙酯冲洗(2×1.5L)。在40±5℃下将湿饼(1.6kg)干燥36h，得到另外1.35kg化合物3(E-166)。总收率为85.1％(8.65kg)。
实施例14F RX-5902的生产
向200加仑反应器中加入1-(3,5-二甲氧基苯基)哌嗪HCl(DMPP)(12.50kg，48.31mol)、乙基-N-(6-氟-2-甲氧基喹喔啉-3-基)碳酸酯(化合物3，8.65kg，32.61mol)和THF(249.6kg)。将混合物在环境温度下搅拌15分钟并且加入DBU(17.60kg，115.6mol)。在回流(～66℃)下将混合物混合～4h并且冷却到20±10℃。由HPLC分析的样品显示反应完成(HPLC结果：剩余0.6％化合物3对NMR的IP测试极限为2.0％)。在真空下将混合物浓缩到～86L体积。使用DCM(159.70kg)稀释溶液并且使用1M HCl(处于24.1加仑水中的8.9kg浓HCl)洗涤。进一步使用水(4×30.0加仑)洗涤有机层直到含水废物层的pH为5-6。进一步使用0.5N氢氧化钠(2.9kg的50％氢氧化钠和18.6加仑水)洗涤有机层，并且使用水(3×25.0加仑)洗涤直到含水废物层的pH为5-6。有机层用硫酸镁(9.5kg)干燥并通过布氏漏斗过滤。使用DCM(19.5kg)冲洗滤饼，然后在真空下浓缩滤液。将滤液在真空下浓缩至47L的终体积。加入庚烷(7kg)并且在10-15℃下将浆液混合～16h。将浆液过滤并且用庚烷(21kg)洗涤。在真空烘箱中在60℃将湿饼(15kg)干燥～48h。IP测试显示THF(10,800ppm)和DCM(15,395ppm)超出了规格限制。在60℃下另外86h后，所有溶剂水平都通过了残留溶剂规格。从烘箱中取出该物质得到RX-5902，为灰白色固体(10.965kg，76.2％收率)。
实施例15：1.3kg批量的RX-5902纳米配制品工艺–再加工先前制备的RX-5902
实施例15A RX-5902的100mg/g纳米悬浮液
实施例15A1-子批次1
使用清洁剂溶液(Alconox)洗涤研磨介质(9kg)并用纯水(Ricca ChemicalCompany)冲洗。清洁剂溶液是通过将5mL清浩剂和500mL纯水混合而制备的。将介质平均分配到三个耐热性容器中。每个容器都封装在一个高压釜袋中，袋的可渗透侧覆盖在容器的开口上。使用经过验证的灭菌周期(250°F下45分钟，其中35分钟干燥时间，参见PSSOP50042“Operation,Maintenance and Clearing of the Tuttnauer 2540EA ElectronicTable-Top Autoclave”)对Tuttnauer 2540EA电子台式高压釜进行灭菌，并且将介质的容器置于烘箱中在110℃下干燥过夜。
用清洁剂溶液清洁以下用品和实验器皿，并将其转移到洁净室中：研磨容器(x3)、搅拌板、漏斗、一次性刮刀、称量容器、磁力搅拌器、磁力搅拌器回收器和移液管。在制造套件中设置了温湿度记录仪，并且记录湿度和温度。在隔离器中设置了天平，并进行了日常验证。
称出泊洛沙姆407，NF(Spectrum)并且装入到每个容器中。向容器A中装入10.68g，向容器B中装入10.64g并且向容器C中装入10.70g。向三个容器的每一个中装入注射用水，USP(WFI)。向容器A中装入299.57g，向容器B中装入300.62g且向容器C中装入301.19g。将搅拌棒放入三个容器中的每一个中并且使用搅拌板混合直到泊洛沙姆407，NF明显溶解在WFI中。
通过漏斗向三个容器中的每一个加入RX-5902(Pfanstiehl)。向容器A中装入133.16g，向容器B中装入133.19g并且向容器C中装入133.41g。使用搅拌板混合容器中的内容物，直到RX-5902明显分散。采用磁力回收器从三个容器的每一个中移去搅拌棒。将一个容器的内容物通过漏斗装入到研磨容器中。对研磨容器的螺纹进行检查，确保螺纹不含研磨介质。将研磨容器的盖子拧紧并密封以防止泄漏。
对研磨容器的外部进行去污，并从隔离器中取出。将一片反光材料附接到研磨容器并且将研磨容器附接到辊磨机上。启动磨机并且调整旋转速度直到容器内部的级联介质达到与水平方向成45度至60度的崩落角(angle-of-break)(目视确定)。使用转速计来测量研磨容器的转速。将三个容器中的每一个都转移到研磨容器中并且使用与上述相同的一般程序制备。
将三个研磨容器中的每一个在90RPM(每分钟转数)下辊磨18.75小时。辊磨完成后，对容器的外部去污并转移到层流罩中。伴随研磨容器将温湿度记录仪一起转移到同一制造套件中。使用无菌移液管从每个研磨容器中取出1mL样品，并将样品转移到小瓶中。
通过激光衍射分析三个样品的粒度分布。样品的接受标准是D90<1μm(平行测定并平均)和单峰分布特征(即分布只允许含有一个主峰和轻微的次峰)。每个容器的结果如下：
三个容器中的每一个均满足接受的标准。将来自子批次1的三个容器封闭并且存储在2-8℃下直到可以进行萃取。
实施例15A2-子批次2
以相同的方式制备第二个子批次。如下装填容器：
在90RPM(每分钟转数)下将三个研磨容器的每一个辊磨19.25小时。辊磨完成后，对容器的外部进行去污并转移到层流罩中。伴随研磨容器将温湿度记录仪一起转移到同一制造套件中。使用无菌移液管从每个研磨容器中取出1mL样品，并将样品转移到小瓶中。
通过激光衍射分析三个样品的粒度分布。样品的接受标准是D90<1μm(平行测定并平均)和单峰分布特征(即分布只允许含有一个主峰和轻微的次峰)。每个容器的结果如下：
三个容器的每一个均满足接受的标准。将来自子批次2的三个容器封闭并且存储在2-8℃下直到可以进行萃取。
实施例15A3-子批次3
以相同的方式制备第三个子批次。如下装填容器：
在90RPM(每分钟转数)下将三个研磨容器的每一个辊磨19.25小时。停止辊磨，对容器的外部进行去污并转移到层流罩中。伴随研磨容器将温湿度记录仪一起转移到同一制造套件中。使用无菌移液管从每个研磨容器中取出1mL样品，并将样品转移到小瓶中。
通过激光衍射分析三个样品的粒度分布。样品的接受标准是D90<1μm(平行测定并平均)和单峰分布特征(即分布只允许含有一个主峰和轻微的次峰)。每个容器的结果如下：
三个容器均未达到接受的标准。
再次将容器G、H和I密封并且返回到辊磨机中。继续研磨22.5小时。伴随容器一起将温湿度记录仪转移到同一制造套件中。使用无菌移液管从每个研磨容器中取出1mL样品，并将样品转移到小瓶中。
通过激光衍射分析三个样品的粒度分布。样品的接受标准是D90<1μm(平行测定并平均)和单峰分布特征(即分布只允许含有一个主峰和轻微的次峰)。经另外研磨时间后每个容器的结果如下：
三个容器的每一个均满足接受的标准。将来自子批次3的三个容器封闭并且存储在2-8℃下直到可以进行萃取。
实施例15B子批次的萃取
准备下列用于萃取的用品和实验器具：萃取容器(x9)、漏斗、管子、软管夹、在线空气过滤器、移液管和过滤漏斗。用70％异丙醇擦拭天平。将这些用品转移到洁净室中。
通过将空气过滤器连接到软管，并将软管连接到氮气罐，以在洁净室套件中安装氮气罐。在制造套件中设置温湿度记录仪，并且记录温度和湿度。
使用如下的萃取工艺制备九个子批次(A-I)。称量空的收集容器并置于过滤漏斗下。将研磨容器A的内容物倒入过滤漏斗中，并使用压缩氮气萃取悬浮液。向研磨容器中装入WFI。将内容物倒入过滤漏斗中并使用压缩氮气进行萃取。向研磨容器中装入WFI。将内容物倒入过滤漏斗中并使用压缩氮气进行萃取。称量收集容器，得到净悬浮液重量。
手动旋转收集容器以混合内容物。使用无菌移液管，移取分析测试用样品以及QA样品。记录收集容器的最终重量。
将所有的子批次存储在2-8℃，直到完成过程中测定。
九个子批次的收率及可用于释放的量如下：
子批次 工艺收率 用于释放的量
A 93％ 1234.94g
B 94％ 1247.05g
C 95％ 1265.06g
D 94％ 1251.18g
E 93％ 1240.57g
F 93％ 1239.88g
G 95％ 1256.83g
H 96％ 1279.70g
I 93％ 1241.99g
来自九个子批次的总加工重量合计为11287.95g(94％收率)，用于释放的总量为11257.21g。
实施例15C冷冻干燥得到83％RX-5902纳米配制品粉末
基于每个子批次的测定分析，计算九个子批次中每一个中的RX-5902的量。每个子批次中的测定量、最终悬浮液重量和RX-5902量如下：
九个子批次中的RX-5902的总量为1168.14g。
准备了用于冻干工艺的下列用品、原材料、设备和实验器皿并转移到洁净室中：天平、计时器、温湿度记录仪、大容量悬浮容器、磁力搅拌器、搅拌板、磁力搅拌器回收器、称量容器、刮刀和大容量冻干托盘。将温湿度记录仪设置在制造套件中并记录温度和湿度条件。
在层流罩中，将所有子批次合并到大容量容器中。加入搅拌棒并混合内容物。向大容量悬浮容器中加入泊洛沙姆407，NF(146.27g，Spectrum)。混合大容量悬浮容器中的内容物，直到通过视觉检查泊洛沙姆407，NF完全溶解。停止混合并移除搅拌棒。
向八个大容量冻干托盘的每一个中加入大容量悬浮容器的内容物的～1/8。关闭八个托盘每一个上的盖子。将八个托盘转移到冻干机中，关闭冻干机门并密封。停止温湿度记录仪。
将冻干机的搁架温度调整到-40℃并且打开“冻结搁架”功能。使托盘完全冷冻超过66.75小时。打开冷凝器，使达到-53℃。然后将搁架温度设定为-25℃，并将真空设置设定为250毫托，用于初级干燥。～18天后，最后的皮拉尼测量仪(284毫托)和电容式压力计(250毫托)读数之间的差<先前的皮拉尼测量仪(285毫托)和电容式压力计(250毫托)读数之间的差的1％。认为完成了初级干燥。
超过～30分钟间隔，以+5℃升高搁架温度设置直到搁架设置为20℃。在～4天后，最后的皮拉尼测量仪(486毫托)和电容式压力计(500毫托)读数之间的差<先前的皮拉尼测量仪(486毫托)和电容式压力计(500毫托)读数之间的差的1％。认为完成了次级干燥。关闭搁架控制器和冷凝器。关闭并释放真空。
通过使用清洁剂溶液洗涤并使用纯水(Ricca Chemical Company)冲洗准备了研钵和研杵。清洁剂溶液是通过混合5mL清洁剂和500mL纯水来制备的。将研钵和研杵放入高压釜袋中，袋的可渗透侧朝向上。使用经过验证的灭菌周期(250°F下45分钟，其中35分钟干燥时间，参见PSSOP 50042“Operation,Maintenance and Clearing of the Tuttnauer2540EA Electronic Table-Top Autoclave”)对Tuttnauer 2540EA电子台式高压釜进行灭菌，并且将含有研钵和研杵的袋置于烘箱中在250℃下干燥～1h。将温湿度记录仪设置在制造套件中并记录温度和湿度条件。
从冻干机中取出干燥的托盘，并且转移到制造套件中。将保持容器称重(3911.45g)、消毒并转移到手套箱隔离器中。将干燥的冻干托盘擦干并转移到手套箱隔离器中。采用研钵和研杵将冻干粉破碎成自由流动的粉末。将粉末转移到保持容器中。
对保持容器称重(5508.47g)并且取样。从保持容器顶部取出均匀性测试用顶部样品(1.15g)。从保持容器中间取出测试用样品(4.48g)、QA保留(8.33g)和微测试用样品(11.00g)。从保持容器的底部取出底部均匀性测试用样品(1.21g)。对保持容器再次称重(5280.12g)并且关闭温湿度记录仪。
加工批量大小计算为1397.02g(97％加工收率)，用于释放的批量大小为1368.67g。该批次的分析测试显示，其符合分析规范的所有证书。
实施例16:高能研磨和干燥
实施例16A高能研磨材料的生产
使用150-mL再循环腔室和150-微米出口筛装配Netzsch DeltaVita搅拌磨机。向腔室中加入约125mL(0.5kg)0.5-mm YTZ陶瓷研磨介质并使用循环冷却器将腔室冷却到10℃。通过将起始悬浮液以约100mL/分钟(48rpm，用MasterFlex 15号管材)泵入磨机中，并且通过每次运行搅拌器几秒钟以周期性“慢跑”磨机，以便更好地分散进入的悬浮液，使腔室准备用于研磨。一旦准备好，磨机就以500rpm的搅拌速度或1.8m/s的叶尖速度运转。这证明是不够的，因为悬浮液入口处的背压增加到了磨机自动关闭的点。这通常是由API颗粒堵塞造成的，API颗粒要么太大而不能通过筛，要么倾向于在筛槽中聚集。为了防止压力积聚，逐渐地提高搅拌器速度直到***在没有压力增加的情况下运行，该速度为2,000rpm(7m/s)。
18分钟后，悬浮液的D90减少到约1微米，其是先前用作过程中悬浮液的最大粒度的非正式限制。研磨90分钟后，悬浮液固化，当将颗粒减小到胶体典型的尺寸范围时，这种情况并不少见。向研磨储罐中加入约150mL额外的纯水，这使API浓度达到20％，并这使悬浮液液化的足以继续研磨。悬浮液总共研磨240分钟，此时粒度分布显示出均匀的单峰亚微米颗粒群，如图14所示。纳米悬浮液的D10为0.07284μm，中值尺寸为0.10526μm，以及D90为0.15167μm。得到的纳米悬浮液是流体且均匀，并且没有显示出已在辊磨悬浮液中观察到的变色或物理变化的迹象。
为了确定RX-5902的晶体结构是否在研磨过程中发生了变化，通过DSC和X射线粉末衍射(XRPD)测试了纳米颗粒。通过离心过滤(Vivaspin)从悬浮液中取出纳米颗粒。用纯水洗涤颗粒三次以尽量除去相关的泊洛沙姆。洗涤后，将颗粒在二氧化硅上干燥。如图15所示的DSC分析显示熔融发生(161℃)略有降低以及低温(50℃)热事件，两者都表明在分离的纳米颗粒中存在泊洛沙姆(熔点＝56℃)。然而，没有观察到指示API的不同晶型的其它热事件。XRPFD分析证实，研磨和未研磨的API的晶体结构是可比的。
实施例16B高能研磨冻干材料的生产
使用实施例15C的冷冻干燥方法冻干实施例16A的高能研磨材料来制备高能研磨冻干材料。
实施例16C高能研磨喷雾干燥的材料的生产
使用表7中列出的参数，用BüchiB-290喷雾干燥器将RX-5902纳米悬浮液喷雾干燥。当从磨机萃取而未添加任何赋形剂或纯水时使用该悬浮液。
表7.喷雾干燥参数
参数 值
喷嘴直径 1.40mm
入口温度 100C
抽吸器 80％
泵速 20％
Q-流 50
在喷雾干燥器的干燥室中观察到最小的材料损失。收集的产品是分散到纯水中的自由流动的粉末。通过激光衍射的粒度测量给出了如图16所示的简洁可重复的分布且测量结果如表8所示。
表8.RX-5902纳米颗粒的大小
批次 平均大小 D10 中值大小 D90
1 3.60752μm 1.99298 3.42597 5.48444
2 3.41835 1.93907 3.26357 5.08637
3 3.51103 1.95287 3.34039 5.30013
如图17和图18所示，显微镜检查显示了包含在无定形球形微粒中的结晶纳米颗粒的存在。没有观察到游离晶体或晶体再生的证据，这表明API的溶解或沉淀不受高温干燥的影响。
实施例17：在静脉和口服给药后，RX-5902的口服生物利用度的确定
在本研究中，在给予各种配制品后，在雄性斯普拉格-杜勒大鼠中评估了RX-5902的口服生物利用度。RX-5902通过静脉内(IV)和口服(PO)给药途径给药。从ParticlesSciences(Bethlehem,PA)接收了四种粉末制剂并且用来制备给药溶液：(制剂A)：未研磨的API(根据实施例13制备)；(制剂B)83％GMP冻干的(根据实施例15制备)；(制剂C)83％高能研磨冻干的(根据实施例16B制备)；和(制剂D)93％喷雾干燥的(根据实施例16C制备的)。
每只动物的剂量水平基于体重和给予的测试物品的量单独确定。对于每一剂量，称量适量的制剂粉末，然后加入1mL适当的溶剂，并立即给予总体积，但未研磨的API不同，其中添加额外的1mL溶剂并且给药以回收残留在小瓶中的所有API。给药后，在给药后24小时收集血液样品，并且通过LC-MS/MS确定测试物品的血浆浓度。使用Phonenix WinNonlin(v6.4)确定药代动力学参数。
以40.7mg/kg平均剂量IV给药后，RX-5902(83％GMP冻干滤饼；组2)的平均半衰期为10.5±2.46小时。其平均清除率为0.400±0.0263L/hr/kg。平均分布体积为5.60±1.30L/Kg。
以68mg/kg平均剂量PO给予未研磨的RX-5902(未研磨的API，处于0.36％处于超纯水中的泊洛沙姆407中；组1)后，在给药后的2至4小时间观察到了最大血浆浓度(平均743±199ng/mL)。平均半衰期无法确定；但是，对于大鼠#576，半衰期是3.29小时。基于剂量归一化的AUCLast的平均暴露为151±25.2hr*kg*ng/mL/mg。未研磨的RX-5902(本文中也被称为“未研磨的API”)在68mg/kg平均剂量下的平均口服生物利用度为7.62±1.27％。
以65.9mg/kg平均剂量PO给予冻干的RX-5902(83％GMP冻干滤饼：组3)后，在给药后2小时观察到最大血浆浓度(平均2027±359ng/mL)。平均半衰期是9.70小时。基于剂量归一化的AUCLast的平均暴露为360±129hr*kg*ng/mL/mg。RX-5902(83％GMP冻干的滤饼)在65.9mg/kg平均剂量下的平均口服生物利用度为18.2±6.53％。
以65.9mg/kg平均剂量PO给予高能研磨冻干的RX-5902(83％高能研磨冻干的滤饼；组4)后，在给药后2小时观察到最大血浆浓度(平均2613±692ng/mL)。平均半衰期是7.99小时。基于剂量归一化的AUCLast的平均暴露为456±45.9hr*kg*ng/mL/mg。RX-5902(83％高能研磨冻干的滤饼)在65.9mg/kg平均剂量下的平均口服生物利用度为23.0±2.32％。
以66.2mg/kg PO给予泊洛沙姆喷雾干燥的RX-5902[93％喷雾干燥的滤饼(SDM)+0.23％泊洛沙姆407；组5]后，在给药后2至4小时观察到最大血浆浓度(平均1270±185ng/mL)。平均半衰期无法确定；然而，对于大鼠#588，半衰期是3.11小时。基于剂量归一化的AUClast的平均暴露为200±33.8hr*kg*ng/mL/mg。RX-5902(93％喷雾干燥的滤饼(SDM)+0.23％泊洛沙姆407)在66.2mg/kg平均剂量下的平均口服生物利用度为10.1±1.71％。
以65.6mg/kg PO给予无泊洛沙姆喷雾干燥的RX-5902[93％喷雾干燥的滤饼(SDM)；组6]后，在给药后2至4小时观察到最大血浆浓度(平均1527±627ng/mL)。平均半衰期无法确定；然而，对于大鼠#589，半衰期是6.89小时。基于剂量归一化的AUClast的平均暴露为293±107hr*kg*ng/mL/mg。RX-5902(93％喷雾干燥的滤饼(SDM))在65.6mg/kg平均剂量下的平均口服生物利用度为14.8±5.40％。
组4中口服给予高能研磨冻干的RX-5902(83％高能研磨冻干的滤饼)具有最高的口服生物利用度，平均为23％。口服生物利用度的整体排名顺序为组4(83％高能研磨冻干的滤饼)>组3(83％GMP冻干的滤饼)>组6[93％喷雾干燥的滤饼(SDM)]>组5[93％喷雾干燥的滤饼(SDM)+0.23％泊洛沙姆407]>组1(未研磨的API，处于0.36％处于超纯水中的泊洛沙姆407中)。表9中示出了RX-5902的不同纳米配制材料的口服生物利用度。
表9.RX-5902的不同纳米配制材料的口服生物利用度
作为参考，RX-5902(纳米研磨的悬浮液)在禁食的雄性和雌性狗中的平均口服生物利用度分别为29.4％和21.4％。
实施例18：RX-5902API和区域异构体杂质
概要：将RX-5902的分析数据与RRT 0.975杂质的分析数据进行了比较。分析数据由1H、19F、13C NMR、紫外-可见吸光度和质谱(通过LC-MS)组成。所有可用的分析数据强烈表明，RRT 0.975杂质是RX-5902的区域异构体。
背景：在RX-5902的一些早期批次中，发现使用HPLC方法分析的一个未知的杂质没有与主产物峰完全分开。开发了一种新的HPLC方法，其能够将未知杂质(“RRT 0.975杂质”)与主RX-5902产物峰分开。
为了确定RRT 0.975杂质的身份，使用超临界流体色谱(SFC)分离15克生产批次的RX-5902。获得了RX-5902部分和RRT 0.975杂质部分。使用用Synergi HydroRP柱的新HPLC方法，分析了RX-5902部分并且发现是97.7面积％的RX-5902与1.5面积％的主杂质。还分析了RRT 0.975杂质部分并且发现是79.0面积％的RRT 0.975杂质与0.7面积％的RX-5902；还存在4个杂质，各自>1面积％。
1H、19F、13C NMR数据
在RX-5902部分和RRT 0.975杂质部分上获得了1H和19F光谱。仅在RRT 0.975杂质部分上获得13C NMR光谱，并且将其与先前RX-5902参考标准批次的13C NMR光谱进行比较。
基于可能产生区域异构中间体的较早的合成步骤，推测RRT 0.975杂质也是RX-5902的区域异构体，由此氟原子在相邻的芳族碳上。RX-5902具有分子式C22H24FN5O4。
RRT 0.975杂质的建议结构
图19示出了RX-5902的1H NMR光谱；图20示出了RRT 0.975杂质的1H NMR光谱；图21示出了RRT 0.975杂质(上)和RX-5902(下)的1H NMR光谱的重叠；并且图22示出了RRT0.975杂质(上部曲线)和RX-5902(底部曲线)的1H NMR光谱的7.0-8.0ppm区域的重叠。
可以看到，两个1H NMR光谱非常相似(特别是***模式)，观察到7.0-8.0ppm区域中信号的轻微化学位移，并且这一观察强烈地表明，RRT 0.975杂质是RX-5902的区域异构体。
图23示出了RX-5902的13C NMR光谱；图24示出了RRT 0.975杂质的13C NMR光谱；图25示出了RX-5902(上部曲线)和RRT 0.975杂质(底部曲线)的13C NMR光谱的重叠；并且图26示出了RX-5902(上部曲线)和RRT 0.975杂质(底部曲线)的13C NMR光谱的108-150ppm区域的重叠。
可以看到，两个13C NMR光谱非常相似，这强烈地支持了RRT 0.975杂质是RX-5902的区域异构体的可能性。
图27示出了RX-5902的19F NMR光谱；图28示出了RRT 0.975杂质的19F NMR光谱。
如图27和图28所示，两个19F NMR光谱完全不同。RX-5902的19F化学位移是-114.5ppm，而RRT 0.975杂质则为-112.0ppm(表现为四重峰)。这表明氟原子处于略微不同的环境中，并且再次强烈地支持了RRT 0.975杂质是RX-5902的区域异构体的可能性。
紫外-可见吸光度数据
在使用相同HPLC方法分离的生产批次RX-5902上采集了紫外-可见吸光度数据。如图29所示，该图表明，RX-5902(实线)和RRT 0.975杂质(虚线)两者具有非常相似的吸收光谱。这再次强烈地支持了RRT 0.975杂质是RX-5902的区域异构体的可能性。
LC-MS数据
图30示出了对应于主RX-5902产物的17.9min峰的LC-MS(左边的图重叠来自右侧的三张图)；图31示出了对应于RRT 0.975杂质的17.2min峰的LC-MS(左边的图重叠来自右侧的三张图)；和图32示出了LC-MS数据，表明RX-5902和RRT 0.975杂质两者具有完全相同的[M+Na]+质量464，再次支持了RRT 0.975杂质是RX-5902的区域异构体的结论。
结论：分析数据(由1H、19F、13C NMR、紫外-可见吸光度和质谱组成)的比较强烈地表明RRT 0.975杂质是RX-5902的区域异构体。
实施例19：RX-5902的X射线晶体结构
分析方法
使用生长的晶体，在三斜空间群P-1中在100K下测定了RX-5902的单晶X射线结构。在不对称单元中只有一个完全有序的API分子。最后的R1[I>2σ(I)]＝4.77％。从晶体结构计算XRPD图，其表明单晶结构代表了所提供材料。
对于XRPD分析，使用了PANalytical(X’Pert3Powder)X-射线粉末衍射仪和Si零背景保持器。使用的参数列于表10中。
表10.XRPD测试的参数
实施例19A RX-5902纳米配制品的XRPD
测定了来自根据实施例16B的方法制备的RX-5902纳米制剂的颗粒的XRPD。如图33所示，RX-5902是结晶的。表11中给出了详细的XRPD峰鉴定。
表11.RXN1490A-001-4(B004194-12-A)的XRPD峰选择
实施例19B RX-5902 API的XRPD
图34示出了根据实施例14的方法制备的RX-5902API的XRPD图谱。
实施例19B1-溶解度评估、缓慢冷却和缓慢蒸发
将RX-5902(约2mg)称量到1.5ml透明玻璃小瓶中。在RT下加入等份的相应溶剂或溶剂混合物，并且在10分钟后评估溶解度，如表12所示。然后，将溶液和悬浮液置于50℃的振荡室中另外10分钟。如果没有观察到溶解，则加入另一等份溶剂，并将样品置于50℃的振荡室中另外10分钟。重复该程序直至达到溶解或加入了400的最大体积。
表12.RX-5902的溶解度评估
说明：n/a，不适用
根据从溶解度评估获得的结果，样品如下处理：(1)在RT下获得的溶液通过在瓶盖上刺穿针头以允许其在RT下缓慢蒸发；(2)在50℃下得到的溶液以0.25℃/min冷却至5℃。使冷却后获得的溶液在RT下缓慢蒸发。通过PLM显微镜评估所获得的具有潜在适用于SCXRD的晶体的任何悬浮液，并且将最有前景的晶体用于SCXRD分析。
实施例19B2-单晶结构确定
通过缓慢蒸发从乙醇中结晶出RX-5209的晶体(在400体积(0.8ml)溶液中约2mg)。所获得的晶体具有针状形态。分离出足够用于单晶X射线衍射分析的大小和质量的晶体，近似尺寸为0.650x 0.080x 0.070mm。图35A和35B中示出了所收到的晶体和用于数据采集的单晶的光学显微照片。表13-21中示出了测量的参数和结果。
晶体学表格
表13.样品和晶体数据
表14.数据采集和结构细化
细化总结：
表15.原子坐标和等效的各向同性原子位移参数，
U(eq)定义为正交化Uij张量的踪迹的三分之一。
表16.选定的键长，
F1-C1 1.364(2) O1-C9 1.227(2)
O2-C5 1.341(2) O2-C20 1.442(2)
O3-C16 1.382(2) O3-C21 1.427(2)
O4-C18 1.370(2) O4-C22 1.434(2)
C1-C8 1.361(3) C1-C2 1.400(3)
N1-C6 1.302(2) N1-C7 1.378(2)
N2-C4 1.386(2) N3-C6 1.378(2)
N3-C9 1.423(2) N3-C9 1.423(2)
N3-H3A 0.89(3) N4-C9 1.340(2)
N4-C10 1.465(2) N4-C13 1.466(2)
N5-C14 1.408(2) N5-C11 1.468(2)
N5-C12 1.471(2) C2-C3 1.379(3)
C3-C4 1.401(3) C4-C7 1.412(2)
C5-C6 1.458(2) C7-C8 1.415(2)
C10-C11 1.515(2) C12-C13 1.522(2)
C14-C19 1.395(2) C14-C15 1.408(2)
C15-C16 1.387(2) C16-C17 1.392(3)
C17-C18 1.394(2) C18-C19 1.389(2)
表17.选定的键角度，(°)
表18.选定的扭转角度，(°)
表19.各向异性原子位移参数，
U11 U22 U33 U23 U13 U12
F1 0.0346(6) 0.0267(6) 0.0213(6) -0.0068(5) 0.0082(5) -0.0096(5)
O1 0.0171(6) 0.0164(6) 0.0245(7) -0.0004(5) 0.0012(5) -0.0043(5)
O2 0.0168(6) 0.0221(7) 0.0226(7) -0.0070(5) 0.0007(5) -0.0078(5)
O3 0.0222(6) 0.0215(7) 0.0257(7) -0.0071(5) -0.0044(5) -0.0081(5)
O4 0.0278(7) 0.0216(7) 0.0261(7) 0.0020(5) -0.0061(6) -0.0076(5)
C1 0.0249(9) 0.0164(9) 0.0239(9) -0.0074(7) 0.0054(7) -0.0037(7)
N1 0.0157(6) 0.0163(7) 0.0204(7) -0.0062(6) 0.0000(6) -0.0028(5)
N2 0.0199(7) 0.0162(7) 0.0225(8) -0.0066(6) -0.0026(6) -0.0020(6)
N3 0.0148(6) 0.0173(7) 0.0201(7) -0.0044(6) -0.0006(6) -0.0060(5)
N4 0.0131(6) 0.0156(7) 0.0204(7) -0.0050(5) -0.0016(5) -0.0017(5)
N5 0.0130(6) 0.0147(7) 0.0215(7) -0.0054(6) -0.0022(5) -0.0027(5)
C2 0.0285(9) 0.0196(9) 0.0184(8) -0.0069(7) -0.0030(7) 0.0009(7)
C3 0.0249(9) 0.0209(9) 0.0223(9) -0.0087(7) -0.0041(7) 0.0007(7)
C4 0.0192(8) 0.0147(8) 0.0235(9) -0.0078(7) -0.0001(7) -0.0015(6)
C5 0.0163(8) 0.0120(8) 0.0244(9) -0.0072(6) -0.0024(7) -0.0023(6)
C6 0.0158(7) 0.0125(8) 0.0203(8) -0.0055(6) -0.0007(6) -0.0022(6)
C7 0.0188(8) 0.0140(8) 0.0203(8) -0.0060(6) 0.0000(7) -0.0015(6)
C8 0.0201(8) 0.0195(9) 0.0242(9) -0.0091(7) 0.0022(7) -0.0042(7)
C9 0.0126(7) 0.0188(8) 0.0169(8) -0.0054(6) 0.0023(6) -0.0033(6)
C10 0.0138(7) 0.0157(8) 0.0216(8) -0.0059(7) -0.0007(6) -0.0027(6)
C11 0.0144(7) 0.0156(8) 0.0207(8) -0.0053(6) -0.0027(6) -0.0008(6)
C12 0.0159(7) 0.0147(8) 0.0226(9) -0.0049(6) -0.0012(7) -0.0023(6)
C13 0.0140(7) 0.0183(8) 0.0196(8) -0.0056(6) -0.0024(6) -0.0016(6)
C14 0.0131(7) 0.0166(8) 0.0211(8) -0.0087(7) 0.0012(6) -0.0017(6)
C15 0.0158(7) 0.0165(8) 0.0194(8) -0.0063(6) 0.0013(6) -0.0024(6)
C16 0.0146(7) 0.0191(8) 0.0226(9) -0.0111(7) -0.0013(6) -0.0015(6)
C17 0.0170(7) 0.0170(8) 0.0225(9) -0.0065(7) 0.0030(7) -0.0053(6)
C18 0.0188(8) 0.0182(9) 0.0210(9) -0.0058(7) -0.0014(7) -0.0007(6)
C19 0.0151(7) 0.0193(9) 0.0233(9) -0.0082(7) -0.0012(7) -0.0020(6)
C20 0.0128(8) 0.0237(9) 0.0328(10) -0.0120(8) -0.0004(7) -0.0064(6)
C21 0.0323(10) 0.0259(10) 0.0338(11) -0.0078(8) -0.0072(8) -0.0145(8)
C22 0.0292(9) 0.0207(9) 0.0250(9) -0.0024(7) 0.0002(8) -0.0064(7)
各向异性原子位移因子指数采取的形式为：-2π2[h2a*2U11+...+2hka*b*U12]
表20.氢原子坐标和各向同性原子位移参数,
x/a y/b z/c U
H3A -0.088(4) 0.089(3) 0.406(2) 0.035(7)
H2B 0.0318 0.4181 -0.1643 0.027
H3B -0.2067 0.2905 -0.0540 0.027
H8A 0.3503 0.4063 0.0672 0.025
H10A 0.1021 0.3964 0.4301 0.021
H10B 0.0367 0.3739 0.3343 0.021
H11A 0.3308 0.4616 0.2458 0.021
H11B 0.2196 0.5607 0.2872 0.021
H12A 0.6918 0.3552 0.4256 0.022
H12B 0.6176 0.3375 0.3294 0.022
H13A 0.5112 0.1665 0.4697 0.021
H13B 0.4085 0.2593 0.5199 0.021
H15A 0.7829 0.5280 0.4312 0.021
H17A 0.9087 0.8660 0.2132 0.023
H19A 0.4304 0.6760 0.1950 0.023
H20A -0.5741 0.0030 0.3255 0.034
H20B -0.4508 0.0043 0.2273 0.034
H20C -0.5676 0.1294 0.2284 0.034
H21A 1.2215 0.8068 0.4078 0.046
H21B 1.0297 0.8843 0.3535 0.046
H21C 1.1941 0.8307 0.2936 0.046
H22A 0.7058 1.0031 -0.0244 0.040
H22B 0.8780 0.9086 0.0356 0.040
H22C 0.7827 1.0146 0.0736 0.040
表21.选定的氢键信息(和°)
D-H...A d(D-H) d(H...A) d(D...A) <(DHA)
N3-H3A...O1#1 0.89(3) 2.02(3) 2.8652(19) 160(3)
#1-x,-y,-z+1
实施例20：分析XRPD数据
图36中是比较RX-5902纳米配制品(实施例18A(上))和RX-5902API(实施例18B(下))的XRPD图谱的重叠。尽管这些样品是在不同的时间进行分析，但使用了相同的测试方法，这有助于鉴定和比较峰位置。浏览样品峰列表显示出几乎所有观察到的峰的良好匹配。峰强度和峰***的变化被认为不太显著且不会影响匹配。还需注意的是，泊洛沙姆407反射可能有助于纳米悬浮液图案。两种图案都与晶体材料一致；没有明显的无定形成分。该数据表明纳米悬浮液晶体结构与RX-5902 API一致。
对于本领域技术人员将显而易见的是，公开的主题的特定实施方案可以涉及上述和下述实施方案中一个或多个的任何组合。尽管已经通过说明和举例的方式相当详细地公开了本发明，但对于本领域技术人员显而易见的是，在不偏离本发明的真实精神和范围的情况下可以进行改变并且等同物可以被替换。因此，说明书和实施例不应当被解释为限制本发明的范围。本文所公开的所有参考文献、出版物、专利和专利申请均通过引用以其整体并入本文，如同每个均已被单独地并入。

Claims (31)

1.一种组合物，用于在需要其的受试者中***的方法中使用，包含固体口服给药剂型的式(I)化合物或其药用盐
其中，在单次给药后，给予所述组合物提供约800-15,000hr·ng/mL的AUC0-t(0-24小时)。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中以约100-1,200mg/天、每周1-7天、至多约2,800mg/周的剂量给予所述组合物。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中以约150-400mg/天、每周3-7天的剂量给予所述组合物。
4.根据权利要求1或2所述的组合物，其中以约150-400mg/天、每周5-7天的剂量给予所述组合物。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述组合物是片剂或胶囊。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中在单次给药后给予所述组合物提供约2,500-9,500hr·ng/mL的AUC0-t(0-24小时)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中在单次给药后给予所述组合物提供约200-1,200ng/mL的Cmax。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述肿瘤选自皮肤癌、结直肠癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌和肾癌。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述肿瘤是三阴性(TN)乳腺癌。
10.根据权利要求8所述的组合物，其中所述肿瘤是铂耐性或难治性卵巢癌。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述受试者是人。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述治疗进一步包括给予所述受试者辐射或抗肿瘤剂。
13.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述治疗进一步包括给予所述受试者选自以下的抗肿瘤剂：抗代谢物、DNA片段化剂、DNA交联剂、嵌入剂、蛋白合成抑制剂、拓扑异构酶I毒素、拓扑异构酶II毒素、微管导向剂、激酶抑制剂、多酚、激素、激素拮抗剂、死亡受体激动剂、免疫检查点抑制剂、抗程序性细胞死亡1(PD-1)受体抗体和抗程序性细胞死亡配体1(PD-L1)抗体。
14.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述治疗进一步包括给予所述受试者PD-L1抗体或PD-1抗体。
15.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中通过抑制Y593磷酸化的p68的β-连环蛋白依赖性ATP酶活性治疗所述肿瘤。
16.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述治疗包括：
(a)在给予所述固体口服剂型之前，从所述受试者采集肿瘤样品；
(b)确定所述肿瘤是否表达Y593磷酸化的p68；和
(c)如果所述肿瘤表达所述Y593磷酸化的p68，则给予所述受试者有效量的式(I)化合物。
17.一种组合物，用于在需要其的受试者中***的方法中使用，包含固体口服给药剂型的式(I)化合物或其药用盐
包括：(a)确定所述受试者是否正在接受CYP3A4或CYP3A5抑制剂或诱导剂的治疗；和(b)如果所述受试者没有接受CYP3A4或CYP3A5抑制剂或诱导剂的治疗，则给予所述受试者有效量的式(I)化合物或其药用盐。
18.一种在商业规模上制备式(I)化合物或其药用盐的方法，包括：
(a)在有机溶剂中在碱存在下，使3-氨基-6-氟-2-甲氧基喹喔啉与氯甲酸乙酯反应，形成混合物；
(b)蒸馏所述混合物同时加入乙酸乙酯以形成悬浮液；
(c)过滤所述悬浮液以分离乙基-N-(6-氟-2-甲氧基喹喔啉-3-基)碳酸酯；和
(d)在第二有机溶剂中在第二碱存在下，使乙基-N-(6-氟-2-甲氧基喹喔啉-3-基)碳酸酯与1-(3,5-二甲氧基苯基)哌嗪盐酸盐反应。
19.根据权利要求18所述的方法，进一步包括：
(e)在有机溶剂中在碱存在下，使3-氨基-2-氯-6-氟喹喔啉与甲醇钠反应，形成混合物；
(f)向步骤(e)的所述混合物中加入水以形成溶液；
(g)将所述溶液冷却到约15-20℃的温度以形成悬浮液；和
(h)过滤步骤(g)的所述悬浮液以分离3-氨基-6-氟-2-甲氧基喹喔啉。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其中在步骤(a)中，所述有机溶剂是二氯甲烷且所述碱是吡啶。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中蒸馏步骤(b)是在大气压下进行。
22.根据权利要求18至21中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括真空过滤。
23.根据权利要求18至22中任一项所述的方法，其中步骤(d)中，所述第二有机溶剂是四氢呋喃并且所述第二碱为1,8-二氮杂双环十一碳-7-烯。
24.根据权利要求18至24中任一项所述的方法，其中步骤是在一个或多个固定反应器中进行。
25.根据权利要求18至25中任一项所述的方法，进一步包括在足以提供悬浮液的条件下，减小式(I)化合物或其药用盐的粒度。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述悬浮液是通过研磨工艺制备的。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述研磨工艺是高能搅拌器研磨或辊磨。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述研磨工艺是高能搅拌器研磨。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述悬浮液的D50粒度为约200nm或更小。
30.根据权利要求25至29中任一项所述的方法，进一步包括喷雾干燥或冷冻干燥所述悬浮液以形成粉末。
31.一种由根据权利要求18至30中任一项所述的方法制备的产品。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150004234A1 (en) * 2013-06-28 2015-01-01 Rexahn Pharmaceuticals, Inc. Nanoparticulate compositions and formulations of piperazine compounds

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS567710A (en) 1979-06-28 1981-01-27 Sansho Seiyaku Kk Whitening cosmetic
ATE66143T1 (de) 1985-01-11 1991-08-15 Abbott Lab Feste zubereitung mit langsamer freisetzung.
JP2773959B2 (ja) 1990-07-10 1998-07-09 信越化学工業株式会社 大腸内放出性固形製剤
UA73092C2 (uk) 1998-07-17 2005-06-15 Брістол-Майерс Сквібб Компані Таблетка з ентеросолюбільним покриттям і спосіб її приготування
KR100501022B1 (ko) 1998-07-28 2005-07-18 다나베 세이야꾸 가부시키가이샤 장내 적소 방출형 제제
BRPI0517734A (pt) * 2004-11-17 2008-10-21 Korea Res Inst Chem Tech derivados de 1-[(6,7-alcoxiquinoxalinil substituìdo) aminocarbonil]-4- (hetero) arilpiperazina
SG11201402603WA (en) * 2011-11-28 2014-06-27 Merck Patent Gmbh Anti-pd-l1 antibodies and uses thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150004234A1 (en) * 2013-06-28 2015-01-01 Rexahn Pharmaceuticals, Inc. Nanoparticulate compositions and formulations of piperazine compounds

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GINA CHUN KOST ,ET AL: "1‐(3,5‐Dimethoxyphenyl)‐4‐ [(6‐Fluoro‐2‐Methoxyquinoxalin‐3‐yl)Aminocarbonyl] Piperazine (RX‐5902), InterferesWith β‐Catenin Function Through Y593 Phospho‐p68 RNA Helicase", 《JOURNAL OF CELLULAR BIOCHEMISTRY》 *
YOUNG BOK LEE ET AL: "Synthesis and anticancer activity of new 1-[(5 or 6-substituted2-alkoxyquinoxalin-3-yl)aminocarbonyl]-4-(hetero)arylpiperazine derivatives", 《BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY》 *

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