KR20180049015A - 퀴녹살리닐-피페라진아미드의 사용 방법 - Google Patents

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KR20180049015A
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tumor
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dose
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KR1020187009465A
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김덕중
이영복
레자 마즈하리
다니엘 에드워드 엠리치
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렉산 파마슈티컬스, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 키트 및 이의 사용 방법을 제공한다:
Figure pct00021

Description

퀴녹살리닐-피페라진아미드의 사용 방법
1. 우선권
본 출원은 2015년 9월 4일 출원된 미국 가출원 번호 제62/214,678호; 및 2016년 2월 1일 출원된 미국 가출원 번호 제62/289,820호에 대한 우선권을 주장하며, 이의 내용은 그의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
2. 발명의 요약
하기 요약은 설명을 목적으로 제시된 것이며, 청구된 주제의 범위를 제한하지 않는다.
본원에 이의 전문이 참고로 포함된 미국 특허 제8,314,100호 (2012년 11월 20일 발행됨)은, 다른 경우 RX-5902로도 지칭되는 화학식 (I)의 화합물인, 4-(3,5-디메톡시페닐)-N-(7-플루오로-3-메톡시퀴녹살린-2-일)피페라진-1-카르복스아미드, 1-[(6-플루오로-2-메톡시퀴녹살린-3-일)아미노카르보닐]-4-(3,5-디메톡시페닐)피페라진, 및 1-(3,5-디메톡시페닐)-4-[(6-플루오로-2-메톡시퀴녹살린-3-일)아미노카르보닐]피페라진을 개시한다:
Figure pct00001
.
RX-5902의 다른 측면이 미국 특허 제8,598,173호 (2013년 12월 3일 발행됨) 및 미국 특허 공개 제2015/0004234호 (2015년 1월 1일 발행됨)에 기재되며, 이는 모두 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 일 측면은 종양의 치료를 필요로 하는 대상체에게 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 고체 경구 투여형을 투여함으로써, 종양을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 800-15,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다. 일 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 2,500-9,300 hr·ng /mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다. 일 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 2,500-9,500 hr·ng /mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다. 일 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 200-1,200 ng/mL의 Cmax를 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 종양의 치료를 필요로 하는 대상체에게 주당 1 내지 7일로 약 100-1,200 mg/일, 최대 약 2,800 mg/주의 투여량으로 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 경구 투여형을 투여함으로써, 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 투여량은 주당 3 내지 7일로 약 150-400 mg/일 일 수 있다. 일 실시형태에서, 투여량은 주당 5 내지 7일로 약 150-400 mg/일 일 수 있다. 일 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 정제 또는 캡슐제일 수 있다.
임의의 실시형태에서, 대상체는 인간일 수 있다. 임의의 실시형태에서, 종양은 피부, 결장직장, 난소, 폐, 유방, 췌장, 위 및 신장 암 중에서 선택될 수 있다. 일 실시형태에서, 종양은 삼중 음성 (TN) 유방암일 수 있다. 일 실시형태에서, 종양은 백금-저항성 또는 -불응성 난소암일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 종양을 치료하는 방법은 방사선 또는 항종양제 (anti-tumor agent)를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 종양을 치료하는 방법은 대상체에게, 항대사물질, DNA-단편화제 (DNA-fragmenting agent), DNA-가교제, 중격제 (intercalating agent), 단백질 합성 억제제, 독성 국소이성화효소 I (topoisomerase I poison), 독성 국소이성화효소 II (topoisomerase II poison), 미세소관-유도제 (microtubule-directed agent), 키나아제 억제제, 폴리페놀, 호르몬, 호르몬 길항제, 사멸 수용체 작용제 death receptor agonist), 면역 체크포인트 억제제, 항-세포예정사 1 (PD-1) 수용체 항체 및 항-세포예정사 리간드 1 (PD-L1) 항체 중에서 선택된 항종양제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 대상체에게 PD-L1 항체 또는 PD-1 항체를 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 다음을 포함하는, 종양의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이의 치료 방법을 제공한다: (a) 대상체가 CYP3A4 또는 CYP3A5 억제제 또는 유발인자 (inducer)로 치료 받았는지의 여부를 측정; 및 (b) 이어서, 대상체가 CYP3A4 또는 CYP3A5 억제제 또는 유발인자로 치료 받지 않은 경우, 대상체에게 유효량의 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 투여. 일 실시형태에서, 상기 방법은 (c) 부작용에 대해서 대상체를 모니터링함을 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은, Y593 인산화된 p68의 β-카테닌 의존성 ATP아제 활성의 억제를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 투여함으로써, 이를 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 종양 치료에 있어서 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 잠재적 효능을 시험하기 위한 키트를 제공하며, 이는 종양이 Y593 인산화된 p68를 발현하는지의 여부를 측정하는 분석을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은, (a) 대상체로부터 종양의 샘플을 수집; (b) 종양이 Y593 인산화된 p68를 발현하는지의 여부를 측정; 및 (c) 이어서, 종양이 Y593 인산화된 p68를 발현하는 경우, 대상체에게 유효량의 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 투여함에 의해, 종양의 치료를 필요로 하는 대상체에서 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 4-(3, 5-디메톡시페닐)-N-(7-플루오로-3-메톡시퀴녹살린-2-일)피페라진-1-카르복스아미드 (RX-5902)를, 예를 들어, 하나 이상의 고정상 반응기에서 상업적 규모로 제조하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 상업적 규모의 RX-5902 제조는, 3-아미노-6-플루오로-2-메톡시퀴녹살린을 염기의 존재하에 유기 용매 중에서 에틸 클로로포르메이트와 반응시켜 혼합물을 형성하는 단계; 상기 혼합물에 에틸 아세테이트를 첨가하면서 증류시켜 현탁액을 형성하는 단계; 상기 현탁액을 여과하여 에틸-N-(6-플루오로-2-메톡시퀴녹살린-3-일) 카르보네이트를 단리하는 단계; 및 에틸-N-(6-플루오로-2-메톡시퀴녹살린-3-일) 카르보네이트를 제2 염기의 존재하에 제2 유기 용매 중 1-(3,5-디메톡시페닐) 피페라진 히드로클로라이드와 반응시키는 단계를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 상업적 규모의 생산은, 3-아미노-2-클로로-6-플루오로퀴녹살린을 염기의 존재하에 유기 용매 중에서 나트륨 메톡시드와 반응시켜 혼합물을 형성하는 단계; 상기 혼합물에 물을 첨가하여 용액을 형성하는 단계; 상기 용액을 약 15 내지 20 ℃의 온도로 냉각시켜 현탁액을 형성하는 단계; 및 상기 현탁액을 여과하여 3-아미노-6-플루오로-2-메톡시퀴녹살린을 단리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 유기 용매는 디클로로메탄일 수 있다. 일 실시형태에서, 염기는 피리딘일 수 있다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 증류 단계는 대기압하에서 수행될 수 있다. 일 실시형태에서, 여과 단계는 진공 여과에 의한 것일 수 있다. 일 실시형태에서, 제2 유기 용매는 테트라히드로푸란일 수 있다. 일 실시형태에서, 제2 염기는 1,8-디아자비사이클로운데크-7-엔 (DBU)일 수 있다.
또한, RX-5902의 개선된 경구 생체이용률을 제공하는 신규 나노제형을 발견하였다. 본 발명은 화학식 (I)의 화합물 및 이의 나노제형의 신규 용도 및 이의 사용 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 불순물을 줄이고, 증류를 사용하여 다른 것들 중에서 용매를 제거하고 최종 생성물을 여과함으로써 생산 비용을 현저히 절감할 수 있는 개선된 공정을 제공한다. 본 발명은 또한 RX-5902의 개선된 생체이용률을 위한 신규 나노제형을 제공한다. 추가로, 본 발명은 대상체에서 화학식 (I)의 화합물 및 이의 나노제형을 사용하기 위한 투여량 및 노출 수준을 제공한다. 본 발명의 또 다른 측면은 현탁액을 제공하기에 충분한 조건하에서, 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 입자의 혼합물을 제조하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 현탁액은 밀링 공정 (milling process)에 의해 제조될 수 있다. 일 실시형태에서, 밀링 공정은 고에너지 교반기 밀링 또는 롤러 밀링일 수 있다. 일 실시형태에서, 밀링 공정은 고-에너지 교반기 밀링이다. 일 실시형태에서, 현탁액은 약 200 nm 이하의 D50 입자 크기를 가질 수 있다.
발명의 실시형태는 현탁액을 분무 건조시켜 분말을 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면은 본원에 기재된 공정에 의한 RX-5902의 제조 방법에 따라 제조된 생생물을 제공한다.
3. 도면의 간단한 설명
도 1은 금식 조건하에서 다양한 투여량의 RX-5902의 단일 경구 투여 후, 진행성 또는 전이성 고형 종양을 갖는 대상체에서 RX-5902의 혈장 농도를 도시한 그래프이다.
도 2는 1주 5일로 50 mg/kg 및 70 mg/kg의 RX-5902의 경구 투여 후, 인간 신장 종양 (Caki-1) 이종이식편을 갖는 마우스 내 평균 종양 부피를 도시한 그래프이다.
도 3은 21일 동안 60 mg/kg의 수니티닙 (Sunitinib) 및 4주 동안 1주 1회로 20, 40, 80 및 160 mg/kg의 RX-5902의 경구 투여 후, 인간 신장 종양 (Caki-1) 이종이식편을 갖는 마우스 내 평균 종양 부피를 도시한 그래프이다.
도 4는 RX-5902와 MDA-MB-231 세포의 상호작용, 특히, 프로테아제 절단으로부터 보호된 약 60kDa의 이동성을 갖는 밴드를 나타내는 웨스턴 블롯이다.
도 5는 도 4의 보호된 밴드가 p68 RNA 헬리카제에 대한 항체에 의해 인식된다는 것을 나타내는 웨스턴 블롯이다.
도 6은 p68이 티로신 잔기에 대해 인산화되었다는 것을 확증하는 웨스턴 블롯이다.
도 7은 필터 결합 검정 (filter binding assay)에서 3H-표지된 RX-5902에 결합된 포스포-68 및 비인산화된 p68의 백분율을 도시하는 그래프이다. Kd는 50%의 p68이 RX-5902에 결합된 것으로 추정된다.
도 8은 0 내지 20 μM의 RX-5902의 백분율 및 2 ㎍의 효소로부터 추출된 전체 RNA에서의 p68의 RNA-의존성 ATP아제 활성을 도시하는 막대 그래프이다.
도 9는 0 내지 20 μM의 RX-5902의 백분율 및 1 ㎍의 β-카테닌에서의 p68의 β-카테닌-의존성 ATP아제 활성을 도시하는 막대 그래프이다.
도 10은 포스포-68의 β-카테닌-의존성 ATP아제 활성의 억제에 대한 RX-5902의 IC50 측정을 도시하는 그래프이다.
도 11은 RX-5902에 의한 사이클린 D1, c-Myc 및 p-c-Jun 발현의 억제를 도시하는 웨스턴 블롯이다.
도 12는 3주 동안 1주 2회로 정맥내 투여된 5 mg/kg의 Abraxane®과 비교하여, 3주 동안 1주 1회로 160 mg/kg, 320 mg/kg 및 600 mg/kg의 RX-5902의 경구 투여 후, 인간 유방암 (MDA-MB-231) 이종이식편을 갖는 마우스 내 평균 종양 부피를 도시하는 그래프이다.
도 13은 3주 동안 1주 2회로 정맥내 투여된 5 mg/kg의 Abraxane®과 비교하여, 3주 동안 1주 1회로 160 mg/kg, 320 mg/kg 및 600 mg/kg의 RX-5902의 경구 투여 후, 인간 유방암 (MDA-MB-231) 이종이식편을 갖는 마우에서의 카플란 마이어 생존 곡선 (Kaplan-Meier survival curve)을 도시하는 그래프이다. 이러한 데이터는 도 12에 도시된 동일한 연구로부터의 것이다.
도 14는 교반기-밀링된 나노현탁액의 입자-크기 분포를 도시하는 그래프이다.
도 15는 추출된 RX-5902 나노입자의 DSC이다.
도 16은 분무-건조된 RX-5902 나노현탁액의 입자-크기 분포이다.
도 17은 분무-건조된 RX-5902 (1000X 배율, 보통 광)을 도시한다.
도 18은 분무-건조된 RX-5902 (1000X 배율, 편광)을 도시한다.
도 19는 RX-5902의 1H NMR 스펙트럼을 도시한다.
도 20은 RRT 0.975 불순물의 1H NMR 스펙트럼을 도시한다.
도 21은 RRT 0.975 불순물 (상단) 및 RX-5902 (하단)의 1H NMR 스펙트럼의 오버레이를 도시한다.
도 22는 RRT 0.975 불순물 (상부 플롯) 및 RX-5902 (하부 플롯)의 1H NMR 스펙트럼의 7.0-8.0 ppm 부분의 오버레이를 도시한다.
도 23은 RX-5902의 13C NMR 스펙트럼을 도시한다.
도 24는 RRT 0.975 불순물의 13C NMR 스펙트럼을 도시한다.
도 25는 RX-5902 (상부 플롯) 및 RRT 0.975 불순물 (하부 플롯)의 13C NMR 스펙트럼의 오버레이를 도시한다.
도 26은 RX-5902 (상부 플롯) 및 RRT 0.975 불순물 (하부 플롯)의 13C NMR 스펙트럼의 108-150 ppm 부분을 도시한다.
도 27은 RX-5902의 19F NMR 스펙트럼을 도시한다.
도 28은 RRT 0.975 불순물의 19F NMR 스펙트럼을 도시한다.
도 29는 RX-5902 (실선) 및 RRT 0.975 불순물 (점선)의 UV-Vis 흡광도 데이터를 도시한다.
도 30은 주요 RX-5902 생성물에 해당하는 17.9 분 피크의 액체 크로마토그래피-질량 분광분석 (LC-MS)을 도시한다.
도 31은 RRT 0.975 불순물에 해당하는 17.2 분 피크의 LC-MS를 도시한다.
도 32는 464의 정확한 [M+Na]+ 질량을 갖는 RX-5902 및 RRT 0.975 불순물을 도시한다.
도 33은 결정성 RX-5902 나노제형의 X-레이 분말 회절 (XRPD)이다.
도 34는 RX-5902 API의 상세한 XRPD 패턴이다.
도 35a 및 35b는 XRPD 데이터 수집에 사용되는 결정성 배치 (좌측) 및 결정 (우측)의 광학 현미경사진이다.
도 36은 RX-5902 나노제형 및 RX-5902 API의 XRPD 패턴 오버레이를 도시한다.
4. 상세한 설명
본 발명의 실시형태가 하기에 상세히 논의된다. 설명된 실시형태에서, 명확한 설명을 위하여 특정한 용어가 사용된다. 그러나, 본 발명은 그렇게 선택된 특정한 용어에 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 특정한 예시적 실시형태가 논의되나, 이는 단지 설명의 목적으로만 이루어진 것임을 이해해야 할 것이다. 당업자는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 다른 구성요소 및 구성이 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
4.1 정의
달리 지시되지 않는 한, 본원에 사용된 용어는 하기 지시된 의미를 갖는다. 이러한 의미는 당업계에서 이해되는 이러한 용어의 의미를 변경하기 보다는 보충하기 위한 것으로 의도된다.
"Cmax"는 최대 관찰된 혈장 농도를 지칭한다.
"Tmax"는 Cmax가 달성된 시간을 지칭한다.
"T1/2"는 약물의 혈장 농도가 원래 값의 절반에 도달하는데 요구되는 시간을 지칭한다. "종결 T1/2"는 종결 단계에서의 T1/2를 지칭한다.
"AUC0-t"는 0 내지 t의 시간까지의 혈장 농도 - 시간 곡선하 면적 (AUC)을 지칭하며, 여기서, "t"는 측정가능한 농도를 갖는 마지막 샘플링 시점이다. 예를 들어, AUC0-24 또는 AUC0-t (0-24 시간)은 0 내지 24시간까지의 AUC를 지칭하며, AUC0-48 또는 AUC0-t (0-48 시간)은 0 내지 48시간까지의 AUC를 지칭한다.
"경구 투여형 (oral dosage form)"은 경구 투여를 위하여 제형화된 약학적 조성물을 지칭한다 경구 투여형은 즉시, 지속된, 연장된, 지연된 또는 조절된 방출을 위하여 제형화될 수 있다. 경구 투여량의 예로는 정제, 캡슐제, 과립제 및 젤-캡 (gel-cap)을 포함한다.
"유효량"은 효능 및 독성 가능성 및 당업자의 지식에 대한 이의 파라미터에 기반하여, 병증의 치료 또는 예방과 같은 목적하는 효과를 산출할 수 있는 조성물 또는 약학적 조성물의 양을 지칭한다. 유효량은 하나 이상의 투여량으로 투여될 수 있다.
"접촉시킴"은 화합물 및 세포가, 예를 들어, 세포자멸사를 유도하거나 단백질 키나아제를 조절하는 것과 같은 목적하는 효과를 생성하도록 직접 또는 간접적으로 충분한 거리에 있도록 하는 것을 지칭한다. 접촉은 시험관내 또는 생체내에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 세포를 화합물과 접촉시키는 공지된 기술, 예컨대, 미세주입법을 사용하여 화합물을 세포내로 직접 전달함, 화합물을 세포를 보유한 대상체에게 투여함, 또는 화합물을 포함하는 배지 중에서 세포를 항온처리함을 포함할 수 있다.
"치료함"은 임상적 결과와 같이 유익하거나 목적하는 결과를 달성하는 것을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 유익하거나 목적하는 결과는 하기 중의 하나 이상의 것이다: 병증의 발병 및 진행의 억제 또는 저지함, 병증의 중증도 감소시킴, 병증과 관련된 증상의 수 및 중증도를 감소시킴, 병증을 앓는 대상체의 삶의 질을 개선시킴, 병증을 치료하는데 요구되는 또 다른 의약의 투여량을 감소시킴, 병증을 위하여 대상체가 섭취하는 또 다른 의약의 효과를 향상시킴, 및 병증을 앓는 대상체의 생존을 연장함.
"예방함"은 병증을 앓지 않으나 발병 위험이 있는 병증을 대상체가 발병할 가능성을 감소시키는 것을 지칭한다. "위험이 있는"은 병증의 발병과 관련되며 당업계에 공지된 측정가능한 파라미터인, 하나 이상의 위험 인자를 대상체가 갖고 있음을 나타낸다. 하나 이상의 위험 인자를 갖는 대상체는, 이러한 위험 인자가 없는 대상체보다 발병 가능성이 더 높다.
"대상체"는 동물, 예컨대, 사람을 비롯한 포유동물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 따라서, 본원에 기재된 방법은 인간 치료법 및 수의학적 적용에도 유용할 수 있다. 일 실시형태에서, 대상체는 포유동물이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 인간이다.
"금식한 (fasted)"은 처리 전 적어도 8시간 동안 음식을 금한 대상체를 지칭한다.
"CYP3A4 또는 CYP3A5 억제제 또는 유발인자"는 시토크롬 P450 3A4 (CYP3A4) 또는 P450 3A5 (CYP3A5) 효소의 기질에 대한 혈장 AUC 값을 각각 적어도 약 30 퍼센트씩 증가 또는 감소시키는 작용제를 지칭한다. CYP3A4 또는 CYP3A5 억제제 또는 유발인자의 예는, 암프레나비르 (amprenavir), 아프레피탄트 (aprepitant), 아타자나비르 (atazanavir), 바르비투레이트, 보세프레비르 (boceprevir), 보젠탄, 카르바마제핀, 클로람페니콜, 시프로플록사신, 클라리트로마이신, 코비시스탯 (cobicistat), 코니바프탄 (conivaptan), 다루나비르 (darunavir), 딜티아젬, 에파비렌즈 (efavirenz), 엘비테그라비르 (elvitegravir), 에리트로마이신, 에트라비린 (etravirine), 플루코나졸, 포스암프레나비르, 자몽 쥬스 (grapefruit juice), 이마티닙, 인디나비르, 이트라코나졸, 케토코나졸, 로피나비르, 미베프라딜, 모다피닐, 나프실린, 네파조돈 (nefazodone), 넬피나비르 (nelfinavir), 페니토인, 포사코나졸 (posaconazole), 리팜핀, 리토나비르, 사퀴나비르, St. John's Wort, 텔라프레비르 (telaprevir), 텔리트로마이신 (telithromycin), 테노포비르 (tenofovir), 티프라나비르, 베라파밀 및 보리코나졸 (voriconazole)을 포함한다.
"부작용"은 화합물 또는 약학적 조성물의 사용과 관련된 임의의 목적하지 않는 효과를 지칭한다. 부작용은 부작용에 대한 국립 암 연구소 일반 용어 기준 (National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events: NCI-CTCAE) 버전 4.03에 따라 평가되고 등급화될 수 있다. 부작용의 예로는 발열성 호중구 감소증 (febrile neutropenia), 빈혈, 저혈소판증, 출혈과 관련된 비정상적 응고 (coagulation abnormality), 설사, 피로, 오심 및 구토를 포함한다.
"민감화시킴"은 세포자멸 신호에 반응하는 세포의 민감성을 증가시키거나, 또는 세포의 저항성을 감소시키는 것을 지칭한다.
"조절시킴 (modifying)"은 활성제의 투여량을 감소하거나 증가시킴, 대상체에 대한 활성제 투여를 중단시킴, 또는 상이한 활성제를 갖는 활성제로 대체함을 지칭한다.
"억제"는 작용제 (예: 화학식 (I)의 화합물) 부재시의 발현 수준 (예: 유전자 발현 수준) 또는 활성 (예: 효소 활성)과 비교하여, 작용제 존재하 발현 수준 또는 활성의 감소를 지칭한다. 감소는, 예를 들어, 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상일 수 있다. 발현 수준 또는 활성은 본원에 기재된 바와 같이 측정되거나, 또는 당업계에 일반적으로 알려진 기술로 측정될 수 있다.
"종양 세포"는 종양 유래의 세포를 지칭한다.
"종양"은 조직 또는 세포의 비정상정 성장을 지칭하며, 양성 또는 악성이다. 예를 들어, 전립선, 폐, 뇌, 유방, 신장, 간, 폐, 장, 림프, 근육, 뼈, 골수, 자궁, 난소, 질, 음문, 췌장, 부신, 중추신경계, 말초신경계, 자궁경부, 방광, 자궁 내막, 목, 식도, 후두, 갑상선, 혈액, 페널 (penal), 고환, 흉선, 피부, 척추, 위, 담관, 소장, 간담즙성 관 (hepatobiliary tract), 결장직장 (colorectal), 결장, 직장, 항문, 내분비계, 눈 및 쓸개에서 발견된 종양이 포함된다.
"암"은 악성 종양을 지칭한다. 암 세포는 조직 주변으로 침투하거나 침투하지 않을 수 있으며, 따라서, 새로운 신체 부위로 전이되거나 전이되지 않을 수 있다. 암은 상피 세포가 암인 암종; 편평 세포 암종, 샘암종, 흑색종, 간암을 포함하는 암종을 포함한다. 또한, 암은 중간엽 기원의 종양인 육종; 골육종, 백혈병 및 림프종을 포함한 육종을 포함한다. 암은 하나 이상의 신생 세포 유형을 포함할 수 있다.
"항종양제"는 종양의 치료 또는 예방에 유용한 임의의 작용제를 지칭한다. 항종양제의 예로는 이하 약학적 조성물에 기재된 활성제를 포함한다. 일 실시형태에서, RX-5902 이외의 항종양제는, 항대사물질, DNA-단편화제, DNA-가교제, 중격제, 단백질 합성 억제제, 독성 국소이성화효소 I, 독성 국소이성화효소 II, 미세소관-유도제, 키나아제 억제제, 폴리페놀, 호르몬, 호르몬 길항제, 사멸 수용체 작용제, 면역 체크포인트 억제제, 항-세포예정사 1 (PD-1) 수용체 항체 및 항-세포예정사 리간드 1 (PD-L1) 항체 중에서 선택된다. 다른 실시형태에서, 추가의 항종양제는 PD-1 수용체 항체이다. 다른 실시형태에서, 추가의 항종양제는 펨브롤리주맙 (pembrolizumab)이다. 다른 실시형태에서, 추가의 항종양제는 니볼루맙 (nivolumab)이다. 다른 실시형태에서, 추가의 항종양제는 두르알루맙 (duryalumab)이다. 다른 실시형태에서, 추가의 항종양제는 니볼루맙 및 펨브롤리주맙의 조합이다.
"방사선"은 종양의 치료 또는 예방에 유용한 임의의 방사선을 지칭한다. 방사선의 예로는, X-레이, 감마선 및 하전 입자를 포함한다. 방사선은 임의의 형태의 방사선 치료, 예컨대, 외부 빔 방사선 치료 (EBRT, XBRT 또는 원격치료), 근접 치료법 (brachytherapy)(체내 조사 치료 또는 밀봉 선원 치료), 수술중 방사선 치료 또는 전신 방사선 치료에 의해 전달될 수 있다.
"Y593 인산화된 p68" 또는 "Y593 포스포-p68"은 티로신 593 잔기에서 인산화된 p68 RNA 헬리카제 (DDX5)를 지칭한다.
"p68 RNA 헬리카제"는 "ATP-의존성 RNA 헬리카제 DDX5" 또는 "DEAD 박스 단백질 5"로도 알려지며, DDX5 유전자에 의해 코딩되는 인간내 효소를 지칭한다.
"상업적 규모 (commercial scale)"는 대중에게 판매 및 유통하기에 적합할 수 있는 양의 생성물의 제조를 지칭한다. 상업적 규모는, 연구 목적에 적합한 생산량의 실험실 또는 작업장 (bench scale) 규모와 구별된다. 또한, 상업적 규모는 처분 및 정화 비용을 최소화하기 위하여 유해 물질의 사용 또는 낭비를 최소화하는 시약 및 방법을 사용하는 실험실 또는 작업장 규모와도 구별된다. 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 상업적 규모 방법은 적어도 약 0.5 kg, 1.0 kg 또는 1.5 kg의 단일 배치량 (single batch quantity)을 산출한다.
"반응시킴"은 목적하는 생성물을 생성하기 위하여 적절한 조건 하 (예: 온도, 압력, pH, 농도)에서 하나 이상의 시약을 배합하는 것을 지칭한다. 목적하는 생성물은 반드시 2개 이상의 시약의 배합으로부터 직접 생성되지 않을 수 있다, 즉, 궁극적으로 목적하는 생성물의 형성을 야기하는 하나 이상의 중간체가 생성될 수 있다.
"증류" 또는 "증류시킴"은, 예를 들어, 증발 또는 차후의 응결에 의해 이들의 상이한 휘발성에 기반하여 화합물을 분리하는 것을 지칭한다.
"여과" 또는 "여과함"은, 예를 들어, 진공, 중력 또는 압력에 의해 액체로부터 고체를 분리하는 것을 지칭한다. "진공 여과"는 액체 혼합물로부터 고체를 추출하는 기술을 지칭하며, 여기서, 필터, 예컨대, 뷰흐너 깔때기 내 여과지를 통해 혼합물을 빨아들이는데 진공 흡인이 사용된다.
"대기압"은 진공 또는 밀폐된 챔버에서의 압력과는 반대로, 개방된 공기 압력을 지칭한다. 대기압은 전형적으로 약 760 Torr이나, 제조 시설의 상태에 따라 달라질 수 있다.
"진공 여과"는 액체 혼합물로부터 고체를 추출하는 기술을 지칭하며, 여기서, 필터, 예컨대, 뷰흐터 깔때기 내 여과지를 통해 혼합물을 빨아들이는데 진공 흡인이 사용된다.
"고정상 반응기"는 한 장소에 고정되어 움직이지 않는 반응기를 지칭한다.
"입자 크기"는 당업계에 알려진 임의의 입자 크기 측정 기술로써 측정된, 활성 약학적 성분 (API), 예컨대, 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 입자 치수를 지칭한다. 이러한 기술의 비제한적 예로는, 예를 들어, Malvern, Sympatec, Microtac 또는 Horiba에서 제공되는 바와 같은 분석기를 사용하여 수행되는 레이저 회절법, 동적 광산란 및 화상 분석을 포함한다.
"D10"은 누적 분포 내 10%에서의 입자 크기를 지칭하며, 입자의 10%가 D10 미만의 입자 크기를 갖고, 입자의 90%가 D10 초과의 입자 크기를 갖는다는 것을 의미한다. "D50"은 누적 분포 내 50%에서의 중간 입자 크기 또는 입자 크기를 지칭하며, 입자의 50%가 D50 미만의 입자 크기를 갖고, 입자의 50%가 D50 초과의 입자 크기를 갖는다는 것을 의미한다. "D90"은 누적 분포 내 90%에서의 중간 입자 크기 또는 입자 크기를 지칭하며, 입자의 90%가 D90 미만의 입자 크기를 갖고, 입자의 10%가 D90 초과의 입자 크기를 갖는다는 것을 의미한다. 누적 분포는 입자의 부피, 질량, 수 또는 표면적에 기반할 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 누적 분포는 입자의 부피에 기반한다.
"동결 건조시킴"은 생성물을 냉동시켜 생성물로부터 실질적으로 하나 이상의 용매를 제거하고, 이어서 주변 압력을 감소시켜 생성물 내 동결된 용매를 고체상에서 기체상으로 직접 승화시키는 냉동-건조 공정을 지칭한다.
"분무 건조함"은 액체 또는 슬러리를 고온 가스를 이용하여 급속히 건조시켜 건조 분말을 생성하는 방법을 지칭한다.
"예컨대"는 "예컨대, 이에 제한되지 않고"와 동일한 의미를 갖는다. 유사하게는, "포함하다"는 "포함하나, 이에 제한되지 않고"와 동일한 의미를 가지며, "비롯하다"는 "비롯하나, 이에 제한되지 않고"와 동일한 의미를 갖는다.
단수 형태 "하나", "또는", 및 "상기"는 문맥이 달리 지시하지 않는 한 복수의 형태를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "화합물"에 대한 언급은 하나 이상의 화합물(들) 및/또는 이의 등가물(들)을 포함할 수 있다.
본원이 기재된 임의의 수치 범위는 달리 지시하지 않는 한, 상한 및 하한 및각각의 개재된 값을 포함한다.
실시예 이외에, 또는 달리 지시된 경우, 명세서 및 청구 범위에 사용된 수치 (예: 성분의 양, 반응 조건을 나타내는 숫자)는 용어 "약"에 의해 변형된다. 따라서, 달리 지시되지 않는 한, 이러한 숫자는 얻고자 하는 목적하는 특성에 따라 변할 수 있는 근사치이다. 적어도, 본 청구 범위의 범위에 대한 등가물의 견해의 적용을 제한하려는 것은 아니며, 각각의 수치 파라미터는 유효 자릿수 및 통상의 반올림 기법에 비추어 해석되어야 한다.
개시된 주제의 범위를 설명하는 수치 파라미터는 근사값이나, 실시예에 기재된 수치는 가능한 정확한 값으로 기록된다. 그러나, 임의의 수치는 본질적으로 각각의 시험 측정에서 관측된 표준 편차부터 반드시 발생하는 특정 오차를 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술 및 과학 용어의 의미는 개시된 주제가 속하는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것들이다.
4.2 종양의 치료 또는 예방 방법
본 발명의 일 측면은 종양의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체가 적어도 약 8시간 동안 음식을 금한 후, 상기 대상체에게 유효량의 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 투여함으로써, 종양을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 투여 후 적어도 3시간 동안 음식을 금하는 것을 지속한다.
본 발명의 또 다른 측면은 종양의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 고체 경구 투여형을 투여함으로써, 종양을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 여기서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 800-15,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 종양의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 고체 경구 투여형을 투여함으로써, 종양을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 여기서, 고체 경구 투여형은 주당 1 내지 7일로 1주간 투여 후, 약 1,000-70,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-168 시간; 즉, 1주)를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 종양의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 주당 1 내지 7일로 약 100-1,200 mg/일의 투여량으로 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 고체 경구 투여형을 투여함으로써, 종양을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 최대 약 3,000 mg/주의 양으로 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 최대 약 2,800 mg/주의 양으로 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 투여량은 주당 3 내지 7일로 약 100-500 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 5 내지 7일로 약 100-500 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 3 내지 7일로 약 150-400 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 1주에 5 내지 7일로 약 150-400 mg/일이다.
본 발명의 또 다른 측면은 (a) 대상체가 CYP3A4 또는 CYP3A5 억제제 또는 유발인자로 치료 받았는지의 여부를 측정; 및 (b) 이어서, 대상체가 CYP3A4 또는 CYP3A5 억제제 또는 유발인자로 치료 받지 않은 경우, 대상체에게 유효량의 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 투여함에 의해, 종양의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 대상체는 CYP3A4 또는 CYP3A5 억제제로 치료 받는다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 CYP3A4 또는 CYP3A5 유발인자로 치료 받는다.
본 발명의 또 다른 측면은 (a) 대상체가 CYP3A4 또는 CYP3A5 억제제 또는 유발인자로 치료 받았는지의 여부를 측정; (b) 이어서, 대상체가 CYP3A4 또는 CYP3A5 억제제 또는 유발인자로 치료 받지 않은 경우, 대상체에게 유효량의 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 투여; 및 (c) 부작용에 대해서 대상체를 모니터링함에 의해, 종양의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 방법은 CYP3A4 또는 CYP3A5 억제제 또는 유발인자로 치료 또는 부작용이 측정되는 경우 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 투여를 조절함을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 대상체는 CYP3A4 또는 CYP3A5 억제제로 치료 받는다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 CYP3A4 또는 CYP3A5 유발인자로 치료 받는다.
조절 치료 (modifying treatment)는, 예를 들어, CYP3A4 또는 CYP3A5 억제제 또는 유발인자의 투여량을 감소 또는 증가시킴, 또는 RX-5902의 투여량을 감소 또는 증가시킴을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조절은 하기 중 하나 이상을 포함한다: CYP3A4 또는 CYP3A5 억제제의 투여량을 감소시킴, 대상체가 CYP3A4 또는 CYP3A5 억제제를 사용한 치료를 받은 경우, RX-5902의 투여량을 증가시킴, 및 대상체가 CYP3A4 또는 CYP3A5 유발인자로 치료 받은 경우, RX-5902의 투여량을 감소시킴.
일 실시형태에서, CYP3A4 또는 CYP3A5 억제제 또는 유발인자는 바르비투레이트, 보젠탄, 카르바마제핀, 에파비렌즈, 에트라비린, 모다피닐, 나프실린, 페니토인, 리팜핀, St. John's Wort, 글루코코르티코이드, 네비라핀 (nevirapine), 옥스카르바제핀, 페노바르비탈, 피오글리타존, 리파부틴, 트로글리타존 및 자몽 쥬스이다. 또 다른 실시형태에서, CYP3A4 또는 CYP3A5 억제제 또는 유발인자는 자몽 쥬스이다. 또 다른 실시형태에서, CYP3A4 또는 CYP3A5 억제제 또는 유발인자는 St. John's Wort이다.
본 발명의 또 다른 측면은 하기에 의한 종양의 치료를 필요로 하는 대상체에서 종양의 치료 방법을 제공한다:
(a) 대상체로부터 종양의 샘플을 수집;
(b) Y593 인산화된 p68를 발현하는지의 여부를 측정; 및
(c) 이어서, 종양이 Y593 인산화된 p68을 발현하는 경우, 대상체에게 유효량의 화학식 (I)의 화합물을 투여.
본원에 기재된 방법의 추가적인 실시형태가 하기에 기재된다.
일 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 주당 5 내지 7일로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 4주 연속 또는 3주 연속으로 주당 5 내지 7일로 투여되며, 이어서 1주 동안은 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 투여되지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 최대 12 투여 주기로 투여되며, 여기서, 각 투여 주기는 3주 연속 치료에 이어서 1주간 휴식하거나, 또는 4주 연속 치료로 이루어진다.
또 다른 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 고체 경구 투여형으로 제형화된다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 정제이다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 캡슐제이다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 나노입자를 포함하는 정제 또는 캡슐제이다.
또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형의 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은, 대상체게 적어도 약 8시간 동안 음식을 금한 후 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 투여 후 적어도 3시간 동안 음식을 금한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형의 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 음식과 함께 투여된다.
또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 1 내지 6시간의 Tmax를 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 2 내지 6시간의 Tmax를 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 2시간의 Tmax를 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 3시간의 Tmax를 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 4시간의 Tmax를 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 5시간의 Tmax를 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 6시간의 Tmax를 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 90-1,200 ng/mL의 Cmax를 제공한다. 일 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 200-1200 ng/mL의 Cmax를 제공할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 200-800 ng/mL의 Cmax를 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 300-700 ng/mL의 Cmax를 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 200-300 ng/mL의 Cmax를 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 300-400 ng/mL의 Cmax를 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 400-500 ng/mL의 Cmax를 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 500-600 ng/mL의 Cmax를 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 600-700 ng/mL의 Cmax를 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 700-800 ng/mL의 Cmax를 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 800-15,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)를 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 2,000-15,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)를 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 2,000-8,500 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 2,000-10,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)를 제공한다. 일 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 2,500-9,500 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다. 일 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 2,500-9,300 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 3,000-7,500 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 3,500-7,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 3,000-5,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)를 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 4,000-6,500 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 4,500-6,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 2,000-3,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 3,000-4,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 4,000-5,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 5,000-6,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 6,000-7,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 7,000-8,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 8,000-9,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 9,000-10,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 10,000-11,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 11,000-12,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 12,000-13,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 13,000-14,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 15,000-16,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 4,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 4,500 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 5,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 5,500 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 6,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 6,500 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 90-1100 ng/mL의 Cmax 및 약 800-15,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 200-1,200 ng/mL의 Cmax 및 약 2,500-9,500 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 200-1,200 ng/mL의 Cmax 및 약 2,500-9,300 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 200-800 ng/mL의 Cmax 및 약 2,000-15,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 200-300 ng/mL의 Cmax 및 약 2,000-4,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 300-400 ng/mL의 Cmax 및 약 4,000-7,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 400-500 ng/mL의 Cmax 및 약 5,000-6,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 600-700 ng/mL의 Cmax 및 약 14,000-15,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 단일 투여 후 약 700-800 ng/mL의 Cmax 및 약 10,000-11,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 주당 1 내지 7일로 1주간 투여 후 약 1,000-70,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-168 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 주당 3 내지 7일로 1주간 투여 후 약 10,000-70,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-168 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 주당 3 내지 7일로 1주간 투여 후 약 20,000-60,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-168 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 주당 5 내지 7일로 1주간 투여 후 약 20,000-70,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-168 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 주당 5 내지 7일로 1주간 투여 후 약 30,000-60,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-168 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 주당 1일로 1주간 투여 후 약 4,000-10,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-168 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 주당 1일로 1주간 투여 후 약 6,000-8,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-168 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 주당 1일로 1주간 투여 후 약 6,500-7,500 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-168 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 주당 1일로 1주간 투여 후 약 7,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-168 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 주당 3일로 1주간 투여 후 약 10,000-35,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-168 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 주당 3일로 1주간 투여 후 약 15,000-30,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-168 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 주당 3일로 1주간 투여 후 약 20,000-25,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-168 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 주당 5일로 1주간 투여 후 약 20,000-60,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-168 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 주당 5일로 1주간 투여 후 약 25,000-55,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-168 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 주당 5일로 1주간 투여 후 약 30,000-50,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-168 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 주당 7일로 1주간 투여 후 약 30,000-75,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-168 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 주당 7일로 1주간 투여 후 약 35,000-70,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-168 시간)을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 고체 경구 투여형은 주당 7일로 1주간 투여 후 약 40,000-65,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-168 시간)을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 주당 1 내지 7일로 약 100-1,200 mg/일, 최대 약 3,000 mg/주의 투여량으로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 1 내지 7일로 약 100-1,200 mg/일, 최대 약 2,800 mg/주이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 1 내지 7일로 약 100-1,200 mg/일, 최대 약 2,000 mg/주이다. 또 다른 실시형태에서, 투여랑은 주당 1 내지 7일로 약 100-600 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 3 내지 7일로 약 100-600 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 5 내지 7일로 약 100-600 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 3일로 약 100-600 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 4일로 약 100-600 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 5일로 약 100-600 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 6일로 약 100-600 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 7일로 약 100-600 mg/일이다.
또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 1 내지 7일로 약 200-500 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 3 내지 7일로 약 200-500 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 5 내지 7일로 약 200-500 mg/일 5-7이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 3일로 약 200-500 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 4일로 약 200-500 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 5일로 약 200-500 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 6일로 약 200-500 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 7일로 약 200-500 mg/일이다.
또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 1 내지 7일로 약 150-400 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 3 내지 7일로 약 150-400 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 5 내지 7일로 약 150-400 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주닫 3일로 약 150-400 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 4일로 약 150-400 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 5일로 약 150-400 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 6일로 약 150-400 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 7일로 약 150-400 mg/일이다.
또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 1 내지 7일로 약 200 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 3 내지 7일로 약 200 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 5 내지 7일로 약 200 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 3일로 약 200 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 4일로 약 200 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 5일로 약 200 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 6일로 약 200 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 7일로 약 200 mg/일이다.
또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 1 내지 7일로 약 250 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 3 내지 7일로 약 250 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 5 내지 7일로 약 250 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 3일로 약 250 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 4일로 약 250 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 5일로 약 250 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 6일로 약 250 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 7일로 약 250 mg/일이다.
또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 1 내지 7일로 약 300 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 3 내지 7일로 약 300 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 5 내지 7일로 약 300 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 3일로 약 300 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 4일로 약 300 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 5일로 약 300 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 6일로 약 300 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 7일로 약 300 mg/일이다.
또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 1 내지 7일로 약 350 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 3 내지 7일로 약 350 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 5 내지 7일로 약 350 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 3일로 약 350 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 4일로 약 350 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 5일로 약 350 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 6일로 약 350 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 7일로 약 350 mg/일이다.
또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 1 내지 7일로 약 400 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 3 내지 7일로 약 400 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 5 내지 7일로 약 400 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 3일로 약 400 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 4일로 약 400 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 5일로 약 400 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 6일로 약 400 mg/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 주당 7일로 약 400 mg/일이다.
1일 투여량은 약 60-80 kg의 체중 또는 몸무게를 갖는 성인 인간에 기반한다. 따라서, 약 100-1,200 mg/일의 범위에 대한 투여량은 약 1-20 mg/kg/일 내지 최대 약 50 mg/kg/주 일 수 있다. 대상체의 체중에 기반한 추가적인 투여량은 이러한 값으로부터 용이하게 계산될 수 있다. 유가사게는, 당업자는 인간 투여량에 대해 공지된 상관 관계에 기반하여 다른 종에 대한 투여량을 계산할 수 있을 것이다.
총 1일 투여량은 하나 이상의 투여량으로 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 경구 투여 형은 1일 1회로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 경구 투여형은 1일 2회로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 경구 투여형은 1일 3회로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 경구 투여형은 1일 4회로 투여된다.
일 실시형태에서, 경구 투여형은 최대 약 12,000 mg/월의 투여량으로 투여된다. 총 1달 투여량은 3주 동안 주당 1 내지 7일로 투여되고 이어서 1주간 휴식하거나, 휴식 없이 4주 동안 투여될 수 있다. 치료 각 주에 대해서, 경구 투여형은 주당 1 내지 7일로 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 경구 투여형은 3주 동안 투여되고 이어서 1주 동안 휴식한다. 또 다른 실시형태에서, 경구 투여형은 3주 동안 주당 3 내지 7일로 투여되고 이어서 1주간 휴식한다. 또 다른 실시형태에서, 경구 투여형은 3주 동안 주당 5 내지 7일로 투여되고 이어서 1주 동안 휴식한다. 또 다른 실시형태에서, 경구 투여형은 3주 동안 매일 투여되고 1주 동안 휴식한다. 또 다른 실시형태에서, 경구 투여형은 28일 동안 매일 투여된다. 각각의 투여 주기는 3주 치료에 이어서 1주 휴식하거나, 4주 연속 치료로 이루어진다. 투여 주기는 당업자에 의해 결정된 바와 같이 필요에 따라 반복될 수 있다. 일 실시형태에서, 경구 투여형은 최대 12 투여 주기 동안 투여된다. 일 실시형태에서, 경구 투여형은 최대 6 투여 주기 동안 투여된다.
임의의 실시형태에서, 종양은 위장관 (gastrointestinal), 비뇨생식기, 피부, 결장직장 (결장 또는 직장), 난소, 폐, 유방, 췌장, 위 및 신장 암 중에서 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 종양은 위장관암이다. 일부 실시형태에서, 종양은 비뇨생식기 암이다. 또 다른 실시형태에서, 종양은 피부암이다. 또 다른 실시형태에서, 종양은 흑색종이다. 또 다른 실시형태에서, 종양은 결장암이다. 또 다른 실시형태에서, 종양은 직장암이다. 또 다른 실시형태에서, 종양은 K-Ras 돌연변이 결장암이다. 또 다른 실시형태에서, 종양은 난소암이다. 또 다른 실시형태에서, 종양은 백금-저향성 또는 -불응성 (예: 시스플라틴- 또는 카르보플라틴-저항성) 난소암이다. 또 다른 실시형태에서, 종양은 폐암이다. 또 다른 실시형태에서, 종양은 비-소세포 폐암이다. 또 다른 실시형태에서, 종양은 유방암이다. 또 다른 실시형태에서, 종양은 삼중-음성 (TN) 유방암이다. 또 다른 실시형태에서, 종양은 전이성 유방암이다. 또 다른 실시형태에서, 종양은 췌장암이다. 또 다른 실시형태에서, 종양은 위암이다.
또 다른 실시형태에서, 대상체는 포유동물이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 인간이다.
4.3 Y593 인산화된 p68의 β-카테닌 의존성 ATP아제 활성의 억제 방법
본 발명의 또 다른 측면은 Y593 인산화된 p68의 β-카테닌 의존성 ATP아제 활성의 억제를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하는 것을 포함하는, Y593 인산화된 p68의 β-카테닌 의존성 ATP아제 활성의 억제 방법을 제공한다.
4.4 치료 효능의 예측 방법
본 발명의 또 다른 측면은 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 사용하여 치료 효능의 예측을 필요로 하는 대상체에서 이의 예측 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기를 포함한다:
(a) 대상체로부터 종양의 샘플을 수집; 및
(b) 종양이 Y593 인산화된 p68을 발현하는지의 여부를 측정.
일 실시형태에서, 상기 방법은 또한 종양이 Y593 인산화된 p68을 발현하는 경우, 대상체에게 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 방법은 또한 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 Y593 인산화된 p68의 β-카테닌 의존성 ATP아제 활성을 억제하는지의 여부를 측정함을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 방법은 Y593 인산화된 p68의 β-카테닌 의존성 ATP아제 활성의 억제가 측정된 경우, 대상체에게 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 방법은 또한 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 Y593 인산화된 p68의 RNA-의존성 ATP아제 활성을 억제하는지의 여부를 측정함을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 방법은 RNA-의존성 ATP아제 활성이 측정되지 않은 경우에만, 대상체에게 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 방법은 또한 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 β-카테닌의 종양 세포 핵으로의 전좌를 억제하는지의 여부를 측정함을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 방법은 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 β-카테닌의 세포내 수준을 감소시키는지의 여부를 측정함을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 방법은 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 β-카테닌에 의해 조절되는 하나 이상의 유전자의 발현을 억제하는지의 여부를 측정함을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 방법은 또한 β-카테닌에 의해 조절되는 하나 이상의 유전자의 발현 억제가 측정되는 경우에만, 대상체에게 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 방법은 또한 β-카테닌-TCF-4 매개된 전사 활성의 억제가 측정되는 경우에만, 대상체에게 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 방법은 또한 Wnt 신호전달 활성의 억제가 측정되는 경우에만, 대상체에게 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 하나 이상의 유전자는 사이클린 D1, c-Myc, Axin2, Surviv1, 및 p-c-Jun 중에서 선택된다.
일 실시형태에서, 대상체는 포유동물이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 인간이다.
임의의 실시형태에서, 종양은 위장관, 비뇨생식기, 피부, 결장직장 (결장 또는 직장), 난소, 폐, 유방, 췌장, 위 및 신장 암 중에서 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 종양은 위장관암이다. 일부 실시형태에서, 종양은 비뇨생식기암이다. 또 다른 실시형태에서, 종양은 피부암이다. 또 다른 실시형태에서, 종양은 흑색종이다. 또 다른 실시형태에서, 종양은 결장직장암이다. 또 다른 실시형태에서, 종양은 결장암이다. 또 다른 실시형태에서, 종양은 직장암이다. 또 다른 실시형태에서, 종양은 K-Ras 돌연변이 결장암이다. 또 다른 실시형태에서, 종양은 난소암이다. 또 다른 실시형태에서, 종양은 백금-저항성 또는 -불응성 (예: 시스플라틴- 또는 카르보플라딘-저항성) 난소암이다. 또 다른 실시형태에서, 종양은 폐암이다. 또 다른 실시형태에서, 종양은 비-소세포 폐암이다. 또 다른 실시형태에서, 종양은 유방암이다. 또 다른 실시형태에서, 종양은 삼중-음성 (TN) 유방암이다. 또 다른 실시형태에서, 종양은 전이성 유방암이다. 또 다른 실시형태에서, 종양은 췌장암이다. 또 다른 실시형태에서, 종양은 위암이다. 또 다른 실시형태에서, 종양은 신장암이다.
4.5 치료 효능 시험을 위한 키트
본 발명의 또 다른 측면은 종양을 치료하는데 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 잠재적 효능을 시험하기 위한 키트를 제공하며, 여기서, 상기 키트는 종양이 Y593 인산화된 p68을 발현하는지의 여부를 측정하는 분석을 포함한다.
일 실시형태에서, 키트는 또한 Y593 인산화된 p68의 β-카테닌 의존성 ATP아제 활성의 억제를 검출하는 분석을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 키트는 β-카테닌의 세포내 수준 (예: 시토졸 및 핵 수준)을 검출하는 분석을 추가로 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 키트는 β-카테닌에 의해 조절되는 하나 이상의 유전자의 발현의 억제를 검출하는 분석을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 하나 이상의 유전자는 사이클린 D1, c-Myc 및 p-c-Jun 중에서 선택된다.
4.6 약학적 조성물
본원에 제공된 임의의 방법 및 키트에서, 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 약학적 조성물 내에 있을 수 있다. 이러한 약학적 조성물은 임의의 적절한 단일 투여형으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 약학적 조성물은 고체 또는 액체 형태로 투여하기 위하여 제형화될 수 있으며, 하기에 적응된 것을 포함한다: (1) 경구 투여, 예를 들어, 음약 (drench), 정제 (예컨대, 구강, 설하 및 전신 흡수를 목적으로 하는 것, 과-캡슐화 정제 (over-encapsulation tablet) 포함), 캡슐제 (예컨대, 경질, 연질, 건조-중전된, 액체-충전된, 젤라틴, 비-젤라틴 또는 과-캡슐화 캡슐제), 당의정, 볼루스 (bolus), 분말, 사쉐 (sachet), 과립제, 페이스트, 마우스 스프레이, 구내정, 로젠지 (lozenge), 펠릿, 시럽제, 현탁액, 엘릭시르, 액제, 리포솜, 에멀전 및 마이크로에멀젼; 또는 (2) 비경구 투여, 예를 들어, 피하, 근육내, 정맥내 또는 경막외 주사, 예컨대, 멸균 용액 또는 현탁액. 추가적으로, 약학적 조성물은 즉시, 지속된, 연장된, 지연된 또는 조절된 방출을 위하여 제형화될 수 있다.
일 실시형태에서, 약학적 조성물은 경구 투여를 위하여 제형화된다. 또 다른 실시형태에서, 약학적 조성물은 고체 경구 투여형이다. 또 다른 실시형태에서, 약학적 조성물은 본원에 기재된 바와 같이 Tmax, Cmax, AUC0-t 또는 이의 조합을 제공하는 고체 경구 투여형이다 (섹션 4.2 참조). 또 다른 실시형태에서, 약학적 조성물은 정제 또는 캡슐제이다. 또 다른 실시형태에서, 약학적 조성물은 정제이다. 또 다른 실시형태에서, 약학적 조성물은 캡슐제이다. 또 다른 실시형태에서, 정제 또는 캡슐제는 즉시 방출을 위하여 제형화된다. 또 다른 실시형태에서, 정제 또는 캡슐제는 지속, 연장된, 지연된 또는 조절된 방출을 위하여 제형화된다.
또 다른 실시형태에서, 정제 또는 캡슐제는 또한 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 담체는 약학적 조성물의 투여 또는 다른 전달을 촉진, 보조 또는 돕는 의도된 목적을 갖는 약학적 조성물과 함께 투여될수 있고/있거나 약학적 조성물의 생체이용률을 개선시키는 임의의 물질을 포함한다. 담체는 약학적 조성물의 투여를 보조하기 위하여 이와 함께 배합될 수 있는 임의의 액체, 고체, 반고체, 젤 에어로졸 또는 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 담체는 결합제, 예컨대, 에틸 셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 미결정 셀룰로오스, 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대, 전분, 락토오스 또는 덱스트린; 붕해제, 예컨대, 알긴산, 나트륨 알기네이트, 프리모겔 (Primogel), 및 옥수수 전분; 윤활제, 예컨대, 스테아린산 마그네슘 또는 스테로텍스 (Sterotex); 활공제 (glidants), 예컨대, 콜로이드성 이산화규소; 감미제, 예컨대, 슈크로스 또는 사카린, 착향료, 예컨대, 페퍼민트, 살리신산 메틸 또는 오렌지 향료, 또는 착색제를 추가로 포함할 수 있다. 담체의 추가의 예로는 폴리에틸렌 글리콜, 사이클로덱스트린, 오일 또는 캡슐제로 제형화될 수 있는 임의의 다른 유사한 액체 담체를 포함할 수 있다. 적절한 담체의 예로는 희석제, 보조제, 부형제, 물, 지질성 제형 및 오일, 예컨대, 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 오일을 포함할 수 있다. 적절한 부형제로는 수-불용성 계면활성제, 수용성 계면활성제 및 친수성 공용매를 포함할 수 있다. 적절한 오일로는 트리, 디 또는 모노글리세리드를 포함할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, RX-5902의 나노입자는 현탁액, 정제, 캡슐제 또는 다른 투여형, 예컨대, 미국 특허 공개 제US20150004234호 (2015.01.01에 공개됨)에 기재된 바와 같은 다른 투여형으로 제조되고 제형화될 수 있다. 일 실시형태에서, 나노입자는 약 1,000 nm 미만의 중간 입자 크기 (D50)를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 나노입자는 약 500 nm 미만의 중간 입자 크기 (D50)을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, RX-5902의 나노입자는 현탁액으로 제형화된다. 또 다른 실시형태에서, 현탁액은 건조, 예컨대, 동결건조되어 분말을 형성한다. 또 다른 실시형태에서, 분말은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께 배합된다. 또 다른 실시형태에서, 분말은 캡슐제로 캡슐화된다.
캡슐제의 조성 및 제조는 당업계에 잘 알려져있다. 예를 들어, 캡슐제는 젤라틴 (예: A형, B형), 카라기난 (예: 카파, 이오타, 람다) 및/또는 변성된 셀룰로오스 (예: 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스 아세테이트 석시네이트, 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스 프탈레이트, 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트), 및 임의로 하나 이상의 부형제, 예컨대, 오일 (예: 어유, 올리브유, 옥수수유, 대두유, 코코넛유, 트리-, 디- 및 모노글리세리드), 가소제 (예: 글리세롤, 글리세린, 소르비톨, 폴리에틸렌 글리콜, 시트르산, 시트르산 에스테르, 예컨대, 트리에틸시트레이트, 다가 알콜), 공-용매 (예: 트리아세틴, 프로필렌 카르보네이트, 에틸 락테이트, 프로필렌 글리콜, 올레산, 디메틸이소소르비드, 스테아릴 알콜, 세틸 알콜, 세토스테아릴 알콜, 글리세릴 베헤네이트, 글리세릴 팔미토스테아레이트), 계면활성제, 완충제, 윤활제, 보습제, 방부제, 착색제 및 향료로부터 제조될 수 있다. 캡슐제는 경질 또는 연질일 수 있다. 경질 캡슐의 예로는 Coni-Snap®, DRcapsTM, OceanCaps®, Pearlcaps®, Plantcaps®, DUOCAPTM, Vcaps® 및 Vcaps® 뿐만 아니라 Capsugel®로부터 구매 가능한 캡슐제를 포함한다. 경질 캡슐제는, 예를 들어, 2개의 끼워넣는 캡슐 반쪽을 형성하고, 그 중 1개의 반쪽을 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 충전하고, 캡슐 반쪽을 함께 밀봉함으로써 제조될 수 있다. 충전제는 임의의 적절한 형태, 예컨대, 건조 분말, 과립제, 현탁액 또는 액제일 수 있다. 연질 캡슐제의 예로는, 연질 젤라틴 (소프트겔, 또는 소프트 엘라스틱으로도 불림), 예컨대, SGcaps®를 포함한다. 연질 캡슐제는, 예를 들어, 회전 다이 (rotary die), 플레이트, 왕복 다이 (reciprocating die) 또는 Accogel® 기기법으로 제조될 수 있다. 일 실시형태에서, 캡슐제는 액체-충전된 경질 캡슐제 또는 연질-젤라틴 캡슐제일 수 있다.
정제는 임의로 하나 이상의 보조 성분과 함께 압축 또는 몰딩 (molding)함으로써 제조될 수 있다. 압축된 정제는 적절한 기기 내에서 임의로 결합제, 윤활제, 불활성 희석제, 방부제, 계면-활성 또는 분사제와 함께 혼합된, 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 자유-유동성 형태, 예컨대, 분말 또는 과립의 형태로 압축함으로써 제조될 수 있다. 몰딩된 정제는 적절한 기기 내에서 불활성 액체 희석제로 적셔진 (moistened) 분말 화합물의 혼합물을 몰딩시킴으로써 제조될 수 있다. 정제는 임의로 코팅되거나 덮혀질 (scored) 수 있고, 지속된, 연장된, 지연된 또는 조절된 방출을 위하여 제형화될 수 있다. 이러한 지속된, 연장된, 지연된 또는 조절된 방출 조성물을 제형화하는 방법은 당업계에 공지되며, 제한 없이 미국 특허 제4,369,174호, 제4,842,866호를 비롯한 발행된 미국 특허, 및 본원에 인용된 참조 문헌에 기재된다. 코팅, 예를 들어, 장용성 코팅이 화합물의 장으로의 전달을 위하여 사용될 수 있다 [참조: U.S. Pat. Nos. 6,638,534, 5,217,720, 6,569,457 및 본원에 인용된 참조 문헌]. 정제 이외에, 지속된, 연장된, 지연된 또는 조절된 방출을 제공하기 위하여 다른 투여형, 예컨대, 캡슐제, 과립제 및 젤-캡이 제형화될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 약학적 조성물은 비경구 투여를 위하여 제형화된다. 비경구 투여에 적절한 약학적 조성물의 예는, 이들 각각이, 예를 들어, 의도된 수용자의 혈액과 등장성이 되게 하는 항-산화제, 완충제, 정균제 및/또는 용질을 함유하는 수성 멸균 주사액 및 비-수성 멸균 주사액; 이들 각각이, 예를 들어, 현탁제 및/또는 증점제를 함유하는 수성 멸균 현탁액 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다. 제형은 단일-용량 또는 다중-용량 용기, 예를 들어, 밀봉된 앰플 또는 바이알 내에 존재할 수 있고, 사용 직전 물과 같은 멸균 액체 담체의 첨가만을 필요로 하는 냉동 건조된 (동결건조된) 조건 중에 저장될 수 있다. 일 실시형태에서, 약학적 조성물은 정맥내 투여를 위하여 제형화된다.
일 실시형태에서, 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함한다. 약학적으로 허용가능한 부형제는, 그 자체가 치료제가 아니라, 치료제를 환자에게 전달하기 위한 담체, 희석제, 보조제, 결합제 및/또는 비히클로서 사용되거나, 또는 이의 취급 또는 저장 특성을 개선하기 위하여 약학적 조성물에 첨가되거나, 또는 투여를 위하여 화합물 또는 약학적 조성물의 단일 투여형으로의 형성을 허용하거나 촉진시키기 위하여 첨가되는, 임의의 물질일 수 있다. 약학적으로 허용가능한 부형체는 당해 약학적 분야에 공지되며, 예를 들어, 문헌 (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed. (Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2005)에 기재된다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 약학적으로 허용가능한 부형제는 다양한 기능을 제공할 수 있으며, 습윤제, 완충제, 현탁제, 윤활제, 유화제, 붕해제, 흡수제, 방부제, 계면활성제, 착색제, 착향료 및 감미제로 기재될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 부형제의 예로는, 제한 없이 하기를 포함한다: (1) 당, 예컨대, 락토오스, 글루코스 및 슈크로스; (2) 전분, 예컨대, 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로오스 및 이의 유도체, 예컨대, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 및 히드록시프로필셀룰로오스; (4) 가루형 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 탈크; (8) 부형제, 예컨대, 코코아 버터 및 좌제 왁스 (suppository wax); (9) 오일, 예컨대, 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; (10) 글리콜, 예컨대, 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예컨대, 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; (12) 에스테르, 예컨대, 에틸 올레이트 및 에틸 라우레이트; (13) 한천; (14) 완충제, 예컨대, 수산화 마그네슘 및 수산화 알루미늄; (15) 알긴산; (16) 주사용 증류수 (pyrogen-free water); (17) 등장성 염수; (18) 링거액; (19) 에틸 알콜; (20) pH 완충액; (21) 폴리에스테르, 폴리카르보네이트 및/또는 다가무수물; 및 (22) 약학적 조성물에 사용되는 기타 비-독성 상용 물질.
일 실시형태에서, 약학적 조성물은 적어도 하나의 추가의 활성제를 포함할 수 있다. 활성제는 항신생물제, 화학치료제, 세포독성제, 면역조절제, 방사선치료제 또는 세포자멸사 유도, 세포자멸사 하도록 세포를 민감화시킴, 단백질 키나아제 조절 또는 신생물, 종양 또는 암 치료가 가능한 임의의 작용제일 수 있다. 활성제의 예로는 (1) 항대사물질, 예컨대, 시타라빈, 플루다라빈, 5-플루오로-2'-데옥시우리딘, 겜시타빈, 4-아미노-1-((1S,4R,5S)-2-플루오로-4,5-디히드록시-3-히드록시메틸-사이클로펜트-2-에닐)-1H-피리미딘-2-온 (RX-3117), 히드록시우레아 또는 메토트렉세이트; (2) DNA-단편화제, 예컨대, 블레오마이신, (3) DNA-가교제, 예컨대, 클로람부실, 시스플라틴, 사이클로포스파미드 및 질소 머스타드; (4) 중격제, 예컨대, 아드리아마아신(독소루비신) 및 미토트란트론; (5) 단백질 합성 억제제, 예컨대, L-아스파라기나아제, 사이클로헥시미드, 퓨로마이신 및 디프테리아 독신; (6) 독성 국소이성화효소 II, 예컨대, 에토포시드 (VP-16) 및 테니포시드; (8) 미세소관-유도제, 예컨대, 콜시미드, 콜히친, 파클리탁셀, 빈블라스틴 및 빈크리스틴; (9) 키나아제 억제제, 예컨대, 플라보피리돌, 스타우로스포린 및 7-히드록시스타우로스포린; (10) 효소 폴리 ADP 리보오스 폴리머라아제 (PARP) 억제제, 예컨대, 올라파립 (olaparib), 벨리파립 (veliparib), 루카파립 (rucaparib), 니라파립 (rucaparib) 및 탈라조파립 (talazoparib); (11) 폴리페놀, 예컨대, 케르세틴, 레스베라트롤, 피세타놀, 에피갈로카테킨 갈레이트, 테아플라빈, 플라바놀, 프로사이아니딘, 베툴린산 및 이의 유도체; (12) 호르몬, 예컨대, 글루코코르티코이드 및 페렌티나이드; (13) 호르몬 길항제, 예컨대, 타목시펜, 피나스테리드 및 LHRH 길항제; (14) 사멸 수용체 작용제, 예컨대, 종양 괴사 인자 α (TNF-α), 종양 괴사 인자 β (TNF-β), Lβ (림프독소-β), TRAIL (Apo2L, DR4 리간드), CD95 (Fas, APO-1) 리간드, TRAM (DR3, Apo-3) 리간드, DR6 리간드 및 단편; (15) 면역 체크포인트 억제제; (16) 항-세포예정사 1 (PD-1) 수용체 항체 또는 항-세포예정사 리간드 1 (PD-L1) 항체; (17) 면역 체크포인트 억제제 (CTLA-4); 및 이의 유도체.
또 다른 실시형태에서, 약학적 조성물 내 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 중량으로 약 0.1% 내지 약 5%이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 양은 중량으로 약 0.5% 내지 약 2.5%이다.
4.7 투여 방법
본원에 제공된 임의의 방법에서, 화합물 또는 약학적 조성물의 투여는 경구 또는 비경구와 같이 당업계에 공지된 임의의 수용된 방식을 통한 것일 수 있다. 용어 "비경구적으로"는 제한 없이, 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 척수내, 심실내, 흉골내, 두개내, 골내 주사 또는 주입 기술에 의한 것을 포함한다. 일 실시형태에서, 화합물 또는 약학적 조성물은 경구로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 화합물 또는 약학적 조성물은 비경구로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 화합물 또는 약학적 조성물은 정맥내로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 화합물 또는 약학적 조성물은 종양내로 투여된다.
일 실시형태에서, 화합물 또는 약학적 조성물은 섹션 4.2에서와 같이 본원에 기재된 용량 또는 투여량으로 경구 투여된다.
투여 수준은 정맥내 투여를 위하여 조정될 수 있다. 이러한 경우, 화합물 또는 약학적 조성물은 약 0.01 ㎍/kg/분 내지 약 100 ㎍/kg/분의 양으로 투여될 수 있다.
4.8 병용 요법
본원에 제공된 종양의 임의의 치료 또는 예방 방법에서, 상기 방법은 또한 대상체에게 하나 이상의 추가의 항종양제 또는 방사선을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 방법은 대상체에게 방사선을 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 방법은 대상체에게 하나 이상의 추가의 항종양제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
추가의 항종양제 또는 방사선은 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하기 전, 후 또는 투여 동안에 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 추가의 항종양제 또는 방사선은 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하기 전에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 추가의 항종양제 또는 방사선은 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 투여한 후에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 추가의 항종양제 또는 방사선은 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하는 동안에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 추가의 항종양제 및 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 투여를 병행하는 동안 약학적 조성물로 제형화된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항종양제"는 종양의 치료 또는 예방에 유용한 임의의 작용제를 지칭한다. 항종양제의 예로는 섹션 4.6에 기재된 활성제를 포함한다. 일 실시형태에서, 추가의 항종양제는 항대사물질, DNA-단편화제, DNA-가교제, 중격제, 단백질 합성 억제제, 국소이성화효소 I 억제제, 국소이성화효소 II 억제제, 미세소관-유도제, 키나아제 억제제 (예: 티로신 키나아제 억제제), 폴리페놀, 호르몬, 호르몬 길항제, 사멸 수용체 작용제, 효소 폴리 ADP 리보오스 폴리머라아제 (PARP) 억제제, 면역 체크포인트 억제제, 항-세포예정사 1 (PD-1) 수용체 항체 및 항-세포예정사 리간드 1 (PD-L1) 항체 중에서 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 추가의 항종양제는 PD-1 수용체 항체이다. 또 다른 실시형태에서, 추가의 항종양제는 펨브롤리주맙이다. 또 다른 실시형태에서, 추가의 항종양제는 니볼루맙이다. 또 다른 실시형태에서, 추가의 항종양제는 트레멜리무맙 (tremelimumab)이다. 또 다른 실시형태에서, 추가의 항종양제는 이필리누맙 (ipilinumab)이다. 또 다른 실시형태에서, 추가의 항종양제는 펩브롤리주맙 및 트레멜리무맙의 조합이다.
4.9 RX-5902의 제조 공정
미국 특허 제8,314,100호는 중간체 3-아미노-6-플루오로-2-메톡시퀴녹살린 및 에틸 N-(6-플루오로-2-메톡시퀴녹살린-3-일)카르바메이트를 통해, 3단계로 3-아미노-2-클로로-6-플루오로퀴녹살린을 RX-5902로 전환시키는 공정을 개시한다.
반응의 소량 배치 공정 동안, 디메틸화된 불순물 (질량 스펙트럼 데이터에 기반)이 검출되며, 이의 제거를 위하여 정제가 요구된다. 또한, 소량 배치 공정은 중간체가 건조되게 농축되는 것을 필요로 한다. 따라서, 공정은 상업적 규모로 생산하기에는 충분하지 않다. 그러므로, 고정된 기기 내에서 규모를 늘려 효과적인 상업적 생산을 가능하게 하는 개선된 공정을 제공하기 위한 필요성이 존재한다. 예를 들어, 공정은 농축물을 건조하여 제거하고, 일부 할로겐화된 용매를 비-할로겐화된 용매로 대체하고, 소량 배치 제조 공정에서의 화합물 1의 부피 비효율적 재결정화를 증진시킴으로써 개선된다.
하기에서, RX-5902의 소량 배치 생산과 개선된 생산 공정이 상세된다.
4.9.1 1.5kg의 RX-5902 의약품 (drug substance)의 소량 배치 생산
반응식 1. RX-5902의 생산을 위한 소량 배치 합성 공정
반응식 1
Figure pct00002
본 발명은 하기 단계에 의한, 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 상업적 규모로 제조하는 방법을 제공한다:
Figure pct00003
(a) 3-아미노-6-플루오로-2-메톡시퀴녹살린을 염기의 존재하에 유기 용매 중에서 에틸 클로로포르메이트와 반응시켜 혼합물을 형성하는 단계; (b) 상기 혼합물에 에틸 아세테이트를 첨가하면서 증류시켜 현탁액을 형성하는 단계; (c) 상기 현탁액을 여과하여 에틸-N-(6-플루오로-2-메톡시퀴녹살린-3-일) 카르보네이트를 단리하는 단계; 및 (d) 에틸-N-(6-플루오로-2-메톡시퀴녹살린-3-일) 카르보네이트를 제2 염기의 존재하에 제2 유기 용매 중 1-(3,5-디메톡시페닐) 피페라진 히드로클로라이드와 반응시키는 단계.
4-(3,5-디메톡시페닐)-N-(7-플루오로-3-메톡시퀴녹살린-2-일)피페라진-1-카르복스아미드 (RX-5902)에 대해 1.5 kg 규모의 현행 우수 제조 관리기준 (cGMP) 생산을 수행하였다. 초기의 생산으로 1.318 kg의 RX-5902을 산출하였다. 그러나, 방출 시험을 수행한 경우, 규격 (결과: 0.82% vs. 한계 ≤0.50%)에서 벗어난 RRT 0.57의 불분명한 불순물이 관측되었다. 후에, 불순물은 질량 분광분석에 의해 디메틸화된 RX-5902로 여겨지는 것과 상응하는 것으로 확인되었다. 염기 세척 재작업 절차 (base wash rework procedure)가 성공적으로 진행되고 시행되어 결과적으로 1.128 kg의 생성물을 산출했다 (배치 35444A로 지정함).
상기 방법의 실시형태는, (e) 3-아미노-2-클로로-6-플루오로퀴녹살린을 염기의 존재하에 유기 용매 중에서 나트륨 메톡시드와 반응시켜 혼합물을 형성하는 단계; (f) 단계 (e)의 상기 혼합물에 물을 첨가하여 용액을 형성하는 단계; (g) 상기 용액을 약 15 내지 20 ℃의 온도로 냉각시켜 현탁액을 형성하는 단계; 및 (h) 단계 (g)의 상기 현탁액을 여과하여 3-아미노-6-플루오로-2-메톡시퀴녹살린을 단리하는 단계를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 단계 (a)에서의 유기 용매는 디클로로메탄일 수 있다. 일 실시형태에서, 단계 (b)에서의 염기는 피리딘일 수 있다. 일 실시형태에서, 증류 단계 (b)는 대기압하에서 수행될 수 있다. 일 실시형태에서, 단계 (c)는 진공 여과에 의한 것일 수 있다. 일 실시형태에서, 단계 (d)에서의 제2 유기 용매는 테트라히드로푸란일 수 있다. 일 실시형태에서, 단계 (d)에서의 제2 염기는 1,8-디아자비사이클로운데크-7-엔일 수 있다. 일 실시형태에서, 단계는 하나 이상의 고정상 반응기 내에서 수행될 수 있다.
4.9.2 RX-5902의 11 kg의 대규모 합성 생산
본 발명은 대규모 생산을 위해 상업적으로 실행가능한, RX-5902의 개선된 제조 공정을 제공한다. 상기 공정은 제조 비용을 현저히 절감하기 위하여 RX-5902의 소량 배치 제조 공정을 고정된 기기 내에서 상업적 규모로 늘리도록 개선한다. 본 발명의 공정은 농축물을 건조 단계로 제거하고, 일부 할로겐화된 용매를 대체하고, 소량 배치 제조 공정에서의 화합물 1의 부피 비효율적 재결정화를 개선한다.
반응식 2는 RX-5902의 고정상 반응기/대규모 생산을 위한 개선된 공정을 예시한다. 반응식 2에 도시된 바와 같이, 상기 방법의 실시형태는, HPLC로 나타난 바와 같이 반응 완료시까지, 에틸-N-(6-플루오로-2-메톡시퀴녹살린-3-일)카르보네이트 (화합물 3)를 염기의 존재하에 유기 용매 중에서 1-(3,5-디메톡시페닐) 피페라진 히드로클로라이드와 반응시킴으로써 RX-5902를 제조하는 단계를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 유기 용매는 테트라히드로푸란일 수 있다. 일 실시형태에서, 염기는 1,8-디아자비사이클로운데크-7-엔 (DBU)일 수 있다.
방법의 실시형태는 화합물 2를 염기의 존재하에 유기 용매 중에서 에틸 클로로포르메이트와 반응시켜 화합물 3을 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 화합물 2는 에틸 클로로포르메이트가 용액에 서서히 첨가되기 전에, 염기의 존재하에 유기 용매 중에서 용해될 수 있다. 일 실시형태에서, 유기 상은 DI 물로 추출될 수 있으며, 유기 상은 대기압하에 증류되어 유기 용매가 제거될 수 있다. 일 실시형태에서, 증류 공정 동안에 에틸 아세테이트가 첨가될 수 있다. 일 실시형태에서, 고체 형태의 화합물 3은 진공 여과로 수집되고 에틸 아세테이트로 세척되고 건조될 수 있다. 일 실시형태에서, 유기 용매는 디클로로메탄일 수 있다. 일 실시형태에서, 염기는 피리딘일 수 있다.
방법의 실시형태는 화합물 1을 완결될 때까지 테트라히드로푸란 중 나트륨 메톡시드를 사용하여 3-아미노-6-플루오로-2-메톡시퀴녹살린 (화합물 2)으로 전환시키는 단계를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 물이 용액 혼합물에 첨가될 수 있다. 일 실시형태에서, 용액은 약 15 내지 20 ℃의 온도로 냉각될 수 있다. 일 실시형태에서, 반응 혼합물은 상압 증류 (atmospheric distillation)를 통해 농축되어 테트라히드로푸란이 제거되고 부피가 절반 미만으로 감소될 수 있다. 일 실시형태에서, 화합물 2는 물로 세척되고 여과로 수집될 수 있다.
방법의 실시형태는 출발 물질로 1,2-디아미노-4-플루오르벤젠을 사용하는 RX-5902의 6단계 공정을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 공정은 RX-5902의 cGMP 생산에 적합한 대규모 공정을 위하여 고정된 기기를 활용한다.
방법의 실시형태는 1,2-디아미노-4-플루오르벤젠을 옥살산과 반응시킴으로써, 1,2-디아미노-4-플루오르벤젠을 6-플루오로-1,4-디히드로퀴녹살린-2,3-디온 (화합물 A)으로 전환시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 화합물 A가 침전되고 진공 여과로 수집될 수 있다.
방법의 실시형태는 완료시까지 화합물 A를 클로로포름 중 과량의 염화티오닐로 환류시킴으로써, 화합물 A를 2,3-디클로로-6-플루오로퀴녹살린 (화합물 B)으로 전환시키는 단계를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 잔여 염화티오닐이 분해될 때까지 반응물을 수산화나트륨으로 퀀칭하고 교반할 수 있다. 일 실시형태에서, 클로로포름은 상압 증류를 통해 증류될 수 있다. 일 실시형태에서, 증류 동안 헵탄이 첨가될 수 있다. 일 실시형태에서, 화합물 B는 여과되고 헵탄으로 세척되고 진공하에 건조될 수 있다. 일 실시형태에서, 여액 (예: 모액)은 진공하에 증류되어 추가의 화합물 B를 회수할 수 있다.
방법의 실시형태는 완료시까지 수산화 암모늄을 사용하여 화합물 B를 3-아미노-2-클로로-6-플루오로퀴녹살린 (화합물 1)으로 전환시키는 단계를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 화합물 1은 반응 혼합물을 따뜻한 온도, 예를 들어, 45±5 ℃의 승온에서 여과함으로써 화합물 1이 정제될 수 있다.
반응식 2
Figure pct00004
특히, 본 발명의 공정 개선은 단계 2, 4 및 5 (각각 화합물 B, 화합물 2 및 화합물 3의 생산을 위한)에서 농축물을 건조하여 제거하고, 화합물 1의 정제에서 부피 효율을 개선하였다. 본 발명은 또한 단계 2, 4 및 5에서의 염소처리된 용매를 비-염소처리된 용매로 대체하였다.
하기 상세된 바와 같이, 건조를 위해 농축되는 것을 막는 절차는 성공적이었다.
단계 2에 대해서, 대부분의 클로로포름이 증류되면서, 헵탄으로 대체되어 여과가능한 현탁액 화합물 B가 생성되었다.
단계 3에 대해서, 화합물 1의 정제가 또한 개선되었다. 구체적으로, 소량 배치 공정을 사용하여 62%의 수율이 달성된 것과 비교하여, 반응 혼합물을 따뜻한 온도 (45±5 ℃)에서 여과함로써 72.6%의 개선된 수율이 달성되었다. 또한, 놀랍게도 목적하지 않은 구조이성질체 (regioisomer)가 허용 수준으로 감소되었다 (표 1 참조).
다양한 배치의 RX-5902의 구조이성질체 불순물 수준
배치 화합물 1
구조이성질체		 화합물 2
구조이성질체		 화합물 3
구조이성질체		 RX-5092
구조이성질체 (7-F)
35444A † 0.9% 0.7% NT* 0.6%
35686A † 0.7% 0.35% NT* 0.3%
35921A † 1.83% ND** ND** 0.08%
† 배치 35444A 및 35686A을 실시예 13에 하기 기재된 바와 같이 이전의 소량 배치 공정으로 제조하였고, 배치 Batch 35921A을 실시예 14에 하기 기재된 바와 같이 개선된 고정된 반응기/대규모 공정으로 제조하였다.
NT* - 시험되지 않음
ND** - 검출되지 않음
단계 4에 대해서, 화합물 2의 제조에 있어서 2가지 개선점이 실현되었다. 먼저, 농축액을 건조 단계로 제거하는 것은 반응물을 물로 퀀칭히고, 이어서 테트라히드로푸란을 증류시키고, 이후 생성물을 여과함으로써 달성되었다. 또한, 이러한 새로운 작업으로 할로겐화된 용매 또한 감소되었다. 상기 작업은 생성 농축물 중 디클로로메탄을 사용하는 것을 피한다.
단계 5에 대해서, 건조 단계에 대한 농축물은 디클로로메탄을 상압 증류하고, 에틸 아세테이트로 이를 인사이투 대체함으로써 제거되었다. 용매 교환은 고순도 및 더 우수한 수율을 갖는 목적하는 생성물을 단리하기 위하여 또 다른 용이하게 여과가능한 슬러리를 제공하였다.
4.10 RX-5902의 나노제형
본 발명은 개선된 경구 생체이용률을 갖는 RX-5902의 신규 나노제형 및 RX-5902 나노제형의 제조 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 현탁액을 제공하기에 충분한 조건하에서 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 입자 크기를 감소시키는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 현탁액은 밀링 공정에 의해 제조될 수 있다. 일 실시형태에서, 밀링 공정은 저에너지 밀링 공정, 예를 들어, 롤러 밀링일 수 있다. 일 실시형태에서, 밀링 공정은 고에너지 밀링 공정, 예를 들어, 고에너지 교반기 밀링일 수 있다. 일 실시형태에서, 밀링 공정은 고에너지 교반기 밀링 또는 롤러 밀링일 수 있다. 일 실시형태에서, 밀링 공정은 고에너지 교반기 밀링일 수 있다. 일 실시형태에서, 현탁액은 약 200 nm 이하의 D50 입자 크기를 가질 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 현탁액을 동결건조시켜 분말을 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 현탁액을 분무 건조시켜 분말을 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
4.10.1 저에너지 밀링 및 동결건조에 의한 RX-5902 나노제형의 재가공
이전 제조로부터의 RX-5902 나노현탁액의 재가공은 비-GLP 사용을 위한 RX-5902의 나노현탁액을 생성하는데 사용될 수 있다. 가공 이전, 나노현탁액이 분석되어 연장된 저장이 활성 약학적 성분 (API), 이경우, RX-5902, 입자의 화학적 또는 물리적 특성에 유해한 영향을 끼치는지의 여부가 측정되었다. 현탁액은 롤러 밀링으로 처리되어 관측된 응집체를 보다 허용가능한 입자-크기 분포로 감소시키고, 이어서 건조 분말을 생성하도록 동결건조되었다.
오래된 (aged) 현탁액의 재가공은, 비가공된 API로부터 밀링되고 즉시 동결건조된 임상 배쓰 (clinical bath)의 것에 필적하는 입자-크기 분포를 갖는 건조 분말을 성공적으로 생성한다. 이전에 제조된 배치는 밀링되어 응집체 없이 보다 더 균일한 입자-크기 분포를 가질 수 있었으며, 이는 재가공된 나노현탁액의 수명이 밀링 효능에 유해한 영향을 미칠 수 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 임상 배치의 제조에 사용되었던 밀링된 물질은 약 200nm의 D90을 갖는 단일 모드의 초미세 분포로 감소되었으나; 재가공된 물질의 D90은 ~800nm의 하한을 가졌다.
동결건조 조건은 또한 건조 분말의 최종 입자-크기 분포에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. -80 ℃ 냉각기를 구비한 동결 건조기를 사용하여 건조되는 연구 및 개발 배치는, 임상 배치 또는 재가공된 배치 보다 더 양호한 입자-크기 분포를 산출하였다. 이 둘 모두는 -53 ℃의 냉각기를 사용하여 건조되었다. 후자인 2개 배치는 또한 연구 물질보다 더 큰 양으로 제조되었고, 이는 동결 시간이 건조 분말 제형 내 응집체의 형성과도 관련된다는 것을 의미할 수 있다.
4.10.2 RX-5902 고에너지 나노 밀링 공정 개발 및 분무 건조 실행가능성
대안적인 기술은 최종 건조된 분말의 생산의 효율성 및 확장성을 향상시키기 위하여, RX-5902 나노현탁액의 밀링 및 건조 모두에 관한 대안적인 기술이 시험되었다. 이전에 제조된 나노현탁액은 대안적으로 고에너지 밀링으로 재가공되고, 동결 건조 또는 분무-건조를 사용하여 건조될 수 있다. 출발 나노현탁액을 제조하기 위하여, 롤러 밀링 대신 고에너지 교반기 밀링이 사용될 수 있다. 건조 분말을 제조하기 위하여 동결건조 대신 분무 건조가 사용될 수 있다. 교반기 밀링은 현탁액 제형에 약간의 조정을 가하여 유사한 나노입자 크기 분포를 생성한다. 관측된 API 분해는 없었다. 분무 건조는 마이크로-크기 범위의 가느다른 입자-크기 분포를 생성하나, API 나노입자에 물리적으로 또는 화학적으로 영향을 미치는 것으로 보이진 않는다.
RX-5902는 눈에띄는 분해 또는 다음의 공정으로 인한 손실 없이, 교반기 밀링 및 동결건조 또는 분무 건조 모두가 가능한 것으로 보인다. 교반기 밀링에 대한 나노현탁액 제조의 전이(transition)에 요구되는 유일한 주요 변화는 출발 제제의 희석이다. 이는, 희석된 교반기-밀링된 물질 내 API의 농도가가 본래의 롤러 밀링 공정으로부터 수득된 최종 농도보다 더 높기 때문에, 건조 분말 생산에 대한 임의의 유해한 효과를 갖는 것으로 예상되지 않는다. 필요한 경우 배지로부터 API를 효과적으로 추출하기 위해서 추가의 희석이 허용되어야 한다.
동결 건조 동안 응집체에 대한 보호를 생성하기 위하여 폴록사머를 첨가함으로써 변형된 10%의 RX-5902를 사용하여 본래의 건조 분말 제형이 개발되었다. 최종 분말을 생성하기 위해 분무 건조를 사용하는 것은 공정의 희석, 분석 및 폴록사머-첨가 단계를 생략시킨다. 분무-건조된 분말의 입자-크기 분포가 동결건조된 물질의 것보다 현저히 큰 반면, 측정치는 나노결정의 크기가 아닌 미소구의 크기를 반영하였으며, 이는 공정에 의해 영향받지 않는 것으로 보인다.
4.10.3 대안적 RX-5902 나노제형 및 공정
연장된 밀링 시간은 1.5kg의 RX-5902 나노제형을 생산하는 동안 거품을 일으켰다. 거품은 생산 동안 서브-배치 (sub-batch) 간헐적 냉각으로 가라앉았다. 연장된 밀링 시간 및 간헐적 냉각은 소규모 배치에서 생산된 바와 같이 소량의 RX-5902 나노제형을 생성하였다.
4.10.4 RX-5902에 대한 밀링 조작
입자 크기 감소가 RX-5902의 생체이용률에 대한 주요 파라미터이기 때문에, 다양한 입자 크기 감소 방법이 활용되며 최적화될 수 있다. 이러한 방법은 미세화 (Mirconization), 기계적 밀링, 초저온 밀링, 습식 밀링법 (Wet Milling method) (교반 및 롤러 밀링), 미세유동화 및 고압 균질화를 포함한다. 습식 밀링법에 이어서 동결건조 또는 분무 건조법으로 고체 형태를 생성할 수 있다.
홀트 용융 압출 (Holt Melt Extrusion), 부형제가 포함된 분무 건조된 분산 (Spray Dried Dispersion) 및 분무 응고 (Spray Congealing)를 비롯한 방법에 의해 제조된 무정형 제형이 또한 사용될 수 있다. 모든 이러한 방법은 개선된 생체이용률을 가질 것으로 예상되는 무정형 형태를 형성할 수 있다.
또한, RX-5902의 지질 제형이 이용될 수 있다. 지질 제형은 RX-5902가 유상 내 미리-가용화된 또는 미리-현탁된 API를 제공하도록 할 수 있다. 지질 기반 제형은 또한 개선된 생체이용률을 가질 것으로 예상된다.
4.11 RX-5902 결정 구조
4.11.1 RX-5902 결정의 XRPD 연구
RX-5902 결정의 X-레이 분말 회절 (XRPD) 분석으로 생성된 주요 피크를 표 2에 나타낸다. 피크 및 다른 파라미터의 전체 목록이 작업예에 제공된다.
RX-5902의 XRPD에서의 주요 피크
Pos.
[°2Th.] 		d-공간
(d-spacing)
[Å] 		Rel. Int. [%]
8.558004 10.33244 92.11
14.346660 6.17385 38.83
15.328680 5.78046 33.92
15.574780 5.68967 79.32
15.850830 5.59121 62.55
16.970760 5.22467 44.44
18.141790 4.88998 67.28
21.479630 4.13705 69.54
21.837050 4.07014 31.41
23.658390 3.76076 66.17
24.417090 3.64560 33.76
24.852430 3.58272 100.00
27.474790 3.24643 93.49
상기 나타난 바와 같이, RX-5902의 결정형 (형태 1로 지정됨)은 8.56, 15.57, 15.85, 18.14, 21.48, 23.66, 24.85 및 27.47에서의 피크로 특징지어지는 특징적 피크 (2 θ°)를 갖는다. 형태 1 RX-5902는 8.56, 14.35, 15.33, 15.57, 15.85, 16.97, 18.14, 21.48, 21.83, 23.66, 24.41, 24.85, 및 27.47에서의 피크 (2 θ°)에 의해 추가로 특징지어질 수 있다. 형태 1 RX-5902의 XRPD는 또한 10.33, 5.69, 5.59, 4.89, 4.14, 3.76, 3.58 및 3.25의 d-공간 (Å)을 갖는 트레이스(trace)로 특징지어진다. 형태 1 RX-5902의 XRPD는 10.33, 6.17, 5.78, 5.69, 5.59, 5.22, 4.89, 4.14, 4.07, 3.76, 3.65, 3.58 및 3.25의 d-공간 (Å)을 갖는 트레이스로 추가로 특징지어진다.
4.11.2 다형체 연구
RX-5902의 배치는 다양한 고체 상태 기술로 특징지어졌다. 공급된 물질은 형태 1로 표시된 바와 같이 결정성 고체였다. 이러한 물질은 습기 노출시 비-흡습성이고 안정하며, 추가 개발에 대해 실행가능한 형태를 나타낸다. RX-5902를 함유하는 제형의 XRPD 분석은 형태 1과 일치된 피크를 나타냈으며, 이는 제형화 공정 동안에 형태 변화가 일어나지 않았다는 것을 시사한다.
결정형 및 무정형 RX-5902를 사용하여 수행된 다형체 스크리닝 실험은 API의 다양한 결정형 형태를 확인하였다. 이들 중 다수는 사실상 결정성이 저조하고, 전체 평가를 위해 재생산하는데 어려움을 겪었다. 수개의 이들 형태의 XRPD 회절도는 유사성을 나타내어, 이들이 구조적으로 관련이 있는 반면, 존재하는 다양한 양의 용매는 이들이 채널 용매화물형 구조 (channel solvate type structure)일 가능성을 제기한다.
다양한 관측된 고체를 재가공함에 있어서의 어려움은 RX-5902의 다형체 형태를 완전히 이해하기는 불가능했다는 것을 의미한다. API가 다양한 형태로 결정화되려는 경향은 형태 1의 확실한 제조를 위하여 엄격한 결정화 프로토콜이 요구될 것이라는 것을 의미한다. 이러한 절차에 적절한 용매를 확인하기 위한 연구는 우수한 후보로서 디에틸 에테르, 2-메틸-1-프로판올, 에탄올 및 MIBK를 제안했다.
5. 실시예
하기 실시예는 설명의 목적을 위하여 제공되며, 개시된 주제의 범위를 제한하려 하는 것은 아니다.
실시예 1: RX-5902에 대한 시험관내 대사 연구
RX-5902의 시험관내 대사에서 특이적인 시토크롬 P450 (CYP450) 이소자임의 관련성을 조사하기 위하여 2개의 시험관내 연구를 수행하였다. 제1 연구에서, 발현된 CYP450 이소자임 (1A2, 2A6, 2B6, 2C8, 2C9, 2C19, 2D6, 3A4 및 3A5)으로 항온처리한 후 RX-5902의 손실을 측정하였다. 30분 간 항온처리한 후, RX-5902의 손실은 결과적으로 CYP 3A4 (87% 손실) 및 3A5 (54% 손실)을 나타냈으나, 다른 CYP 이소자임으로 항온처리한 결과는 거의 손실되지 않았다. 제2 연구에서, CYP450 이소자임-선별적 화학 억제제의 존재하에 풀링된 (pooled) 인간 간 마이크로솜으로 RX-5902를 항온처리하였다. CYP3A4/5-선별적 억제제 (케토코나졸)의 존재하에 RX-5902 대사의 현저한 억제가 관찰되었으나, 다른 이소자임의 억제제의 존재하에서 유의한 억제가 관찰되지 않았다. 종합하면, 이러한 연구는 RX-5902의 CYP450-매개된 대사가, 다른 CYP450 이소자임을 통한 대사이기 보다는, 주로 CYP3A4/5 이소자임으로 인한 것이라는 것을 시사한다.
데이터는, RX-5902 대사 및 노출이 CYP3A4/5 활성을 변경하는 약물과의 약물-약물 상호작용에 특히 민감할 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, CYP3A4/5 억제제와 RX-5902의 동시-투여는 RX-5902의 혈장 농도를 증가시킬 수 있으나, CYP3A4/5 유발인자와의 동시-투여는 RX-5902의 혈장 농도를 감소시킬 수 있다. 따라서, CYP3A4/3A5 억제제를 수여한 대상체는 RX-5902에 대해 과한 약리학적 또는 독성 반응을 가질 수 있고, 또는 CYP3A4 유발인자를 수여한 대상체는 RX-5902 활성이 감소할 수 있다는 가능성이 존재한다.
실시예 2: 인간에서 RX-5902의 약물동태학, 안전성 및 내성 (tolerability)
투여량 연구 (dose-ranging study)에서, 다양한 경구 투여량의 RX-5902의 약물동태학, 안전성 및 내성을 평가하였다. 진행성 또는 전이성 고형 종양을 갖는 대상체에게 RX-5902를 함유하는 캡슐을 주 1회 25-775 mg의 1일량, 주 3회 250-300 mg의 1일량, 주 5회 150-300 mg의 1일량, 또는 주 7회 300-350 mg의 1일량으로 최대 6주 투여 주기 동안 투여하였다. 각각의 주기는 주당 1 내지 5 투여량으로 RX-5902를 3주간 투여함에 이어서 1주간 휴식, 또는 휴식없이 주당 5 내지 7 투여량으로 RX-5902를 4주간 투여함으로 이루어진다. 1명의 대상체를 제외한 모든 대상체는 투여 전 적어도 8시간 동안 음식을 금하였다. 1명의 대상체는 음식을 공급하면서 300 mg RX-5902를 투여받았다. 검증된 LC-MS/MS 분석을 사용하여 48시간 동안 1일 및 15일에서의 혈장 농도를 측정하였고, Phoenix WinNonlin, Version　6.4을 사용하여 비분할 (noncompartmental) 약동학적 파라미터를 계산하였다.
약물동태학 (PK)
단일 투여 후의 예비 PK 데이터를 도 1 (대상체 #1-11에 대한) 및 표 3에 제시한다.
인간 PK 데이터
투여량 대상체 # 횟수 일 음식 C max T max T 1/2 AUC 0-24 AUC 0-48
mg 주당 ng/mL hr Hr hr*ng/mL hr*ng/mL
25 1 1 1 금식 99.1 6 5.8 830 894
50 2 1 1 금식 109 1.5 13.2 1027 1308
100 3 1 1 금식 252 2 27.6 1783 2341
150 4 1 1 금식 226 6 11.5 2689 3280
225 5 1 1 금식 364 4 12.0 3425 4312
300 6 1 1 금식 318 6 14.6 4679 6141
300 7 1 1 금식 452 1.5 15.6 4170 5552
425 8 1 1 금식 660 2 -- 9321 14673
575 9 1 1 금식 707 4 -- 6825 10098
775 10 1 1 금식 487 1.5 -- 3541 5012
775 11 1 1 금식 654 4 9.7 6925 8126
300 12 1 1 음식 공급 779 4 11.9 8615 10749
250 13 3 1 금식 394 2 14.0 3975 5211
250 13 3 15 금식 403 2 -- 4812 7774
300 14 3 1 금식 288 6 10.3 3848 4555
300 14 3 15 금식 301 2 -- 3049 4143
150 15 5 1 금식 227 2 -- 2152 --
150 15 5 15 금식 347 1 -- 3721 --
200 16 5 1 금식 337 4 8.5 2752 --
200 16 5 15 금식 440 2 -- 4034 --
300 17 5 1 금식 317 2 -- 3798 --
300 17 5 15 금식 460 1.5 -- 3840 --
300 18 5 1 금식 549 1.5 -- 4607 --
300 18 5 15 금식 536 1 -- 4878 --
300 19 5 1 금식 419 4 -- 3855 --
300 19 5 15 금식 190 2 --
300 20 5 1 금식 624 2
300 21 7 1 금식 713 4 -- -- --
300 21 7 15 금식 1250 6 -- -- --
300 22 7 1 금식 374 2 -- 2986 3178
300 23 7 1 금식 276 4 -- -- --
300 24 7 1 금식 391 1.5 -- -- --
금식한 상태로 300 mg이 투여된 대상체와 비교하여, 음식이 공급된 상태로 300 mg이 투여된 대상체에서 유의하게 높은 노출을 관찰하였다 (표 3).
RX-5902는 때로 분명한 짧은 지체 시간 (lag time)(0.25 시간)에 이어서, 보통 가파른 상승하는 혈장 단계를 나타내었다. Tmax는 다소 가변적이었으며, 투여 후 1 내지 6시간에 관찰되었다. Tmax 후, 종종 짧은 분포 단계에 이어서 분명한 종결 단계를 관찰하였다. 보통은, 75% 이상의 AUC0-t (0-48　시간)을 24시간까지에서 관찰하였다. 분명한 종결 T1/2는 5.8 내지 27.6 시간의 범위었으나, 대개 각각의 값은 평균 값 13.0 시간 부근이었다. Cmax 및 AUC0-t (0-48 시간)은 투여량에 따라 상당히 선형적으로 증가하였다. AUClast은 전반적으로 용량-비례적인 방식으로 증가하였으나, Cmax는 비례적인 방식 미만으로 증가하였다. 다양한 투여량 및 투여 빈도에 대한 임상 Cmax 및 AUC 범위는 표 3에 나타난다.
안전성 및 내성
가장 흔히 보고되는 부작용은 경미한 오심, 구토 및 피로였다. 결과는, 시험된 용량 수준의 RX-5902이 꽤 내성이 있는 것으로 나타난다.
실시예 3: 암의 이종이식편 모델에서 RX-5902의 효능 평가를 위한 프로토콜
인간 암 이종이식편 마우스 모델에서 RX-5902의 효능을 조사한다. 연구 1일째 9-10주령의 15-30g 체중 (BW)을 갖는 암컷 누드 마우스 (nu/nu, Harlan 또는 CRL: NU(NCr)-Foxn1nu, Charles River)에게 물을 자유롭게 공급하고 (역삼투, 1 ppm Cl), 18.0% 조단백질, 5.0% 조지방 및 5.0% 조섬유로 이루어진 NIH 31 변형된 조사된 Lab Diet®를 공급한다. 20-22 ℃ (68-72 ℉) 및 40-60% 습도에서 12 광주기로 정적인 마이크로이소레이터 (microisolator) 내 조사된 Enrich-o'cobs™ 실험 동물 침대에 마우스를 수용한다. 연구는 규제, 축산, 수술 절차, 사료 및 유동성 규제에 대하여 실험실 동물의 관리 및 사용 안내서의 권고를 준수하였다.
다양한 인간 종양 세포주 (예: HCT116, HT29, H460, H69, Caki-1, CaSki, MiaPaca2, BxPC3 및 Colo 205 세포 [ATCC, Manassas, VA, USA])를 ATCC의 지침에 따라 배양한다. 5% CO2 및 95% 공기의 대기하 37 ℃의 가습된 항온처리기 내 조직 배양 플라스크 중에서 종양 세포를 배양한다.
지수 성장기 동안 세포를 수확하고, 인산완충식염수로 재현탁시킨다. 각각의 시험 동물은 우측 옆구리에 5Х106 종양 세포를 피하 주사로 수용하고, 평균 종양 크기가 80-300 mm3의 목표 범위에 도달함에 따라 종양 성장을 모니터링한다. 종양이 목표 크기에 도달하면, 마우스를 임의로 여러 그룹으로 나누고 (n=10-20), RX-5902 또는 양성 (예: 젬시타빈) 또는 음성 대조군 (예: 비히클, 염수)의 다양한 레지멘으로의 처리를 시작한다. 종양 및 체중을 연구가 종결될 때까지 주기적으로 측정한다.
캘리퍼를 사용하여 종양을 2차원으로 측정하고, 하기 수학식을 사용하여 부피를 계산한다:
종양 부피 (mm3) =
Figure pct00005
상기 식에서, w = 종양 넓이 (mm), l = 종양 길이 (mm)이다. 종양 중량은 1 mg이 1 mm3의 종양 부피와 같다고 가정하여 추정할 수 있다.
특정 세포주의 피하 종양이 확립된 8그룹의 마우스 (n = 10-20/그룹)에서 1일에 처리를 시작한다. 각각의 그룹을 연구 설계에 따라 처리한다. 모든 투여량을 체중에 따라 조절한다. 각각의 그룹 내 동물을 효능 및 샘플링 목적으로 나눈다. 또한, 샘플링 목적을 위하여 비히클 대조군 및 비처리군으로 지정된 그룹이 존재한다.
연구 1일, 비처리된 그룹으로부터 모든 동물을 종양 및 전혈에 대해 샘플링한다. 추가적으로, 다른 그룹으로부터 4마리 동물을 제1 투여 후 2, 8 및 24시간에 샘플링하고, 제2 투여 후 24시간에 샘플링한다. 이소플루란 마취 하에 치명적 심장 천자 (terminal cardiac puncture)로 마우스를 희생시킨다. 전체 혈액량을 리튬 헤파린 항응고제를 함유하는 튜브 내 수집한다. PBMC 용 항응고제로서 리튬 헤파린을 사용하여 혈장에 대해 각각의 혈액 샘플을 처리한다. 종양을 수집하고, 반으로 나누고, 여기서, 1 부분은 10% 중화 완충된 포르말린 (NBF) 내 24시간 동안 고정하고 이어서 70% 에탄올로 옮기고, 다른 부분은 급속 냉동시킨다. 동결된 혈장 및 종양 샘플을 -80 ℃에 보관한다.
15일로부터의 데이터를 사용하여 처리 효능을 측정한다. 15일에 동물의 MTV (n)(중앙 종양 부피), n을 각 그룹에 대해 측정한다. 종양 성장 억제율 (%TGI)을 지정된 대조군의 MTV (비히클 투여) 및 약물-처리된 그룹의 MTV 간의 차이로 정의하며, 대조군의 MTV 백분율로 표현된다:
%TGI = [1-(MTV약물 처리군/MTV대조군)] x 100
TGI 분석에 대한 데이터 세트는 처리-관련된 (TR) 또는 비처리-관련된 (NTR) 원인으로 인해 죽은 동물을 제외한, 그룹 내 모든 동물을 포함한다. 이러한 분석에서 적어도 60%의 TGI를 산출하는 작용제는 잠재적으로 치료학적 활성인 것으로 간주된다.
71일 까지 종양 성장에 대해 동물을 개별적으로 모니터링하였다. 연구 프로토콜은 처리된 그룹 대비 대조군에서 종점까지의 중위 시간 (TTE)에 기반한 종양 성장 지연 분석을 상술한다. 각각의 동물은 종양이 2000 mm3 부피 종점에 달하는 종양 진행의 경우에 안락사시킨다. 각각의 마우스에 대한 종점까지의 시간 (TTE)을 하기 수학식으로 계산한다:
Figure pct00006
상기 식에서, b는 절편이고, m은 로그-변환된 종양 성장 데이터 세트의 선형 회귀에 의해 수득된 선의 기울기이다. 데이터 세트는 연구 종점 부피를 초과하는 첫번째 관측 및 종점 부피 도달 직전의 3회 연속 관측으로 구성된다. 종점에 도달하지 않는 임의의 동물을 연구 종료시 안락사시키고, 연구 마지막 날 (71 일)과 동일한 TTE 값을 부여한다. 로그-변환하여 계산된 TTE가 종점에 도달하기 전날보다 앞서거나, 또는 종양 부피 종점에 도달하는 날을 지난 경우, 선형 내삽법을 수행하여 TTE를 근사화한다. 처리-관련된 (TR) 원인에 의해 죽은 것으로 측정된 임의의 동물에게 사망일과 동일한 TTE 값을 부여한다. 비처리-관련된 (NTR) 원인에 의해 죽은 임의의 동물을 TTE 분석에서 배제한다.
71일에, 마지막 날까지 생존하며, 이의 종양이 부피 종점까지 도달하지 않는 동물의 수 (n)의 중앙 종양 부피로 MTV (n)을 정의한다. 처리-관련된 (TR) 원인으로 죽은 것으로 측정된 임의의 동물에게는 사망일과 동일한 TTE 값을 부여해야한다. 비처리-관련된 (NTR) 원인으로 죽은 임의의 동물을 분석에서 배제한다. 처리 성과를 종양 성장 지연 (TGD)으로 평가하고, 이를 대조군과 비교하여 처리 그룹에 대한 중앙 TTE의 증가로 정의하며:
TGD = T - C
이는 일수로 표시하거나, 또는 대조군의 중앙 TTE의 백분율로 표현된다:
Figure pct00007
상기 식에서, T = 처리 그룹에 대한 중앙 TTE, C = 대조군에 대한 중앙 TTE이다.
또한, 처리 효능을 퇴화 반응의 수로 측정한다. 처리는 동물 내 종양의 부분적 퇴화 (PR) 또는 완전한 퇴화 (CR)를 일으킬 수 있다. PR 반응에서, 종양 부피는 연구 과정 동안 3회 연속 측정시 이의 D1 부피의 50% 이하, 및 3회 연속적 측정 중 하나 이상에 대해 13.5 mm3 이상이다. CR 반응에서, 종양 부피는 연구 과정 동안 3회 연속적 측정에 대해 13.5 mm3 미만이다. 연구 마지막 날 CR 반응을 보이는 임의의 동물을 무종양 생존자로 추가로 분류한다.
독성 평가에 대해서, 연구 처음 5일 동안, 그리고 그 후 주 2회로 동물의 체중을 매일 측정한다. 임의의 유해한 처리-관련된 부작용의 명백한 징후에 대해, 및 관측시 기록된 독성의 임상 징후에 대해 마우스를 자주 관찰한다.
연구 동안 20% 미만의 그룹 평균 체중 손실 및 10마리 처리된 동물 중 하나 이하의 처리-관련된 (TR) 사망으로 허용가능한 독성을 정의한다. 더 큰 독성을 야기하는 임의의 투여량 레지멘을 최대 내약 용량 (MTD) 초과인 것으로 간주한다. 만일 임상 징후 및/또는 부검으로 증명된 처리 부작용으로 인한 것이거나, 또는 만일 투약 기간 동안 또는 마지막 투약의 14일 이내에 알 수 없는 원인으로 인한 것인 경우, 사망을 TR로 분류한다. 만일 처리 부작용과 관련된다는 증거가 없는 경우, 사망을 비-처리-관련된 (NTR) 것으로 분류한다.
윈도우용 Prism 6.05 (GraphPad)를 통계 및 그래픽 분석에 사용한다. 다수의 그룹에 대한 MTV 값을 비-모수 크러스칼-왈리스 검정 (Kruskal-Wallis test) 및 post hoc Dunn의 다중 비교 검정과 비교한다. 양측의 통계 분석은 P = 0.05에서 수행한다. 프리즘은 P > 0.05에서 비-유의적 (ns)이고, < P ≤ 0.05에서 유의적 ("*"로 표시)이고, 0.001 < P ≤ 0.01에서 매우 유의적이고 ("**"), P = 0.001에서 상당히 유의적인 ("***) 결과를 보고한다. 통계적 시험이 유의성 시험이고, 그룹 간 차이의 크기 추정치를 제공하지 않기 때문에, 모든 수준의 유의성은 이러한 보고 내 유의하거나 비-유의한 것으로 설명된다.
생존을 TTE 값에 기반하여 카플란-마이어법 (Kaplan-Meier method)으로 분석한다. 로그 순위 (Mantel-Cox) 및 Gehan-Breslow-Wilcoxon 시험은 TTE 값에 기반하여 2 그룹의 전체 생존 실험 (생존 곡선) 간의 차이의 유의성을 결정한다. 카플란-마이어 플롯 및 통계적 시험은 동일한 데이터 세트를 공유하며, NTR 사망으로 기록된 임의의 동물을 배제한다. 산점도를 구성하여 그룹에 의한 개별적인 마우스에 대한 TTE 값을 나타내며; 이러한 플롯은 모든 다른 도면에서 배제된 NTR 사망을 나타낸다. 그룹 평균 종양 부피를 시간의 함수로 플롯팅한다. 종양 크기 또는 TR 사망으로 인해 동물이 연구를 종료할 경우, 이의 최종 기록된 종양 부피가 데이터에 포함되어 후속 시점에서 중앙 부피를 계산하는데 사용된다. 종양 성장 곡선은 2개 TR 사망이 동일한 그룹에서 발생한 이후 생략된다. 연구 과정 동안의 그룹 평균 체중 (BW) 변화를 D1로 부터 변화율, ± SEM으로 그래프로 나타낸다. 종양 성장 및 BW 변화 곡선은 그룹 내 평가 가능한 마우스의 절반 이상이 연구를 종료한 후 생략된다.
실시예 4: 신장 세포 암종 이종이식편 모델에서의 RX-5902의 효능
실시예 3에 기재된 프로토콜에 따라, 인간 신장 종양 이종이식편 (Caki-1)을 갖는 마우스에서 종양 성장에 대한 RX-5902의 효과를 조사하였다. 종양 성장 지연을, 비히클 처리된 그룹과 비교하여 처리된 그룹 내 종점 종양 부피에 대한 중위 시간의 증가로서 측정하였다. RX-5902의 효능을 2개 상이한 투여량 개요를 사용하여 측정하였다: 20-160 mg/kg의 주간 투여량으로 4주 동안 (도 3), 또는 50-70 mg/kg의 1일 투여량으로 3주 동안 (5일 시행/ 2일 휴식)(도 2). RX-5902를 160 mg/kg로 주간 투여함은 75% TGD (P<0.001)를 일으켰다 (도 3). RX-5902의 1일 투여는 용량-의존적 TGI (80 및 96%; 21일) 및 TGD (68 및 104%, P<0.001)를 일으켰고 (도 2), 2개 용량 모두에서 동물의 전체적인 생존을 연장하였다 (P<0.0001) (데이터 명시 안됨). 70 mg/kg의 1일 투여량으로, 6/10 마리의 동물이 부분적인 종양 퇴화를 입증하였으며, 1/10 마리의 동물이 완전한 종양 퇴화를 입증했다. RX-5902는 체중 증가, 처리 관련 사망, 또는 투여량 개요의 임상적 관측에서 감소를 나타내지 않았다. 수니티닙 (이러한 연구에서 양성 대조군; 60 mg/kg; 21일 동안 매일)은 본원에서 Caki-1 모델을 입증하는 생체내 연구 모두에 대해 TGD를 일으켰다. 이러한 데이터는 신장 세포 암에서 RX-5902의 잠재적 치료 활성 및 생존 연장을 지지한다. 또한, 결과는, 인간에서 더 낮은 1일 투여량으로 보다 빈번하게 투여하는 것이 신장 암에서 RX-5902에 대한 보다 효과적인 투여 스케줄일 수 있다는 것을 시사한다.
이종이식편 연구 결과 (실시예 4 내지 9에 기재됨)를 표 4에 요약한다.
마우스에서 경구 투여된 RX-5902의 항종양 활성
투여량
(mg/kg)		 스케쥴 이종이식편 (TGI%* 또는 TGD^)
Caki-1 MiaPaca-2 Colo205 MDA-MB-231 A2780 SK-OV3 A549
160 QWK 75%^ 0%* 44%*; 39%* 43%* 30%*
320 QWK 13%* 65%*; 82%* 43%* 26%*
600 QWK 33%* 83%*; 165%* 75%* 26%*
40 5일 시행
/2일 휴식		 6%^
50 5일 시행
/2일 휴식		 68%^ 83%^
60 5일 시행
/2일 휴식
70 5일 시행
/2일 휴식		 104%^ 339%^ 49%^
^는 TGD%를 나타내고; *은 TGI%를 나타낸다. 경우에 따라 두 값을 기록한다.
실시예 5: 췌장암 이종이식편 모델에서 RX-5902의 효능
실시예 3에 기재된 프로토콜에 따라, 인간 췌장 종양 이종이식편 (MiaPaca-2)을 갖는 마우스에서 종양 성장에 대한 RX-5902의 효과를 조사하였다. 비히클 처리된 그룹과 비교하여 처리된 그룹에서 종양 성장을 측정하였다. 결과는, 1주에 5일로 50 또는 70 mg/kg RX-5902를 투여함으로써 현저한 효능을 나타냈으며 (표 4 참조), 이는 인간에서 1일 투여가 췌장 암에서 RX-5902에 대한 효과적인 처리 스케줄일 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 6: 결장직장암 이종이식편 모델에서 RX-5902의 효능
실시예 3에 기재된 프로토콜에 따라, 인간 결장직장 종양 이종이식편 (Colo205)을 갖는 마우스에서 종양 성장에 대한 RX-5902의 효과를 조사하였다. 비히클 처리된 그룹과 비교하여 처리된 그룹에서 종양 성장을 측정하였다. 결과는, 320 및 600 mg/kg의 주간 RX-5902 투여로써 현저한 효능을 나타냈으며 (표 4 참조), 이는 RX-5902가 결장직장 암에서 효과적인 처리일 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 7: 유방암 이종이식편 모델에서 RX-5902의 효능 및 인산화된 p68의 역할
실시예 3에 기재된 프로토콜에 따라, 인간 유방 종양 이종이식편 (MDA-MB-231)을 갖는 마우스에서 종양 성장에 대한 RX-5902의 효과를 조사하였다. 비히클 처리된 그룹과 비교하여 처리된 그룹에서 종양 성장을 측정하였다. 결과는, 160, 320 및 600 mg/kg의 주간 RX-5902 투여로써 현저한 효능을 나타내고 (표 4; 도 12 참조), 처리된 마우스에서 생존 연장 (도 13)을 나타냈다. 이러한 결과는, RX-5902가 유방 암 치료 및 생존 연장에 효과적일 수 있다는 것을 시사한다.
또한 Tyr593에 대해 인산화된 p68이, p68을 녹다운시킴으로써 암세포 성장을 억제하기 위한 RX-5902의 능력에 중요한 역할을 하는지의 여부를 측정하였다. p68-siRNA는 Tyr593에 대해 인산화된 p68의 발현뿐만 아니라, 삼중-음성 (TN) 유방암 세포주 MDA-MB-231 내 p68을 효과적으로 하향조절하였다. p68-siRNA-형질감염된 세포의 IC50 농도의 RX-5902에 대한 노출이 RX-5902의 세포독성 효과로부터 MDA-MB-231 세포를 보호하며, 이는 Tyr593에 대해 인산화된 p68이 RX-5902의 세포독성 효과를 위한 핵심 분자라는 것을 의미한다.
실시예 8: 시스플라틴-저항성 난소암 이종이식편 모델에서 RX-5902의 효능
실시예 3에 기재된 프로토콜에 따라, 인간 난소 종양 이종이식편 (A-2780)을 갖는 마우스에서 종양 성장에 대한 RX-5902의 효과를 조사하였다. 비히클 처리된 그룹과 비교하여 처리된 그룹에서 종양 성장을 측정하였다. 결과는, 160, 320 및 600 mg/kg의 주간 RX-5902 투여 (표 4 참조)로써 현저한 효능을 나타냈다. 소정 일당 40 및 70 mg/kg RX-5902으로 난소 종양 이종이식편 (SK-OV3)의 또 다른 모델에서 유사한 결과를 관찰하였다(표 4). 이러한 결과는, RX-5902가 인간 난소암에서 효과적인 처리일 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 9: 비-소세포 폐암 이종이식편 모델에서 RX-5902의 효능
실시예 3에 기재된 프로토콜에 따라, 인간 비-소세포 폐암 이종이식편 (A549)을 갖는 마우스에서 종양 성장에 대한 RX-5902의 효과를 조사하였다. 비히클 처리된 그룹과 비교하여 처리된 그룹에서 종양 성장을 측정하였다. 결과는, 160, 320 및 600 mg/kg의 주간 RX-5902 투여 (표 4 참조)로써 효능을 나타냈고, 이는 RX-5902가 폐암에 효과적인 치료(처리) 일 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 10: 동계 MC38 뮤린 결장암 이종이식편 모델에서 RX-5902의 효능
하기 기재된 방법에 따라, MC38 뮤린 결장암을 갖는 암컷 C57BL/6 마우스를 사용한 동계 모델에서 종양 성장에 대한 RX-5902의 효과를 조사하였다. (비히클 처리된) 대조군 그룹과 비교하여 처리 그룹에서 종양 성장을 측정하였다 (투여량 개요 및 치료 레지멘에 대해 하기 표 5 참조). 이러한 데이터는, 예정된 사멸 수용체 1 (PD-1) 억제제인 RMP1-14로의 RX-5902의 첨가가 종양 성장 억제에 부가적인 효과를 갖는다는 것을 입증하였다 (90% RX-5902 단독, 93% RMP1-14 단독, 대비 2개 작용제의 조합 99% [P<0.01 대비 대조군]). 또한, 2개 제제의 조합은, 무종양 생존 (tumor free survival)을 나타내는 2마리 동물과 함께 RMP1-14 단독 그룹 내 부분적 퇴화 및 완전한 퇴화를 갖는 4마리 동물을 비교하여, 무종양 생존을 나타내는 4마리 동물과 함께 부분적 퇴화 및 완전한 퇴화를 갖는 더 많은 수의 마우스 (6마리)를 발생시켰다. 조합 그룹 내 마우스에게 임의의 유해한 효과가 없는 것으로 모든 결과를 관찰하였다. 이러한 연구는, RX-5902 및 PD-1 억제제의 조합이 종양 성장을 유의하게 감소시키며, 임의의 유해한 효과없이 마우스에서 부분적 및 완전한 반응 및 무종양 생존을 초래한다는 것을 입증한다.
약물 및 처리 스케쥴
Gr. N 레지멘 1 레지멘 2
제제 mg/kg 경로 스케쥴 제제 mg/kg 경로 스케쥴
1# 10 비히클 - po (5/2) x 3 - - - -
2 10 RX-5902 84.34 po (5/2) x 3 - - - -
3 10 항-PD-1 RMP1-14 100* ip biwk x 2 - - - -
4 10 RX-5902 84.34 po (5/2) x 3 항-PD-1 RMP1-14 100* ip biwk x 2
# - 대조군
* - ㎍/동물
본 연구는 투여 시작시 연구 일 (D1)에 피하 MC38 종양 (평균 종양 부피 범위: 66 - 68 mm3)를 갖는 암컷 C57BL/6 마우스를 5 그룹 (그룹 당 n=10)으로 구성하였다. 비히클을 경구 투여하였다 (p.o.). RX-5902를 84.34 mg/kg (70 mg/kg 활성 투여량) p.o. 투여하였다. 항-PD-1 (RMP1-14)을 100 ㎍/동물로 복강내 (i.p.) 투여하였다. 그룹 1의 마우스를 대조군으로 제공하고, 3회 주기동안 5일 PBS (비히클)를 제공하고, 2일 휴식하였다 ((5/2) x 3). 그룹 2에 RX-5902를 (5/2) x 3으로 제공하였다. 그룹 3에 2주 동안 주 2회 항-PD-1을 제공하였다 (biwk x 2). 그룹 4에 RX-5902 (5/2) x 3 및 항-PD-1 biwk x 2로 제공하였다. 연구 종점을 종양 부피 1500 mm3 또는 45일 (둘 중 빠른 날짜 적용)로 정하였다. 45일 까지 종양 측정을 매주 2회 실시하여, 종양 부피가 종점에 다다를 시 각각의 동물들의 연구를 종료하였다.
부분적 처리 성과는, TGI 분석을 위해 선택된 처리된 대조군 마우스의 중앙 종양 부피 (MTV)의 28일 동안의 백분율 차이로 정의된 종양 성장 억제율 (%TGI)에 기반하였다. 결과를 분석하고, P ≤0.05에서 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 적어도 60%의 TGI를 산출하는 치료를 잠재적으로 치료학적 활성인 것으로 간주하였다. 추가적으로, 대조군과 비교하여, 치료에서 종점까지의 중위 시간 (TTE)의 증가 척도인 종양 성장 지연 (TGD)으로부터 효능을 측정하였다. 연구 생존자 수, 부분적인 퇴화 (PR) 및 완전한 퇴화 (CR) 반응, 및 생존에서 차이의 로그순위 유의성에 기반하여 반응을 추가적으로 평가하였다. 체중 (BW) 측정 및 임상 징후 및 처리-관련된 (TR) 부작용에 대한 주기적 관측으로 다양한 처리의 내성을 평가하였다.
28일에, 대조군 그룹 1에 대한 중양 종양 부피는 1226 mm3 였으며, 각각의 종양은 14 내지 1800 mm3의 범위였다. 대조군 그룹 1에서 7개 종양은 29.7일의 중앙 TTE를 갖는 부피 종점에 도달하였고, 45일 연구에서 15.3 일의 최대 T - C (52% TGD)를 확립하였다. 대조군 TTE는 26.9 내지 45.0 일의 범위였다. 대조군 그룹의 다양성은 통계적 유의도를 달성할 가능성을 감소시켰다. 3마리 생존개체의 MTV는 14 mm3 였고, 2마리 PR이 존재했다.
RX-5902의 투여는 유의적 90% TGI (P < 0.05, Mann-Whitney)를 나타냈다. 이러한 치료법은 44.8 일의 종양 TTE 또는 비-유의적 51% TGD를 산출하였다. 5마리 동물은 D45에 14 mm3의 MTV로 남겨졌으며, 3마리 PR이 존재했다. 항-PD-1을 이용한 치료는 유의적 93% TGI (P < 0.05, Mann-Whitney)로 이어졌다. 이러한 치료법으로 6마리 생존 개체가 생겼고, 45.0 일의 TTE 및 최대 52% TGD 가능성을 부여하였다. 결과는 유의적이지 않았다. D45에서 MTV는 14 mm3 이었고, 1마리 PR 및 3마리 CR이 존재했고; 후반부 2마리 동물은 무종양 생존개체 (TFS)로 연구에 남겨졌다.
RX-5902 및 항-PD-1와의 병용 요법은 99% TGI를 산출하였다. 이러한 결과는 대조군과 (P < 0.01, Mann-Whitney) 비교하여 유의하였으나, 항-PD-1 단일요법과는 달리 유의하지 않았다. 이러한 2중 요법은 45.0 일의 중앙 TTE 또는 최대 52% TGD의 가능성이 부여되었다. 10마리 모든 동물은 14 mm3의 MTV로 생존하였다. 1마리 PR 및 5마리 CR이 존재하며, 이들 중 4마리는 TFS였다. 결과는 대조군 (P < 0.01, 로그 순위) 및 단일 요법 (비교 모두에 대해 P < 0.05, 로그 순위)과 비교한 경우 유의하였다.
실시예 11: Y593 인산화된 p68의 β-카테닌 의존성 ATP아제 활성 및 β-카테닌에 의해 조절된 유전자 발현에 대한 RX-5902의 효과
재료 및 방법
세포 배양 및 항체
ATCC (Manassas, VA, USA)로부터 MDA-MB-231, SK-MEL-28 및 WI-38 세포를 수득하고, 제조사의 지침에 따라 배양하였다. 항-p68 항체 및 항Y593-p68 항체를 각각 Cell Signaling (Danvers, MA) 및 Abcam (Cambridge, MA)로부터 구매하였다. β-액틴, 사이클린 D1, p-c-Jun 및 c-Myc에 대한 항체를 Santa Cruz (Dallas, TX)로부터 구매하였다. 항-포스포-티로신 항체 및 HRP 접합된 GAPDH 항체를 Cell Signaling (Danvers, MA)로부터 수득하였다. 재조합 β-카테닌 및 p68 단백질을 각각 Creative Biomart (Shirley, NY) 및 Origene (Rockville, MD)로부터 구매하였다.
재조합 단백질
재조합 β-카테닌을 추가의 처리 없이 사용한 반면, 필터 결합 검정을 위하여 재조합 p68 단백질을 p68로 사용하거나, 또는 c-Abl로 인산화하였다. 재조합 c-Abl을 Abcam (Cambridge, MA)로부터 수득하였다.
약물 처리
RX-5902를 DMSO 중에 용해시켜 2mM의 원액을 제조하였다. 원액을 -20 ℃에 저장하고, 배지로 희석하여 작용 농도 (working concentration)를 제조하였다.
RX-5902 결합 단백질의 동정
MDA-MB-231 세포를 6웰 플레이트 상에 플레이팅하고, 1시간 동안 다양한 농도 (0, 0.1, 1 및 10 μM)에서 RX-5902로 처리하였다. 얼음 상에서 세포를 프로테아제/포스포타아제 억제제를 함유하는 p-MER 완충액으로 용해시켰다. 세포 용해물을 RT에서 10분 동안 서몰리신 (thermolysin) 프로테아제 (1:1,500 비)로 처리하고, 0.5 M EDTA 용액을 첨가하여 반응을 중단하였다. 반응 혼합물을 쿠마시 염색으로 시각화된 10% SDS-PAGE 상에서 분리하였다. 질량 분광분석 시퀀싱 분석으로부터 수개의 후보 단백질을 동정한 후, RX-5902와 상호작용하는 단백질을 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다.
필터 결합 분석
필터 결합 연구를 이전에 다른 곳에 기술하였다 (Coombs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:5291-5295 (1978). 간략하게는, 티로신 인산화된/인산화되지 않은 재조합 p68 RNA 헬리카제를 PBS와 함께 3H-표지된 RX-5902 (10 Ci/mmol)에 첨가하였다. 3H-표지된 RX-5902를 Quotient Bioresearch (Cardiff, UK)로부터 합성하였다. 실온에서 30분 동안 항온처리한 후, 결합 혼합물을 니트로셀룰로오스 막 상에 로딩하였다. 막을 PBS로 5회 세척하고, 이어서 진공으로 건조시켰다. 인산화된/인산화되지 않은 p68에 결합된 RX-5902의 양을 3H 섬광 계수로 측정하였다. p68 RNA 헬리카제의 첨가 없이 3H-표지된 RX-5902 단독으로 및 백그라운드 3H 섬광 계수로서 3H-표지된 RX-5902의 첨가 없이 샘플 p68 RNA 헬리카제 단독으로 동일한 절차를 수행하였다. 화합물에 대한 p68의 결합율을 계산하고, 농도에 대해 플롯팅하였다. RX-5902에 결합된 p68의 50%에서의 농도로 해리 상수 (Kd)를 예측하고, 선형 회귀 분석으로 이를 계산하였다.
ATP아제 검정
직접 비색 분석법 (direct colorimetric assay)을 사용하여 ATP 가수분해 동안 방출된 무기 인산염을 측정함으로써 ATP아제 활성을 측정하였다 (Shin et al., Cancer Res., 67:7572-7578 (2007); Yang et. al., Cell, 127:139-155 (2006)). 50 ㎕의 반응 부피로 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 200 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 5 mM DTT, ~1 - 2 ㎍의 적절한 기질, 4 mM ATP 및 10 ㎕의 헬리카제를 함유하는 반응물 중에서 전형적인 ATP아제 검정을 수행하였다. ATPd아제 반응물을 37 ℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 1 ml의 말라카이트-몰리브덴 시약을 반응 혼합물에 첨가하고, 반응물을 정확히 5분 동안 실온에서 추가로 항온처리하였다. 이어서, 630 nm에서의 흡광도 (A)를 측정하였다. A630nm의 표준 곡선에서의 A630nm vs. 공지된 인산염 농도를 매치시킴으로써 무기 인산염의 농도를 측정하였다. 이러한 검정에 사용된 단백질인 p68 또는 포스포-68을 이전에 기록된 절차와 유사하게 내부에서 (in-house) 제조하였다 (Yang et al., Protein Expr. Purif., 35:327-333 (2004)). RX-5902가 없는 포스포-p68의 ATP아제 활성을 억제율 0%로 정의함으로 억제율을 계산하고, RX-5902의 IC50을 Kaledia Graph software program (Synergy Software, Reading, PA)을 사용하여 비-선형 회귀 분석으로 계산하였다.
웨스턴 블롯
단백질 혼합물 또는 세포 용해물을 SDS-PAGE로 분리하고, PVDF 막으로 옮겼다. 막을 블로킹 완충액 (5% BSA 함유 1 x TBST)로 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 가볍게 세척한 후, 막을 4 ℃에서 밤새 블로킹 완충액 중에서 1차 항체와 함께 항온처리하였다. 1차 항체 중에서 항온처리한 후, 막을 1 x TBST로 3회 세척하고, 이어서 HRP 접합된 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 블로킹 완충액 중에서 항온처리하였다. 막을 다시 3회 세척하고, ECL 시스템 (Thermo Scientific, Rockford, IL)으로 시각화하였다.
결과
잘-확립된 표적 식별 방법인 DARTS 검정 (Lomenick et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106:21984-21989 (2009))을 사용하여 암세포 내에서 RX-5902와 상호작용 할 수 있는 표적 단백질을 발견하였다. DARTS 방법으로 약 60 kDa 이동도를 갖는 밴드가 RX-5902와 상호작용 시 프로테아제 절단으로부터 보호된다는 것을 나타낸다 (도 4). 이러한 보호된 단백질을 동정하기 위하여, 대조군과 함께 밴드를 잘라내고, ProtTech (Phoenixville, PA)에 의해 LC-MS/MS로 분석하였다. SDS-PAGE 내 유사한 이동도를 가져 RX-5902 처리에 의해 보호된 단백질을 확인하는 LC-MS/MS 분석으로부터 수개의 잠재적인 후보에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 명확하게는, 이러한 보호된 밴드는 p68 RNA 헬리카제에 대한 항체에 의해 인식되며 (도 5), 이는 RX-5902가 세포 내 p68 RNA 헬리카제와 상호작용 할 수 있으며, 서몰리신에 의한 분해로부터 p68을 보호할 수 있다는 것을 의미한다. RX-5902와 p68과의 상호작용을 입증하기 위하여, 3H-표지된 RX-5902를 사용하였다. 재조합 p68 단백질 및 시험관내 티로실 인산화된 재조합 p68 단백질과의 3H-표지된 RX-5902의 상호작용을 필터 결합 검정으로 규명하였다 (Coombs et al., supra). 웨스턴 블롯 분석을 통해, p68가 티로신 잔기에 대해 인산화된다는 것을 확인하였다 (도 6). 필터 결합 검정은, RX-5902가 Y593 포스포-p68과 상호작용하며, 약 19 nM의 Kd로 예측되나, RX-5902는 필터 결합 연구에서 비인산화된 p68과는 상호작용하지 않았다는 것을 명확히 밝혔다 (도 7; 사각형 및 삼각형은 중복 실험을 나타냄).
p68의 ATP아제 활성에 대한 RX-5902의 효과를 조사하였다. 이를 위하여, RX-5902의 존재하 재조합 p68의 ATP아제 활성 및 효소로부터 추출된 전체 RNA를 측정하였다. RX-5902는 0.2 μM 및 심지어 20 μM와 같은 더 높은 농도의 p68 RNA 헬리카제의 RNA-의존성 ATP아제 활성에도 영향을 미치지 않았고, RNA-의존성 ATP아제 활성은 30% 미만으로 억제되었으며 (도 8), 이는 RX-5902가 p68의 RNA-의존성 ATP아제 활성에 거의 영향을 미치지 않았다는 것을 의미한다. 이러한 데이터는 RX-5902가 필터 결합 검정에서 비인산화된 p68과 상호작용하지 않았다는 것을 확증할 수 있다 (도 7).
결과는, 포스포-p68의 β-카테닌 의존성 ATP아제 활성은 0.2 μM의 RX-5902의 존재하에서 크게 감소된다는 것을 나타냈다 (도 9). 저 농도의 RX-5902에서 실험을 반복하여 IC50을 계산하였다. β-카테닌 의존성 ATP아제 활성의 억제에 대한 RX-5902의 IC50는 61 nM인 것으로 계산되었으며 (도 10), 이는 RX-5902가 포스포-p68/β-카테닌 상호작용을 잠재적으로 방해한다는 것을 의미한다.
RX-5902가 Y593 포스포-p68에 직접적으로 결합하기 때문에, RX-5902와 함께 세포를 처리한 것은 포스포-p68/β-카테닌 상호작용을 방해하여, 결과적으로 포스포-p68/β-카테닌 상호작용에 의해 조절되는 p-c-Jun, c-Myc 및 사이클린 D를 비롯한 수개의 성장 관련된 유전자의 발현에 영향을 끼칠 것으로 예상하였다. 따라서, RX-5902로 처리된 세포 내 사이클린 D1 및 c-Myc 발현뿐만 아니라, c-Jun의 인산화를 분석하였다. 암 세포주인 SK-MEL-28 및 MDA-MB-231과 정상 태아 폐 섬유아세포인 WI-38을 사용하였다. 20 nM RX-5902가 단백질 수준을 변화시키기 않았으나, 70 nM RX-5902는 사이클린 D1 및 c-Myc 모두의 발현을 감소시켰으며, 전체 p68 단백질 수준의 변화 없이 SK-MEL-28 내 c-Jun 인산화 수준도 감소시켰다. 단백질 수준의 유사한 변화를 20 nM 및 70 nM RX-5902 모두를 갖는 MDA-MB-231에서 검출하였다. RX-5902는 심지어 70 nM에서도 WI-38 세포 내 사이클린 D1 또는 c-Myc 발현 또는 c-Jun 인산화에 임의의 유의한 변화를 일으켰다 (도 11). 결과는, RX-5902로의 암세포 처리가 β-카테닌 경로에 의해 조절되는 것으로 공지된 특정 유전자, 예컨대, c-Myc, 사이클린 D1 및 p-c-Jun의 발현을 하향조절시킨 것을 입증하였다. 따라서, 연구는, RX-5902가 Y593 포스포-p68 RNA 헬리카제에 직접 결합함으로써 Y593 포스포-p68 헬리카제 - β-카테닌 상호작용을 억제하는 것이 이러한 화합물의 항암 활성에 기여할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 12: 인간에서 RX-5902의 효능, 안전성 및 내성
다양한 투여량의 RX-5902의 효능, 안전성 및 내성 및 빈도를 평가한다. 본 연구의 1단계 부분에서, 진행성 고형 종양 악성이 있는 대상체를 등록시킨다. 본 연구의 1단계 부분 동안, 최대 내약 용량 (maximum tolerated dose: MTD) 또는 권고 단계 2 투여량 (recommended phase 2 dose: RP2D) 및 스케쥴을 결정하고, RX-5902의 약물동태학을 적격인 대상체에서 특화한다. 진행성 악성 종양을 갖는 대상체에게 각각 4주 주기 동안으로 3주간 주당 1, 3, 5, 또는 7 일로 125-1050 mg/일 투여량의 RX-5902를 함유하는 캡슐제를 투여하고 1주간 휴식하거나, 또는 4주 주기 동안 휴식 없이 4주간 투여한다. 용량 증가는 투여량 당 1명의 대상체를 치료하는 가속화된 설계로 시작하여 (Simon et al., J. Natl. Cancer Inst., 89(15):1138-47 (1997), 단일 관련 등급 2 이상의 부작용이 발생한 후 변형된 피보나치 수열을 사용하는 표준 3 + 3 설계로 이어진다.
2단계 부분에서, 대상체를 2개 진단 그룹 중 1개에 등록시킨다: 삼중 음성 유방암 또는 백금 저항성/불응성/재발성 난소암. 본 연구의 2단계 부분은 단계 1에서 확인된 투여량 및 스케쥴을 사용하며, 2단 설계를 따른다. 각각의 종양 징후의 10명의 평가가능한 대상체를 등록시키고, 진행성 질환으로 인해 최소 4 치료 주기를 완료하거나 또는 치료를 지속할 가능성을 갖는 경우, 중간 분석을 수행한다. 2단계의 두번째 등급에서, 이러한 질환 그룹에 등록된 처음 10명의 반응-평가가능한 환자에서 적어도 2개 반응이 관측되는 경우, 질환 그룹에의 등록을 진행한다. 약 40명의 추가 대상체를 각각의 질환 징후에 등록시킨다. 2단계의 두번째 등급에서, 전반적인 반응 속도 및 무진행 생존율을 첫번째 등급을 넘어 계속되는 질환 그룹에서 추가로 평가한다. 표 6은 잠재적인 투여량 및 스케쥴을 요약하나, 이러한 스케쥴은 안전성 및 내성 데이터에 따라 변경될 수 있다.
투여 스케쥴
투여
그룹		 주당 투여수 1일 투여량
(mg)		 전체 주간
투여량 (mg)		 투여 주수*
1 5 150 750 3
2 3 250 750 3
3 3 300 900 3
4 5 150 750 3 또는 4
5 5 200 1000 3 또는 4
6 5 250 1250 3 또는 4
7 5 300 1500 3 또는 4
8 5 350 1750 3 또는 4
9 5 400 2000 3 또는 4
10 7 200 1400 3 또는 4
11 7 300 2100 3 또는 4
12 7 350 2450 3 또는 4
13 7 400 2800 3 또는 4
*는 4주 주기 중 투여한 주의 수를 나타낸다
실시예 13: RX-5902의 소량 생산 (배치 35444A의 제조)
실시예 13A: 화합물 A의 생산
100 L 반응기에 1,2-디아미노-4-플루오로벤젠 (1.75 kg, 13.8 mol, ChemiK), 옥살산 (1.25 kg, 13.9 mol), 11.4 kg 물 및 3.8 kg conc. 염산 (3 M HCl 용액, 3.28 equiv HCl)으로 채웠다. 거무스름한 혼합물을 환류 온도 (95-100 ℃)에서 약 25시간 동안 가열하였다. 교반하면서 분액 (1 mL)을 취하고, 포화 NaHCO3 용액 (30 mL)으로 pH 8로 중화시켰다. HPLC 분석으로써 출발 물질이 완전히 소모되었음을 나타냈다.
가열로 혼합물을 제거하고, 실온으로 냉각시키고, 이어서 찬물 (14 kg)을 첨가하였다. 어두운색 고체를 침전시키고, 진공 여과로 이를 수집하였다. 필터 케이크를 찬물 (12 kg)에 이어서 이소프로필 알콜 (IPA, 9.4 kg)로 세척하였다. 이어서, 물기가 있는 케이크 (3.4 kg)를 진공 오븐 (50 ℃)에서 밤새 건조시켜 2.38 kg의 6-플루오로-1,4-디히드로퀴녹살린-2,3-디온 (화합물 A)를 97.0% HPLC 순도를 갖는 청회색 고체 (96% 몰 수율)를 생성하였다.
실시예 13B: 화합물 B의 생산
100 L 반응기에 화합물 A (2.38 kg, 13.2 mol), 디메틸포름아미드 (DMF, 0.25 kg) 및 CHCl3 (37.0 kg)을 첨가하였다. 이어서, 염화티오닐 (SOCl2, 4.9 kg, 41.2 mol)을 첨가하여 온도를 <25 ℃로 유지하였다. 이어서, 혼합물을 55-60 ℃에서 환류시켰다. 23시간 후, HPLC 분석을 위하여 샘플을 취하였다. HPLC 분석은 출발 물질이 완전히 소모되었으나, 98%의 2,3-디클로로-6-플루오로퀴녹살린 (화합물 B) 이외에 ~2%는 중간체임을 나타났다. 추가량의 SOCl2 (494 g) 및 DMF (25 g)를 첨가하고, 혼합물을 추가 1시간 동안 환류시켰다. HPLC가 변하지 않았으므로, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 탈염수 (DI)(8.8 kg)를 반응 혼합물에 서서히 첨가하였으며, 이는 열 및 가스의 방출로 이어졌다. 이어서 0.5 M NaOH (8 kg)를 서서히 첨가했다. 전체 퀀치(quench)를 13시간 교반하여 과량의 SOCl2가 분해되도록 하였다. 유기층을 4 Х 8 kg 물에 이어서 8 Х 16 kg 물로 세척하였다.
유기상 (50 L 반응기 내)을 40g의 활성탄으로 처리하고, 35분 동안 교반하였다. 활성탄을 여과로 제거하고, 배치를 농축시켜 건조하였다. 생성된 고체를 진공 오븐 (46 ℃) 중에서 건조시켜, 98.0%의 HPLC 순도를 갖는 2.62 kg의 화합물 B를 수득하였다 (94% 몰 수율).
실시예 13C: 화합물 1의 생산
100 L 반응기에 2,3-디클로로-6-플루오로퀴녹살린 (화합물 B, 1.30 kg, 6.00 mol), 아세토니트릴 (32.0 kg) 및 수산화 암모늄 (11.9 kg)을 첨가하였다. 혼합물을 50 ℃에서 28시간 동안 교반하엿다. 약 4%의 비반응된 화합물 B를 관찰하였다. 추가 1.2 kg의 수산화 암모늄을 첨가하고, 혼합물을 추가로 20시간 동안 50 ℃에서 교반하였다. HPLC 분석은 잔여 출발 물질이 없다는 것을 나타냈다. 배치를 20 ℃로 냉각시키고, 고체를 뷰흐너 필터를 사용하여 진공 여과하고, ACN/물로 헹구고, 밤새 50 ℃로 진공 오븐에서 건조시켜 972 g의 조 3-아미노-2-클로로-6-플루오로퀴녹살린 (화합물 1)을 생성하였다. 반응을 동일한 규모로 2회 반복하여 954 g의 조 화합물 1을 생성하였다. 배합된 생산물 (1.92 kg)을 30분 동안 27 kg 물 중에서 슬러리화히고, 이어서 여과하고, 50 ℃에서 진공하에 약 40시간 동안 건조시켜 1.90 kg의 염분이 제거된 조 화합물 1을 생성하였다. 물질의 일부 (0.63 kg)를 75-80 ℃에서 아세토니트릴 (55 kg) 중에 분해시켜 재결정화하고, 주변 온도로 냉각시켰다. 케이크를 여과로 단리하고, 5 ℃에서 약 20시간 동안 건조시켰다. 0.286 kg의 일부 정제된 화합물 1을 수득하였다 (HPLC: 98.9%, 1.0% 구조이성질체). 재결정화 공정의 다음 반복을 위하여 대부분의 고체를 반응기 중에 남겼다. 0.63 kg의 조 물질로부터 다시 시작하여, 이번에는 76 kg의 아세토니트을 활용하고릴 (제1 부분으로부터의 고체를 설명하기 위하여), 0.686kg를 회수하였다 (HPLC: 98.8%, 0.9% 구조이성질체). 최종적으로, 마지막 부분 (0.63 kg)을 이전과 같이 55 kg의 아세토니트릴로부터 재결정화하여 0.505 kg의 단리된 생성물 (HPLC: 98.8%, 0.9% 구조이성질체)을 수득하였다. 전체 수율은 1.48 kg의 화합물 1 이었다 (62% 전체 수율).
실시예 13D: 화합물 2의 생산
100 L 둥근바닥 플라스크에 3-아미노-2-클로로-6-플루오로퀴녹살린 (화합물 1, 1.48 kg, 7.49 mol) 및 THF (26.7 kg)를 첨가하였다. 이어서, 20 ± 10 ℃의 온도를 유지하기 위하여 MeOH 중 25 wt% NaOCH3 (12.1 kg, 56.0 mol, 7.5 equiv)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. HPLC는 출발 물질이 소모되었음을 나타냈다. 용액을 감압하에 약 21 L로 농축시키고, 이어서, 디클로로메탄 (DCM, 34 kg) 및 물 (34 kg) 중에 분배하였다. 수성층을 분리하고, 이어서, 유기층을 또 다른 부분의 DCM (34 kg)으로 추가로 희석하였다. 수성 층의 pH가 5에 도달할 때까지 유기층을 세척하였다 (4 Х 19 kg 세척). 유기층을 농축시켜 고체를 생성하였다. 고체를 DCM (2.1 kg) 중에 슬러리화하고, 여과하고, 물기있는 케이크를 DCM (1 Х 5 kg)으로 세척하였다. 물기있는 케이크를 진공하 44 ℃에서 밤새 건조시켜, HPLC: 97.0% (0.7% 구조이성질체)인 1.06 kg의 3-아미노-6-플루오로-2-메톡시퀴녹살린 (화합물 2)를 생성하였다 (73.3% 수율).
실시예 13E: 화합물 3의 생산
100 L 반응기에 3-아미노-6-플루오로-2-메톡시퀴녹살린 (화합물 2, 1.06 kg, 5.48 mol), DCM (21.4 kg) 및 피리딘 (0.63 kg, 7.97 mol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 교반하고, 이어서, 온도를 30 ℃ 이하로 유지하면서 에틸 클로로포르메이트 (872 g, 8.0 mol, 1.46 equiv)를 서서히 첨가하였다. 실온에서 18.5시간 후, 반응은 완료되지 않은 것으로 밝혀졌다. 보다 많은 에틸 클로로포르메이트 (174 g, 1.6 mol) 및 피리딘 (126 g, 1.6 mol)을 첨가하였다. 이어서, 실온에서 추가 28.5 시간 혼합한 후, HPLC 분석으로 반응을 완료하였다. pH가 5.8을 달성할 때까지 탈염수로 유기상을 추출하였다 (4 Х 16.1 kg). 유기층을 황산 마그네슘 (970 g)으로 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 건조하였다. 이어서, 에틸 아세테이트 (3.2 kg)를 채우고, 생성된 고체를 진공 여과로 수집하였다. 물기있는 케이크를 에틸 아세테이트 (1.3 kg)로 세척하고, 진공하 43 ℃에서 밤새 건조시켜 에틸-N-(6-플루오로-2-메톡시퀴녹살린-3-일) 카르보네이트 (화합물 3)을 수득하였다 (HPLC 순도 100%, 1.116 kg, 76.7% 수율).
실시예 13F: RX-5902의 생산
100 L 반응기에 1-(3,5-디메톡시페닐) 피페라진 HCl (DMPP, 1.588, 6.14 mol), 에틸-N-(6-플루오로-2-메톡시퀴녹살린-3-일) 카르보네이트 (화합물 3, 1.12 kg, 4.22 mol) 및 THF (30.6 kg)을 첨가하였다. 혼합물을 주변 온도에서 15분 동안 교반하고, 1,8-디아자비사이클로운데크-7-엔 (DBU, 2.444 kg, 14.7 mol)을 첨가하였다. 혼합물을 환류하에 약 4시간 동안 혼합하고 (~66 ℃), 이어서, 반응 완료를 위해 샘플링하였다 (HPLC 결과: 1.1% 화합물 3 잔류). 반응이 완료된 것으로 간주하였다. 혼합물을 진공하에 ~11 L 부피로 농축시켰다. 용액을 DCM (20.2 kg)으로 희석하고, ~12 kg의 1M HCl로 세척하였다. 수성 폐기물 층의 pH가 5-6이 될 때까지 4 Х 10 kg 부분의 물로 추가로 유기층을 세척하였다. 유기층을 무수 황산 마그네슘 (1.2 kg) 상에 건조시키고, 뷰흐너 깔때기를 통해 여과하였다. 케이크를 5 kg의 DCM으로 헹구고, 여액을 진공하에 6 L의 최종 부피로 농축시켰다. 이어서, 헵탄 (0.868 kg)을 첨가하고, 10-15 ℃에서 약 16L 동안 슬러리를 혼합하였다. 슬러리를 여과하고, 헵탄 (2.62 kg)으로 세척하였다. 이어서, 물기있는 케이크 (2.45 kg)를 진공 오븐에서 건조시켰다. 66 ℃에서 약 48시간 후, IP (In Process) 시험이 한계를 초과하는 THF (4506 ppm) 및 DCM (3250 ppm)인 것으로 나타났다. 66 ℃에서 추가 96시간 후, 단지 THF (1141 ppm) 만이 한계를 초과했다. 66 ℃에서 추가 24시간 후, 잔류 THF는 770 ppm까지 떨어졌다. 최종적으로, 67 ℃에서 추가의 또 다른 24시간 후, THF 수준은 통과 수준 (679 ppm)으로 떨어졌다. 이어서, 오븐으로부터 물질을 제거하여 회백색 고체로 RX-5902를 생성하였다 (1.514 kg, 81.2% 수율). HPLC: NMT 0.50%의 사양 한계 0.82% 초과의 RRT 0.57 불순물.
질량 분광분석으로 확인된 RRT 0.57는 탈메틸화된 형태의 RX-5902에 상응하는 것으로 여겨진다.
실시예 13G : RX-5902의 정제
100 L 반응기에 실시예 13F로부터의 RX-5902 (1.318 kg, 2.99 mol) 및 DCM (17.5 kg)을 첨가하였다. 용액을 ~7 kg의 0.5 M NaOH (aq)로 세척하였다. 수성 폐기물 층의 pH가 5-6이 될 때까지 4 Х 5.3 kg 부분 물로 추가로 유기층을 세척하였다. 유기층을 무수 황산 마그네슘 (0.6 kg) 상에 건조시키고, 뷰흐너 깔때기를 통해 여과하였다. 케이크를 2 kg의 DCM으로 헹구고, 여액을 진공하에 4 L의 최종 부피로 농축시켰다. 헵탄 (2.70 kg)을 첨가하고, 10-15 ℃에서 ~15시간 동안 슬러리를 혼합하였다. 슬러리를 여과하고 헵탄 (1.86 kg)으로 세척하였다. 이어서, 물기있는 케이크를 진공 오븐에서 건조시켰다. 55 ℃에서 ~48시간 후, IP 시험은 모든 용매의 통과 수준을 나타냈다. 물질을 오븐으로부터 제거하여 회백색 고체로 RX-5902를 생성하였다 (1.14 kg, 86.5% 회수).
실시예 14: RX-5902의 고정상 반응기/대규모 생산 (배치 35921A의 제조)
하기 세부사항에 따라, 고정된 35, 100, 124, 200 및 300 갤런 유리, 스테인리스 및 Hastelloy lined reactor 및 스테인리스 스틸 또는 Hastelloy Aurara filter를 사용한 개선된 공정에 따른 조건하에서 RX-5902의 10.96 kg의 cGMP 배치 생산을 수행하였다.
실시예 14A: 화합물 A의 생산
35 갤런 반응기를 1,2-디아미노-4-플루오르벤젠 (7.50 kg, 59.46 mol, ChemiK), 옥살산 (5.35 kg, 59.42 mol) 및 3 M HCl 용액 (95.8 kg 물 및 37.8 kg conc. 염산)으로 채웠다. 거무스름한 혼합물을 환류 온도 (100±5 ℃)에서 ~21시간 동안 가열하였다. 분액 (1 mL)를 취하고, 포화 NaHCO3 용액 (30 mL)으로 pH 8로 중화시켰다. HPLC 분석으로써 출발 물질이 완전히 소모되었음을 나타냈다.
가열로부터 혼합물을 제거하고, 주변 온도로 냉각시키고, 이어서 찬물 (55 kg)을 첨가하였다. 어두운색 고체를 침전시키고, 진공 여과로 이를 수집하였다. 필터 케이크를 찬물 (50.0 kg)에 이어서 이소프로필 알콜 (IPA, 39.14 kg)로 세척하였다. 이어서, 물기가 있는 케이크 (11.43 kg)를 진공 오븐 (50±5 ℃)에서 밤새 건조시켜 10.3 kg의 6-플루오로-1,4-디히드로퀴녹살린-2,3-디온 (화합물 A)를 >99%의 HPLC 순도를 갖는 청회색 고체 (96% 몰 수율)를 생성하였다. 동일한 규모로 공정을 반복하여 9.95 kg (>99%)를 제공하였다.
실시예 14B: 화합물 B의 생산
200 갤런 반응기에 6-플루오로-1,4-디히드로퀴녹살린-2,3-디온 (화합물 A, 20.25 kg, 112.41 mol), DMF (2.20 kg) 및 클로로포름 (310.3 kg)을 첨가하였다. 염화티오닐 (40.95 kg)을 첨가하고, 온도를 <25 ℃로 유지하였다. 혼합물을 50-55 ℃에서 환류시켰다. 21시간 후, HPLC 분석을 위하여 샘플을 취하였다. HPLC 분석은 출발 물질이 완전히 소모되어 97.7% (면적으로)의 화합물 B를 나타냈다. 반응 혼합물을 주변 온도 (25±5 ℃)로 냉각시키고, DI 물 (64.7 kg)을 반응 혼합물에 서서히 첨가하였으며, 이는 열 및 가스의 방출로 이어졌다. 이어서, 0.5 M NaOH (64.7 kg)를 서서히 첨가했다. 전체 퀀치를 13시간 교반하여 과량의 SOCl2가 분해되도록 하였다. 유기층을 8 Х 32.8 kg 물로 세척하였다.
유기상 (200 갤런 반응기 내)을 약 3 갤런이 남을때까지 상압 증류로 농축시켰다. 증류가 진행됨에 따라, 헵탄 (69.5 kg)을 증류 포트에 첨가하였따. 포트 온도가 70 ℃를 초과 (70.3 ℃)할 때까지 증류를 지속하였다. 포트를 10-15 ℃로 냉각시키고, 12시간 동안 교반하였다. 슬러리를 여과하고, 헵탄 (2 Х 16.0 kg)으로 세척하였다. 생성된 물기가 있는 고체 (20.65 kg)를 가열 없이 진공 오븐내 45±5℃에서 25시간 동안 건조시켜 97.7%의 HPLC 순도로 14.80 kg의 2,3-디클로로-6-플루오로퀴녹살린 (화합물 B)(64.5% 수율)을 생성하였다.
낮은 수율로 인해, 모액 (the mother liquor)을 재처리하였다. 약 30 갤런이 제거될 때까지 (포트 내 ~12 갤런 잔류) 진공하에서 모액을 증류시켰다. 재킷 (jacket)을 40 ℃로 설정하였다. 증류가 완료되면, 현탁액을 10-15 ℃ (실제 13.2 ℃)로 냉각시키고, 3시간 이상 교반하였다. 슬러리를 여과하고, 헵탄 (2 Х 16.0 kg)으로 세척하였다. 생성된 물기가 있는 고체 (10.50 kg)를 45±5 ℃에서 18시간 이상 동안 진공 오븐에서 건조시켜 98.4%의 HPLC 순도로 3.62 kg의 2,3-디클로로-6-플루오로퀴녹살린 (화합물 B, 두번째 포트)를 생성하였다. 전체 수율은 75.5% (18.45 kg)였다.
실시예 14C: 화합물 1의 생산
200 갤런 반응기에 2,3-디클로로-6-플루오로퀴녹살린 (화합물 B, 18.45 kg, 85.01 mol), 아세토니트릴 (448.60 kg) 및 수산화 암모늄 (169.80 kg)을 첨가하였다. 혼합물을 50 ℃에서 거의 24시간 동안 교반하였다. HPLC 분석은 잔여 출발 물질이 없다는 것을 나타냈다. 배치를 45±5 ℃로 냉각시키고, 거의 25시간 동안 교반하였다. 고체를 진공 여과하고, 물 (2 Х 14.0 kg) 및 아세토니트릴 (2 Х 36.1 kg)로 세척하였다. 물기가 있는 케이크 (16.70 kg)를 진공하에 50 ℃에서 49시간 동안 밤새 건조시켜 3-아미노-2-클로로-6-플루오로퀴녹살린 (화합물 1, 12.20 kg, 72.7% 수율)을 생성하였다. 화합물 1을 수득하였다 (HPLC: 97.86%, 1.83% 구조이성질체).
실시예 14D: 화합물 2의 생산
200 갤런 글라스 라인 반응기 (glass-lined reactor)에 3-아미노-2-클로로-6-플루오로퀴녹살린 (화합물 1, 12.10 kg, 61.23 mol) 및 THF (212.20 kg)에 이어서, MeOH (91.80 kg) 중 25 wt% NaOCH3를 첨가하여 20±10 ℃의 온도를 유지하도록 하였다. 혼합물을 주변 온도에서 ~4시간 동안 교반하였다. HPLC는 출발 물질이 소모되었다는 것을 나타냈다. 내부 온도를 <35 ℃로 유지하면서 물 (43.50 gal)을 첨가하였다. ~55 갤런이 남을 때까지 (~63 갤런이 제거됨) 상압 증류를 통해 용액을 농축시켰다. 용액의 온도를 15-20 ℃로 냉각시키고, ~18시간 동안 교반하였다. 슬러리를 여과하고, 물 (2 Х 8.0 갤런)로 세척하였다. 생성된 물기 있는 고체를 50±5 ℃에서 진공 오븐 내 거의 96시간 동안 건조시켜, 99.1%의 HPLC 순도를 갖는 7.40 kg의 3-아미노-6-플루오로-2-메톡시퀴녹살린 (화합물 2) (62.6 % 수율)을 생성하였으며; 구조이성질체는 검출되지 않았다.
실시예 14E: 화합물 3의 생산
100 갤런 반응기에 3-아미노-6-플루오로-2-메톡시퀴녹살린 (화합물 2, 7.40 kg, 38.30 mol), DCM (144.6 kg) 및 피리딘 (3.6 kg)을 첨가하였따. 혼합물을 주변 온도에서 교반하고, 이어서, 온도를 <30 ℃으로 유지하면서 에틸 클로로포르메이트 (6.9 kg, 63.58 mol)를 서서히 첨가하였다. 주변 온도에서 21.5시간 후, 반응이 완료된 것을 관찰하였다. 유기상을 pH가 5.8이 될 때까지 DI 물 (3 Х 16.4 갤런)로 유기상을 세척하였다. 유기상을 ~16 갤런이 남을 때까지 대기압하에 증류시켰다. 증류 동안 에틸 아세테이트 (47.4 kg)를 첨가하였다. 현탁액을 10-15 ℃로 냉각시키고, 22시간 동안 교반하였다. 고체를 진공 여과로 수집하고, 에틸 아세테이트 (2 Х 8.3 kg)로 세척하고, 진공하에 40±5 ℃에서 밤새 건조시켜 (7.8 kg, 물기있음), 에틸-N-(6-플루오로-2-메톡시퀴녹살린-3-일) 카르보네이트 (화합물 3)을 수득하였다 (7.30 kg, 71.8% 수율). HPLC: 100%; 구조이성질체는 검출되지 않았다.
낮은 회수율로 인해, 상기로부터 모액을 이의 원래 부피 (17 L)의 약 절반으로 진공하에 농축시켰다. 고체를 여과하고, 에틸 아세테이트 (2 Х 1.5 L)로 헹궜다. 물기가 있는 케이크 (1.6 kg)를 40±5 ℃에서 36시간 동안 건조시켜 추가로 1.35 kg의 화합물 3 (E-166)을 생성하였다. 전체 수율은 85.1% (8.65 kg)였다.
실시예 14F: RX-5902의 생산
200 갤런 반응기에 1-(3,5-디메톡시페닐) 피페라진 HCl (DMPP) (12.50 kg, 48.31 mol), 에틸-N-(6-플루오로-2-메톡시퀴녹살린-3-일) 카르보네이트 (화합물 3, 8.65 kg, 32.61 mol) 및 THF (249.6 kg)을 첨가하였다. 혼합물을 주변 온도에서 15분 동안 교반하고, DBU (17.60 kg, 115.6 mol)를 첨가하였다. 혼합물을 환류 온도 (~66 ℃)에서 ~4시간 동안 혼합하고, 20±10 ℃로 냉각시켰다. HPLC로 분석한 샘플은 반응이 완료되었음을 나타냈다 (HPLC 결과: 잔여 0.6% 화합물 3 대비 NMR 2.0%의 IP 시험 한계). 혼합물을 진공하에 ~86 L 부피로 농축시켰다. 용액을 DCM (159.70 kg)로 희석하고, 1M HCl (24.1 갤런 물 중 8.9 kg conc. HCl)으로 세척하였다. 수성 폐기물 층의 pH가 5-6이 될 때까지 물 (4 Х 30.0 갤런)으로 추가로 유기층을 세척하였다. 수성 폐기물 층의 pH가 5-6이 될 때까지 유기층을 0.5 N 수산화나트륨 (50% 수산화나트륨 2.9 kg 및 18.6 갤런의 물)으로 추가로 세척하고, 물 (3 Х 25.0 갤런)로 세척하였다. 유기층을 황산 마그네슘 (9.5 kg) 상에서 건조시키고, 뷰흐너 깔때기를 통해 여과하였다. 케이크를 DCM (19.5 kg)으로 헹구고, 이어서, 여액을 진공하에 DCM (19.5 kg)으로 농축시켰다. 진공하에서 여액을 47 L의 최종 부피로 농축시켰다. 헵탄 (7 kg)을 첨가하고, 슬러리를 10-15 ℃에서 ~16시간 동안 혼합하였다. 슬러리를 여과하고, 헵탄 (21 kg)으로 세척하였다. 물기가 있는 케이크 (15 kg)를 진공하에 60 ℃에서 ~48시간 동안 건조시켰다. IP 시험은 THF (10,800 ppm) 및 DCM (15,395 ppm) 한계를 초과하는 것으로 나타났다. 60 ℃에서 추가 86시간 후, 모든 용매 수준은 잔여 용매 사양을 통과하였다. 오븐으로부터 물질을 제거하여 회백색 고체 (10.965 kg, 76.2% 수율)를 수득하였다.
실시예 15: 이전에 제조된 RX-5902의 1.3 kg 배치 - 재가공을 위한 RX-5902 나노제형 처리
실시예 15A: RX-5902의 100mg/g 나노현탁액
실시예 15A1 - 서브-배치 1
YTZ® Grinding Media (9 kg)를 세정 용액 (Alconox)으로 세척하고, 정제수 (Ricca Chemical Company)로 헹궜다. 5 ml의 세정제 (cleanser) 및 500 mL의 정제수를 혼합하여 세정 용액을 제조하였다. 매질을 3개 내열성 용기에 균등하게 나누었다. 용기 입구를 감싸는 백의 투과성 측면을 갖는 오토클레이브 백 중에 각 용기를 동봉하였다. 검증된 살균 사이클 (250 ℉로 45분간, 35분간 건조 시간, 참조 (PSSOP 50042 "Operation, Maintenance and Clearing of the Tuttnauer 2540EA Electronic Table-Top Autoclave))을 사용하여 Tuttnauer 2540EA Electronic Table-Top Autoclave를 멸균하고, 매질의 용기를 오븐에 두어 110 ℃에서 밤새 건조하였다.
하기의 소모품 및 실험기구를 세정 용액으로 세정하고, 청정실 (cleanroom)로 옮겼다: 밀링 용기 (x3), 교반 플레이트, 깔때기, 일회용 스파츌라, 무게 용기, 마그네틱 교반기, 마그네틱 교반기 리트리버 및 이동 피펫. 제조 제품에 자기 온습계 (hydrothermograph)를 설치하고, 습도 및 온도를 기록하였다. 아이솔레이터에 저울을 설치하고, 1일 검증을 수행하였다.
폴록사머 407, NF (Spectrum)을 측량하고, 각 용기에 채워넣었다. 용기 A에 10.68 g를 채우고, 용기 B에 10.64 g 및 용기 C에 10.70 g을 채웠다. 각각의 3개 용기에 주사용 증류수 USP (WFI)를 채웠다. 용기 A에 299.57 g 및 용기 B에 300.62 g를 채우고, 용기 C에 301.19 g를 채웠다. 교반 막대를 각 3개 용기에 배치하고, 폴록사머 407, NF가 WFI에 뚜렷하게 용해될 때까지 교반 플레이트를 사용하여 혼합하였다.
각 3개 용기에 깔때기로 RX-5902 (Pfanstiehl)를 첨가하였다. 용기 A에 133.16 g, 용기 B에 133.19 g를 채우고, 용기 C에 133.41 g를 채웠다. 교반 플레이트를 사용하여 RX-5902가 뚜렷하게 분산될 때까지 용기내 내용물을 교반하였다. 교반 막대를 마그네틱 리트리버를 이용한 각 3개 용기에서 제거하였다. 1개 용기의 내용물을 깔때기로 밀링 용기 안에 채웠다. 밀링 용기의 실 (thread)를 검사하여 밀링 매질로부터 실이 자유롭다는 것을 확인하였다. 누출 방지를 위해 밀링 용기의 뚜껑을 조이고 밀봉하였다.
밀링 용기의 외부를 오염 제거하고, 아이솔레이터로부터 제거하였다. 한 조각의 반사 물질을 밀링 용기에 부착하고, 밀링 용기를 롤러 밀에 부착하였다. 밀을 활성화시키고, 용기 내부 계단식 매체가 수평으로부터 45 내지 60°의 파단각 (angle-of-break)이 (육안으로) 달성될 때까지 회전 속도를 조절하였다. 회전 속도계를 사용하여 밀링 용기의 회전 속도를 측정하였다. 각 3개 용기를 밀링 용기로 옮기고, 상기 기재된 동일한 일반 절차에 따라 제조하였다.
각 3개 밀링 용기는 90 RPM (분당 회전수)으로 18.75 시간 동안 롤러 밀링되었다. 롤러 밀링이 완료된 후, 용기 외부의 오염을 제거하고 클린 벤치 (laminar-flow hood)로 옮겼다. 밀링 용기에 따라 자기 온습계를 동일한 제조 제품으로 옮겼다. 멸균 피펫을 사용하여 각 밀링 용기로부터 1 mL의 샘플을 취하고, 샘플을 바이알로 옮겼다.
레이저 회절법으로 3개 샘플의 입자-크기 분포를 분석하였다. 샘플의 허용 기준치는 D90 < 1 ㎛ (레플리케이트(replicate) 및 평균)이고, 단정 분포 프로파일이었다 (즉, 분포가 단지 약간의 2차 피크가 허용되는 하나의 주 피크를 포함). 각 용기의 결과는 하기와 같았다:
Figure pct00008
각 3개 용기는 허용 기준치를 충족하였다. 서브-배치 1로부터의 3개 용기를 마치고, 추출을 수행할 수 있을 때까지 2 내지 8 ℃에 저장하였다.
실시예 15A2 - 서브-배치 2
동일한 방법으로 제2 서브-배치를 제조하였다. 용기를 하기와 같이 채웠다:
Figure pct00009
각 3개 밀링 용기는 90 RPM (분당 회전수)으로 19.25 시간 동안 롤러 밀링되었다. 롤러 밀링이 완료된 후, 용기 외부의 오염을 제거하고 클린 벤치로 옮겼다. 밀링 용기에 따라 자기 온습계를 동일한 제조 제품으로 옮겼다. 멸균 피펫을 사용하여 각 밀링 용기로부터 1 mL의 샘플을 취하고, 샘플을 바이알로 옮겼다.
레이저 회절법으로 3개 샘플의 입자-크기 분포를 분석하였다. 샘플의 허용 기준치는 D90 < 1 ㎛ (반복 및 평균)이고, 단정 분포 프로파일이었다 (즉, 분포가 단지 약간의 2차 피크가 허용되는 하나의 주 피크를 포함). 각 용기의 결과는 하기와 같았다:
Figure pct00010
각 3개 용기는 허용 기준치를 충족하였다. 서브-배치 2로부터 3개 용기를 마치고, 추출을 수행할 수 있을 때까지 2 내지 8 ℃에 저장하였다.
실시예 15A3 - 서브-배치 3
동일한 방법으로 제3 서브-배치를 제조하였다. 용기를 하기와 같이 채웠다:
Figure pct00011
각 3개 밀링 용기는 90 RPM (분당 회전수)으로 19.5 시간 동안 롤러 밀링되었다. 롤러 밀링을 중단하고, 용기 외부의 오염을 제거하고 클린 벤치로 옮겼다. 밀링 용기에 따라 자기 온습계를 동일한 제조 제품으로 옮겼다. 멸균 피펫을 사용하여 각 밀링 용기로부터 1 mL의 샘플을 취하고, 샘플을 바이알로 옮겼다.
레이저 회절법으로 3개 샘플의 입자-크기 분포를 분석하였다. 샘플의 허용 기준치는 D90 < 1 ㎛ (반복 및 평균)이고, 단정 분포 프로파일이었다 (즉, 분포가 단지 약간의 2차 피크가 허용되는 하나의 주 피크를 포함). 각 용기의 결과는 하기와 같았다:
Figure pct00012
3개 용기 중 어느 것도 허용 기준치를 충족하지 못했다.
용기 G, H 및 I를 다시 밀봉하고, 다시 롤러 밀링하였다. 밀링을 22.5시간 동안 지속하였다. 밀링 용기에 따라 자기 온습계를 동일한 제조 제품으로 옮겼다. 멸균 피펫을 사용하여 각 밀링 용기로부터 1 mL의 샘플을 취하고, 샘플을 바이알로 옮겼다.
레이저 회절법으로 3개 샘플의 입자-크기 분포를 분석하였다. 샘플의 허용 기준치는 D90 < 1 ㎛ (반복 및 평균)이고, 단정 분포 프로파일이었다 (즉, 분포가 단지 약간의 2차 피크가 허용되는 하나의 주 피크를 포함). 각 용기의 결과는 하기와 같았다:
Figure pct00013
각 3개 용기는 허용 기준치를 충족하였다. 서브-배치 3으로부터의 3개 용기를 마치고, 추출을 수행할 수 있을 때까지 2 내지 8 ℃에 저장하였다.
실시예 15B: 서브-배치의 추출
하기의 추출용 소모품 및 실험기구를 준비하였다: 추출 용기 (x9), 깔때기, 배관, 고정기, 일직선 공기 여과기, 이동 피펫 및 여과 깔때기. 저울을 70% 이소프로판올로 닦았다. 이러한 소모품을 청정실로 옮겼다.
청정실에 질소 탱크를 설치하여 공기 필터에서 호스로 연결시키고, 호스를 질소 탱크로 연결하였다. 제조 제품에 자기 온습계를 설치하고, 온도를 기록하였다.
하기와 같은 추출 공정을 사용하여 9개 서브-배치 (A-I)를 제조하였다. 빈 수집 용기를 측량하고, 여과 깔때기 아래에 배치하였다. 밀링 용기 A의 내용물을 여과 깔때기에 붓고, 압축 질소 하에 현탁액을 추출하였다. WFI를 밀링 용기에 채웠다. 내용물을 여과 깔때기에 붓고, 압축 질소를 사용하여 추출하였다. WFI를 밀링 용기에 채웠다. 내용물을 여과 깔때기에 붓고, 압축 질소를 사용하여 추출하였다. 수집 용기를 측량하여 순 현탁액 무게를 산출하였다.
수집 용기를 수동으로 휘저어 내용물을 혼합하였다. 멸균 이동 피펫을 사용하여, 분석 시험용 샘플 및 QA 샘플을 제거하였다. 수집 용기의 최종 무게를 기록하였다.
공정-중 분석이 완료될 때까지 모든 서브-배치를 2 내지 8 ℃에 저장하였다.
9개 서브-배치의 수율 및 방출 가능한 양은 하기와 같다:
Figure pct00014
9개 서브-배치로부터 합한 전체 공정 무게는 11287.95 g (94% 수율)이고, 전체 방출량은 11257.21 g이다.
실시예 15C: 동결건조하여 83% RX-5902 나노제형 분말을 산출함
각 9개 서브-배치에서의 RX-5902의 양을 각각의 서브-배치의 분석에 기반하여 계산하였다. 각 서브-배치에서의 분석량, 최종 현탁액 중량 및 RX-5902 양은 하기와 같이 관찰되었다:
Figure pct00015
9개 서브-배치에서의 RX-5902의 총량은 1168.14 g였다.
동결건조 공정을 위하여 하기의 소모품, 원료, 장비 및 실험기구를 준비하고, 청정실로 옮겼다: 저울, 타이머, 자기 온습계, 대형 현탁 용기, 마그네틱 교반기, 교반 플레이트, 마그네틱 교반기 리트리버, 무게 용기, 스파츌라 및 대형 동결건조 트레이. 제조 제품에 자기 온습계를 설치하고, 온도 및 습도 조건을 기록하였다.
클린 벤치에서, 모든 서브-배치를 대량 용기에서 배합하였다. 교반 막대를 추가하여 내용물을 혼합하였다. 대형 현탁 용기에 폴록사머 407, NF (146.27 g, 스펙트럼)을 첨가하였다. 대형 현탁 용기의 내용물을 폴록사머 407, NF가 육안으로 완전히 용해될 때까지 혼합하였다. 혼합을 중단하고 교만 막대를 제거하였다.
각각의 8개 대형 동결건조 트레이에 대형 현탁 용기 내용물의 ~1/8th를 첨가하였다. 8개 트레이의 각 뚜껑을 닫았다. 8개 트레이를 동결건조기에 옮기고, 동결건조기 문을 닫고 밀봉하였다. 자기 온습계를 중단하였다.
동결건조기의 쉘프 온도 (shelf temperature)를 -40 ℃로 조정하고, "Freeze Shelf" 기능을 작동시켰다. 트레이를 66.75 시간 이상 동안 완전히 동결시켰다. 응축기를 작동시키고 -53 ℃에 도달시켰다. 이어서, 쉘프 온도를 -25 ℃로 설정하고, 진공 세팅을 1차 건조 동안 250 mTorr로 설정하였다. ~18일 후, 최종 피라니 게이지 (Pirani gauge) (284 mTorr) 및 정전 압력계 (250 mTorr) 판독치 간의 차이는 이전의 피라니 게이지 (285 mTorr) 및 정전 압력계 (250 mTorr) 판독치의 <1% 였다. 1차 건조가 완료된 것으로 간주하였다.
~30분 간격으로, 쉘프 세팅이 20 ℃일 때까지 쉘프 온도 세팅을 +5 ℃씩 증가시켰다. ~4일 후, 최종 피라니 게이지 (486 mTorr) 및 정전 압력계 (500 mTorr) 판독치 간의 차이는 이전의 피라니 게이지 (486 mTorr) 및 정전 압력계 (500 mTorr) 판독치 간의 차이의 <1% 였다. 제2 건조가 완료된 것으로 간주하였다. 쉘프 조절 및 응축기를 껐다. 진공을 작동시키고, 해제하였다.
모르타르 및 막자를 세정 용액으로 세척하고, 정제수 (Ricca Chemical Company)로 헹궜다. 5 mL의 세정제 및 500 mL의 정제수를 혼합하여 세정 용액을 제조하였다. 모르타르 및 막자를 백의 투과성 측면이 위를 향하게 하여 오토클레이브 백 중에 놓았다. 검증된 살균 사이클 (250 ℉로 45분간, 35분간 건조 시간, 참조: PSSOP 50042 "Operation, Maintenance and Clearing of the Tuttnauer 2540EA Electronic Table-Top Autoclave)을 사용하여 Tuttnauer 2540EA Electronic Table-Top Autoclave를 멸균하고, 모르타르 및 막자를 함유하는 백을 오븐에 두어 250 ℃에서 ~1 시간 동안 건조하였다. 제조 제품에 자기 온습계를 설치하고, 온도 및 습도 조건을 기록하였다.
건조된 트레이를 동결건조기로부터 제거하고, 제조 제품군으로 옮겼다. 보관 용기를 측량하고 (3911.45 g), 살균하고, 글러브-박스 아이솔레이터에 옮겼다. 동결 건조된 트레이를 닦고, 글러브-박스 아이솔레이터에 옮겼다. 모르타르 및 막자를 사용하여 동결건조물을 자유롭게 흐르는 분말로 부수었다. 분말을 보관 용기에 옮겼다.
보관 용기를 측량하고 (5508.47 g) 샘플링하였다. 균질성 시험용 상부 샘플 (1.15 g)을 보관 용기의 상부에서 제거하였다 (1.15 g). 시험 (4.48 g), QA 보유 (QA retain)(8.33 g)용 샘플 및 미세 시험 (11.00 g)용 샘플을 보관 용기의 중앙부로부터 제거하였다. 하부 균질성 시험용 샘플 (1.21 g)을 보관 용기의 하부로부터 제거하였다. 보관 용기를 다시 측량하고 (5280.12 g), 자기 온습계를 껐다.
공정 배치 크기를 1397.02 g (97% 공정 수율)로 계산하고, 방출용 배치 크기를 1368.67 g로 계산하였다. 배치용 분석 시험은 분석 사양의 모든 권고사항을 충족했다는 것을 나타냈다.
실시예 16: 고-에너지 밀링 및 건조
실시예 16A: 고-에너지 밀링된 물질의 생산
Netzsch DeltaVita 교반 밀 (agitator mill)은 150-mL 재순환 챔버 및 150-micron 배출구 스크린을 사용하여 조립되었다. 약 125 mL (0.5 kg)의 0.5-mm YTZ 세라믹 밀링 매질을 챔버에 첨가하고, 재순환 칠러를 사용하여 챔버를 10 ℃로 냉각시켰다. 밀링을 위하여, 출발 현탁액을 분당 약 100 mL의 밀로 펌핑하고 (MasterFlex 사이즈 15개 배관을 사용하여 48 rpm), 유입하는 현탁액을 더 분산시키기 위하여 교반기를 한번에 몇초 동안 작동시켜 밀을 주기적으로 "조깅 (jogging)"함으로써, 챔버를 프라이밍하였다. 일단 프라이밍 되면, 밀을 500 rpm의 교반속도 또는 1.8 m/s의 선단 속도로 작동시켰다. 밀이 자동적으로 중단되는 시점으로 증가된 현탁액 주입구에서의 배압으로서 불충분한 것으로 밝혀졌다. 이는 전형적으로 스크린을 통과하기에 너무 크거나, 또는 스크린 슬롯 내 응축하는 경향이 있는 API 입자에 의한 방해로 유발된다. 압력 상승을 방지하기 위하여, 2,000 rpm (7 m/s)에서 압력 증가 없이 시스템이 실행될 수 있을 때까지 교반기 속도를 점차적으로 증가시켰다.
18분 후, 현탁액의 D50은 약 1 micron으로 감소되었으며, 이는 공정-중 현탁액에 대한 최대 입자 크기로 이전에 사용되었던 비공식 한계이다. 밀링 90분 후, 현탁액이 고형화되고, 콜로이드의 전형적인 크기 범위로 입자를 감소시키는 경우 일반적이지 않은 현상이 발생했다. 약 150 mL의 추가 정제수를 밀링 저장소에 첨가함으로, API 농도가 20%로 되어, 밀링을 지속하기에 충분한 현탁액으로 액화시켰다. 현탁액을 총 240분 동안 밀링시켰고, 이 시점에서 입자-크기 분포는 도 14에 도시된 바와 같이 균일한 단정의 서브-미크론 입자 군을 나타냈다. 나노현탁액의 D10은 0.07284 ㎛, 중앙 크기는 0.10526 ㎛, D90은 0.15167 ㎛이다. 생성된 나노현탁액은 유체이고 균일했으며, 롤러-밀링된 현탁액에서 관측되었던 변색 또는 물리적 변화의 징후를 나타내지 않았다.
RX-5902의 결정 구조가 밀링 동안 변경되는지의 여부를 측정하기 위하여, DSC 및 X-레이 분말 회절로 나노입자를 시험하였다. 원심분리 여과 (Vivaspin)로 현탁액에서 나노입자를 제거하였다. 관련 폴록사머 제거를 위하여 정제수로 입자를 3회 세척하였다. 세척 후, 입자를 실리카 상에서 건조하였다. 도 15에 묘사된 DSC 분석은, 융해 개시점 (161 ℃) 및 저온 (50 ℃) 열 발생에서 약간의 감소를 나타냈으며, 이들 모두는 단리된 나노입자 내 폴록사머의 존재 (융해점 = 56 ℃)를 의미했다. 그러나, API의 상이한 결정형을 나타내는 다른 열 발생은 관찰되지 않았다. XRPFD 분석은 밀링된 및 밀링되지 않은 API의 결정 구조가 비슷하다는 것을 확증하였다.
실시예 16B: 고-에너지 밀링된 동결건조된 물질의 생산
실시예 15C의 동결건조법을 사용하여 실시예 16A의 고-에너지 밀링된 물질을 동결건조하여 고-에너지 밀링된 동결건조된 물질을 제조하였다.
실시예 16C: 고-에너지 밀링된 분무-건조된 물질의 생산
표 7에 개략된 파라미터를 사용하여 부이치 (Buchi) B-290 분무 건조기로 RX-5902 나노현탁액을 분무 건조하였다. 현탁액이 밀로부터 추출된 것이기 때문에, 임의의 부형제 또는 정제수의 첨가 없이 이를 사용하였다.
분무-건조 파라미터
파라미터 값
노즐 직경 1.40 mm
주입구 온도 100 C
흡입기 80%
펌프 속도 20%
Q-유동 50
분무 건조기의 건조 챔버에서 최소한의 물질 손실을 관찰하였다. 수집된 생성물은 정제수로 분산되는 자유-유동성 분말이었다. 레이저 회절법에 의한 입자-크기 측정은 도 16에 도시된 바와 같이 간결하며 반복가능한 분포를 제공하였고, 측정치를 표 8에 나타낸다.
RX-5902 나노입자의 크기
배치 평균 크기 D10 중앙 크기 D90
1 3.60752 ㎛ 1.99298 3.42597 5.48444
2 3.41835 1.93907 3.26357 5.08637
3 3.51103 1.95287 3.34039 5.30013
현미경 검사 결과 도 17 및 도 18에 도시된 바와 같이 비결정질 구형 마이크로입자에 함유된 결정형 나노입자의 존재를 나타냈다. 유리 결정 또는 결정 재성장의 증거는 관찰되지 않았으며, API의 용해 또는 침전이 승온의 건조에 영향받지 않는다는 것을 시사한다.
실시예 17: 정맥내 및 경구 투여 후 RX-5902의 경구 생체이용률의 측정
이러한 연구에서, 다양한 제형의 투여 후 수컷 스프라그-돌리 래트에서 RX-5905의 경구 생체이용률을 평가하였다. RX-5902를 정맥내 (IV) 및 경구 (PO) 투여로 투약하였다. 4가지 분말 제제를 Particles Sciences (Bethlehem, PA)로부터 공급받아, 이를 사용하여 다음의 투여 용액을 제조하였다: (제제 A): 밀링되지 않은 API (실시예 13에 따라 제조); (제제 B) 83% 동결건조된 GMP (실시예 15에 따라 제조); (제제 C) 83% 고-에너지 밀링되고 동결건조된 (실시예 16B에 따라 제조); 및 (제제 D) 93% 분무-건조된 (실시예 16C에 따라 제조).
각 동물의 투여 수준을 체중 및 투여된 시험 물질의 양에 기반하여 개별적으로 측정하였다. 각각의 투여량에 대해서, 추가 1mL의 용매를 첨가하고 투약하여 바이알 내 잔류하는 모든 API가 회수되는 경우 밀링되지 않은 API를 제외하고, 제형 분말의 적절한 양을 측량하고, 이어서, 1 mL의 적절한 용매를 첨가하고, 총 부피를 바로 투여하였다. 투여 후, 혈액 샘플을 투여-후 최대 24시간까지 수집하고, 시험 물질의 혈장 농도를 LC-MS/MS로 측정하였다. Phonenix WinNonlin (v6.4)를 사용하여 약물 동태학 파라미터를 측정하였다.
40.7 mg/kg 평균 투여량의 IV 투여 후, RX-5902 (83% GMP 동결건조된 케이크; 그룹 2)는 10.5 ± 2.46 시간의 평균 반감기를 갖는다. 이의 평균 제거율 (clearance rate)은 0.400 ± 0.0263 L/hr/kg이었다. 분포의 평균 부피는 5.60 ± 1.30 L/Kg 였다.
68 mg/kg 평균 투여량의 밀링되지 않은 RX-5902 (초순수 중 0.36% 폴록사머 407 내 밀링되지 않은 API)의 PO 투여 후, 최대 혈장 농도 (평균 743 ± 199 ng/mL)를 투여 후 2 내지 4시간에 관찰하였다. 평균 반감기는 측정할 수 없었으나; 래트 # 576에 대해 3.29 시간이었다. 투여량 표준화된 AUCLast에 기반한 평균 노출은 151 ± 25.2 hr*kg*ng/mL/mg 였다. 밀링되지 않은 RX-5902에 대한 평균 경구 생체이용률 (본원에 "밀링되지 않은 API"로도 지칭됨)은 68 mg/kg의 평균 투여량에서 7.62 ± 1.27% 였다.
65.9 mg/kg 평균 투여량의 동결건조된 RX-5902 (83% GMP 동결건조된 케이크; 그룹 3)의 PO 투여 후, 최대 혈장 농도 (평균 2027 ± 359 ng/mL)를 투여 후 2시간에 관찰하였다. 평균 반감기는 9.70 시간이었다. 투여량 표준화된 AUCLast에 기반한 평균 노출은 360 ± 129 hr*kg*ng/mL/mg 였다. RX-5902에 대한 평균 경구 생체이용률 (83% GMP 동결건조된 케이크)은 65.9 mg/kg의 평균 투여량에서 18.2 ± 6.53% 였다.
65.9 mg/kg 평균 투여량에서 고-에너지 밀링된 동결건조된 RX-5902 (83% 고-에너지 밀링된 동결건조된 케이크; 그룹 4)의 PO 투여 후, 최대 혈장 농도 (평균 2613 ± 692 ng/mL)를 투여 후 2시간에 관찰하였다. 평균 반감기는 7.99 시간이었다. 투여량 표준화된 AUCLast에 기반한 평균 노출은 456 ± 45.9 hr*kg*ng/mL/mg 였다. RX-5902에 대한 평균 경구 생체이용률 (83% 고-에너지 밀링된 동결건조된 케이크)는 65.9 mg/kg의 평균 투여량에서 23.0 ± 2.32% 였다.
66.2 mg/kg의 폴록사머 분무 건조된 RX-5902 [93% 분무 건조된 케이크 (SDM) + 0.23% 폴록사머 407; 그룹 5]의 PO 투여 후, 최대 혈장 농도 (평균 1270 ± 185 ng/mL)를 투여 후 2 내지 4시간에 관찰하였다. 평균 반감기는 측정할 수 없었으나; 반감기는 래트 # 588에 대해서 3.11였다. 투여량 표준화된 AUClast에 기반한 평균 노출은 200 ± 33.8 hr*kg*ng/mL/mg 였다. RX-5902 (93% 분무 건조된 케이크 (SDM) + 0.23% 폴록사머 407)에 대한 평균 경구 생체이용률은 66.2 mg/kg의 평균 투여량에서 10.1 ± 1.71% 였다.
65.6 mg/kg의 폴록사머가 없는 분무 건조된 RX-5902 [93% 분무 건조된 케이크 (SDM); 그룹 6]의 PO 투여 후, 최대 혈장 농도 (평균 1527 ± 627 ng/mL)를 투여 후 2 내지 4시간에 관찰하였다. 평균 반감기는 측정할 수 없었으나; 래트 # 589에 대한 반감기는 6.89 시간이었다. 투여량 표준화된 AUClast에 기반한 평균 노출은 293 ± 107 hr*kg*ng/mL/mg 였다. RX-5902 (93% 분무 건조된 케이크 (SDM))에 대한 평균 경구 생체이용률은 65.6 mg/kg의 평균 투여량에서 14.8 ± 5.40% 였다.
그룹 4 (83% 고-에너지 밀링된 동결건조된 케이크)에서 고-에너지 밀링된 동결건조된 RX-5902의 경구 투여는 평균 23%의 가장 높은 경구 생체이용률을 가졌다. 경구 생체이용률의 전반적인 순위는 그룹 4 (83% 고-에너지 밀링된 동결건조된 케이크) > 그룹 3 (83% GMP 동결건조된 케이크) > 그룹 6 [93% 분무 건조된 케이크 (SDM)] > 그룹 5 [93% 분무 건조된 케이크 (SDM) + 0.23% 폴록사머 407] > 그룹 1 (초순수 중 0.36% 폴록사머 407 내 밀링되지 않은 API) 이었다. 차별적으로 나노제형화된 물질인 RX-5902의 경구 생체이용률을 표 9에 나타낸다.
Figure pct00016
참고를 위하여, 금식한 수컷 및 암컷 개에서의 RX-5902 (나노밀링된 현탁액)에 대한 평균 경구 생체이용률은 각각 29.4% 및 21.4% 였다.
실시예 18: RX-5902 API 및 구조이성질체 불순물
요약 : RRT 0.975 불순물을 갖는 RX-5902의 분석 데이터의 비교를 수행하였다. 분석 데이터는 1H, 19F, 13C NMR, UV-Vis 흡광도 및 질량 분광분석 (LC-MS에 의한)으로 구성되었다. 모든 이용가능한 분석 데이터는 RRT 0.975 불순물이 RX-5902의 구조이성질체라는 것을 강력히 나타낸다.
배경 : RX-5902의 일부 조기 배치에서, 미지의 불순물이 HPLC 방법을 사용하여 분석된 주요 생성물 피크로부터 완전히 분해되지 않은 것으로 밝혀졌다. 주요 RX-5902 생성물 피크로부터 미지의 불순물 ("RRT 0.975 불순물")을 분해할 수 있는 신규 HPLC 방법을 개발하였다.
RRT 0.975 불순물의 존재를 측정하기 위하여, 15 g의 RX-5902의 생성 배치를 초임계 유체 크로마토그래피 (SFC)를 사용하여 분리하였다. RX-5902 분획 및 RRT 0.975 불순물 분획을 수득하였다. Synergi HydroRP 컬럼을 구비한 신규 HPLC 방법을 사용하여, RX-5902 분획을 분석하였고, 97.7 면적 (%)의 RX-5902 및 1.5 면적 (%)의 주요 불순물을 갖는 것으로 밝혀졌다. 또한, RRT 0.975 불순물 분획을 분석하여, 79.0 면적 (%)의 RRT 0.975 불순물 및 0.7 면적 (%)의 RX-5902를 갖는 것으로 밝혀졌으며; 따라서, 또한 4 불순물 각각이 >1 면적 (%)라는 것이 밝혀졌다.
1 H, 19 F, 13 C NMR 데이터
RX-5902 분획 및 RRT 0.975 불순물 분획에 대해 1H 및 19F 스펙트럼을 수득하였다. 13C NMR 스펙트럼을 RRT 0.975 불순물 분획에 대해서만 수득하였고, 이를 이전의 RX-5902 참조 표준 lot의 13C NMR 스펙트럼과 비교하였다.
구조이성질체성 중간체를 생성할 가능성이 있는 초기 합성 단계에 기반하여, 불소 원자가 인접한 원자 탄소상에 있다는 것에 의해, RRT 0.975 불순물이 또한 RX-5902의 구조이성질체인 것으로 추측된다. RX-5902는 화학식 C22H24FN5O4를 갖는다.
RRT 0.975 불순물의 제안된 구조
Figure pct00017
도 19는 RX-5902의 1H NMR 스펙트럼을 나타내고; 도 20은 RRT 0.975 불순물의 1H NMR 스펙트럼을 나타내고; 도 21은 RRT 0.975 불순물 (상부) 및 RX-5902 (하부)의 1H NMR 스펙트럼의 오버레이를 나타내고; 도 22는 RRT 0.975 불순물 (상부 플롯) 및 RX-5902 (하부 플롯)의 1H NMR 스펙트럼의 7.0-8.0 ppm 구간의 오버레이를 나타낸다.
2개 1H NMR 스펙트럼은 7.0-8.0 ppm 구간에서의 신호에 대해 관측된 소수의 화학적 이동으로, 매우 유사한 (특히, 분할 패턴)것으로 볼 수 있으며, 이러한 관측은 RRT 0.975 불순물이 RX-5902의 구조이성질체라는 것을 강력히 시사한다.
도 23은 RX-5902의 13C NMR 스펙트럼을 나타내고; 도 24는 RRT 0.975 불순물의 13C NMR 스펙트럼을 나타내고; 도 25는 RX-5902 (상부 플롯) 및 RRT 0.975 불순물 (하부 플롯)의 13C NMR 스펙트럼의 오버레이를 나타내고; 도 26은 RX-5902 (상부 플롯) 및 RRT 0.975 불순물 (하부 플롯)의 13C NMR 스펙트럼의 108-150 ppm 구간을 나타낸다.
2개 13C NMR 스펙트럼이 매우 유사한 것으로 볼 수 있으며, 이는 RRT 0.975 불순물이 RX-5902의 구조이성질체라는 것을 강력히 시사한다.
도 27는 RX-5902의 19F NMR 스펙트럼을 나타내고; 도 28은 RRT 0.975 불순물의 19F NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 27 및 28에 도시된 바와 같이, 2개 19F NMR 스펙트럼은 꽤 상이하다. 19F 화학적 이동이 RX-5902에 대해 -114.5 ppm인 반면, RRT 0.975 불순물에 대해서는 -112.0 ppm (4중항으로 나타남) 이었다. 이는, 불소 원자가 다소 상이한 환경에 있으며, RRT 0.975 불순물이 RX-5902의 구조이성질체라는 것을 다시금 강력히 시사한다.
UV-Vis 흡광도 데이터
동일한 HPLC방법을 사용하여 분리된 RX-5902의 생산 배치 (production batch)에 대해 UV-Vis 흡광도 데이터를 얻었다. 도 29에 도시된 바와 같이, 그래프는 RX-5902 (실선) 및 RRT 0.975 불순물 (점선) 모두가 매우 유사한 흡광도 스펙트럼을 갖는다는 것을 나타낸다. 이는 RRT 0.975 불순물이 RX-5902의 구조이성질체라는 가능성을 다시 강력히 지지한다.
LC-MS 데이터
도 30은 주요 RX-5902 생성물에 상응하는 17.9 min 피크의 LC-MS를 나타내고 (우측의 3개 그래프를 겹친 좌측 그래프); 도 31은 RRT 0.975 불순물에 상응하는 17.2 min 피크의 LC-MS를 나타내고 (우측의 3개 그래프를 겹친 좌측 그래프); 도 32는 RX-5902 및 RRT 0.975 불순물 모두가 464의 정확한 [M+Na]+ 질량을 갖는 다는 것을 의미하는 LC-MS 데이터를 나타내며, 이로 RRT 0.975 불순물이 RX-5902의 구조이성질체라는 결론을 다시금 지지한다.
결론: 분석 데이터 (1H, 19F, 13C NMR, UV-Vis 흡광도 및 질량 분광분석)을 비교한 결과는 RRT 0.975 불순물이 RX-5902의 구조이성질체라는 것을 강력히 나타낸다.
실시예 19: RX-5902의 X-레이 결정 구조
분석 방법
RX-5902의 단일 결정 X-레이 구조를 성장에 따른 결정을 사용하여 삼사정계 공간군 P-1 중 100 K에서 결정하였다. 비대칭 단위에는 완전히 정렬된 API 분자가 하나 있다. 최종 R1　[I>2σ(I)] = 4.77% 였다. XRPD 패턴을 결정 구조로부터 계산하고, 단일 결정 구조가 공급된 물질을 대표한다는 것을 나타낸다.
XRPD 분석을 위하여 PANalytical (X'Pert3 Powder) X-레이 분말 회절계 및 Si 제로 백그라운드 홀더를 사용하였다. 사용된 파라미터는 하기에 기재된다:
XRPD 시험을 위한 파라미터
파라미터 값
X-레이 파장 Cu, kα,
Kα1 (Å): 1.540598,
Kα2 (Å): 1.544426
Kα2/Kα1 강도 비율: 0.50
X-레이 튜브 세팅 45 kV, 40 mA
발산 슬릿
(Divergence slit)		 자동
스캔 모드 연속
스캔 범위 (º2TH) 3º-40º
단계 크기 (º2TH) 0.16
총 시간 (min) 4 min
실시예 19A: RX-5902 나노제형의 XRPD
실시예 16B의 방법에 따라 제조된 RX-5902 나노제형으로부터의 입자의 XRPD를 측정하였다. 도 33에 도시된 바와 같이, RX-5902는 결정성이었다. 상세한 XRPD 피크 확인을 하기에 확인한다:
RXN1490A-001-4 (B004194-12-A)의 XRPD 피크 선별
Pos.
[°2Th.]		 높이
[cts]		 FWHM left
[°2Th.]		 d-공간
[Å]		 Rel. Int. [%]
6.642046 348.056300 0.230256 13.30800 15.42
8.558004 2079.155000 0.204672 10.33244 92.11
12.968890 320.995500 0.127920 6.82647 14.22
14.346660 876.465800 0.102336 6.17385 38.83
14.753260 178.574600 0.102336 6.00460 7.91
15.328680 765.607200 0.153504 5.78046 33.92
15.574780 1790.413000 0.153504 5.68967 79.32
15.850830 1411.945000 0.102336 5.59121 62.55
16.970760 1003.171000 0.281424 5.22467 44.44
17.671800 539.593000 0.153504 5.01896 23.90
18.141790 1518.727000 0.076752 4.88998 67.28
18.544620 513.062700 0.102336 4.78466 22.73
19.727840 402.150200 0.153504 4.50028 17.82
20.506980 529.090300 0.089544 4.33102 23.44
21.479630 1569.747000 0.051168 4.13705 69.54
21.837050 709.123000 0.102336 4.07014 31.41
22.167590 269.386500 0.127920 4.01019 11.93
22.923880 215.980500 0.204672 3.87957 9.57
23.658390 1493.694000 0.115128 3.76076 66.17
24.417090 761.980500 0.102336 3.64560 33.76
24.852430 2257.320000 0.191880 3.58272 100.00
25.533150 377.178100 0.102336 3.48872 16.71
26.636410 222.121300 0.153504 3.34668 9.84
27.474790 2110.269000 0.153504 3.24643 93.49
28.174960 326.430600 0.179088 3.16733 14.46
28.796790 137.265100 0.153504 3.10033 6.08
29.856940 54.482390 0.153504 2.99262 2.41
30.860610 212.309100 0.153504 2.89754 9.41
31.366870 81.582460 0.153504 2.85192 3.61
32.276590 111.028900 0.281424 2.77359 4.92
34.449570 122.052000 0.153504 2.60345 5.41
35.664690 93.923380 0.204672 2.51749 4.16
36.904290 45.109600 0.153504 2.43572 2.00
37.463500 34.154410 0.307008 2.40064 1.51
38.747700 19.893850 0.307008 2.32399 0.88
실시예 19B: RX-5902 API의 XRPD
도 34는 실시예 14의 방법에 따라 제조된 RX-5902 API의 XRPD 패턴을 나타낸다.
실시예19B1 - 용해도 평가, 느린 냉각 및 느린 증발
RX-5902 (ca. 2 mg)를 1.5 ml 투명한 유리 바이알 내 측량하였다. 상응하는 용매 또는 용매 혼합물의 분액을 RT에서 첨가하고, 표 12에 나타난 바와 같이 10분 후 용해도를 평가하였다. 이어서, 용액 및 현탁액을 50 ℃에서 10분 이상 진탕 챔버에 두었다. 용해가 관찰되지 않은 경우, 또 다른 분액의 용매를 첨가하고, 용액을 50 ℃에서 10분 이상 진탕 챔버에 두었다. 용해가 달성되거나 최대 400 vol을 첨가할 때까지 이러한 절차를 반복하였다.
RX-5902의 용해도 평가
용매 RT에서
용해도
(mg/ml) 		50 °C에서 용해도 (mg/ml) 느리게
냉각한 후 결과 		증발 후
결과
메탄올 < 100 ≥ 2.5 용액 용액
에탄올 < 100 ≥ 2.5 용액 현탁액,
바늘형
아세톤 < 100 ≥ 12.5 판형 결정 n/a
MEK < 100 ≥ 12.5 판형 결정 n/a
MIBK < 100 ≥ 6.25 현탁액,
바늘형		 n/a
에틸
아세테이트		 < 100 ≥ 12.5 판형 결정 n/a
THF < 100 ≥ 25 용액 무수
백색 고체
아세토니트릴 < 100 ≥ 12.5 판형 결정 n/a
DMSO < 100 ≥ 100 용액 용액
이소프로판올-10% 물 < 100 ≥ 2.5 용액 현탁액,
바늘형
n/a, 해당 없음
용해도 평가로부터 수득된 결과에 따라, 샘플을 하기와 같이 처리하였다: (1) RT에서 바이알 뚜껑에 바늘로 구멍을 뚫어 수득한 용액을 RT에서 서서히 증발시키고, (2) 50 ℃에서 수득한 용액을 0.25°C/min 에서 5 ℃로 냉각시켰다. 냉각 후 수득한 용액을 RT에서 서서히 증발시켰다. SCXRD에 잠재적으로 적합한 결정과 함께 수득한 임의의 현탁액을 PLM 현미경 검사로 평가하고, SCXRD 분석에 가장 유력한 결정을 사용하였다.
실시예19B2 - 단일 결정 구조 측정
RX-5902의 결정을 느리게 증발시킴으로써 에탄올로부터 결정화시켰다 (400 vol. (0.8 ml)의 용매 중 ca. 2 mg). 수득한 결정은 바늘 모양이었다. 단일 결정 X-레이 회절법으로 분석에 충분한 크기 및 품질의 결정을 약 0.650 x 0.080 x 0.070 mm로 단리하였다. 얻은 결정의 광학 현미경 사진 및 데이터 수집에 사용된 단일 결정을 도 35A 및 35B에 도시한다. 측정의 파라미터 및 결과를 표 13 내지 21에 나타낸다.
결정학상 표
샘플 및 결정 데이터
결정화 용매 에탄올
결정화 방법 느린 증발
실험식 C22H24FN5O4
화학식량 441.46
온도 100(2) K
파장 1.54178 Å
결정 크기 0.650 x 0.080 x 0.070 mm
결정 습성 무색의 바늘형
결정계 삼사정계
공간군 P-1
단위 셀 치수
(Unit cell dimension)		 a = 6.7439(3) Å, α= 67.972(5)°
b = 11.4634(5) Å, β= 86.247(4)°
c = 14.5456(8) Å, γ= 86.663(4)°
부피 1039.48(9) Å3
Z 2
(계산된) 밀도 1.410 Mg/m3
흡수 계수 0.880 mm-1
F(000) 464
데이터 수집 및 구조 리파인먼트 (structure refinement)
회절계 SuperNova, Dual, Cu at zero, Atlas
방사선원 SuperNova (Cu) X-레이 Source, CuKα
데이터 수집 방법 omega scans
데이터 수집을 위한 세타 범위 9.018 to 74.481°
인덱스 범위 -6 = h = 8, -14 = k = 14, -18 = l = 17
수집된 반사 9202
독립적 반사 4227 [R(int) = 0.0459]
독립적 반사의 범위 99.4 %
체크 반사의 변동 n/a
흡수 보정 Semi-empirical from equivalents
최대 및 최소 투과 (transmission) 1.00000 및 0.72908
구조 솔루션 기술 직접적인 방법
구조 솔루션 프로그램 SHELXTL (Sheldrick, 2013)
리파인먼트 기술
(Refinement technique)		 Full-matrix least-squares on F 2
리파인먼트 프로그램 SHELXTL (Sheldrick, 2013)
최소화 함수 Σ w(F o 2 - F c 2)2
데이터 / 억제 / 파라미터 4227 / 0 / 296
Goodness-of-fit on F 2 1.035
△/σmax 0.000
최종 R 지수
3240 데이터; I>2σ(I)
모든 데이터
R1 = 0.0477, wR2 = 0.1257
R1 = 0.0647, wR2 = 0.1397
가중치 설계
(weighting scheme)		 w =1 / [σ2 (F o 2) + (0.0750P)2+0.1242P] 여기서, P=(F o 2+2F c 2)/3
소멸 계수 n/a
최대 diff. 피크 및 홀(hole) 0.249 및 -0.273 eÅ-3
리파인먼트 요약:
규칙적인 비-H 원자, XYZ 자유 리파이닝
규칙적인 비-H 원자, U 이방성
H 원자 (탄소 상), XYZ 부착된 원자에 따른 이상적인 위치
H 원자 (탄소 상), U 결합된 원자에 대한 U(eq)의 적절한 배수
H 원자 (헤테로원자 상), XYZ 자유 리파이닝
H 원자 (헤테로원자 상), U 등방성
불규칙한 원자, OCC 무질서
불규칙한 원자, XYZ 무질서
불규칙한 원자, U 무질서
원자 좌표 및 동등한 등방성 원자 변위 파라미터, (Å2)
x/a y/b z/c U(eq)
F1 0.33930(18) 0.50175(11) -0.12020(9) 0.0282(3)
O1 0.23176(18) 0.04077(12) 0.47864(10) 0.0214(3)
O2 -0.31711(18) 0.09001(12) 0.30184(10) 0.0207(3)
O3 1.02089(19) 0.70023(13) 0.38735(10) 0.0232(3)
O4 0.6086(2) 0.87007(13) 0.10089(11) 0.0278(3)
C1 0.2064(3) 0.42287(17) -0.05502(14) 0.0220(4)
N1 0.1173(2) 0.26781(14) 0.21122(12) 0.0176(3)
N2 -0.2182(2) 0.19787(14) 0.13777(12) 0.0196(3)
N3 -0.0078(2) 0.15134(14) 0.37225(12) 0.0179(3)
N4 0.2561(2) 0.25262(14) 0.40644(11) 0.0168(3)
N5 0.4667(2) 0.47744(14) 0.36062(11) 0.0166(3)
C2 0.0448(3) 0.38960(18) -0.09454(14) 0.0222(4)
C3 -0.0951(3) 0.31417(18) -0.02920(14) 0.0224(4)
C4 -0.0741(3) 0.27209(16) 0.07350(14) 0.0189(4)
C5 -0.1907(2) 0.16298(16) 0.23162(14) 0.0173(3)
C6 -0.0189(2) 0.19765(16) 0.27046(13) 0.0163(3)
C7 0.0921(3) 0.30631(16) 0.11079(14) 0.0179(3)
C8 0.2363(3) 0.38315(17) 0.04389(14) 0.0210(4)
C9 0.1691(2) 0.14402(16) 0.42264(13) 0.0165(3)
C10 0.1522(2) 0.37615(16) 0.37214(13) 0.0172(3)
C11 0.2900(2) 0.47736(16) 0.30681(13) 0.0172(3)
C12 0.5727(2) 0.35405(16) 0.38973(14) 0.0182(4)
C13 0.4403(2) 0.24899(17) 0.45586(13) 0.0176(3)
C14 0.5861(2) 0.58318(16) 0.31906(13) 0.0165(3)
C15 0.7508(2) 0.59303(16) 0.37003(13) 0.0174(3)
C16 0.8660(2) 0.69848(17) 0.33020(14) 0.0177(3)
C17 0.8272(3) 0.79508(17) 0.24001(14) 0.0191(4)
C18 0.6636(3) 0.78338(17) 0.19067(14) 0.0197(4)
C19 0.5428(2) 0.68034(17) 0.22955(14) 0.0191(4)
C20 -0.4913(2) 0.05379(18) 0.26809(15) 0.0225(4)
C21 1.1247(3) 0.8144(2) 0.35825(17) 0.0308(5)
C22 0.7554(3) 0.95587(19) 0.04173(15) 0.0266(4)
U(eq)는 직교된 Uij 텐서의 트레이스의 1/3로 정의된다.
선별된 결합 길이, (Å)
F1-C1 1.364(2) O1-C9 1.227(2)
O2-C5 1.341(2) O2-C20 1.442(2)
O3-C16 1.382(2) O3-C21 1.427(2)
O4-C18 1.370(2) O4-C22 1.434(2)
C1-C8 1.361(3) C1-C2 1.400(3)
N1-C6 1.302(2) N1-C7 1.378(2)
N2-C4 1.386(2) N3-C6 1.378(2)
N3-C9 1.423(2) N3-C9 1.423(2)
N3-H3A 0.89(3) N4-C9 1.340(2)
N4-C10 1.465(2) N4-C13 1.466(2)
N5-C14 1.408(2) N5-C11 1.468(2)
N5-C12 1.471(2) C2-C3 1.379(3)
C3-C4 1.401(3) C4-C7 1.412(2)
C5-C6 1.458(2) C7-C8 1.415(2)
C10-C11 1.515(2) C12-C13 1.522(2)
C14-C19 1.395(2) C14-C15 1.408(2)
C15-C16 1.387(2) C16-C17 1.392(3)
C17-C18 1.394(2) C18-C19 1.389(2)
선별된 결합각 (°)
C5-O2-C20 116.72(14) C16-O3-C21 117.15(15)
C18-O4-C22 117.38(15) C8-C1-F1 118.53(17)
C8-C1-C2 124.02(17) F1-C1-C2 117.44(17)
C6-N1-C7 116.91(15) C5-N2-C4 116.44(15)
C6-N3-C9 124.41(14) C6-N3-H3A 115.5(19)
C9-N3-H3A 112.2(18) C9-N4-C10 124.08(14)
C9-N4-C13 118.71(14) C10-N4-C13 113.84(14)
C14-N5-C11 116.47(14) C14-N5-C12 115.86(13)
C11-N5-C12 109.99(14) C3-C2-C1 117.99(17)
C2-C3-C4 120.56(17) N2-C4-C3 119.53(16)
N2-C4-C7 120.53(17) C3-C4-C7 119.94(17)
N2-C5-O2 122.67(15) N2-C5-C6 123.22(16)
O2-C5-C6 114.10(16) N1-C6-N3 122.18(16)
N1-C6-C5 121.17(17) N3-C6-C5 116.65(15)
N1-C7-C4 121.72(16) N1-C7-C8 118.68(16)
C4-C7-C8 119.59(17) C1-C8-C7 117.87(17)
O1-C9-N4 123.90(16) O1-C9-N3 119.09(15)
N4-C9-N3 117.01(15) N4-C10-C11 110.75(13)
N5-C11-C10 109.96(14) N5-C12-C13 111.35(14)
N4-C13-C12 109.79(14) C19-C14-C15 118.87(16)
C19-C14-N5 121.69(15) C15-C14-N5 119.42(16)
C16-C15-C14 119.45(16) O3-C16-C15 114.76(16)
O3-C16-C17 122.84(15) C15-C16-C17 122.39(16)
C16-C17-C18 117.23(16) O4-C18-C19 114.41(16)
O4-C18-C17 123.79(16) C19-C18-C17 121.80(17)
C18-C19-C14 120.23(16)
선별된 뒤틀림각 (°)
C8-C1-C2-C3 1.5(3) F1-C1-C2-C3 -177.32(16)
C1-C2-C3-C4 -0.3(3) C5-N2-C4-C3 -179.49(16)
C5-N2-C4-C7 0.0(2) C2-C3-C4-N2 179.06(16)
C2-C3-C4-C7 -0.4(3) C4-N2-C5-O2 -179.28(15)
C4-N2-C5-C6 -0.2(2) C20-O2-C5-N2 -1.6(2)
C20-O2-C5-C6 179.27(14) C7-N1-C6-N3 178.67(15)
C7-N1-C6-C5 -0.6(2) C9-N3-C6-N1 -17.9(3)
C9-N3-C6-C5 161.39(16) N2-C5-C6-N1 0.6(3)
O2-C5-C6-N1 179.71(15) N2-C5-C6-N3 -178.74(16)
O2-C5-C6-N3 0.4(2) C6-N1-C7-C4 0.4(2)
C6-N1-C7-C8 179.72(16) N2-C4-C7-N1 0.0(3)
C3-C4-C7-N1 179.43(16) N2-C4-C7-C8 -179.39(16)
C3-C4-C7-C8 0.1(3) F1-C1-C8-C7 176.99(15)
C2-C1-C8-C7 -1.8(3) N1-C7-C8-C1 -178.41(16)
C4-C7-C8-C1 1.0(3) C10-N4-C9-O1 -156.16(17)
C13-N4-C9-O1 1.8(3) C10-N4-C9-N3 22.9(2)
C13-N4-C9-N3 -179.15(15) C6-N3-C9-O1 -119.92(19)
C6-N3-C9-N4 61.0(2) C9-N4-C10-C11 -147.08(16)
C13-N4-C10-C11 53.99(19) C14-N5-C11-C10 -166.06(14)
C12-N5-C11-C10 59.55(18) N4-C10-C11-N5 -56.42(19)
C14-N5-C12-C13 165.97(15) C11-N5-C12-C13 -59.34(19)
C9-N4-C13-C12 147.35(16) C10-N4-C13-C12 -52.49(19)
N5-C12-C13-N4 54.67(19) C11-N5-C14-C19 -2.4(2)
C12-N5-C14-C19 129.37(18) C11-N5-C14-C15 176.08(15)
C12-N5-C14-C15 -52.2(2) C19-C14-C15-C16 -0.1(2)
N5-C14-C15-C16 -178.61(15) C21-O3-C16-C15 -170.41(17)
C21-O3-C16-C17 9.2(3) C14-C15-C16-O3 178.42(15)
C14-C15-C16-C17 -1.2(3) O3-C16-C17-C18 -178.51(16)
C15-C16-C17-C18 1.0(3) C22-O4-C18-C19 -160.61(17)
C22-O4-C18-C17 19.0(3) C16-C17-C18-O4 -179.19(17)
C16-C17-C18-C19 0.4(3) O4-C18-C19-C14 177.97(16)
C17-C18-C19-C14 -1.6(3) C15-C14-C19-C18 1.5(3)
N5-C14-C19-C18 179.92(16)
이방성 원자 변위 파라미터, (Å2)
U11 U22 U33 U23 U13 U12
F1 0.0346(6) 0.0267(6) 0.0213(6) -0.0068(5) 0.0082(5) -0.0096(5)
O1 0.0171(6) 0.0164(6) 0.0245(7) -0.0004(5) 0.0012(5) -0.0043(5)
O2 0.0168(6) 0.0221(7) 0.0226(7) -0.0070(5) 0.0007(5) -0.0078(5)
O3 0.0222(6) 0.0215(7) 0.0257(7) -0.0071(5) -0.0044(5) -0.0081(5)
O4 0.0278(7) 0.0216(7) 0.0261(7) 0.0020(5) -0.0061(6) -0.0076(5)
C1 0.0249(9) 0.0164(9) 0.0239(9) -0.0074(7) 0.0054(7) -0.0037(7)
N1 0.0157(6) 0.0163(7) 0.0204(7) -0.0062(6) 0.0000(6) -0.0028(5)
N2 0.0199(7) 0.0162(7) 0.0225(8) -0.0066(6) -0.0026(6) -0.0020(6)
N3 0.0148(6) 0.0173(7) 0.0201(7) -0.0044(6) -0.0006(6) -0.0060(5)
N4 0.0131(6) 0.0156(7) 0.0204(7) -0.0050(5) -0.0016(5) -0.0017(5)
N5 0.0130(6) 0.0147(7) 0.0215(7) -0.0054(6) -0.0022(5) -0.0027(5)
C2 0.0285(9) 0.0196(9) 0.0184(8) -0.0069(7) -0.0030(7) 0.0009(7)
C3 0.0249(9) 0.0209(9) 0.0223(9) -0.0087(7) -0.0041(7) 0.0007(7)
C4 0.0192(8) 0.0147(8) 0.0235(9) -0.0078(7) -0.0001(7) -0.0015(6)
C5 0.0163(8) 0.0120(8) 0.0244(9) -0.0072(6) -0.0024(7) -0.0023(6)
C6 0.0158(7) 0.0125(8) 0.0203(8) -0.0055(6) -0.0007(6) -0.0022(6)
C7 0.0188(8) 0.0140(8) 0.0203(8) -0.0060(6) 0.0000(7) -0.0015(6)
C8 0.0201(8) 0.0195(9) 0.0242(9) -0.0091(7) 0.0022(7) -0.0042(7)
C9 0.0126(7) 0.0188(8) 0.0169(8) -0.0054(6) 0.0023(6) -0.0033(6)
C10 0.0138(7) 0.0157(8) 0.0216(8) -0.0059(7) -0.0007(6) -0.0027(6)
C11 0.0144(7) 0.0156(8) 0.0207(8) -0.0053(6) -0.0027(6) -0.0008(6)
C12 0.0159(7) 0.0147(8) 0.0226(9) -0.0049(6) -0.0012(7) -0.0023(6)
C13 0.0140(7) 0.0183(8) 0.0196(8) -0.0056(6) -0.0024(6) -0.0016(6)
C14 0.0131(7) 0.0166(8) 0.0211(8) -0.0087(7) 0.0012(6) -0.0017(6)
C15 0.0158(7) 0.0165(8) 0.0194(8) -0.0063(6) 0.0013(6) -0.0024(6)
C16 0.0146(7) 0.0191(8) 0.0226(9) -0.0111(7) -0.0013(6) -0.0015(6)
C17 0.0170(7) 0.0170(8) 0.0225(9) -0.0065(7) 0.0030(7) -0.0053(6)
C18 0.0188(8) 0.0182(9) 0.0210(9) -0.0058(7) -0.0014(7) -0.0007(6)
C19 0.0151(7) 0.0193(9) 0.0233(9) -0.0082(7) -0.0012(7) -0.0020(6)
C20 0.0128(8) 0.0237(9) 0.0328(10) -0.0120(8) -0.0004(7) -0.0064(6)
C21 0.0323(10) 0.0259(10) 0.0338(11) -0.0078(8) -0.0072(8) -0.0145(8)
C22 0.0292(9) 0.0207(9) 0.0250(9) -0.0024(7) 0.0002(8) -0.0064(7)
이방성 원자 변위 인자 지수는 다음과 같은 형태를 취한다: -2π2 [h2a*2 U11 + ... + 2hka* b* U12]
수소 원자 좌표 및 등방성 원자 변위 파라미터, (Å)
x/a y/b z/c U
H3A -0.088(4) 0.089(3) 0.406(2) 0.035(7)
H2B 0.0318 0.4181 -0.1643 0.027
H3B -0.2067 0.2905 -0.0540 0.027
H8A 0.3503 0.4063 0.0672 0.025
H10A 0.1021 0.3964 0.4301 0.021
H10B 0.0367 0.3739 0.3343 0.021
H11A 0.3308 0.4616 0.2458 0.021
H11B 0.2196 0.5607 0.2872 0.021
H12A 0.6918 0.3552 0.4256 0.022
H12B 0.6176 0.3375 0.3294 0.022
H13A 0.5112 0.1665 0.4697 0.021
H13B 0.4085 0.2593 0.5199 0.021
H15A 0.7829 0.5280 0.4312 0.021
H17A 0.9087 0.8660 0.2132 0.023
H19A 0.4304 0.6760 0.1950 0.023
H20A -0.5741 0.0030 0.3255 0.034
H20B -0.4508 0.0043 0.2273 0.034
H20C -0.5676 0.1294 0.2284 0.034
H21A 1.2215 0.8068 0.4078 0.046
H21B 1.0297 0.8843 0.3535 0.046
H21C 1.1941 0.8307 0.2936 0.046
H22A 0.7058 1.0031 -0.0244 0.040
H22B 0.8780 0.9086 0.0356 0.040
H22C 0.7827 1.0146 0.0736 0.040
선별된 수소 결합 정보 (Å 및 °)
D-H...A d(D-H) d(H...A) d(D...A) <(DHA)
N3-H3A...O1#1 0.89(3) 2.02(3) 2.8652(19) 160(3)
#1 -x,-y,-z+1
실시예 20: 분석 XRPD 데이터
RX-5902 나노제형 (실시예 18A (상부)) 및 RX-5902 API (실시예18B (하부))의 XRPD 패턴을 비교한 오버레이는 도 36에 도시된다. 이러한 샘플을 상이한 시간에 분석했을지라도, 피크 위치의 확인 및 비교를 용이하게 하는 동일한 시험 방법을 사용하였다. 샘플 피크 리스트의 리뷰는 거의 모든 관찰된 피크에 대해 우수한 매치를 나타낸다. 여기서의 피크 강도 및 피크 분할의 변화는 보다 덜 유의한 것으로 간주되며, 매치에 영향을 미치치 않는다. 또한, 폴록사머 407이 나노현탁액 패턴에 일조할 수 있음을 유의해야 한다. 두 패턴은 결정성 물질과 일치하며; 명백한 무정형 성분은 없다. 이러한 데이터는 나노현탁액 결정 구조가 RX-5902 API와 일치한다는 것을 입증한다.
당해 기술 분야의 당업자는 개시된 주제의 구체적인 실시형태가 하나 이상의 상술한- 및 이하에-나타난 실시형태의 임의의 조합에 대해 지시될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본 발명은 실례 및 예시로 일부 상세히 기재되었으나, 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않으면서 변경이 이루어지고 등가물이 대체될 수 있다는 것이 당업자에게 명백하다. 따라서, 상세한 설명 및 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에 기재된 모든 참조 문헌, 출판물, 특허 및 특허 출원은 각각이 개별적으로 통합된 것과 같이 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

Claims (31)

  1. 종양의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이의 치료 방법에 사용하기 위한 조성물로서, 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 고체 경구 투여형을 포함하고, 여기서, 조성물의 투여가 단일 투여 후 약 800 내지 15,000 hr·ng/mL의 AUC0-t (0-24 시간)을 제공하는, 조성물:
    Figure pct00018
    .
  2. 제1항에 있어서,
    조성물이 주당 1 내지 7일로 약 100 내지 1,200 mg/일, 최대 약 2,800 mg/주의 투여량으로 투여되는, 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    조성물이 주당 3 내지 7일로 약 150 내지 400 mg/일의 투여량으로 투여되는, 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    조성물이 주당 5 내지 7일로 약 150 내지 400 mg/일의 투여량으로 투여되는, 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물이 정제 또는 캡슐제인, 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물의 투여가 단일 투여 후 약 2,500 내지 9,500 hr·ng/mL의 AUC0 -t (0-24 시간)를 제공하는, 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물의 투여가 단일 투여 후 약 200 내지 1,200 ng/mL의 Cmax를 제공하는, 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양이 피부, 직장결장, 난소, 폐, 유방, 췌장, 위 및 신장 암 중에서 선택되는, 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    종양이 삼중-음성 (TN) 유방암인, 조성물.
  10. 제8항에 있어서,
    종양이 백금-저항성 또는 -불응성 난소암인, 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체가 인간인, 조성물.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료가 방사선 또는 항-종양제를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함하는, 조성물.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료가 대상체에게 항대사물질, DNA-단편화제 (DNA-fragmenting agent), DNA-가교제, 중격제 (intercalating agent), 단백질 합성 억제제, 독성 국소이성화효소 I (topoisomerase I poison), 독성 국소이성화효소 II (topoisomerase II poison), 미세소관-유도제 (microtubule-directed agent), 키나아제 억제제, 폴리페놀, 호르몬, 호르몬 길항제, 사멸 수용체 작용제, 면역 체크포인트 억제제, 항-세포예정사 1 (PD-1) 수용체 항체 및 항-세포예정사 리간드 1 (PD-L1) 항체 중에서 선택된 항-종양제를 투여하는 것을 추가로 포함하는, 조성물.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료가 대상체에게 PD-L1 항체 또는 PD-1 항체를 투여하는 것을 추가로 포함하는, 조성물.
  15. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양이 Y593 인산화된 p68의 β-카테닌 의존성 ATP아제 활성을 억제함으로써 치료되는, 조성물.
  16. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료가 하기를 포함하는, 조성물:
    (a) 고체 경구 투여형을 투여하기 전 대상체로부터 종양 샘플을 수집;
    (b) 종양이 Y593 인산화된 p68을 발현하는지의 여부를 측정; 및
    (c) 종양이 Y593 인산화된 p68을 발현하는 경우, 대상체에게 유효량의 화학식(I)의 화합물을 투여.
  17. 종양의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이의 치료 방법에 사용하기 위한 조성물로서, 고체 경구 투여형의 화학식 (I)의 화합물을 포함하고, (a) 대상체가 CYP3A4 또는 CYP3A5 억제제 또는 유발인자로 치료 받았는지의 여부 측정; 및 (b) 대상체가 CYP3A4 또는 CYP3A5 억제제 또는 유발인자로 치료 받지 않은 경우, 대상체에게 유효량의 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 투여를 포함하는, 조성물:
    Figure pct00019
    .
  18. 하기 단계를 포함하는, 상업적 규모의 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 제조 방법:
    Figure pct00020

    (a) 3-아미노-6-플루오로-2-메톡시퀴녹살린을 염기의 존재하에 유기 용매 중에서 에틸 클로로포르메이트와 반응시켜 혼합물을 형성하는 단계;
    (b) 에틸 아세테이트를 첨가하면서 상기 혼합물을 증류시켜 현탁액을 형성하는 단계;
    (c) 상기 현탁액을 여과하여 에틸-N-(6-플루오로-2-메톡시퀴녹살린-3-일) 카르보네이트를 단리하는 단계; 및
    (d) 상기 에틸-N-(6-플루오로-2-메톡시퀴녹살린-3-일) 카르보네이트를 제2 염기의 존재하에 제2 유기 용매 중에서 1-(3,5-디메톡시페닐) 피페라진 히드로클로라이드와 반응시키는 단계.
  19. 제18항에 있어서,
    하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
    (e) 3-아미노-2-클로로-6-플루오로퀴녹살린을 염기의 존재하에 유기 용매 중에서 나트륨 메톡시드와 반응시켜 혼합물을 형성하는 단계;
    (f) 상기 단계 (e)의 혼합물에 물을 첨가하여 용액을 형성하는 단계;
    (g) 상기 용액을 약 15 내지 20 ℃의 온도로 냉각시켜 현탁액을 형성하는 단계; 및
    (h) 상기 단계 (g)의 현탁액을 여과하여 3-아미노-6-플루오로-2-메톡시퀴녹살린을 단리하는 단계.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서,
    단계 (a)에서 유기 용매가 디클로로메탄이고 염기가 피리딘인, 방법.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    증류 단계 (b)가 대기압하에서 수행되는, 방법.
  22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (c)가 진공 여과를 포함하는, 방법.
  23. 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (d)에서, 제2 유기 용매가 테트라히드로푸란이고 제2 염기가 1,8-디아자비사이클로운데크-7-엔인, 방법.
  24. 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계들이 하나 이상의 고정상 반응기에서 수행되는 방법.
  25. 제18항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    현탁액을 제공하기에 충분한 조건 하에서 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 입자 크기를 감소시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    현탁액이 밀링 공정에 의해 제조되는, 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    밀링 공정이 고에너지 교반기 밀링 또는 롤러 밀링인, 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    밀링 공정이 고에너지 교반기 밀링인, 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    현탁액이 약 200 nm 이하의 D50 입자 크기를 갖는, 방법.
  30. 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    현탁액을 분무 건조 또는 동결 건조하여 분말을 형성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  31. 제18항 내지 제30항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 생성물.

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