CN107988274A - 发酵玉米秸秆生产l-乳酸和乙醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种发酵玉米秸秆生产L‑乳酸和乙醇的方法：先用离子液体对玉米秸秆进行预处理；然后用酶制剂1进行酶解，酶解后过滤，得到滤液和滤渣，滤液接种嗜热乙醇杆菌，生产乙醇；用酶制剂2进行酶解，过滤，得到滤液和滤渣，滤液接种米根霉菌，生产L‑乳酸。本发明的方法，可同时生产L‑乳酸和乙醇，不产生废酸或废碱，对环境无污染，玉米秸秆的资源得到了充分利用，节约了资源。本发明在充分高效合理利用玉米秸秆生产L‑乳酸和燃料乙醇的同时，不仅可以解决木质纤维资源大量浪费的问题，又可以避免用酸或碱处理玉米秸秆带来的废酸废碱处理问题。

Description

发酵玉米秸秆生产L-乳酸和乙醇的方法
技术领域
本发明涉及一种发酵玉米秸秆生产L-乳酸并行生产燃料乙醇的方法，属于微生物学和固体废弃物处理领域。
背景技术
L-乳酸是二十一世纪最重要的一种大宗化学品，被广泛应用于食品、药品、化妆品等各个领域，特别是在环境友好型材料聚L-乳酸（PLLA）行业上的应用，随着PLLA需求量的增大，对L-乳酸的需求更是大幅度提高。如何降低L-乳酸的生产成本具有重要的意义。
玉米秸秆可通过预处理和酶解转化为可溶性糖类，进而可被发酵生产L-乳酸，可大幅度降低L-乳酸的生产成本，但是用玉米秸秆生产L-乳酸也存在一定的问题：一方面玉米秸秆的预处理大多采用的是稀酸或是稀碱的方法，处理后的废酸和废碱的处理会造成环境的负担，如公开号为CN102174602A的专利中就是用稀碱对玉米秸秆进行预处理来生产L-乳酸的；另一方面大多微生物只能利用纤维素酶解产物或是半纤维素酶解产物去生产L-乳酸，不能既利用纤维素酶解产物又利用半纤维素酶解产物，造成了资源浪费。因此，采用一种可以回收利用的物质去处理玉米秸秆，并且合理利用纤维素酶解产物或是半纤维素酶解产物具有重要的现实意义。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种发酵玉米秸秆生产L-乳酸并行生产燃料乙醇的方法，采用可回收、不挥发性的“绿色液体”对玉米秸秆进行预处理，并分批加入不同的酶，合理利用纤维素酶解产物或半纤维素酶解产物。
本发明是通过以下技术方案实现的：
发酵玉米秸秆生产L-乳酸和乙醇的方法，包括以下步骤：
（1）玉米秸秆的预处理：将玉米秸秆粉碎，过60目筛，与混合液混合，二者质量比为的0.5～1：2.5～3.5，搅拌均匀，110℃～130℃处理90 min～130 min；处理结束后，水洗，固液分离，得到滤液和滤渣，备用；
所述混合液由离子液体与水按重量比1～2:1混合而成，所述离子液体选自季铵类化合物、季磷类化合物、咪唑类化合物、吡咯类化合物、卤素类化合物、四氟硼酸根类化合物、六氟磷类化合物中的任意一种或两种以上的组合，优选1-乙基-3甲基-咪唑磷酸二乙酯盐、N-丁基吡啶硝酸盐([BPy]NO3)；
进一步地，水洗时，用相当于混合液2倍（体积倍数）的水量进行水洗；
（2）滤渣的酶解：将酶制剂1与步骤（1）得到的滤渣混合，酶制剂1的活力为6万～10万U/g，在30℃～40 ℃下酶解4 h～10 h；酶解结束后水洗2次，过滤，得到滤液和滤渣，将滤液的pH调节至5.0～8.0（用于乙醇的生产）；
（3）滤渣的再次酶解：将酶制剂2与步骤（2）得到滤渣混合，酶制剂2的活力为6万～10万U/g，在30 ℃～40 ℃下酶解4 h～10 h；酶解结束后水洗2次，过滤，得到滤液和滤渣，向滤液中加入碳酸钙（用于L-乳酸的生产），碳酸钙的加入量为20%～40%（按滤液的重量计算）；
所述酶制剂1是通过以下方法制备得到的：将木聚糖酶或半纤维素酶溶于磷酸缓冲溶液，即得；
所述酶制剂2是通过以下方法制备得到的：将纤维素酶溶于醋酸缓冲溶液，即得；
（5）接种、发酵：将活化后的嗜热乙醇杆菌（Thermoanerobacter ethanolicus）接入步骤（2）得到的滤液中，接种量10 %～15 %（体积百分数）；发酵12 h～24 h，发酵结束后，得到乙醇；
将活化后的米根霉菌接入步骤（3）得到的滤液中，接种量10 %～15 %（体积百分数）；发酵12 h～24 h，发酵结束后，得到L-乳酸。
所述嗜热乙醇杆菌和米根霉菌，均为现有技术中的菌种，可常规市场购买得到；所述活化方法为常规方法，具体可如下：
嗜热乙醇杆菌的活化：取新鲜的斜面，活化菌种，制成孢子悬浮液，并接种于发酵培养基中，接种量为10 %，60℃，200 r/min，摇床培养18 h；发酵培养基（g/L）为：LB培养基，胰化蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10；用1 mol/L的NaOH溶液调节pH值到6.0～8.0，121 ℃灭菌30 min；
米根霉菌的活化：取新鲜的斜面，活化菌种，制成孢子悬浮液，并接种于发酵培养基中，接种量为10 %，34 ℃，200 r/min，摇床培养60 h；发酵培养基（g/L）为：葡萄糖100，尿素2.0，KH2PO4 0.3，NaH2PO4 0.08，MgSO4·7H20 0.25，ZnSO4·7H20 0.08，CaCO3 50，并且一次性添加CaCO3 用于pH的调节，pH值为6.0～8.0，121 ℃灭菌30 min。
进一步地，得到乙醇的具体方式为：发酵结束后，对发酵液采用生石灰脱水法进行提取，生石灰与水的比例为3：1（重量比），静置8 h～12 h，75 ℃～85℃蒸馏1 h～4 h，冷凝出乙醇。
进一步地，得到L-乳酸的具体方式为：发酵结束后，对发酵液进行过滤，滤液的主要成分为乳酸钙，向滤液中加入质量浓度为40 %～70 %的浓硫酸溶液，对L-乳酸进行提取。
进一步地，步骤（2）与步骤（3）的先后顺序可互换，即：先用酶制剂2进行酶解，得到的滤渣再用酶制剂1酶解。
进一步地，还包括以下步骤：步骤（1）得到的滤液，采用超临界二氧化碳的方法回收离子液体，压力为2.0 MPa～4.9 MPa，温度为100 K～293 K。
本发明的发酵玉米秸秆生产L-乳酸并行生产燃料乙醇的方法，采用可回收、不挥发性的“绿色液体”对玉米秸秆进行预处理，并分批加入不同的酶，合理利用纤维素酶解产物或半纤维素酶解产物。本发明的方法，可同时生产L-乳酸和乙醇，不产生废酸或废碱，对环境无污染，玉米秸秆的资源得到了充分利用（既利用了纤维素酶解产物，又利用了半纤维素酶解产物），节约了资源。本发明在充分高效合理利用玉米秸秆生产L-乳酸和燃料乙醇的同时，不仅可以解决木质纤维资源大量浪费的问题，又可以避免用酸或碱处理玉米秸秆带来的废酸废碱处理问题。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1 发酵玉米秸秆生产L-乳酸和乙醇
向反应器中加入粉碎、过60目筛子的玉米秸秆5 kg。
将离子液体与水按比例1：1混匀形成混合液，所述离子液体为1-乙基-3甲基-咪唑磷酸二乙酯盐（[Emim][DEP]），然后加入到反应器中，玉米秸秆与混合液的比例为1 g：2.5g；110℃处理90 min；用相当于混合液2倍的水量进行水洗并过滤，将滤液和滤渣分开，滤液在2.0 MPa，100 K条件下采用超临界二氧化碳的方法进行回收。
向滤渣中加入活化好的酶制剂1，酶活力为6万U/g，调节温度为30℃，酶解6 h；分离滤渣和酶解液；调节酶解液的pH至6.0，将嗜热乙醇杆菌种子液接入酶解液中进行发酵，接种量为10 %，发酵12 h，发酵液采用生石灰脱水法进行提取乙醇，生石灰与水的比例为3：1，静置10 h，80℃蒸馏3 h，冷却至室温，得到燃料乙醇。
向滤渣中加入活化好的酶制剂2，酶活力为6万U/g，调节温度为30 ℃，酶解6 h；分离滤渣和酶解液；向酶解液中按重量加入30 %的碳酸钙，将米根霉菌种子液接入酶解液中进行发酵，接种量为10 %，发酵12 h；将发酵液进行过滤；向滤液中加入40 %的浓硫酸溶液进行酸解，提取L-乳酸。
结果：得到93 %乙醇400 g，得到L-乳酸1100 g，离子液体的回收率为99.6 %。
所述嗜热乙醇杆菌和米根霉菌，均为现有技术中的菌种，可常规市场购买得到；所述活化方法为常规方法，具体可如下：
嗜热乙醇杆菌的活化：取新鲜的斜面，活化菌种，制成孢子悬浮液，并接种于发酵培养基中，接种量为10 %，60℃，200 r/min，摇床培养18 h；发酵培养基（g/L）为：LB培养基，胰化蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10；用1 mol/L的NaOH溶液调节pH值到6.0～8.0，121 ℃灭菌30 min；
米根霉菌的活化：取新鲜的斜面，活化菌种，制成孢子悬浮液，并接种于发酵培养基中，接种量为10 %，34 ℃，200 r/min，摇床培养60 h；发酵培养基（g/L）为：葡萄糖100，尿素2.0，KH2PO4 0.3，NaH2PO4 0.08，MgSO4·7H20 0.25，ZnSO4·7H20 0.08，CaCO3 50，并且一次性添加CaCO3 用于pH的调节，pH值为6.0～8.0，121 ℃灭菌30 min。
实施例2 发酵玉米秸秆生产L-乳酸和乙醇
向反应器中加入粉碎、过60目筛子的玉米秸秆5 kg。
将[Emim][DEP]与水按比例2：1混匀形成混合液加入反应器，玉米秸秆与混合液的比例为为0.5 g：3.5g，120℃处理110 min；水洗并过滤，将滤液和滤渣分开，滤液在3.2MPa，178 K条件下采用超临界二氧化碳的方法进行回收。
向滤渣中加入活化好的酶制剂1，酶活力为8万U/g，35 ℃，酶解8 h；分离滤渣和酶解液；调节酶解液的pH至7.0，将嗜热乙醇杆菌种子液接入酶解液中进行发酵，接种量为15%，发酵20 h，发酵液采用生石灰脱水法进行提取乙醇，生石灰与水的比例为3：1，静置8h，75℃蒸馏4 h，冷却至室温，得到燃料乙醇。
向滤渣中加入活化好的酶制剂2，酶活力为8万U/g，调节温度为40 ℃，酶解8 h；分离滤渣和酶解液；向酶解液中按重量加入20 %的碳酸钙，将米根霉菌种子液接入酶解液中进行发酵，接种量为15 %，发酵20 h；将发酵液进行过滤；向滤液中加入60 %的浓硫酸进行酸解，提取L-乳酸。
结果：得到93.8 %乙醇440 g，得到L-乳酸1200 g，离子液体的回收率为99.4 %。
实施例3 发酵玉米秸秆生产L-乳酸和乙醇
向反应器中加入粉碎、过60目筛子的玉米秸秆5 kg。
将[Emim][DEP]与水按比例1：1混匀形成混合液，加入反应器，玉米秸秆与混合液的比例为为1 g：3.5 g，130℃处理130 min；水洗并过滤，将滤液和滤渣分开，滤液在4.9MPa，293 K条件下采用超临界二氧化碳的方法进行回收。
向滤渣中加入活化好的酶制剂1，酶活力为10万U/g，40 ℃，酶解10 h；分离滤渣和酶解液；调节酶解液的pH至8.0，将嗜热乙醇杆菌种子液接入酶解液中进行发酵，接种量为15 %，发酵24 h，对发酵液采用生石灰脱水法进行提取乙醇，生石灰与水的比例为3：1，静置10 h，75℃蒸馏4 h，冷却至室温，得到燃料乙醇.
向滤渣中加入活化好的酶制剂2，酶活力为10万U/g，调节温度为40 ℃，酶解10 h；分离滤渣和酶解液；向酶解液中按重量加入40 %的碳酸钙，将米根霉菌种子液接入酶解液中进行发酵，接种量为10 %，发酵24 h；将发酵液进行过滤；向滤液中加入70 %的浓硫酸进行酸解，提取L-乳酸。
结果：得到95 %乙醇465g，得到L-乳酸1400 g，离子液体的回收率为99.4 %。
实施例4 发酵玉米秸秆生产L-乳酸和乙醇
向反应器中加入粉碎、过60目筛子的玉米秸秆5 kg。
将N-丁基吡啶硝酸盐([BPy]NO3)与水按比例2：1混匀形成混合液，加入反应器，玉米秸秆与混合液的比例为为1 g：3.5g，130℃处理130 min；水洗并过滤，将滤液和滤渣分开，滤液在4.0 MPa，293 K条件下采用超临界二氧化碳的方法进行回收。
向滤渣中加入活化好的酶制剂1，酶活力为10万U/g，40 ℃，酶解10 h；分离滤渣和酶解液；调节酶解液的pH至7.0，将嗜热乙醇杆菌种子液接入酶解液中进行发酵，接种量为10 %，发酵24 h，对发酵液采用生石灰脱水法进行提取乙醇，生石灰与水的比例为3：1，静置10h，80℃蒸馏4 h，冷却至室温，得到燃料乙醇.
向滤渣中加入活化好的酶制剂2，酶活力为10万U/g，调节温度为40 ℃，酶解10 h；分离滤渣和酶解液；向酶解液中按重量加入30%的碳酸钙，将米根霉菌种子液接入酶解液中进行发酵，接种量为15 %，发酵24 h；将发酵液进行过滤；向滤液中加入60 %的浓硫酸进行酸解，提取L-乳酸。
结果：得到93%乙醇427 g，得到L-乳酸1235 g，离子液体的回收率为96.8 %。

Claims (9)

1.一种发酵玉米秸秆生产L-乳酸和乙醇的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）玉米秸秆的预处理：将玉米秸秆粉碎，过60目筛，与混合液混合，二者质量比为的0.5～1：2.5～3.5，搅拌均匀，110℃～130℃处理90 min～130 min；处理结束后，水洗，固液分离，得到滤液和滤渣，备用；
所述混合液由离子液体与水按重量比1～2:1混合而成，所述离子液体选自季铵类化合物、季磷类化合物、咪唑类化合物、吡咯类化合物、卤素类化合物、四氟硼酸根类化合物、六氟磷类化合物中的任意一种或两种以上的组合；
（2）滤渣的酶解：将酶制剂1与步骤（1）得到滤渣混合，酶制剂1的活力为6万～10万U/g，在30℃～40℃下酶解4 h～10 h；酶解结束后水洗，过滤，得到滤液和滤渣，将滤液的pH调节至5.0～8.0；
（3）滤渣的再次酶解：将酶制剂2与步骤（2）得到滤渣混合，酶制剂2的活力为6万～10万U/g，在30℃～40 ℃下酶解4 h～10h；酶解结束后水洗，过滤，得到滤液和滤渣，向滤液中加入碳酸钙，碳酸钙的加入量为20 %～40 %；
所述酶制剂1是通过以下方法制备得到的：将木聚糖酶或半纤维素酶溶于磷酸缓冲溶液，即得；
所述酶制剂2是通过以下方法制备得到的：将纤维素酶溶于醋酸缓冲溶液，即得；
（5）接种、发酵：将活化后的嗜热乙醇杆菌接入步骤（2）得到的滤液中，接种量10 %～15%；发酵12 h～24 h，发酵结束后，得到乙醇；
将活化后的米根霉菌接入步骤（3）得到的滤液中，接种量10 %～15 %；发酵12 h～24h，发酵结束后，得到L-乳酸。
2.根据权利要求1所述的发酵玉米秸秆生产L-乳酸和乙醇的方法，其特征在于：所述离子液体为1-乙基-3甲基-咪唑磷酸二乙酯盐或N-丁基吡啶硝酸盐。
3.根据权利要求1所述的发酵玉米秸秆生产L-乳酸和乙醇的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，水洗时，用相当于混合液2倍的水量进行水洗。
4.根据权利要求1所述的发酵玉米秸秆生产L-乳酸和乙醇的方法，其特征在于：所述嗜热乙醇杆菌通过以下方法的活化：取新鲜的斜面，活化菌种，制成孢子悬浮液，并接种于发酵培养基中，接种量为10 %，60℃，200 r/min，摇床培养18 h；发酵培养基为：LB培养基，胰化蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10；用1 mol/L的NaOH溶液调节pH值到6.0～8.0，121 ℃灭菌30 min。
5.根据权利要求1所述的发酵玉米秸秆生产L-乳酸和乙醇的方法，其特征在于：所述米根霉菌通过以下方法活化：取新鲜的斜面，活化菌种，制成孢子悬浮液，并接种于发酵培养基中，接种量为10 %，34 ℃，200 r/min，摇床培养60 h；发酵培养基为：葡萄糖100，尿素2.0，KH2PO4 0.3，NaH2PO4 0.08，MgSO4·7H20 0.25，ZnSO4·7H20 0.08，CaCO3 50，并且一次性添加CaCO3 用于pH的调节，pH值为6.0～8.0，121 ℃灭菌30 min。
6.根据权利要求1所述的发酵玉米秸秆生产L-乳酸和乙醇的方法，其特征在于：得到乙醇的具体方式为：发酵结束后，对发酵液采用生石灰脱水法进行提取，生石灰与水的比例为3：1，静置8 h～12 h，75℃～85℃蒸馏1 h～4 h，冷凝出乙醇。
7.根据权利要求1所述的发酵玉米秸秆生产L-乳酸和乙醇的方法，其特征在于：得到L-乳酸的具体方式为：发酵结束后，对发酵液进行过滤，滤液的主要成分为乳酸钙，向滤液中加入质量浓度为40 %～70 %的浓硫酸溶液，对L-乳酸进行提取。
8.根据权利要求1所述的发酵玉米秸秆生产L-乳酸和乙醇的方法，其特征在于：所述步骤（2）与步骤（3）的先后顺序互换，即：先用酶制剂2进行酶解，得到的滤渣再用酶制剂1酶解。
9.根据权利要求1所述的发酵玉米秸秆生产L-乳酸和乙醇的方法，其特征在于：还包括以下步骤：步骤（1）得到的滤液，采用超临界二氧化碳的方法回收离子液体，压力为2.0 MPa～4.9 MPa，温度为100 K～293 K。
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