JP2011152079A - セルロース系バイオマスの糖化発酵システム - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 セルロース系バイオマスを原料とする糖化発酵システムであって、該バイオマス原料含有液にセルロース分解酵素及びアルコール発酵性酵母を加えて併行糖化発酵反応を行う糖化醗酵反応工程、該糖化発酵反応工程からの反応液を生成アルコール含有液体留分と、セルロース分解酵素、アルコール発酵性酵母及びバイオマス原料由来の各種物質を含有する残留分とに分離するアルコール分離工程、該残留分の一部または全部を前記糖化醗酵反応工程に循環供給する工程を有するシステムにおいて、アルコール発酵性酵母としてイサチェンキア・オリエンタリス(Issatchenkia orientalis)を用いるセルロース系バイオマスを原料とする糖化醗酵システム。
【選択図】 図1
Description
バイオマス資源中の多糖類から発酵基質となる単糖や少糖類を作る方法として、酵素やその酵素を生産する微生物を用いて、セルロースやヘミセルロースを加水分解する酵素糖化法が、環境負荷の小さい方法として検討されている。
セルロース系バイオマスの糖化、発酵では糖化酵素のコストが高いことが課題であり、糖化酵素の糖化効率を高めることが重要であるにもかかわらず、至適温度で反応できないという課題があった。そこで酒酵母より高い温度で増殖し、発酵することができる微生物の開発は重要である。この様な微生物としてイサチェンキア・オリエンタリスが単離されている(特許文献2参照)。
また、特許文献3では、高温で同時糖化発酵できる酵母について記載されている。
その他、酵素の有効利用については、特許文献4、5などにも記載されている。
一般に自然界より分離される微生物の多くは、プロテアーゼを菌体外に分泌生産すること、または増殖後の死滅期に、溶菌により菌体内のプロテアーゼが溶出することが知られており、これらの微生物を発酵菌として用いる場合には、糖化酵素が分解されるため、併行糖化発酵には好ましくない。特に酵素を回収再利用しながら行う連続的に併行糖化発酵の場合、少量のプロテアーゼであっても、回収再利用する間に著しく糖化酵素活性が損なわれ、実用的ではない。
また、酵素糖化にあたっては、バイオマスの前処理を必要とすることが多く、酸やアルカリで前処理した後には、糖化に適したpH領域にまで中和して糖化させるが、酵素を循環再利用することにより、反応系内にイオンが蓄積し、発酵反応を阻害するという問題がある。
このようなセルラーゼ製剤の市販品としては、全て商品名で、例えば、セルロイシンT2(エイチピィアイ社製)、メイセラーゼ(明治製菓社製)、ノボザイム188(ノボザイム社製)、マルティフェクトCX10L(ジェネンコア社製)等が挙げられる。
図1に示すセルロース系バイオマスを原料とする糖化発酵システムにおいて、セルロース系バイオマス原料調製工程からのセルロース系バイオマス原料は、経路(イ)を経由して糖化醗酵反応工程に供給され、同時にセルロース分解酵素と、アルコール発酵性酵母及び培地が糖化醗酵反応工程に供給されてセルロースの糖化とアルコール発酵とが同時に行われる。
一方、アルコール分離工程からの残留分は経路(ハ)を経由して、直接に糖化醗酵反応工程に循環供給される。あるいは、必要に応じて、五炭糖の処理、リグニンの処理、アルカリ分の処理などの工程を経ても良い。
固液分離工程からの液体留分は、アルコール分離工程により生成アルコール分が経路(ニ)を経て回収されアルコール貯槽に貯蔵され、残留分は経路(ハ)から取り出されて糖化醗酵反応工程に循環し、再利用する。
所定の滞留時間で併行糖化発酵を行うために、イサチェンキア・オリエンタリスの濃度は106〜108個/mlが好ましい。酵素の活性は所望の滞留時間で所定の糖化率となるような濃度が好ましく、滞留時間が48時間として、基質1gに対して濾紙崩壊活性で10単位が例示されるが、基質の種類、前処理の方法によって適宜酵素の添加量を調節する。特に滞留時間を15ないし35時間となるように大量の酵素を添加し、反応効率を高めて、酵素あたりの基質分解量をなるべく高く維持し、その酵素を回収再利用して有効に利用することが好ましい。
(1)CBH I活性
1.25 mM 4-Methyl-umberiferyl-cellobiosideを含む125 mM 酢酸緩衝液(pH4.0) 16μlに、酵素液4 μlを加え、50℃、10min反応を行ったのち、500 mM glycine-NaOH緩衝液(pH10.0)100 μlを添加し、反応を停止させた。これを350 nmの励起光での460 nmの蛍光を測定し、1分間に1μmolのウンベリフェロンを生成する酵素の量を1単位とした。
溶液中のエタノールおよびグルコースの濃度はグルコースセンサー(王子計測機器製BF-400型)で定量した。
<実施例1>
図2に示す糖化醗酵システムにより木質バイオマスを原料とするエタノール生産を行った。
原料として、上質紙のアルミニウム蒸着ラベル古紙を苛性ソーダで処理して、蒸着金属を溶解させて水分60%に濃縮した古紙パルプを使用した。
酵素としては、ジェネンコア社製のセルラーゼ「マルティフェクトCX10L」(ろ紙崩壊活性が120FPU/ml)を使用した。
エタノール発酵を行う微生物として酵母「イサチェンキア・オリエンタリス」(Issatchenkia orientalis)のMF−121株を使用した。この酵母を、液体培地〔2質量%グルコース、1質量%CSL(コーンスティープリカー)、0.5質量%硫酸アンモニウム、pH4.5〕で、130rpmで振とうしながら、24時間37℃で培養し、得られた菌体を発酵に供した。
糖化発酵反応工程は、5L容量の攪拌翼付培養槽を用いて行った。始めに、前記古紙パルプを水で希釈し、固形分8質量%の分散液とし、次いで塩酸を添加し、pHを7.0に調整して原料パルプスラリーとした。
前記原料パルプスラリー3kg(パルプ固形分250 g)に酵素を200g、酵母を1×108cells/mlとなるように加えた。また培地成分としてCSL(コーンスティープリカー)25g、硫酸アンモニウム12.5gを加えた。150〜250rpmで攪拌しながら、37℃で20時間反応を行った。反応終了後、反応液の一部をとり、反応液中の固形分量を測定し、糖化率を算出した。
糖化率=(供給した固形分−反応後の反応液中の固形分量)÷供給した固形分×100
得られた糖化発酵反応液について、遠心分離機を用い、固形分40質量%に濃縮して固液分離を行った。固形分含有留分(パルプ分28g、水分42g)は糖化発酵反応工程に戻し、これに新たに前記原料パルプを加え固形分8質量%のパルプスラリーとし、塩酸を添加してpHを7.0に調整して、第2回目の糖化発酵反応に供する。
遠心分離機により得られた液体分中のエタノールは、フラッシュエバポレーター(東京理化器械)を用いた蒸留工程で分離した。エタノールとともに、水分も一定量蒸発させた。エタノール分離後の濃縮液のエタノール濃度は0.1質量%以下であった。蒸留液のエタノール濃度をバイオセンサー(王子計測機器)で測定し、エタノール生産量を算出した。
蒸留後、残留した液(若干の固形物も含む)をそのまま第2回目の糖化発酵工程に投入する。
残留酵素活性は、第1回目の反応開始前の系内の液と、第5回目の反応終了時の系内の液について、CBH I活性を測定し、その比率で示した。
酵母をMF−121株に変えて、サッカロミセス・セレビシエ244株とし、酵母の増殖ならびに糖化発酵温度を30℃とした他は実施例と同様にした。
両酵母とも、酵素活性については同様の傾向を示すが、糖化率はMF−121株の方が高くなった。これは、酵素活性を十分に生かせる温度で糖化発酵を行えたためであると考えられる。また、糖化率の差より、エタノール生産量の差が大きくなっているのは、MF−121株は244株に比較して、系内のイオン濃度が上昇しても発酵の効率が下がらないためと考えられる。なお、両酵母とも、繰り返し使用による酵素活性の著しい低下をもたらすことはなく、プロテアーゼなど、糖化酵素に悪影響を及ぼす酵素を発生していないことが推定される。
Claims (1)
- セルロース系バイオマスを原料とする糖化発酵システムであって、該バイオマス原料含有液にセルロース分解酵素及びアルコール発酵性酵母を加えて併行糖化発酵反応を行う糖化醗酵反応工程、該糖化発酵反応工程からの反応液を生成アルコール含有液体留分と、セルロース分解酵素、アルコール発酵性酵母及びバイオマス原料由来の各種物質を含有する残留分とに分離するアルコール分離工程、該残留分の一部または全部を前記糖化醗酵反応工程に循環供給する工程を有するシステムにおいて、アルコール発酵性酵母としてイサチェンキア・オリエンタリス(Issatchenkia orientalis)を用いることを特徴とする、セルロース系バイオマスを原料とする糖化醗酵システム。
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