CN107988134A - 一种提高芽孢杆菌产芽孢率的菌种驯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高芽孢杆菌产芽孢率的菌种驯化方法，包括以下步骤：将芽孢杆菌活化；将活化后的菌种依次按照从正常培养基到贫瘠培养基，然后再增加营养物质浓度到正常培养基中培养的顺序进行传代培养，培养基根据浓度设置3个以上，连续传代3代以上。本发明提供的提高芽孢杆菌产芽孢率的菌种驯化方法，很大程度上缩短了培养驯化时间，操作简单，按照本发明的方法，可以使芽孢杆菌的产芽孢率提高到96％。

Description

一种提高芽孢杆菌产芽孢率的菌种驯化方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体的是涉及一种提高芽孢杆菌产芽孢率的菌种驯化方法。
背景技术
随着微生态制剂成为饲料添加剂研究的热点，益生菌制剂在动物饲养中的优势逐步显现。但是大多数益生菌存在抗逆性差，不耐热的缺点，给制剂的保藏、运输都带来了较大困难。芽孢杆菌是在自然界广泛存在的一种好氧的产芽孢杆菌，芽孢是细菌营养体在必需养料即将耗尽时，在细胞内形成的含水量极低、抗逆性极强的休眠体。
研究表明，芽孢杆菌所产生的芽孢具有耐热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂等多种抗逆性，由于芽孢极强的抗逆性，在工业机械化生产高温干燥的过程中，可以保证微生物菌剂的活性，提高其产品质量，并且其对人畜无害，不污染环境，所以在畜牧业、饲料行业中得到广泛应用。目前，从自然生境中筛选得到芽孢杆菌益生菌种在工业生产过程中普遍存在芽孢形成率不高、应用效果不稳定等问题。如何提高枯草芽孢杆菌产芽孢率已经成为限制芽孢杆菌微生态制剂发展的瓶颈问题之一。
中国专利文献CN102181389A公开了一种选育高产芽孢率芽孢杆菌的方法，该方法是根据芽孢的热稳定性特点，采用逐级加热处理后培养的手段，选育出高产芽孢率的芽孢杆菌。其步骤包括：芽孢杆菌激活、一级加热处理、一级培养、二级加热处理、二级培养、三级加热处理、三级培养与收集，得到所述高产芽孢率芽孢杆菌。上述方法虽然提高了芽孢杆菌的产芽孢率，但是此方法需要较长的培养时间，由激活并经过三级培养，每次至少3-5天，培养一次至少需要2周的时间，拉长了培养驯化的时间，并且经过培养后，还需要进行不同程度的热处理，需要谨慎的设置温度和时间，增加了控制成本。所以建立一种快速、高效并且工艺简单的提高芽孢杆菌产芽孢率的菌种驯化方法十分必要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为了克服现有技术中存在的选育高产芽孢率的芽孢杆菌培养时间长、操作复杂等问题，提供一种提高芽孢杆菌产芽孢率的菌种驯化方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种提高芽孢杆菌产芽孢率的菌种驯化方法，包括以下步骤：
将芽孢杆菌活化；
将活化后的菌种依次按照从正常培养基到贫瘠培养基，然后再增加营养物质浓度到正常培养基中培养的顺序进行传代培养，培养基根据浓度设置3个以上，连续传代3代以上。
上述菌种驯化方法中，所述正常培养基为80-100％原始浓度的培养基，所述贫瘠培养基为12.5％-80％原始浓度培养基。
上述菌种驯化方法中，所述从正常培养基到贫瘠培养基再到正常培养基，逐步设置3-9个浓度梯度，从正常培养基到贫瘠培养基，后一浓度为前一浓度的12.5％-80％；从贫瘠培养基到正常培养基，前一浓度为后一浓度的12.5％-80％。
上述菌种驯化方法中，所述从正常培养基到贫瘠培养基再到正常培养基，逐步设置3-7个浓度梯度，从正常培养基到贫瘠培养基，后一浓度为前一浓度的12.5％-80％；从贫瘠培养基到正常培养基，前一浓度为后一浓度的12.5％-80％。
上述菌种驯化方法中，所述从正常培养基到贫瘠培养基再到正常培养基的顺序为：原始浓度培养基、50％原始浓度培养基、25％原始浓度培养基、12.5％原始浓度培养基、25％原始浓度培养基、50％原始浓度培养基、原始浓度培养基。
上述菌种驯化方法中，所述原始浓度培养基为：每1000mL，包含如下组分：胰蛋白胨8-12g、酵母浸膏1.5-3g、葡萄糖1.5-4g、牛肉膏2-5g、氯化钠3-6g、磷酸氢二钠2.5-4g、七水硫酸镁0.5-1.5g，pH值为7.0-7.4。
上述菌种驯化方法中，优选的，所述原始浓度培养基为：每1000mL，包含如下组分：胰蛋白胨10g、酵母浸膏2g、葡萄糖2g、牛肉膏3g、氯化钠4g、磷酸氢二钠3g、七水硫酸镁1.0g，pH值为7.2。
上述菌种驯化方法中，在每一代结束培养后，水浴加热，然后再进行下一次传代。
上述菌种驯化方法中，所述水浴加热的方法为：80-100℃，加热5-20min。
上述菌种驯化方法中，所述传代培养的条件为：摇瓶发酵，发酵温度为30-37℃，发酵时间为30-48h，转速为180-220r/min，pH值为7.0-7.4，优选的，发酵温度为37℃，发酵时间为36h，转速为200r/min，pH值为7.0。
上述菌种驯化方法中，所述芽孢杆菌为能形成芽孢的杆菌或球菌，包括芽孢杆菌属、芽孢乳杆菌属、梭菌属、脱硫肠状菌属和芽孢八叠球菌属，优选的，为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌或丁酸梭菌。
上述菌种驯化方法中，所述传代培养的方法为：每次以体积比2-5％的接种量接种到培养基中。
上述菌种驯化方法中，所述芽孢杆菌活化的方法为：将芽孢杆菌于37℃摇瓶培养培养10-15h，转速为200r/min。
上述菌种驯化方法中，每代培养结束后，采用平板菌落计数法检测细菌总数；水浴加热后，将菌液作为种子液进行下一代传代，采用平板菌落计数法检测芽孢的生成量。
菌总数及芽孢检测用培养基为营养琼脂(NA)培养基，具体成分为(g/L)：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15g。
本申请中所述的X％原始浓度培养基，是指营养物质为原始浓度培养基的X％或X％以上，例如，50％、25％、12.5％浓度培养基浓度分别为上述原始培养基浓度的50％、25％、12.5％，即在相同体积的培养基中，各营养物质的用量分别为原始培养基的50％、25％、12.5％。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的提高芽孢杆菌产芽孢率的菌种驯化方法，通过将菌种在正常培养基，减少营养物质浓度到贫瘠培养基，然后再逐步增加营养物质浓度到正常培养基的顺序进行传代培养的方式，利用改变培养基的营养物质的多少，改变菌种生存的环境，来提高芽孢杆菌的产芽孢率。本发明的方法很大程度上缩短了培养驯化时间，操作简单，按照本发明的方法，可以使芽孢杆菌的产芽孢率提高到96％。
具体实施方式
下面将通过具体的实施例对本发明作进一步详细的说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。以下实施例中所使用的试剂和仪器，如无特殊说明，均为市售。
在以下实施例中使用的枯草芽孢杆菌ANSB060，其保藏号为CGMCC No.3440，在CN101705203A中公开；枯草芽孢杆菌ANSB01G，其保藏号为CGMCC No.4297，在CN 102181376A中公开；枯草芽孢杆菌ANSB471，其保藏号为CGMCC No.7344，在CN 103243047A中公开。
实施例1
1、种子液的制备
将保存的枯草芽孢杆菌ANSB060摇瓶发酵做种子液，于37℃恒温箱摇瓶发酵培养12h，转速200r/min，得枯草芽孢杆菌ANSB060种子液(活菌浓度约为109CFU/mL)
其中发酵培养基的配方为：每1000mL培养基含有：胰蛋白胨8g、酵母浸膏3g、葡萄糖2g、牛肉膏5g、氯化钠3g、磷酸氢二钠4g、七水硫酸镁1.5g，pH值为7.0。
将上述成分按配方称量好后，溶于适量的水，然后加水定容，调节PH值，并通过121℃蒸汽灭菌20min，备用。
2、不同浓度培养基的菌株传代培养
取上述枯草芽孢杆菌ANSB060种子液以2％(体积比)的接种量接种到50ml原始浓度发酵液(即上述发酵培养基)的250ml三角瓶中，发酵温度为37℃，pH值7.0，转速200r/min，发酵时间36h，得到发酵液A。
取上述枯草芽孢杆菌ANSB060的发酵液A，80℃水浴加热15min后，以2％(体积比)的接种量接种到50ml 50％原始浓度发酵液的250ml三角瓶中，发酵温度为37℃，pH值7.0，转速200r/min，发酵时间36h，得到发酵液B。
取上述枯草芽孢杆菌ANSB060发酵液B，80℃水浴加热15min后，以2％(体积比)的接种量接种到50ml原始浓度发酵液的250ml三角瓶中，发酵温度为37℃，pH值7.0，转速200r/min，发酵时间36h。
在每一浓度培养基培养后的发酵液经过80℃水浴加热15min后作为下一浓度培养基的种子液。即依次在原始培养基、50％浓度培养基、原始培养基上进行传代培养，连续传3代。
3、芽孢率的计算
每代培养结束后，采用平板菌落计数法检测细菌总数；经过80℃水浴加热15min后，采用平板菌落计数法检测芽孢的生成量。其中芽孢率的计算方式如下：
芽孢率(％)＝(芽孢数/活菌总数)*100％。
活菌总数及芽孢检测用培养基为营养琼脂(NA)培养基，具体成分为(g/L)：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15g。
经过3代培养后，枯草芽孢杆菌ANSB060的产芽孢率从75％提高到了93％。
实施例2
1、种子液的制备
将保存的枯草芽孢杆菌ANSB01G，摇瓶发酵做种子液，于37℃恒温箱震荡培养12h，转速200r/min，得枯草芽孢杆菌ANSB01G种子液。(活菌浓度约为109CFU/mL)
其中发酵培养基的配方为：每1000mL培养基含有：每胰蛋白胨10g、酵母浸膏2g、葡萄糖2g、牛肉膏3g、氯化钠4g、磷酸氢二钠3g、七水硫酸镁1.0g，pH值为7.2。制备方法如实施例1，121℃蒸汽灭菌20min。
2、不同浓度培养基的菌株传代培养
取上述枯草芽孢杆菌ANSB01G种子液以2％(体积比)的接种量接种到50ml原始浓度发酵液(上述“1、种子液的制备中”的发酵培养基)的250ml三角瓶中，发酵温度为37℃，pH值7.0，转速200r/min，发酵时间36h，得到发酵液A。
取上述枯草芽孢杆菌ANSB01G发酵液A，80℃水浴加热15min后，以2％(体积比)的接种量接种到50ml 50％原始浓度发酵液的250ml三角瓶中，发酵温度为37℃，pH值7.0，转速200r/min，发酵时间36h，得到发酵液B。所述50％浓度培养基浓度为原始培养基浓度的1/2，121℃蒸汽灭菌20min。
取上述枯草芽孢杆菌ANSB01G发酵液B，80℃水浴加热15min后，以2％(体积比)的接种量接种到50ml 25％原始浓度发酵液的250ml三角瓶中，发酵温度为37℃，pH值7.0，转速200r/min，发酵时间36h,得到发酵液C。所述25％浓度培养基浓度为原始培养基浓度的1/4，121℃蒸汽灭菌20min。
取上述枯草芽孢杆菌ANSB01G发酵液C，80℃水浴加热15min后，以2％(体积比)的接种量接种到50ml 12.5％原始浓度发酵液的250ml三角瓶中，发酵温度为37℃，pH值7.0，转速200r/min，发酵时间36h，得到发酵液D。所述12.5％浓度培养基浓度为原始培养基浓度的1/8，121℃蒸汽灭菌20min。
按照上述发酵培养方式，依次在25％浓度培养基、50％浓度培养基、原始培养基上传代培养。在每一浓度培养基培养后的发酵液经过80℃水浴加热15min后作为下一浓度培养基的种子液。即依次在原始培养基、50％浓度培养基、25％浓度培养基、12.5％浓度培养基、25％浓度培养基、50％浓度培养基、原始培养基上传代培养7代。
3、芽孢率的计算
每代培养结束后，采用平板菌落计数法检测细菌总数；经过80℃水浴加热15min后，采用平板菌落计数法检测芽孢的生成量。其中芽孢率的计算方式如下：
芽孢率(％)＝(芽孢数/活菌总数)*100％。
活菌总数及芽孢检测用培养基为营养琼脂(NA)培养基，具体成分为(g/L)：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15g。
经过7代培养后，枯草芽孢杆菌ANSB01G的产芽孢率从71％提高到了96％。
实施例3
1、种子液的制备
将保存的枯草芽孢杆菌ANSB471，摇瓶发酵做种子液，于37℃恒温箱震荡培养12h，转速200r/min，得枯草芽孢杆菌ANSB471种子液(活菌浓度约为109CFU/mL)。
其中发酵培养基的配方为：每1000mL培养基含有：胰蛋白胨12g、酵母浸膏1.5g、葡萄糖3g、牛肉膏2g、氯化钠4g、磷酸氢二钠2.5g、七水硫酸镁0.5g、蒸馏水1000ml，pH值为7.4；制备方法如实施例1，121℃蒸汽灭菌20min。
2、不同浓度培养基的菌株传代培养
取上述枯草芽孢杆菌ANSB471以2％(体积比)的接种量接种到50ml原始浓度发酵液((上述“1、种子液的制备中”的发酵培养基))的250ml三角瓶中，发酵温度为37℃，pH值7.0，转速200r/min，发酵时间36h，得到发酵液A。
取上述枯草芽孢杆菌ANSB471发酵液A，80℃水浴加热15min后，以2％(体积比)的接种量接种到50ml 50％原始浓度发酵液的250ml三角瓶中，发酵温度为37℃，pH值7.0，转速200r/min，发酵时间36h，得到发酵液B。所述50％浓度培养基浓度为原始培养基浓度的1/2，121℃蒸汽灭菌20min。
取上述枯草芽孢杆菌ANSB471发酵液B，80℃水浴加热15min后，以2％(体积比)的接种量接种到50ml 12.5％原始浓度发酵液的250ml三角瓶中，发酵温度为37℃，pH值7.0，转速200r/min，发酵时间36h,得到发酵液C。所述12.5％浓度培养基浓度为原始培养基浓度的1/8，121℃蒸汽灭菌20min。
按照上述发酵培养方式，依次在50％浓度培养基、原始培养基上传代培养。每代的发酵液经过80℃水浴加热15min后作为下一代的种子液。即依次在原始培养基、50％浓度培养基、12.5％浓度培养基、50％浓度培养基、原始培养基上传代培养5代。
3、芽孢率的计算
每代培养结束后，采用平板菌落计数法检测细菌总数；经过80℃水浴加热15min后，采用平板菌落计数法检测芽孢的生成量。其中芽孢率的计算方式如下：
芽孢率(％)＝(芽孢数/活菌总数)*100％。
活菌总数及芽孢检测用培养基为营养琼脂(NA)培养基，具体成分为(g/L)：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15g。
经过5代培养后，枯草芽孢杆菌ANSB471的产芽孢率从81％提高到了93％。

Claims (10)

1.一种提高芽孢杆菌产芽孢率的菌种驯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
将芽孢杆菌活化；
将活化后的菌种依次按照从正常培养基到贫瘠培养基，然后再增加营养物质浓度到正常培养基中培养的顺序进行传代培养，培养基根据浓度设置3个以上，连续传代3代以上。
2.根据权利要求1所述的菌种驯化方法，其特征在于，所述正常培养基为80-100％原始浓度的培养基，所述贫瘠培养基为12.5％-80％原始浓度培养基。
3.根据权利要1或2所述的菌种驯化方法，其特征在于，所述从正常培养基到贫瘠培养基再到正常培养基，逐步设置3-9个浓度梯度，从正常培养基到贫瘠培养基，后一浓度为前一浓度的12.5％-80％；从贫瘠培养基到正常培养基，前一浓度为后一浓度的12.5％-80％。
4.根据权利要求3所述的菌种驯化方法，其特征在于，所述从正常培养基到贫瘠培养基再到正常培养基，逐步设置3-7个浓度梯度，从正常培养基到贫瘠培养基，后一浓度为前一浓度的12.5％-80％；从贫瘠培养基到正常培养基，前一浓度为后一浓度的12.5％-80％。
5.根据权利要求4所述的菌种驯化方法，其特征在于，所述从正常培养基到贫瘠培养基再到正常培养基的顺序为：原始浓度培养基、50％原始浓度培养基、25％原始浓度培养基、12.5％原始浓度培养基、25％原始浓度培养基、50％原始浓度培养基、原始浓度培养基。
6.根据权利要求2-5任一项所述的菌种驯化方法，其特征在于，所述原始浓度培养基为：每1000mL，包含如下组分：胰蛋白胨8-12g、酵母浸膏1.5-3g、葡萄糖1.5-4g、牛肉膏2-5g、氯化钠3-6g、磷酸氢二钠2.5-4g、七水硫酸镁0.5-1.5g，pH值为7.0-7.4。
7.根据权利要求1-6任一项所述的菌种驯化方法，其特征在于，在每一代结束培养后，水浴加热，然后再进行下一次传代。
8.根据权利要求7所述的菌种驯化方法，其特征在于，所述水浴加热的方法为：80-100℃，加热5-20min。
9.根据权利要求1所述的菌种驯化方法，其特征在于，所述传代培养的条件为：摇瓶发酵，发酵温度为30-37℃，发酵时间为30-48h，转速为180-220r/min，pH值为7.0-7.4，优选的，发酵温度为37℃，发酵时间为36h，转速为200r/min，pH值为7.0。
10.根据权利要求1所述的菌种驯化方法，其特征在于，所述芽孢杆菌为能形成芽孢的杆菌或球菌，包括芽孢杆菌属、芽孢乳杆菌属、梭菌属、脱硫肠状菌属和芽孢八叠球菌属，优选的，为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌或丁酸梭菌。
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