CN106434520B - 芽孢杆菌芽孢的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本案涉及芽孢杆菌芽孢的制备方法，包括：将1份的嗜热脂肪芽孢杆菌接种于10份的富营养培养基，在50‑55℃、150‑250rpm/min下培养12h后；随后加入90份的富营养培养基，继续培养12h，获得营养细胞培养液；向1份的营养细胞培养液中加入1份的无机离子培养基，在55‑60℃、100‑150rpm/min下培养12h；每隔12h加入1份的无机离子培养基，直至加入的无机离子培养基的总份数与富营养培养基的份数比例达到7∶1‑10∶1；得到含芽孢杆菌芽孢的培养液。本案仅需两种培养基即可，操作简单，重复性好；培养时间得到缩短，耗时仅需60‑72h；芽孢产量达到了109每毫升，芽孢率在90％以上。

Description

芽孢杆菌芽孢的制备方法
技术领域
本发明涉及一种微生物芽孢制备领域，具体涉及一种芽孢杆菌芽孢的制备方法。
背景技术
嗜热脂肪芽孢杆菌为革兰阳性菌，需氧或兼性厌氧，嗜热脂肪芽孢杆菌可产芽孢，最佳生长温度为55-60℃，最高生长温度为65-75℃，属于嗜热菌。中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)收藏编号为CICC：10267；或ATCC：7953。
嗜热脂肪芽孢杆菌所产芽孢无致病性、无热原、无毒。该芽孢对一定灭菌因子有确定的抵抗力，因此可作为指示微生物被用来监测灭菌效果，包括压力蒸汽灭菌、过氧化氢(H2O2)低温等离子体灭菌、低温蒸汽甲醛灭菌等灭菌方式。作为灭菌生物指示菌，按照中国药典规范要求，芽孢数量一般为5×105至5×106个，休眠芽孢含量需占90％以上。
目前，现有技术中，已经可以实现对嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢进行小剂量的制备，但在大规模量产时，却存在许多技术障碍，主要存在芽孢形成率不高、生产成本过高等问题，同时耗时长，工艺繁琐。
发明内容
针对现有技术的不足之处，本发明的目的在于提出一种芽孢杆菌芽孢的制备方法，其通过操作简便的液体培养方法，利用芽孢生成的原理，通过两种不同液体培养基的转换，来保证芽孢的产量和产率。
为实现上述目的，本发明的技术方案概述如下：
一种芽孢杆菌芽孢的制备方法，其包括以下步骤：
步骤1)营养细胞增殖：
将1重量份的嗜热脂肪芽孢杆菌接种于10重量份的富营养培养基，在50-55℃环境中，转速为150-250rpm/min条件下培养12h后；随后加入90重量份的富营养培养基，继续培养12h，获得营养细胞培养液；
步骤2)芽孢转化：
向1重量份的所述营养细胞培养液中加入1重量份的无机离子培养基，在55-60℃环境中，转速为100-150rpm/min条件下培养12h；随后每隔12h加入1重量份的无机离子培养基，直至加入的无机离子培养基的总质量份与富营养培养基的质量份比例达到7∶1-10∶1；得到含芽孢杆菌芽孢的培养液。
优选的是，所述的芽孢杆菌芽孢的制备方法，其中，所述富营养培养基包括：5-20重量份的大豆蛋白胨、5重量份的牛肉浸膏、3-5重量份酵母提取物、5重量份的氯化钠和1000重量份的蒸馏水。
优选的是，所述的芽孢杆菌芽孢的制备方法，其中，所述富营养培养基的pH为7.2-7.5。
优选的是，所述的芽孢杆菌芽孢的制备方法，其中，所述无机离子培养基包括：1重量份的NaCl、0.5-1重量份的MnSO4·H2O、0.1-0.5重量份的MgSO4·2H2O、0.01-1重量份的CaCl2·2H2O、0.01-0.1重量份的KH2PO4和1000重量份的蒸馏水。芽孢杆菌芽孢为菌体在恶劣环境下产生的休眠体，而无机离子培养基的作用就是使营养物质减少，环境变恶劣。
优选的是，所述的芽孢杆菌芽孢的制备方法，其中，所述无机离子培养基的pH为7.2-7.5。
优选的是，所述的芽孢杆菌芽孢的制备方法，其中，所述无机离子培养基还包括有0.1-0.2重量份的ZnCl2。
优选的是，所述的芽孢杆菌芽孢的制备方法，其中，所述无机离子培养基还包括有0.1-0.2重量份的FeCl3。
本发明的有益效果是：本案通过对现有芽孢杆菌芽孢制备工艺的改进，使得芽孢制备方法仅需两种培养基即可，操作步骤简单，重复性好；培养时间得到进一步的缩短，耗时仅需60-72h；芽孢产量达到了109每毫升，芽孢率在90％以上。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1
一种芽孢杆菌芽孢的制备方法，其包括以下步骤：
步骤1)营养细胞增殖：
将1g的嗜热脂肪芽孢杆菌接种于10g的富营养培养基，在50℃环境中，转速为150rpm/min条件下培养12h后；随后加入90g的富营养培养基，继续培养12h，获得营养细胞培养液；
步骤2)芽孢转化：
向1g的营养细胞培养液中加入1g的无机离子培养基，在55℃环境中，转速为100rpm/min条件下培养12h；随后每隔12h加入1g的无机离子培养基，直至加入的无机离子培养基的总质量份与富营养培养基的质量份比例达到7∶1；得到含芽孢杆菌芽孢的培养液。
其中，富营养培养基优选包括：5-20重量份的大豆蛋白胨、5重量份的牛肉浸膏、3-5重量份酵母提取物、5重量份的氯化钠和1000重量份的蒸馏水。富营养培养基的pH控制在7.2-7.5。
其中，无机离子培养基优选包括：1重量份的NaCl、0.5-1重量份的MnSO4·H2O、0.1-0.5重量份的MgSO4·2H2O、0.01-1重量份的CaCl2·2H2O、0.01-0.1重量份的KH2PO4和1000重量份的蒸馏水。无机离子培养基的pH控制在7.2-7.5。
实施例2
一种芽孢杆菌芽孢的制备方法，其包括以下步骤：
步骤1)营养细胞增殖：
将1g的嗜热脂肪芽孢杆菌接种于10g的富营养培养基，在55℃环境中，转速为250rpm/min条件下培养12h后；随后加入90g的富营养培养基，继续培养12h，获得营养细胞培养液；
步骤2)芽孢转化：
向1g的营养细胞培养液中加入1g的无机离子培养基，在60℃环境中，转速为150rpm/min条件下培养12h；随后每隔12h加入1g的无机离子培养基，直至加入的无机离子培养基的总质量份与富营养培养基的质量份比例达到10∶1；得到含芽孢杆菌芽孢的培养液。
其中，富营养培养基优选包括：5-20重量份的大豆蛋白胨、5重量份的牛肉浸膏、3-5重量份酵母提取物、5重量份的氯化钠和1000重量份的蒸馏水。富营养培养基的pH控制在7.2-7.5。
其中，无机离子培养基优选包括：1重量份的NaCl、0.5-1重量份的MnSO4·H2O、0.1-0.5重量份的MgSO4·2H2O、0.01-1重量份的CaCl2·2H2O、0.01-0.1重量份的KH2PO4和1000重量份的蒸馏水。无机离子培养基的pH控制在7.2-7.5。
实施例3
一种芽孢杆菌芽孢的制备方法，其包括以下步骤：
步骤1)营养细胞增殖：
将1g的嗜热脂肪芽孢杆菌接种于10g的富营养培养基，在52℃环境中，转速为200rpm/min条件下培养12h后；随后加入90g的富营养培养基，继续培养12h，获得营养细胞培养液；
步骤2)芽孢转化：
向1g的营养细胞培养液中加入1g的无机离子培养基，在57℃环境中，转速为125rpm/min条件下培养12h；随后每隔12h加入1g的无机离子培养基，直至加入的无机离子培养基的总质量份与富营养培养基的质量份比例达到8.5∶1；得到含芽孢杆菌芽孢的培养液。
其中，富营养培养基优选包括：5-20重量份的大豆蛋白胨、5重量份的牛肉浸膏、3-5重量份酵母提取物、5重量份的氯化钠和1000重量份的蒸馏水。富营养培养基的pH控制在7.2-7.5。
其中，无机离子培养基优选包括：1重量份的NaCl、0.5-1重量份的MnSO4·H2O、0.1-0.5重量份的MgSO4·2H2O、0.01-1重量份的CaCl2·2H2O、0.01-0.1重量份的KH2PO4和1000重量份的蒸馏水。无机离子培养基的pH控制在7.2-7.5。
实施例4
一种芽孢杆菌芽孢的制备方法，其包括以下步骤：
步骤1)营养细胞增殖：
将1kg的嗜热脂肪芽孢杆菌接种于10kg的富营养培养基，在50℃环境中，转速为150rpm/min条件下培养12h后；随后加入90kg的富营养培养基，继续培养12h，获得营养细胞培养液；
步骤2)芽孢转化：
向1kg的营养细胞培养液中加入1kg的无机离子培养基，在55℃环境中，转速为100rpm/min条件下培养12h；随后每隔12h加入1kg的无机离子培养基，直至加入的无机离子培养基的总质量份与富营养培养基的质量份比例达到7∶1；得到含芽孢杆菌芽孢的培养液。
其中，富营养培养基优选包括：5-20重量份的大豆蛋白胨、5重量份的牛肉浸膏、3-5重量份酵母提取物、5重量份的氯化钠和1000重量份的蒸馏水。富营养培养基的pH控制在7.2-7.5。
其中，无机离子培养基优选包括：1重量份的NaCl、0.5-1重量份的MnSO4·H2O、0.1-0.5重量份的MgSO4·2H2O、0.01-1重量份的CaCl2·2H2O、0.01-0.1重量份的KH2PO4和1000重量份的蒸馏水。无机离子培养基的pH控制在7.2-7.5。
实施例5
无机离子培养基中还包括有0.1-0.2重量份的ZnCl2，其余与实施例1相同。
实施例6
无机离子培养基中还包括有0.1-0.2重量份的FeCl3，其余与实施例5相同。
对比例1
控制步骤2)中加入的无机离子培养基的总质量份与富营养培养基的质量份比例为6∶1；其余与实施例1相同。
对比例2
控制步骤2)中加入的无机离子培养基的总质量份与富营养培养基的质量份比例为11∶1；其余与实施例1相同。
表1列出采用实施例和对比例的方法所获得的芽孢产量和芽孢率：
表1
表1数据表明，实施例4是将实施例1的投放量放大了1000倍，但所得结果没有发生衰减，说明该工艺稳定，具备量产基础。实施例5和实施例6说明了锌离子的加入有利于芽孢率在一定程度上的提升。
表2是对本工艺重复性的考察，列出了实施例1、实施例5和实施例6分别重复10次所得到的芽孢率的浮动情况：
表2
实施例1 实施例5 实施例6
第1次 91％ 96％ 98％
第2次 92％ 97％ 98％
第3次 95％ 98％ 97％
第4次 93％ 97％ 98％
第5次 91％ 98％ 99％
第6次 96％ 96％ 98％
第7次 94％ 98％ 98％
第8次 93％ 96％ 99％
第9次 94％ 96％ 98％
第10次 91％ 98％ 97％
平均芽孢率 93％ 97％ 98％
表2表明锌离子和铁离子可以减小芽孢率的波动幅度，提高该工艺的重复性，利于在大规模生产时保证产品质量。而锌离子和铁离子的组合使用相较于单独添加锌离子可以获得更高的数据重现性。此外，需要说明的是，锌离子和铁离子对芽孢产量的影响不大；且实施例1-4中的芽孢产量的重现性本身就很稳定，无需再作进一步的改进。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (4)

1.一种芽孢杆菌芽孢的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)营养细胞增殖：
将1重量份的嗜热脂肪芽孢杆菌接种于10重量份的富营养培养基，在50-55℃环境中，转速为150-250rpm/min条件下培养12h后；随后加入90重量份的富营养培养基，继续培养12h，获得营养细胞培养液；
步骤2)芽孢转化：
向1重量份的所述营养细胞培养液中加入1重量份的无机离子培养基，在55-60℃环境中，转速为100-150rpm/min条件下培养12h；随后每隔12h加入1重量份的无机离子培养基，直至加入的无机离子培养基的总质量份与富营养培养基的质量份比例达到7∶1-10∶1；得到含芽孢杆菌芽孢的培养液；
其中，所述无机离子培养基包括：1重量份的NaCl、0.5-1重量份的MnSO4·H2O、0.1-0.5重量份的MgSO4·2H2O、0.01-1重量份的CaCl2·2H2O、0.01-0.1重量份的KH2PO4、1000重量份的蒸馏水、0.1-0.2重量份的ZnCl2和0.1-0.2重量份的FeCl3。
2.根据权利要求1所述的芽孢杆菌芽孢的制备方法，其特征在于，所述富营养培养基包括：5-20重量份的大豆蛋白胨、5重量份的牛肉浸膏、3-5重量份酵母提取物、5重量份的氯化钠和1000重量份的蒸馏水。
3.根据权利要求1所述的芽孢杆菌芽孢的制备方法，其特征在于，所述富营养培养基的pH为7.2-7.5。
4.根据权利要求1所述的芽孢杆菌芽孢的制备方法，其特征在于，所述无机离子培养基的pH为7.2-7.5。
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