CN105886445A - 一种地衣芽孢杆菌的提纯方法 - Google Patents

一种地衣芽孢杆菌的提纯方法 Download PDF

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CN105886445A CN201610489624.3A CN201610489624A CN105886445A CN 105886445 A CN105886445 A CN 105886445A CN 201610489624 A CN201610489624 A CN 201610489624A CN 105886445 A CN105886445 A CN 105886445A
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Abstract

本发明公开了一种地衣芽孢杆菌的提纯方法，包括如下步骤：(1)取地衣芽孢杆菌菌种，接种，制成均匀菌悬液，5‑7℃保存备用；(2)将第一培养基加入二号三角瓶中，摇床培养，得到菌种；(3)取第二培养基，并将培养基中加入蒸馏水，在电炉上煮沸5‑10min，冷却到室温，凝固待用；(4)第二培养基融化，并涂布于平板上，再将菌种在平板上进行划线培养，将地衣芽孢杆菌进行分离、纯化；(5)将分离、纯化得到的地衣芽孢杆菌进行培育。本发明对市售的地衣芽孢杆菌菌种进行培养、扩大，适应之后，进行进一步的分离纯化，提高了纯化的成功率，使得纯化的地衣芽孢杆菌菌种充分表现出其较佳的生长性能。

Description

一种地衣芽孢杆菌的提纯方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体为一种地衣芽孢杆菌的提纯方法。
背景技术
芽孢杆菌属(Bacillus Cohn,1872)，细胞呈直杆状，0.5～2.5μm×1.2～10μm，常以成对或链状排列，具圆端或方端。细胞染色大多数在幼龄培养时呈现革兰氏阳性，以周生鞭毛运动。芽孢椭圆、卵圆、柱状、圆形，能抗许多不良环境。每个细胞产一个芽孢，生孢不被氧所抑制；好氧或兼性厌氧，具有对热、p H和盐等不同环境的耐受性。它属于化能异养菌，具发酵或呼吸代谢类型，通常接触酶阳性。芽孢杆菌属发现于不同的环境，少数种对脊椎动物和非脊椎动物致病。芽孢杆菌属是一群好氧和兼性厌氧生活，产耐热性内生孢子的杆状细菌。它的营养细胞具有活跃的酶活性和多样的代谢类型，从而被广泛应用于生产各种酶制剂、杀虫剂、抗生素和生物添加剂等。它还具有处于休眠期的内生孢子和营养细胞交替的生长周期，可作为研究细菌分化的重要材料，而作为典型种的枯草芽孢杆菌又是分子生物学研究的重要材料之一。
芽孢杆菌属中存在很多特殊功能的菌株，在工业、农业、医学、军事和科学研究中都有广泛的应用价值。有的可以在高渗、高酸、高碱、高温、高寒的环境下良好生长，有较大的生态学价值；有的可分泌多种酶类，应用于酶制剂工业；有的可作为多种蛋白基因表达受体，在基因工程和生物学研究领域中有较高的应用价值；除极个别的菌种外，多数菌种与动物，植物关系密切并与其形成良好的共生体系，可以将其应用于益生菌制剂，微生物肥料的生产；有的菌种能产生对昆虫毒性较强的蛋白，用于微生物农药的生产；炭疽芽孢杆菌用于生物武器显示其重要的军事意义。
但是，目前并没有一种合理的方法实现地衣芽孢杆菌的提纯，导致微生物菌的纯度很低，影响了后续的使用。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于提供一种地衣芽孢杆菌的提纯方法，从而解决上述背景技术中的问题。
本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：
一种地衣芽孢杆菌的提纯方法，包括如下步骤：
(1)取地衣芽孢杆菌菌种，接种至新鲜试管斜面，于31-35℃培养19-25h，然后取培养好的斜面，加入10-15mL无菌生理盐水，用接种环将斜面上的菌苔轻轻刮下，振荡无菌生理盐水，然后将无菌生理盐水倾注于另一盛有30-35mL无菌生理盐水的一号三角瓶中，瓶中放入四粒营养珠，然后在摇床上以100-130r/min的速度振荡25-27min，制成均匀菌悬液，5-7℃保存备用；
(2)取第一培养基，并将培养基加入二号三角瓶中，加塞后，0.1-0.3MP灭菌23-27min，然后将步骤(1)得到的均匀菌悬液接种到二号三角瓶的培养基中，接种量按3-4％(V/V)(菌悬液与培养基的体积比)，接种后将二号三角瓶于35-37℃，振荡28-35h，摇床转速为120-145r/min，得到菌种；
(3)取第二培养基，并将培养基中加入蒸馏水，在电炉上煮沸5-10min，冷却到室温，凝固待用；
(4)将步骤(3)得到的第二培养基融化，并涂布于平板上，再将步骤(2)得到的菌种在平板上进行划线培养，将地衣芽孢杆菌进行分离、纯化；
(5)将分离、纯化得到的地衣芽孢杆菌进行培育。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述营养珠包括以下重量份的原料制备而成：胰蛋白胨1-1.5、酵母浸出粉0.7-0.9、NaCl 1.2-1.3；pH为7.3。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述第一培养基包括以下重量份的原料制备而成：蛋白胨5-7，牛肉膏4-5，NaCl 5-7。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述第二培养基包括以下重量份的原料制备而成：葡萄糖2.5-2.7、豆芽浸汁25-27、酵母浸粉0.8-1.2；p H7.0。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述步骤(4)的划线培养，其步骤如下：
A.融化培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基放入水浴中加热至融化。
B.倒平板：待培养基冷却至50℃左右，按无菌操作法倒2只平板(每皿约15m1)，平置，待凝固。
倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住管(瓶)塞(也可将试管塞或瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住。如果试管内或三角瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在手中)。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速例入培养基约15m1，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
C.作分区标记在皿底将整个平板划分成A、B、C、D四个面积不等的区域。各区之间的交角应为120℃左右(平板转动一定角度约60℃)，以便充分利用整个平板的面积，而且采用这种分区法可使D区与A区划出的线条相平行，并可避免此两区线条相接触。
D.划线操作
(1)挑取他含菌样品：选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量菌种。
(2)划A区：将平板倒置于煤气(酒精)灯旁,左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌面，有培养基一面向着煤气灯(这时皿盖朝上，仍留在煤气灯旁)，右手拿接种环先在A区划3—4条连续的平行线(线条多少应依挑菌量的多少面定)。划完A区后应立即烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在烧接种环时，左手持皿底并将其覆盖在皿盖上方(不要放入皿盖内)，以防止杂菌的污染。
(3)划其他区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转到上方，接种环通过A区(菌源区)将菌带到B区，随即划数条致密的平行线。再从B区作C区的划线。最后经C区作D区的划线，D区的线条应与A区平行，但划D区时切勿重新接触A、B区，以免极该两区中浓密的菌液带到D区，影响单菌落的形成。随即将皿底放入皿盖中。烧去接种环上的残菌。
E.恒温培养：将划线平板倒置，于37℃(或28℃)培养，24h后观察。
F.取生长态势最为优秀的菌落，作为纯化后的菌种，进行后续的培育。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述步骤(5)的培育方法，其步骤如下：采用300L不锈钢发酵罐，高径比为2.3：1.4，装液量73-78％，培养周期90h，将步骤(4)得到的纯化菌种进行摇瓶培养，然后接种，接种量7-9％，温度30～34℃，罐压0.13-0.17MPa，搅拌转速100-120r/min。其中，摇瓶培养时，摇瓶内培养基包括玉米粉3-5重量份，豆饼粉4-6重量份，营养盐适量，pH 6.6～6.8。
由于采用了以上技术方案，本发明具有以下有益效果：
本发明通过对市售的地衣芽孢杆菌菌种进行培养、扩大，适应之后，进行进一步的分离纯化，提高了纯化的成功率，使得纯化的地衣芽孢杆菌菌种充分表现出其较佳的生长性能，经过本发明纯化后的地衣芽孢杆菌菌种，在进行步骤(5)的扩大培育后，检测营养液内含活菌量(地衣芽孢杆菌)达到3.5×1010CFU/m L。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1
一种地衣芽孢杆菌的提纯方法，包括如下步骤：
(1)取地衣芽孢杆菌菌种，接种至新鲜试管斜面，于31℃培养19h，然后取培养好的斜面，加入10m L无菌生理盐水，用接种环将斜面上的菌苔轻轻刮下，振荡无菌生理盐水，然后将无菌生理盐水倾注于另一盛有30m L无菌生理盐水的一号三角瓶中，瓶中放入四粒营养珠(营养珠包括以下重量份的原料制备而成：胰蛋白胨1、酵母浸出粉0.7、NaCl 1.2；pH为7.3)，然后在摇床上以100r/min的速度振荡25min，制成均匀菌悬液，5℃保存备用；
(2)取第一培养基(第一培养基包括以下重量份的原料制备而成：蛋白胨5，牛肉膏4，NaCl 5)，并将培养基加入二号三角瓶中，加塞后，0.1MP灭菌23min，然后将步骤(1)得到的均匀菌悬液接种到二号三角瓶的培养基中，接种量按3％(V/V)(菌悬液与培养基的体积比)，接种后将二号三角瓶于35℃，振荡28h，摇床转速为120r/min，得到菌种；
(3)取第二培养基(第二培养基包括以下重量份的原料制备而成：葡萄糖2.5、豆芽浸汁25、酵母浸粉0.8；p H7.0)，并将培养基中加入蒸馏水，在电炉上煮沸5min，冷却到室温，凝固待用；
(4)将步骤(3)得到的第二培养基融化，并涂布于平板上，再将步骤(2)得到的菌种在平板上进行划线培养，将地衣芽孢杆菌进行分离、纯化；划线培养的步骤如下：
A.融化培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基放入水浴中加热至融化。
B.倒平板：待培养基冷却至50℃，按无菌操作法倒2只平板(每皿约15m1)，平置，待凝固。
倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住管(瓶)塞(也可将试管塞或瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住。如果试管内或三角瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在手中)。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速例入培养基约15m1，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
C.作分区标记在皿底将整个平板划分成A、B、C、D四个面积不等的区域。各区之间的交角应为120℃左右(平板转动一定角度约60℃)，以便充分利用整个平板的面积，而且采用这种分区法可使D区与A区划出的线条相平行，并可避免此两区线条相接触。
D.划线操作
D1.挑取他含菌样品：选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量菌种。
D2.划A区：将平板倒置于煤气(酒精)灯旁,左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌面，有培养基一面向着煤气灯(这时皿盖朝上，仍留在煤气灯旁)，右手拿接种环先在A区划3—4条连续的平行线(线条多少应依挑菌量的多少面定)。划完A区后应立即烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在烧接种环时，左手持皿底并将其覆盖在皿盖上方(不要放入皿盖内)，以防止杂菌的污染。
D3.划其他区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转到上方，接种环通过A区(菌源区)将菌带到B区，随即划数条致密的平行线。再从B区作C区的划线。最后经C区作D区的划线，D区的线条应与A区平行，但划D区时切勿重新接触A、B区，以免极该两区中浓密的菌液带到D区，影响单菌落的形成。随即将皿底放入皿盖中。烧去接种环上的残菌。
E.恒温培养：将划线平板倒置，于37℃(或28℃)培养，24h后观察。
F.取生长态势最为优秀的菌落，作为纯化后的菌种，进行后续的培育。
(5)将分离、纯化得到的地衣芽孢杆菌进行培育,其步骤为：采用300L不锈钢发酵罐，高径比为2.3：1.4，装液量73％，培养周期90h，将步骤(4)得到的纯化菌种进行摇瓶培养，然后接种，接种量7％，温度30℃，罐压0.13MPa，搅拌转速100r/min。其中，摇瓶培养时，摇瓶内培养基包括玉米粉3重量份，豆饼粉4重量份，营养盐适量，pH 6.6。
实施例2
一种地衣芽孢杆菌的提纯方法，包括如下步骤：
(1)取地衣芽孢杆菌菌种，接种至新鲜试管斜面，于33℃培养20h，然后取培养好的斜面，加入12m L无菌生理盐水，用接种环将斜面上的菌苔轻轻刮下，振荡无菌生理盐水，然后将无菌生理盐水倾注于另一盛有34m L无菌生理盐水的一号三角瓶中，瓶中放入四粒营养珠(营养珠包括以下重量份的原料制备而成：胰蛋白胨1.3、酵母浸出粉0.8、NaCl 1.3；pH为7.3)，然后在摇床上以120r/min的速度振荡26min，制成均匀菌悬液，6℃保存备用；
(2)取第一培养基(第一培养基包括以下重量份的原料制备而成：蛋白胨6，牛肉膏4.5，NaCl 6)，并将培养基加入二号三角瓶中，加塞后，0.2MP灭菌25min，然后将步骤(1)得到的均匀菌悬液接种到二号三角瓶的培养基中，接种量按3.5％(V/V)(菌悬液与培养基的体积比)，接种后将二号三角瓶于36℃，振荡30h，摇床转速为130r/min，得到菌种；
(3)取第二培养基(第二培养基包括以下重量份的原料制备而成：葡萄糖2.6、豆芽浸汁26、酵母浸粉1.0；p H7.0)，并将培养基中加入蒸馏水，在电炉上煮沸8min，冷却到室温，凝固待用；
(4)将步骤(3)得到的第二培养基融化，并涂布于平板上，再将步骤(2)得到的菌种在平板上进行划线培养，将地衣芽孢杆菌进行分离、纯化；划线培养的步骤如下：
A.融化培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基放入水浴中加热至融化。
B.倒平板：待培养基冷却至50℃左右，按无菌操作法倒2只平板(每皿约15m1)，平置，待凝固。
倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住管(瓶)塞(也可将试管塞或瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住。如果试管内或三角瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在手中)。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速例入培养基约15m1，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
C.作分区标记在皿底将整个平板划分成A、B、C、D四个面积不等的区域。各区之间的交角应为120℃左右(平板转动一定角度约60℃)，以便充分利用整个平板的面积，而且采用这种分区法可使D区与A区划出的线条相平行，并可避免此两区线条相接触。
D.划线操作
D1.挑取他含菌样品：选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量菌种。
D2.划A区：将平板倒置于煤气(酒精)灯旁,左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌面，有培养基一面向着煤气灯(这时皿盖朝上，仍留在煤气灯旁)，右手拿接种环先在A区划3—4条连续的平行线(线条多少应依挑菌量的多少面定)。划完A区后应立即烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在烧接种环时，左手持皿底并将其覆盖在皿盖上方(不要放入皿盖内)，以防止杂菌的污染。
D3.划其他区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转到上方，接种环通过A区(菌源区)将菌带到B区，随即划数条致密的平行线。再从B区作C区的划线。最后经C区作D区的划线，D区的线条应与A区平行，但划D区时切勿重新接触A、B区，以免极该两区中浓密的菌液带到D区，影响单菌落的形成。随即将皿底放入皿盖中。烧去接种环上的残菌。
E.恒温培养：将划线平板倒置，于37℃(或28℃)培养，24h后观察。
F.取生长态势最为优秀的菌落，作为纯化后的菌种，进行后续的培育。
(5)将分离、纯化得到的地衣芽孢杆菌进行培育,其步骤为：采用300L不锈钢发酵罐，高径比为2.3：1.4，装液量75％，培养周期90h，将步骤(4)得到的纯化菌种进行摇瓶培养，然后接种，接种量8％，温度33℃，罐压0.15MPa，搅拌转速115r/min。其中，摇瓶培养时，摇瓶内培养基包括玉米粉4重量份，豆饼粉5重量份，营养盐适量，pH 6.7。
实施例3
一种地衣芽孢杆菌的提纯方法，包括如下步骤：
(1)取地衣芽孢杆菌菌种，接种至新鲜试管斜面，于35℃培养25h，然后取培养好的斜面，加入15m L无菌生理盐水，用接种环将斜面上的菌苔轻轻刮下，振荡无菌生理盐水，然后将无菌生理盐水倾注于另一盛有35m L无菌生理盐水的一号三角瓶中，瓶中放入四粒营养珠(营养珠包括以下重量份的原料制备而成：胰蛋白胨1.5、酵母浸出粉0.9、NaCl 1.3；pH为7.3)，然后在摇床上以130r/min的速度振荡27min，制成均匀菌悬液，7℃保存备用；
(2)取第一培养基(第一培养基包括以下重量份的原料制备而成：蛋白胨7，牛肉膏5，NaCl 7)，并将培养基加入二号三角瓶中，加塞后，0.3MP灭菌27min，然后将步骤(1)得到的均匀菌悬液接种到二号三角瓶的培养基中，接种量按4％(V/V)(菌悬液与培养基的体积比)，接种后将二号三角瓶于37℃，振荡35h，摇床转速为145r/min，得到菌种；
(3)取第二培养基(第二培养基包括以下重量份的原料制备而成：葡萄糖2.7、豆芽浸汁27、酵母浸粉1.2；p H7.0)，并将培养基中加入蒸馏水，在电炉上煮沸10min，冷却到室温，凝固待用；
(4)将步骤(3)得到的第二培养基融化，并涂布于平板上，再将步骤(2)得到的菌种在平板上进行划线培养，将地衣芽孢杆菌进行分离、纯化；划线培养的步骤如下：
A.融化培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基放入水浴中加热至融化。
B.倒平板：待培养基冷却至50℃左右，按无菌操作法倒2只平板(每皿约15m1)，平置，待凝固。
倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住管(瓶)塞(也可将试管塞或瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住。如果试管内或三角瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在手中)。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速例入培养基约15m1，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
C.作分区标记在皿底将整个平板划分成A、B、C、D四个面积不等的区域。各区之间的交角应为120℃左右(平板转动一定角度约60℃)，以便充分利用整个平板的面积，而且采用这种分区法可使D区与A区划出的线条相平行，并可避免此两区线条相接触。
D.划线操作
D1.挑取他含菌样品：选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量菌种。
D2.划A区：将平板倒置于煤气(酒精)灯旁,左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌面，有培养基一面向着煤气灯(这时皿盖朝上，仍留在煤气灯旁)，右手拿接种环先在A区划3—4条连续的平行线(线条多少应依挑菌量的多少面定)。划完A区后应立即烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在烧接种环时，左手持皿底并将其覆盖在皿盖上方(不要放入皿盖内)，以防止杂菌的污染。
D3.划其他区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转到上方，接种环通过A区(菌源区)将菌带到B区，随即划数条致密的平行线。再从B区作C区的划线。最后经C区作D区的划线，D区的线条应与A区平行，但划D区时切勿重新接触A、B区，以免极该两区中浓密的菌液带到D区，影响单菌落的形成。随即将皿底放入皿盖中。烧去接种环上的残菌。
E.恒温培养：将划线平板倒置，于37℃(或28℃)培养，24h后观察。
F.取生长态势最为优秀的菌落，作为纯化后的菌种，进行后续的培育。
(5)将分离、纯化得到的地衣芽孢杆菌进行培育,其步骤为：采用300L不锈钢发酵罐，高径比为2.3：1.4，装液量78％，培养周期90h，将步骤(4)得到的纯化菌种进行摇瓶培养，然后接种，接种量9％，温度34℃，罐压0.17MPa，搅拌转速120r/min。其中，摇瓶培养时，摇瓶内培养基包括玉米粉5重量份，豆饼粉6重量份，营养盐适量，pH 6.8。
对比实施例
采用市售的地衣芽孢杆菌菌种，直接进行扩大培育：采用300L不锈钢发酵罐，高径比为2.3：1.4，装液量78％，培养周期90h，将步骤(4)得到的纯化菌种进行摇瓶培养，然后接种，接种量9％，温度34℃，罐压0.17MPa，搅拌转速120r/min。
实验结果如下：
项目 营养液内含活菌量 杂菌占比(％)
实施例1 3.1×1010CFU/mL 2.9
实施例2 3.5×1010CFU/mL 2.1
实施例3 3.4×1010CFU/mL 2.7
对比实施例 2.3×1010CFU/mL 15.3
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (5)

1.一种地衣芽孢杆菌的提纯方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)取地衣芽孢杆菌菌种，接种至新鲜试管斜面，于31-35℃培养19-25h，然后取培养好的斜面，加入10-15m L无菌生理盐水，用接种环将斜面上的菌苔轻轻刮下，振荡无菌生理盐水，然后将无菌生理盐水倾注于另一盛有30-35m L无菌生理盐水的一号三角瓶中，瓶中放入四粒营养珠，然后在摇床上以100-130r/min的速度振荡25-27min，制成均匀菌悬液，5-7℃保存备用；
(2)取第一培养基，并将培养基加入二号三角瓶中，加塞后，0.1-0.3MP灭菌23-27min，然后将步骤(1)得到的均匀菌悬液接种到二号三角瓶的培养基中，接种量按3-4％，接种后将二号三角瓶于35-37℃，振荡28-35h，摇床转速为120-145r/min，得到菌种；
(3)取第二培养基，并将培养基中加入蒸馏水，在电炉上煮沸5-10min，冷却到室温，凝固待用；
(4)将步骤(3)得到的第二培养基融化，并涂布于平板上，再将步骤(2)得到的菌种在平板上进行划线培养，将地衣芽孢杆菌进行分离、纯化；
(5)将分离、纯化得到的地衣芽孢杆菌进行培育。
2.根据权利要求1所述的一种地衣芽孢杆菌的提纯方法，其特征在于：所述营养珠包括以下重量份的原料制备而成：胰蛋白胨1-1.5、酵母浸出粉0.7-0.9、NaCl 1.2-1.3；pH为7.3。
3.根据权利要求1所述的一种地衣芽孢杆菌的提纯方法，其特征在于：所述第一培养基包括以下重量份的原料制备而成：蛋白胨5-7，牛肉膏4-5，NaCl 5-7。
4.根据权利要求1所述的一种地衣芽孢杆菌的提纯方法，其特征在于：所述第二培养基包括以下重量份的原料制备而成：葡萄糖2.5-2.7、豆芽浸汁25-27、酵母浸粉0.8-1.2；p H7.0。
5.根据权利要求1所述的一种地衣芽孢杆菌的提纯方法，其特征在于：所述步骤(5)的培育方法，其步骤如下：采用300L不锈钢发酵罐，高径比为2.3：1.4，装液量73-78％，培养周期90h，将步骤(4)得到的纯化菌种进行摇瓶培养，然后接种，接种量7-9％，温度30～34℃，罐压0.13-0.17MPa，搅拌转速100-120r/min。
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